EJERCICIOS CURVA DE TITULACIN DE ANTICUERPO

PARA REALIZAR UNA CURVA DE TITULACIN DE ANTICUERPOS RECUERTE QUE

A PARTIR DE LA SOLUCIN CONCENTRADA SE TOMAN ALCUOTAS QUE LUEGO
SE DILUYEN EN EL BUFFER RECOMENDADO POR EL FABRICANTE. DE LA MISMA
FORMA, CUANDO SE REALIZAN LOS LAVADOS DURANTE LA EJECUCIN DE LA
TCNICA INMUNOHISTOQUMICA, STOS DEBEN REALIZARSE CON BUFFER DE
LAVADO EQUIVALENTE AL BUFFER DE DILUCIN DE ANTICUERPOS. DEBE
SIEMPRE CONSIDERARSE LA CONCENTRACIN MOLAR O NORMAL Y EL RANGO
DE pH INDICADOS POR EL FABRICANTE.
AS, SI EL ANTICUERPO ES PREPARADO EN BUFFER FOSFATO, SE UTILIZA
BUFFER FOSFATO TANTO PARA LA CURVA DE TITULACIN COMO PARA LOS
PASOS DE LAVADOS; SI EL ANTICUERPO ES PREPARADO EN BUFFER TRIS, SE
UTILIZA BUFFER TRIS TANTO EN LA CURVA DE TITULACIN COMO PARA LOS
PASOS DE LAVADO.
CUANDO SE TIENE UN VIAL DE ANTICUERPOS CONCENTRADOS Y EL
FABRICANTE PROPORCIONA EL RANGO DE DILUCIONES DE TRABAJO
RECOMENDABLES, LA CURVA DE TITULACIN SE REALIZA TOMANDO EN
CONSIDERACIN AMBOS VALORES, Y DILUYENDO A PARTIR DE LA
CONCENTRACIN MAYOR (MENOS DILUDO) INDICADA HASTA LA
CONCENTRACIN MENOR (MS DILUDO).
CABE RECORDAR QUE LOS ANTICUERPOS CONCENTRADOS SE ALMACENAN EN
REFRIGERADOR ENTRE 4 A 8 GRADOS CELSIUS, SEGN RECOMENDACIN DEL
FABRICANTE.
SE RECOMIENDA ALICUOTAR EN TUBOS EPPENDORFF, EN VOLMENES DE 5 A
20 MICROLITROS, PARA AS NO GENERAR DAO POR DENATURACIN DE
ANTICUERPOS ASOCIADO A LOS CAMBIOS DE TEMPERATURA QUE
EXPERIMENTAN CADA VEZ QUE SE LES SACA DEL REFRIGERADOR. LAS
ALCUOTAS SE CONGELAN EN FREEZER ENTRE -10 Y -40 GRADOS CELSIUS,
PARA PRESERVARLOS MS TIEMPO.
ESTAS ALCUOTAS SERN LAS QUE SE UTILICEN PARA UNA CURVA DE
TITULACIN Y LUEGO STAS SE EMPLEARN PARA LA EJECUCIN DE LA
TCNICA INMUNOHISTOQUMICA.
LOS VOLMENES DILUIDOS EN LA CURVA DE TITULACIN SE PRESERVAN EN
CONGELACIN, PARA ASEGURAR UNA DURACIN MAYOR EN EL TIEMPO.
EL ANTICUERPO CONCENTRADO INDICA EN SU HOJA TCNICA LA
CONCENTRACIN EN MICRGRAMOS/DECILITRO O MICRGRAMOS/MILILITRO
DE INMUNOGLOBULINAS EN BUFFER.
RECUERDE QUE CUANDO SE SEALA QUE UN ANTICUERPO EST EN DILUCIN
1:X CORRESPONDE A QUE 1 MICROLITRO DE ANTICUERPO ES DILUIDO EN (X-
1)MICROLITROS DE BUFFER DE DILUCIN, SIENDO X EL VOLUMEN TOTAL
SUMADO DEL BUFFER CON EL ANTICUERPO.

DILUCIN 1:X= 1 L Ac+ (X-1) L BUFFER

AS, SI LA DILUCIN ES 1:100, ES UN MICROLITRO DE ANTICUERPO + 99

MICROLITROS DE BUFFER, LO QUE NOS DA 100 MICROLITROS TOTALES DE LA
SOLUCIN.
SI LA DILUCIN ES 1:125, CORRESPONDE A UN MICROLITRO DE ANTICUERPO +
124 MICROLITROS DE BUFFER, LO QUE NOS DA 125 MICROLITROS TOTALES DE
LA SOLUCIN.
SI LA DILUCIN ES 1:250, CORRESPONDE A UN MICROLITRO DE ANTICUERPO +
249 MICROLITROS DE BUFFER, LO QUE NOS DA 250 MICROLITROS TOTALES DE
LA SOLUCIN.
POR LO TANTO RECUERDE MULTIPLICAR POR EL VOLUMEN DE
ANTICUERPOS EN LA ALCUOTA EL VOLUMEN TOTAL A UTILIZAR
TAMBIN DE BUFFER.
SI POR EJEMPLO TIENE 5 MICROLITROS DE ANTICUERPO ALICUOTADOS
Y DEBE PREPARAR UNA DILUCIN 1:125, DEBER CONSIDERAR QUE EN
LUGAR DE 125 SERN 125x5=625 MICROLITROS EL VOLUMEN TOTAL.
POR LO TANTO LOS 5 MICROLITROS DE LA ALICUOTA SE DILUYEN EN
625-5=620 MICROLITROS DE BUFFER
EJERCITEMOS:
CUNTOS MICROLITROS DE BUFFER NECESITA PARA UNA DILUCIN DE
ANTICUERPOS DE 1:300 MICROLITROS SI TIENE UNA ALCUOTA CONCENTRADA
DE 8 MICROLITROS?
CUNTOS MICROLITROS DE BUFFER NECESITA PARA UNA DILUCIN DE
ANTICUERPOS DE 1:250 MICROLITROS SI TIENE UNA ALCUOTA CONCENTRADA
DE 14 MICROLITROS?
CUNTOS MICROLITROS DE BUFFER NECESITA PARA UNA DILUCIN DE
ANTICUERPOS DE 1:400 MICROLITROS SI TIENE UNA ALCUOTA CONCENTRADA
DE 5 MICROLITROS?
CUNTOS MICROLITROS DE ANTICUERPO CONCENTRADO NECESITA PARA UNA
DILUCIN DE ANTICUERPOS DE 1:375 MICROLITROS SI TIENE 3375
MICROLITROS DE BUFFER?
CUNTOS MICROLITROS DE ANTICUERPO CONCENTRADO NECESITA PARA UNA
DILUCIN DE ANTICUERPOS DE 1:200 MICROLITROS SI TIENE 1400
MICROLITROS DE BUFFER?
QU DILUCIN TIENE SI TOMA UNA ALCUOTA DE 12 MICROLITROS Y LA DILUYE
EN 588 MICROLITROS DE BUFFER?
QU DILUCIN TIENE SI TOMA UNA ALCUOTA DE 5 MICROLITROS Y LA DILUYE
EN 495 MICROLITROS DE BUFFER?

POR EJEMPLO, SI UN ANTICUERPO DE CONCENTRACIN 39 g/ml ES

PROPORCIONADO EN UN VIAL DE 100 MICROLITROS, SE TOMARN ALCUOTAS
5 A 10 MICRLITROS QUE SE PONDRN EN TUBOS EPPENDORFF. EL
ANTICUERPO EST PREPARADO EN BUFFER FOSFATO 0,1 M pH 7.4-7.6; PARA
ESE ANTICUERPO EL FABRICANTE RECOMIENDA DILUCIONES ENTRE 1:50 Y
1:800.
SUPNGASE QUE SE PREPARARON ALCUOTAS DE 10 MICROLITROS, LAS QUE
SE ALMACENARON EN TUBOS EPPENDORFF DE 200 MICRLITROS (EL VOLUMEN
DEL TUBO EPPENDORFF DEBE IDEALMENTE SER EL MENOR POSIBLE PARA
ATENUAR LOS EFECTOS DE LA SUBLIMACIN DEL BUFFER POR EFECTO DEL
FRO)
SI PARA ESE ANTICUERPO EL FABRICANTE RECOMIENDA DILUCIONES ENTRE
1:50 Y 1:800, SE PROCEDER DE LA SIGUIENTE MANERA:
PREPARAR BUFFER DE DILUCIN (EN ESTE CASO BUFFER FOSFATO 0,1 M pH
7.4) EN VOLUMEN SUFICIENTE PARA ALICUOTAR Y PARA LOS LAVADOS (POR
EJEMPLO, UN LITRO)
UNA DE LAS ALCUOTAS DE 10 MICROLITROS SE SACA DEL CONGELADOR
SE PREPARAN TUBOS EPPENDORFF DE VOLUMEN 1,5 mL Y SE ROTULAN DE
ACUERDO A LOS VALORES DE TITULACIN O DILUCIN QUE SE PROBARN (POR
EJEMPLO 1:50; 1:100; 1:200; 1:400; 1:800)
A CADA TUBO EPPENDORFF, CON EXCEPCIN DEL PRIMERO SE AGREGA POR
TANTO UN VOLUMEN SEMEJANTE DE BUFFER, EQUIVALENTE A LA MITAD DEL
VOLUMEN QUE CONTENDR DE CADA DILUCIN:
ENTENDIENDO QUE LA ALCUOTA DE ANTICUERPO CONCENTRADO SON 10
MICROLITROS, ENTONCES AL EPPENDORFF DE LA PRIMERA DILUCIN SE LE
COLOCAN 490 MICROLITROS DE BUFFER, Y A LOS DEMS 250 MICROLITROS DE
BUFFER.
A CONTINUACIN, AL PRIMER TUBO EPPENDORFF, SE LE PONDR LA ALCUOTA
DE 10 MICROLITROS DE ANTICUERPO CONCENTRADO, SE AGITAR Y
HOMOGENEIZAR CUIDADOSAMENTE, QUEDANDO AS PREPARADA LA
DILUCIN 1:50 (10 MICROLITROS DE ANTICUERPO + 490 MICROLITROS DE
BUFFER).
UNA VEZ HOMOGENEIZADO, SE TOMAN 250 MICROLITROS DE LA DILUCIN
1:50 Y SE AGREGAN AL SEGUNDO VIAL QUE CORRESPONDER A LA DILUCIN
1:100; SE AGITA Y HOMOGENEIZA Y LUEGO SE REPITE EL MISMO PASO DE
TOMAR 250 MICROLITROS Y AS SUCESIVAMENTE PASAR A LOS SIGUIENTES
VIALES, QUEDANDO AS PREPARADAS LAS DILUCIONES 1:100; 1:200; 1:400 Y
1:800.
OTRO MODO DE REALIZAR EL CLCULO PARA LA PREPARACIN DE DILUCIONES
DE ANTICUERPO SE BASA EN LA SIGUIENTE FRMULA:
CANTIDAD DE ANTICUERPO A UTILIZAR

VOLUMEN ANTICUERPO: 1/DILUCIN INICIAL X VOLUMEN FINAL

1/DILUCIN FINAL

CUNTO VOLUMEN DE ANTICUERPOS NECESITA PARA PREPARAR 900 L DE

DILUCIN DE TRABAJO 1/50? CONSIDERE QUE UNA DILUCIN INICIAL DE
ANTICUERPO DE (MEZCLADO A PARTES IGUALES CON GLICEROL):

VOLUMEN ANTICUERPO: 2 X 900 L = 36 L

50
CUNTO VOLUMEN DE ANTICUERPOS NECESITA PARA PREPARAR 900 L DE
DILUCIN DE TRABAJO 1/50? CONSIDERE QUE UNA DILUCIN INICIAL DE
ANTICUERPO DE (MEZCLADO A PARTES IGUALES CON GLICEROL):

CUNTO VOLUMEN DE ANTICUERPOS NECESITA PARA PREPARAR 600 L DE

DILUCIN DE TRABAJO 1/300? CONSIDERE QUE UNA DILUCIN INICIAL DE
ANTICUERPO DE 1/4 (MEZCLADO CON GLICEROL):

CUNTO VOLUMEN DE ANTICUERPOS NECESITA PARA PREPARAR 750 L DE

DILUCIN DE TRABAJO 1/250? CONSIDERE QUE UNA DILUCIN INICIAL DE
ANTICUERPO DE 1/3 (MEZCLADO CON GLICEROL):

CUNTO VOLUMEN DE ANTICUERPOS NECESITA PARA PREPARAR 850 L DE

DILUCIN DE TRABAJO 1/40? CONSIDERE QUE UNA DILUCIN INICIAL DE
ANTICUERPO DE 1/7 (MEZCLADO A PARTES IGUALES CON GLICEROL):

PARA UNA SOLUCIN DE TRABAJO DE 790 L, CUL SER SU DILUCIN FINAL

SI SE OBTUVO A PARTIR DE 23 L DE UNA DILUCIN INICIAL DE 1/8?:

QU VOLUMEN DE TRABAJO TENDR PARA UNA DILUCIN FINAL DE

ANTICUERPOS DE 1/350, SI TRABAJA A PARTIR DE UN VOLUMEN DE SI SE
OBTUVO A PARTIR DE 11,5 L DE UNA DILUCIN INICIAL DE 1/33?: