Mthode rapide pour la dtermination de

sulfures dissous et prcipits dans des

cultures de bactries sulfates
Ralf Cord-Ruwisch

Lahoratvire de Micrvhiologie ORSTOM, Universir6 de Provence. 3, Place Victor Hugo, 13331 Marseille
Ci.tk:y 3 (Franw)

(Received 23 January 1985) (Revised version received 19 March 1985) (Accepted 22 March 1985)

Rsum
Le sulfure dissous a t dtermin par spectrophotomtrie sous la forme d'une solution
collodale de sulfure de cuivre. Les courbes d'talonnage taient linaires. L'erreur de
dviation maximale tait infrieure 5%. Le sulfure prcipit comme FeS a t dtermin
aprs acidification du milieu.

Introduction
Le sulfure dans les cultures de bactries sulfidognes est usuellement dtermin par la
raction du bleu de mthylne [I, 21]. Cette mthode permet une analyse quantitative
des traces de sulfure dissous (par exemple dans les eaux souterraines) jusqu' des
concentrations de micromoles par litre. Comme cette raction dure environ 20 min, la
prsence de sulfure dissous dans les cultures de bactries sulfate-rductrices (SRB) est
prouve rapidement par sa prcipitation collodale sous forme de CuS dans un ractif
sulfate de cuivre [3, 41]. tre quantifis photo-mtriquement, comme dcrit dans ce
papier.

Matriaux et mthodes
Le ractif de cuivre tait constitu de HCl (50 mmol / l) et CuSO, (5 mmol / l). La raction
tait:

Cu SO4 + H2S CuS + H2SO4

Procdure

Tous les vaisseaux de culture ont t compltement remplis. Si ce n'est pas le cas, le pH
de la culture est augment pH 1O pour rduire la perte de H, S volatils qui s'est
chappe dans la phase gazeuse. Le fluide de culture (0,05 ml) a t retir par une
seringue ou une pipette du rcipient de culture tandis que 1, 95 ml de ractif de cuivre a
t agit magntiquement (1000 tpm) dans une cuvette de mesure de 2 ml et 1 cm. Le
fluide de culture a t rapidement inject dans le ractif d'agitation. Immdiatement
aprs le mlange pendant 5 s, l'absorbance a t mesure 480 nm dans un photomtre
Bausch & Lomb Spectronic 21. Le mlange de 0,05 ml de liquide de culture et 1,95 ml de
HCl (50 mmol / 1) a servi de blanc. La cuvette agitation magntique pourrait tre
remplace par un tube essai pos sur un mlangeur tourbillons (1000 r.p.m.). Dans ce
cas, on a utilis 4 ml de ractif et 0, 1 ml de fluide de culture.

Prparation standard Sulfure

On a fait bouillir de l'eau distille (200 ml) pour liminer l'oxygne dissous. L'eau chaude
a t refroidie sous N, car la phase gazeuse (technique Hungate [5, 61] et le rcipient ont
t scells avec un septum en caoutchouc (Tubes Hungate, Bellco Glass Inc., Vineland, NJ,
USA). Un cristal lav de Na2S. 9H2O dans de l'eau anoxique jusqu' une concentration
connue (50-100 mM). 5 ml de cette solution de sulfure concentre ont t transfrs par
seringue dans les tubes contenant 5 ml d'eau anoxique. Aprs agitation, 5 ml de ce
mlange ont t transfrs anarobie- ment dans le second tube. Cette srie de dilution
anoxique de sulfure dissous a t prpare. Comme les solutions de Na 2S sont alcalines
(pH 12), le H2S volatil dans l'atmosphre gazeuse est ngligeable.

Sulfate prcipit

Dans les milieux de culture contenant du Fe 2 + dissous, le sulfure produit a t

partiellement prcipit au fond du rcipient sous forme de Fex. Cinq pour cent du liquide
de culture exempt de Fes a t enlev de la totalit remplie par la seringue travers le
septum en caoutchouc et a t remplac par HCl 4 M. Fes dissous et le sulfure total a t
dtermin comme dcrit ci-dessus. Le sulfure non dissous a t calcul par soustraction
du sulfure dissous du sulfure total.

Rsultats et discussion
Des aliquotes de cultures bactriennes rductrices de sulfate, cultives sans phase
gazeuse dans le milieu de Widdel et Pfennig [7], ajoutes (I: 4, v / v) la solution acide de
CuSO, ont provoqu une prcipitation brun fonc De CuS. De plus petites quantits (1:
40, v / v) d'aliquotes ajoutes au ractif de cuivre en mouvement ont donn une solution
de CuS collodale qui est reste stable pendant 20 40 s. Pendant ce temps, l'absorbance
du produit final a t mesure une longueur d'onde de 480 nm. A 480 nm, le ractif
avait la mme densit optique que l'eau distille. Le HCl (50 mmol / 1) ajout par
l'aliquote de culture a servi de blanc. Les courbes d'talonnage taient linaires jusqu'
une absorbance de 0,5 (figure I). Par consquent, un facteur pourrait tre utilis pour
calculer la concentration de sulfure partir de l'absorbance mesure, l'cart maximal
obtenu de la droite de rgression droite calcule tait infrieure 5%. Les rsultats
reproductibles n'ont t obtenus que lorsque le ractif et l'aliquote de culture ont t
mlangs ensemble pendant qu'ils se dplaaient (agitateur magntique ou mlangeur
tourbillonnaire). Mme une agitation intensive du ractif immdiatement aprs l'ajout du
liquide de culture au ractif de repos, a donn un cart maximal d'environ 15%. Certains
milieux de culture de SRB contiennent de fortes quantits de sels de fer ferreux (par
exemple, le milieu de Postgate [7]) qui prcipitent aprs croissance bactrienne comme
Fes; Ou de fer dissous est complte pour piger le sulfure d'hydrogne [8]. En prsence
de fer lmentaire, une partie du sulfure produit se prcipite aussi comme Fs
(expriences de corrosion [9]). Dans ce cas, seul un excs de sulfure reste dissous dans le
milieu. Aprs sdimentation des bandes de FeS, le sulfure dissous restant a t dtermin
comme ci-dessus. Aprs acidification du liquide de culture (voir ci-dessus), la Fs s'est
dissoute et le sulfure produit total a pu tre dtermin. Compar la raction du bleu de
mthylne [I, 21, la dtermination du sulfure dissous dans le culte des bactries sulfate-
rductrices avec la mthode dcrite a t plus rapide avec la prcision de similak et
aucun produit toxique (Tableau 1). Aucun autre anion habituellement prsent dans les
cultures bactriennes ou les environnements biologiques ne prcipite avec du cuivre en
solution acide. Par consquent, cette mthode peut galement tre applique
directement dans les habitats naturels de bactries sulfates (sdiments marins).

Rfrences
Pachmayr, F. (1960) Vorkommen und Bestimmung von Schwefelverbindungen in Mineralwasser. PhD
thesis, University Mnchen, FRG.

Cline, J. D. (1969) Spectrophotometric determination of hydrogen sulfide in natural waters. Limnol.

Oceanogr. 14.454-458.

Widdel. F. (1980) Anaerober Abbau von Fettsuren und Benzoesure durch neu isolierte Arten
sulfat- reduzierender Bakterien. PhD thesis, University Gttingen, FRG.

Laanbroek, H. J. and Pfennig, N. (1981) Oxidation of short-chain fatty acids by sulfate-reducing

bacteria in freshwater and in marine

sediments. Arch. Microbiol. 128,330 335. Hungate, R.E. (1969) A roll tube method for cultivation of
strict anaerobes. In: Methods in
Microbiology, Vol. 3b (Norris. R. and Ribbons, D. W., eds.) pp. 117-132. Academic Press, New York.
Bryant, M. I'. (1972) Commentary on the Hungate Technique for culture of anaerobic bacteria.
Am. .I.

Clin. Nutr. 25, 1324-1328. Widdel, F. and Pfennig, N. (1984) Dissimilatory sulfate- or sulfur-reducing
bacteria. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. I (Krieg, N. R. and Holt, J.G.. eds.)
pp. 663-679, Williams & Wilkins

Co., dtimoq. King, R.A.. Miller. J.D.A. and Wakerley. D.S. (1973) Corrosion of mild steel in cultures
of sulfate- reducing bacteria: effects of changing the soluble iron concentration during growth. Ur.
Corros. J. 8, 89-94. ell, R.G., Chor Kiang Lim (1981) Corrosion of mild and stainless steel by four
tropical I>esu/f\~ibriu
desu&nktm strains. Can. J. Microbiol. 27, 242-245