FACULTAD DE EDUCACION Y CIENCIAS HUMANAS

MICROBIOLOGA
LABORATORIO N 3.1

PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Y TCNICAS DE SIEMBRA

INTRODUCCIN

Las bacterias en la naturaleza, segn sus necesidades nutricionales, ocupan distintos nichos ecolgicos que
satisfacen las mismas. En el laboratorio, para conseguir que una determinada especie bacteriana se desarrolle
adecuadamente es necesario proporcionarle un ambiente artificial que las satisfaga igualmente. Esto se consigue
mediante el uso de los llamados medios de cultivo. Para el cultivo y aislamiento de bacterias en el laboratorio se
utilizan medios adecuados, los cuales segn su consistencia pueden ser slidos, semislidos y lquidos.
El cultivo de microorganismos es una actividad que requiere del conocimiento de tcnicas de siembra o
inoculacin y de aislamiento para transferirlos de un medio a otro, o mantener su crecimiento y actividad. Es
indispensable para realizar diversos estudios morfolgicos, de identificacin, bioqumicos, de patogenicidad y
ecolgicos, entre otros. Existen diferentes tcnicas de siembra: por suspensin de la muestra en medios lquidos;
extensin de diluciones de un cultivo en superficie de medios en caja de Petri; por estra en caja de Petri y tubos con
medios solidificados en forma inclinada; por piquete o picadura en tubos con medios slidos o semislidos. Con la
aplicacin de cada tcnica se obtiene informacin de importancia para el estudio bsico o aplicado de los
microorganismos de inters.
En la naturaleza, los microorganismos generalmente se encuentran en poblaciones, formando parte de
comunidades de gran complejidad, por lo que uno de los objetivos de estudio ms importantes en microbiologa es
aislarlos. El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora de los casos, mediante la
tcnica de estra cruzada para producir colonias aisladas en cultivos slidos y as, obtener un cultivo puro o axnico,
tambin conocido como cepa, que contiene un solo tipo de microorganismo con la misma composicin gentica.
Cuando la tcnica por estra se aplica para aislar un microorganismo de inters a partir de mezclas donde se
encuentra en pequeas cantidades, generalmente se obtendrn las bacterias dominantes. En este caso, se utilizan
medios selectivos o de enriquecimiento, los que contienen nutrientes especiales, antibiticos, altas concentraciones
de sales y/o condiciones de pH, luz o temperatura que incrementarn la poblacin del microorganismo de inters y
se facilitar su aislamiento.
Si se agregan a los medios de cultivo otros componentes como: sangre, colorantes, indicadores, es posible
distinguir entre especies bacterianas por la forma en que metabolizan los sustratos y que se manifiesta por cambios
en la apariencia del pH del medio de cultivo. Estos medios se conocen como medios diferenciales y son de gran
utilidad para la caracterizacin e identificacin de especies bacterianas.

OBJETIVOS

1. Adquirir destreza en la preparacin de medios de cultivo utilizado en microbiologa

2. Que el alumno aplique diferentes tcnicas de siembra y aislamiento de cultivos de bacterias y levaduras en
medios slidos.
3. Comprobar la utilidad que tienen los medios de cultivos de uso general, diferenciales y selectivos

MATERIALES
Cultivos puros (cepas) de bacterias Gram+, Gram- Agua destilada
Cajas Petri estriles 1 incubadora a 37C
Cajas Petri con agar nutritivo (AN) 1 refrigerador
Medios de cultivo para preparar (agar SS, Agar XLD 2 pares de guantes de asbesto
(xilosa-lisina-desoxicolato)) Escobillones, fibra, detergente y toallas de papel
Cajas Petri con agar AN Papel estraza, algodn y gasa
Tubos con caldo nutritivo (CN) Autoclaves con base, canastilla y vlvula
Tubos inclinados con AN Balanzas analticas
3 mecheros Bunsen Alcohol
Asas de inoculacin Asa Digralsky
PROCEDIMIENTOS

Preparacin de medios de cultivo:

Se pesa la cantidad de medio que se requiera

Se disuelve en agua
Se ajusta el pH con NaOH y HCl a 7,2
Calentar en bao de maria hasta que el agar est fundido
Se esterilizar a 121C por 20 minutos, algunos medios no lo requieren
Esperar a que enfre a 42C o hasta que pueda sostener el recipiente sin quemarse la mano
Servir 20 ml aproximadamente en cada caja de Petri o 5ml aproximadamente en tubo
Limpiar bien la boca de los tubos y el matraz y tapar con algodn

Tcnicas de siembra:
El profesor proporcionar cultivos puros (cepas) de bacterias Gram (+), Gram (-). Cada equipo de trabajo inocular
cada uno de los microorganismos en cajas de AN y en tubos.

Tcnica de estra cruzada (Figura 1)

A. Dividir cada una de las cajas Petri por la parte de atrs en cuatro cuadrantes. Esterilizar el asa con calor en el
mechero.
B. Dejar enfriar el asa y tomar la muestra de una colonia.
C. Inocular la muestra haciendo 4 o 5 estras simples muy juntas de lado a lado sobre el primer cuadrante de la caja,
cerrar la caja. Flamear el asa de inoculacin y hacer girar la caja Petri un cuarto de vuelta.
D. Abrir nuevamente la caja y con el asa de siembra esterilizada y fra, tocar la superficie del de estras recin hechas
en un punto alejado del inicio. Hacer un segundo grupo de estras como en el caso anterior. Realizar el mismo
procedimiento en el tercer cuadrante y en el ltimo cuadrante, sin flamear el asa de siembra har una estra ms
abierta (simple).
F. Las cajas con la base hacia arriba se incuban a 37C durante 24-48 horas.

Siembra en tubos (Figura 2)

A partir de cultivos previos transferir con el asa, previamente esterilizada y fra, una pequea muestra de la colonia a
un tubo de CN.
C. Transferir de la misma forma una muestra de la misma colonia inoculando por estra los tubos inclinados con AN
D. Incubar los tubos a 37C durante 24-48 hrs. Observar la aparicin de colonias y reportar la forma de crecimiento
de los microorganismos. Hacer sus reportes.

Anlisis de resultados
A. Reportar sus resultados de siembra de las cepas en cada medio de cultivo.
B. Describir la morfologa colonial representativa de cada cultivo microbiano de acuerdo con los criterios indicados
en al final de la gua.
Morfologa colonial de los cultivos en cajas

Descripcion de los cultivos en tubos

Bibliografa

http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_general.pdf
 UNIVERSIDAD DE CRDOBA
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MICROBIOLOGA
LABORATORIO N 3.2

CULTIVO Y MORFOLOGA DE HONGOS FILAMENTOSOS Y OBSERVACIN

DE LEVADURA

Introduccin
Los hongos son organismos eucariotas, de mayor tamao y complejidad que las bacterias. Se distinguen
de otros eucariontes, como los animales, por ser inmviles y, de las algas y plantas, por carecer de
pigmentos fotosintticos. Son de nutricin hetertrofa; es decir, dependen de nutrientes orgnicos
disueltos por sistemas enzimticos especficos, que son absorbidos a travs de su pared celular y
membrana plasmtica.
En este grupo de organismos se encuentran formas unicelulares (levaduras) o pluricelulares
(filamentosos). Las levaduras son clulas de forma esfrica u oval, ampliamente distribuidas en la
naturaleza; con frecuencia se encuentran formando una cubierta pulverulenta fina sobre frutos y hojas.
Las levaduras se reproducen en forma asexual por gemacin, un proceso por el cual brota una
protuberancia o yema de la clula madre que, posteriormente se separa como clula individual.
Los hongos filamentosos (mohos) tienen una estructura vegetativa caracterstica denominada hifa. El
conjunto de hifas ramificadas constituye el micelio. Las hifas de algunos hongos presentan tabiques
transversales o septos, aunque en el caso de los hongos que pertenecen al grupo Zygomycota, las hifas no
presentan estos septos y se conocen como hifas cenocticas.
El principal mecanismo de reproduccin de los hongos es asexual por fragmentacin de hifas
vegetativas o por la produccin de esporas en conidiforos y esporangiforos, formados en hifas
areas, llamadas reproductivas.
La presencia de estructuras de reproduccin sexual, es el principal criterio de clasificacin que permite
ubicar a los hongos en tres divisiones o phyla: Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Otros criterios
importantes para la clasificacin de los hongos son las caractersticas de las hifas y las estructuras de
produccin de esporas asexuales.

Objetivos
1. Que el alumno adquiera los conocimientos bsicos para la manipulacin de hongos
filamentosos y tcnicas de cultivo.
2. Que describa las caractersticas morfolgicas macroscpicas y microscpicas e identifique
algunas especies de hongos.
3. Reconocer y diferenciar las distintas estructuras (micelios, hifas, esporas, etc.) de los hongos
unicelulares y pluricelulares, por observacin microscpica en fresco.

Materiales
Cajas Petri con 25 mL de PDA
Mecheros Bunsen
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pinza de diseccin
Asa de siembra
Palillos de 10 cm (Palillos de hisopo de algodn) o varillas de vidrio de 10 cm
Papel filtro
Microscopios pticos
Aceite de inmersin
Incubadora
Azul de Lactofenol
Solucin de levadura liofilizada al 10%
Cultivo de Hongos (Aspergillus niger, Fusarium sp)

Procedimiento

Descripcin macroscpica
Observar las siguientes caractersticas de los hongos filamentosos:
a) Forma, tamao y tipo de colonia
b) Aspecto del micelio: algodonoso, aterciopelado, velloso, areo o pegado al medio
c) Color del micelio y color de las esporas
d) Cambios en el medio de cultivo

Tcnica de la cinta adhesiva

1. Se abre el medio de cultivo que tiene el hongo (Aspegillus niger o Fusarium sp) cerca al mechero
2. Se corta un pedazo de cinta adhesiva que se pone en contacto con una colonia del hongo.
3. Sobre un portaobjeto depositamos una gota de agua o azul de lactofenol.
4. Se presiona la cinta sobre el porta, eliminando el exceso de agua o colorante conpapel secante (filtro),
evitando la formacin de burbujas.
5. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

Tcnica del cubreobjetos

1. Se abre el medio de cultivo que tiene el hongo (Aspegillus niger o Fusarium sp) cerca al mechero
2. Con un asa de siembra se toma una porcin del centro de la colonia.
3. Sobre un portaobjeto depositamos una gota de agua o azul de lactofenol.
4. Se dislacera, con ayuda del asa de siembra, la porcin de colonia en estudio.
5. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de agua o colorante con papel
secante (filtro).
6. Se observa la preparacin al microscopio a distintos aumentos.

El agua para el montaje de la preparacin, se emplea cuando queremos conocer la coloracin que tienen
las estructuras de los hongos.

Observacin de levadura
1. Tomar una gota de la solucin de levadura y colocarla al portaobjeto
2. Se coloca un cubreobjetos sobre la preparacin, eliminando el resto de lquido papel secante (filtro).
3. repetir el anterior procedimiento agregando azul de lactofenol para observacin de las estructuras
4. Observar con distintos aumentos

Microcultivo

Se deposita un cuadrado del medio PDA sobre un portaobjetos previamente flameado y fro. Se
siembra el hongo en sus bordes. Se coloca un cubreobjetos que tambin fu flameado y enfriado. Se
apoya el conjunto sobre dos varillas de vidrio, dentro de una caja de Petri en cuyo fondo hay un papel
absorbente estril embebido en agua. Se incuba a temperatura ambiente con alternancia luz solar
indirecta y obscuridad durante el tiempo necesario (Dade & Gunnell 1969). La figura muestra un
esquema de la preparacin de un microcultivo.
Cuestionario

1. Qu diferencias hay entre los procedimientos de observacin e identificacin de bacterias, levaduras

y hongos filamentosos?

2. Cules son los principales criterios de identificacin de los hongos y levaduras?

3. Describa los tipos de esporas sexuales y asexuales que caracterizan a los diferentes clases de hongos.

4. Describa de manera breve tres problemticas causadas al hombre por hongos y tres ejemplos de sus
aplicaciones industriales.