Resumen

En las ltimas tcnicas de una sola clula lustro como una sola clula de PCR
cuantitativa, ARN y secuenciacin de ADN, y el estado de la tcnica
citometra de tiempo de vuelo (CyTOF) citmetro de masas han permitido un
anlisis detallado de la sub-composicin de los diferentes rganos de
la hematopoytica compartimiento de mdula sea para el cerebro. Estos anlisis
de grano fino han puesto de manifiesto la gran heterogeneidad dentro de
cada compartimento celular que revela las subpoblaciones de clulas previamente
desconocidos. En esta revisin, se analiza cmo este ayuno tecnolgico
la evolucin ha mejorado nuestra comprensin de los procesos biolgicos con un
enfoque particular en raras clulas del sistema inmune

introduccin

Consideramos que un ser humano como un ser singular, nico y

irrepetible. Sin embargo, en los ltimos aos de una sola clula mltiple
tecnologas han puesto de manifiesto que no slo son nicos y
irrepetible, pero que podra estar compuesto de millones de millones de
cells.1-5 nico e irrepetible La mayor parte de nuestro conocimiento cientfico
origina a partir de datos de poblacin donde las clulas pertenecientes a la misma
subtipo se consideran como una sola unidad, en la que todos los miembros que
componer la clase son, por definicin, homognea e idntica. Esta
concepto representa una simplificacin extrema de la realidad y puede ser
atribuido tanto a la simplificacin necesaria requerida para entender
la imagen global y tambin a la falta de tecnologas y anlisis de datos
tcnicas que permiten ms de grano fino investigaciones

La ausencia de tecnologas para el estudio de clulas individuales ha tenido la

mayor impacto en el anlisis de clulas que son producen como mnimo fraccin
de la poblacin inicial: clulas raras. Una clula se considera "rara" cuando el
nmero de clulas de ese en particular subpoblacin representa una fraccin del
total de heterognea poblacin o0.01%. Los ejemplos de clulas raras estn
circulando las clulas tumorales (CTC) y 6 que circulan clulas fetales en el
perifrico sangre.7 Ms especficamente para el sistema inmune, las clulas raras
incluyen linfocitos especficos de antgeno y clulas madre hematopoyticas
(HSC) .8 En el contexto inmunolgico, captura y anlisis de clulas raras en una
poblacin heterognea es de vital importancia especialmente para el estudio de
vas reguladoras clave, tanto en el estado estacionario y durante la enfermedad
progression.9 Hasta el momento, el instrumento que ha permitido que la mayor
parte del estudio de clulas raras es el citmetro de flujo, donde hasta 17
marcadores fenotpicos diferentes se pueden analizar a la vez por cell.10 El ms
sofisticado y la mquina reciente, con un caudal de hasta 100 000 evento

por segundo, permite la deteccin de clulas a frecuencias tan bajo como

0,0001%. La combinacin de esta tecnologa con el paralelo desarrollo tanto de
nuevos anticuerpos especficos de fluorforo conjugado, que abarcan actualmente
el conjunto visible y parte del infrarrojo cercano espectro, y tambin algoritmos de
anlisis ms rpidos y mejor es la clave para el identificacin y aislamiento de
clulas raras. En los ltimos aos una gran cantidad de diferentes tecnologas
unicelulares ha sido desarrollado que permite anlisis incluso ms dimensiones de
clulas individuales aisladas (Figura 1). Una sola clula de PCR cuantitativa, 11 de
lata cuantificar la expresin de cientos de genes por una adaptacin de estndar
cuantitativa en tiempo real PCR. Sola clula con el anlisis protemico citometra
de tiempo de vuelo (citometra de masa de una sola clula) 12 Actualmente
permite la deteccin de los niveles de hasta 40 protenas diferentes dentro de la
misma clula. Por ltimo, el ADN de una sola clula y ARN mtodos de
secuenciacin puede determinar los perfiles completos de transcriptmica y
genmica

secuenciacin de una sola clula fue, en 2013, nombrado por la revista Nature Los
mtodos como el mtodo del ao, ya que permite una visin completa de tanto el
perfil de la transcripcin y el contenido de ADN en una clula sin requerir un
conocimiento a priori de los genes de inters. Hasta el momento los cientficos, la
secuenciacin de una sola clula ha permitido caracterizar raras clulas como las
neuronas individuales, 20 que circula cells21 tumor y cells.22 espermatozoide Este
enfoque global e imparcial no slo arrojar ms luz sobre el comportamiento de
clulas raras, sino que tambin aumentar el nmero de diferentes tipos de
clulas raras que se han descrito

SUBPOBLACIONES RARO, recientemente identificado en el

SISTEMA INMUNE

secuenciacin de una sola clula ha demostrado que casi cada clula es diferente
a todos los dems cell23 y ha identificado previamente desconocido escondido
subpoblacin de clulas dentro de las poblaciones en estudio

El empleo de la secuencia de ARN de una sola clula en tanto in vivo como ex

vivo Las clulas se cultivaron T helper (Th), Mahata et al24 identificaron una
subpoblacin de clulas que producen la pregnenolona esteroides dentro del
subtipo Th2. Esta produccin de esteroides estaba relacionado con la presencia
de la enzima CYP11A1 y fue demostrado para suprimir la proliferacin de clulas
T. Esto nuevo subconjunto Th2, cree que contribuyen al mantenimiento de la
homeostasis, que no han sido identificados con las mediciones clsicas de la
poblacin a granel, ya que habra sido enmascarado por la otra clulas ms
frecuente. De la misma manera, Shalek et al. encontrado un subconjunto muy
pequeo de clulas que nombraron expresadores precoces entre mdula sea de
ratn (BM) -derivado cells.23 dendrticas Esas clulas particulares son los que, en
respuesta a inflamatoria inducida por lipopolisacrido estmulo, primero producen y
secretan una ola de interfern con el fin de coordinar una respuesta antiviral
ncleo gradual. La actividad de las clulas tambin se ensay en ausencia de la
comunicacin de clula a clula por la estimulacin de las clulas despus de su
captura dentro de un microfluidos cmara

Recientemente, alta dimensin citometra de masas (citometra de tiempo en

espera de vuelo) se integr con citometra de flujo fosfo-especfico y novedoso
anlisis de datos computacional para estudiar la heterogeneidad de la
ROSmediated regulacin de la sealizacin del receptor de clulas B dentro de
subconjuntos de primaria humano B cells.25 amigdalina Esto permiti la
identificacin de una pequea subpoblacin de clulas sensibles a H2O2 y
determinado su identidad con un panel de masas citometra diseado para
caracterizar las clulas B maduras. El llamado "respondedor" fenotipo celular
sugiri un centro germinal la identidad de clulas B.

En general, estos hallazgos representan bien el potencial de la de una sola clula

la investigacin, ya que esos subconjuntos especficos de clulas habran sido
identificado con anlisis de la poblacin tradicional. El impacto de este tipo de
investigacin puede ser muy importante, sobre todo en inmunologa donde la
variacin de clula a clula es notoriamente alta y es clave para el xito de la
respuesta inmune

CLONES de clulas T especficas de antgeno

diversidad celular tremenda origina a partir de la transposicin somtica de

receptor de clulas T (TCR) genes durante su desarrollo en el timo. nmeros
tericos propuestos de posibles humano diferenciado TCR son tan altas como
1015 o 1016 26,27 y un solo individuo se ha estimado que tenga en el orden de
108 clones.27 de clulas T Aproximadamente solamente uno de cada 106 a 107
clulas T humanas son ingenuas capaz de reaccionar a un eptopo del antgeno
determinado, poniendo de relieve la inmensa specialization.28 funcional As, el
repertorio de clulas T contiene enorme diversidad, as como la flexibilidad, por
alteraciones de esta repertorio frente a las condiciones cambiantes. la diversidad
TCR disminuido puede resultar de varios estados de enfermedad, tales como
lupus sistmico erythematosus.29 Tpicamente, el repertorio de clulas T tambin
se convierte algo ms estrecha durante la vejez acompaada de cambios en
clonal frecuencias, reduccin de la funcin inmune y la respuesta disminuida de
vaccinations.30 Si bien esta disminucin de la funcin inmune no es
completamente entendido, es probable que el resultado de una combinacin de
involucin del timo y las infecciones por patgenos latentes tales como
cytomegaloviru

Hasta la fecha, la relacin exacta de la secuencia de TCR y funcional

potencial de la celda que queda por esclarecer concluyente. La progenie de
clulas T CD4 + especficas de antgeno purificados usando histocompatibilidad
pptido-major
complejo de multmero tincin y clasificacin de clulas son capaces de
asumir mltiples destinos celulares alternativos (Th1, Th2 y Th17) in vitro.
32
In vivo, las clulas T CD4 + con los TCR recombinantes transgnicos han sido
se muestra para diferenciar a ambas clulas Th1 y Tfh de tipo, con el
frecuencias influenciados por la fuerza de TCR signalling.33 Con tales
resultados, es obvio que el potencial funcional de un clon de clulas T es
no restringido por su secuencia TCR. Sin embargo, es menos claro cmo
la estructura del receptor influye en la propensin del clon de alojamiento
alternativo
clula destino in vivo

Recientemente, potentes herramientas para la caracterizacin de las clulas T

especficas de antgenos
poblaciones se han desarrollado. Posibilidades de flujo convencional
Los ensayos basados en citometra se han ampliado con la citometra de masas
la tecnologa, que se ha utilizado en conjuncin con el pptido-major
histocompatibilidad tincin complejo de multmero en las clulas T CD8 + por
Newell et al.34 utilizando un panel de 77-rotavirus especfico de pptido-
tetrmeros
etiquetado en una forma combinatoria, junto con un conjunto de 27 anticuerpos
contra protenas marcadoras funcionales, era posible identificar clulas T
reactivos contra eptopos diferentes de rotavirus en los estados de regulacin
distintos.
Sin embargo, como los experimentos de citometra consumen inevitablemente la
muestra,
determinacin novo de simultneo de la secuencia de TCR no es posible.
Una estrategia para la obtencin de la secuencia de TCR y la informacin
funcional
a partir de las mismas clulas individuales, fue publicado recientemente por Han et
al 9 Uso
la amplificacin por PCR anidada del TCR, en combinacin con ensayos para
17 marcadores del fenotipo, los autores pudieron al mismo tiempo
determinar el TCR exacta y lograr una clasificacin funcional en bruto
de las clulas de medicin. El anlisis recientemente, totalmente imparcial de
estado funcional en combinacin con la secuenciacin de TCR se ha convertido
es posible con el advenimiento de la secuenciacin de ARN de una sola clula.
Tenemos
desarrollado una estrategia computacional para reconstruir secuencias de TCR
a partir de datos transcriptmica de una sola clula de genoma completo
(Stubbington et al.)
y aplicado a murino clulas T CD4 + activadas durante un Salmonella
infeccin typhimurium. Nuestros resultados demostraron clona significativa

Heterogeneidad de las clulas de la tmica MDULA

Funcionalmente poblaciones divergentes de clulas raras tambin pueden surgir

como
resultado de la accin estocstica de genes que se expresan en similares
niveles en las clulas. Un ejemplo de tal proceso se ve en la
clulas epiteliales de la mdula tmica (MTEC). Estas clulas son cruciales
en purgar las clulas T autorreactivas y promover el desarrollo del timo
Las clulas T reguladoras por 'proyectar una sombra auto inmunolgica'
a travs de la expresin sistemtica de antgenos restringida tejidos (TRA). En
mTECs, the35 expresin del gen Aire, que codifica para autoinmune
protena reguladora, activa la transcripcin de un gran nmero de genes en
una, de manera independiente de la secuencia aparentemente estocstico, y su
resultados de delecin en autoimmunity.35 severa
Estudios recientes que explotan el potencial de la secuenciacin de una sola
clula tienen
por primera vez delineado sistemticamente la accin de AIRE en
mTECs. Brennecke et al36 han demostrado que, si bien cada uno de los
Aireinduced
genes se expresa por slo una pequea fraccin de las clulas Mtec,
En la poblacin general 11 distintos co-expresin de estos grupos de TRA
los genes pueden ser detectados, lo que indica un nivel hasta ahora desconocido
de
organizacin en este proceso aparentemente aleatorio. Adems, su
los datos junto con los resultados de assays37 objetivo anterior sugiere que
los mTECs seran la transicin de uno de los 11 grupos co-expresin
a la siguiente de manera escalonada y direccional. Tanto Brennecke et al.
y una publicacin de regreso a la espalda de Meredith et al.38suggested que la
la expresin de los genes de TRA Aire-dependientes se enriquece en
cromosmica
microclusters que se encuentran dispersos en todo el genoma. Notablemente,
Meredith et al. Adems, demostr que estos son microclusters
especfica a los individuos y compartido por mltiples clulas individuales. Dado
que la
genes en estas agrupaciones no ha dado motivos de reglamentacin detectables,
las
ms explicacin plausible para esto es un origen evolutivo comn,
es decir, las clulas con grupos TRA compartidos representan hijas de la
misma progenitora que fue sometido a una indujo AIRE-principios hereditarios
la activacin de las genes.38 TRA A la luz de estos resultados, es justificable
considerar el epitelio tmico como un mosaico de rara, funcionalmente
subpoblaciones especializadas, pero su desarrollo relacionados de la MTEC

Las clulas madre hematopoyticas

HSC tiene la capacidad de auto-renovacin y de diferenciarse en todo el
otras clulas sanguneas. Se derivan del mesodermo y residir
principalmente en el BM.39 BM-HSC representan slo una pequea fraccin de
BM clulas totales, lo que representa aproximadamente el 0,01% del total (Tabla
1).
Hematopoyesis es uno de los proceso de diferenciacin ms estudiado
tanto debido a la amplia disponibilidad de las clulas y debido a la
existencia de una jerarqua discreta de stages.40 diferenciacin Incluso
a pesar de que ha sido ampliamente estudiado, las clulas HSC han sido
errneamente
considerado por muchos aos una poblacin homognea de clulas con
comportamiento flexible. En la ltima dcada, una imagen completamente
diferente
ha surgido y las CMH se sabe ahora que es caracterizado por una gran
nivel de heterogeneity41,42 en mltiples aspectos, incluyendo su proliferativa
y el potencial de auto-renovacin, de 43 aos la vida til y tambin una
diferenciacin
preferencia hacia el linaje linfoide o mieloide el lineage.44
Por todas estas razones la secuenciacin de una sola clula se ha empleado en
los ltimos aos con el fin de arrojar ms luz sobre este intrnseca
heterogeneidad.
Tsang et al45 perfila la transcriptomes de 180 clulas en el ratn
compartimiento de HSC adultos y estudiado la estructura de perfil de expresin
y el papel de BCL11A. En primer lugar, ponen de relieve cmo las fluctuaciones
del ciclo celular es
la fuente principal de variacin de la transcripcin en el compartimiento de HSC.
En segundo lugar, Bcl11a- / - transcriptomic anlisis revel anormal
fenotipos proliferativas con reducida quiescencia, selfrenewal reducida
proliferacin potencial y superior, que era experimentalmente
confirmado por tincin con BrdU. Este estudio demuestra una vez ms el poder
transcriptmica de una sola clula en la diseccin de los procesos celulares y el
linaje
heterogeneidades en compartimentos de clulas madre.
Wilson et al.46 ndice de una sola clula empleada sorting, junto con
secuenciacin para analizar la firma molecular de HSC clasificado con cuatro
diferentes estrategias de purificacin. Esto permiti la construccin de una
lista de genes firma comn que puede ser el uso de un solo separada por la
HSCs ms probable funcionales.
De alto rendimiento cuantitativo PCR en tiempo real con sencillo en primaria
clulas madre de sangre y BM-HSC durante hematopoytica temprana
etapas de diferenciacin tambin han revelado que las diferentes poblaciones
se caracterizan por, pero el factor de transcripcin distintivo relacionada
estados de expresin
Otro estudio sobre el desarrollo de glbulos temprano en una sola clula
resolucin se ha centrado en los factores de transcripcin como reguladores
maestros
de fate.48 celular utilizando cuantitativa con transcripcin inversa-PCR, Moignard
y compaeros de trabajo analizaron 46 genes en las clulas de alrededor de 4000
5
poblaciones en 4 etapas secuenciales de ratn despus de la implantacin
desarrollo entre el da embrionario 7.0 y 8.25. combinaron
la expresin del gen perfiles con un enfoque computacional elegante
basado en mapas de difusin para la reduccin de la dimensionalidad y la red
sntesis a partir de las grficas de transicin de estados con el fin de determinar la
la estructura y funcin de las redes de regulacin transcripcional. los
anlisis mostr que la maduracin celular podra ser asncrono, con
las clulas individuales de maduracin a diferentes velocidades. Este estudio
demuestra
cmo modelado de la red a partir de clulas individuales puede ayudar a revelar la
jerarquas de transcripcin que controlan el desarrollo de los mamferos.
Desde el punto de vista de protemica, Bendall et al49 combin la
Unicelular citometra de masas con un algoritmo, llamado Wanderlust, a
alinear las clulas individuales de un linaje dado hacia una trayectoria jerrquica,
por lo tanto
la prediccin de la va de desarrollo. Este enfoque les permiti
realizar un examen en profundidad de la primeras etapas raras y transitorias de
desarrollo de clulas B e identificar las poblaciones previamente desconocidas de
progenitores de clulas B en base a la combinacin de expresin de CD34, CD38,
CD24 y TDT.

APLICACIN futuro de las tecnologas unicelular EN

Derivadas de sangre del HSC
Un porcentaje muy pequeo de clulas HSC son capaces de dejar el BM y
circular en el torrente sanguneo. Estas clulas se llaman sangre perifrica
madre cells.50 A pesar de su baja frecuencia extrema, ca. 1 por milln
clulas nucleadas, estas clulas progenitoras circulantes con clonognico
propiedades han sido de gran inters debido a su capacidad de
sustituto BM-HSC deriva en trasplantes para tratar a pacientes con
tipos de cncer y otros trastornos de la sangre y systems.51,52 inmune
Por otra parte, algunos estudios informaron que las clulas madre de sangre
perifrica son
no slo es capaz de diferenciarse en todos los linajes hematopoyticos, pero
tambin son capaces de diferenciarse en otros linajes de clulas, tales como
adipocitos, 53 lo que sugiere que estas clulas tienen un gran potencial para
aplicaciones en ingeniera de tejidos fuera del sistema hematopoytico.
Por desgracia, una coleccin de clulas madre de sangre perifrica adecuada es
una
pre-requisito para la mayora de sus aplicaciones clnicas.
Esas clulas son conocidos por ser extremadamente heterognea, pero debido a
su baja abundancia extrema, su heterogeneidad no ha sido todava
investigado adecuadamente.
Todas estas caractersticas hacen de las nuevas tecnologas unicelulares
extremadamente
valiosa para obtener una visin ms completa de estas clulas y para
analizar su heterogeneidad.
Inicialmente, la identificacin de nuevas dianas moleculares especficas para
la mejora de la movilizacin de clulas madre de sangre perifrica de la
BM sera crucial para aumentar la tasa de xito en la clnica
aplicaciones como en neoplasias hematolgicas avanzadas

OBSERVACIONES FINALES
En el contexto inmunolgico, las mediciones a granel han contribuido a la mayora
de nuestro conocimiento actual de la patognesis de la enfermedad y la
inmunidad, pero que no haba comunicado un cuadro detallado de los jugadores.
Cell a clula variacin, el gen co-regulacin transcripcional y redes no pueden ser
precisamente inferida por anlisis de la poblacin. En el sistema inmune, donde se
sabe que las clulas para mostrar un nivel muy alto de heterogeneidad, un anlisis
ms profundo de las fluctuaciones de la expresin gnica es de suma importancia
con amplias implicaciones para ambas bsica y clnica investigacin. A pesar de
los grandes avances que se han hecho en el pasado unos aos en el campo de la
tecnologa de clula nica, desarrollos adicionales de esas tcnicas sern muy
beneficioso con el fin de obtener una mayor la imagen de grano fino de todos los
eventos moleculares que conducen a la patognesis de condiciones mrbidas o
de la enfermedad. En particular, la capacidad de la secuenciacin de ARN
poliadenilado y ambos no microARN y pequeos ARN, la integracin del perfil de
transcriptmica con posicin de la clula en tres dimensiones, la estandarizacin
de tanto el experimental procedimiento y el anlisis computacional de la
elaboracin de perfiles de una sola clula sern los prximos pasos cruciales para
permitir un anlisis ms profundo tanto de la en estado estacionario y los
mecanismos de la enfermedad