REACCIN DE LAS PEROXIDASAS Y ACTIVIDAD PSEUDOPEROXIDASA

a
Gmez J., b Rodrguez N., c Snchez M.
a
jvgc250@gmail.com , bnatisro09@hotmail.com, c marisanchez422@hotmail.com
Universidad ICESI, a, c Facultad de Ingeniera, Programa de Ingeniera Bioqumica,
b
Facultad de Ciencias Naturales, Programa de Qumica Farmacutica
Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia

pg. 1
 1. OBJETIVOS

Identificar la actividad peroxidasa en dos materiales biolgicos distintos, y definir si

esta actividad es enzimtica o no.
2. RESULTADOS

2.1 Procedimiento experimental

Para realizar la prctica de reaccin de las peroxidasas y actividad pseudoperoxidasa
se llev a cabo el procedimiento, tal como se describe en la gua de laboratorio.

2.2 Datos y clculos

Para el desarrollo de algunas pruebas fue necesaria la preparacin de una mezcla
compuesta por clara de huevo y agua destilada en una proporcin 1:3, la cual ser
llamada solucin A.

2.2.1 Datos de muestras nativas y desnaturalizadas

Se realizaron pruebas en muestras nativas y desnaturalizadas para determinar la
presencia de actividad peroxidasa en algunos alimentos. Para esto se tom una
pequea cantidad de muestra de los alimentos en tubos de ensayo, se disolvieron en
un poco de agua destilada y se les adicion perxido de hidrogeno y bencidina hasta
que la muestra mostrara un cambio de color. Las muestras desnaturalizadas fueron
sometidas a calor (Agente fsico desnaturalizante). Los resultados obtenidos en estas
pruebas se encuentran en las siguientes tablas.

Tabla 1. Datos para muestras nativas

TUB
FOTO INICIAL CONTENIDO FOTO OBSERVACIN
O

Sangre diluida + Coloracin inicial

3 gotas de transparente al agregar
S perxido de perxido de hidrogeno,
hidrogeno + 0,5 forma capa de espuma (~
mL de bencidina 5 cm) burbujas

Muestra de
espinaca + 3
gotas de
Se observa un
perxido de
E precipitado, y una capa de
hidrogeno + 0,5
burbujas (~1cm)
mL de bencidina
+ 0,5 mL de
bencidina
 1.
La muestra toma un
Muestra de color amarillo, se forma
zanahoria + 3 una capa de
gotas de espuma(~2cm). 2. Se
Z
perxido de observa un precipitado de
hidrogeno + 0,5 color caf oscuro.
mL de bencidina

R
1.
Observado tras aadir 3 gotas de perxido de hidrgeno.
2.
Observado tras aadir 0.5mL de bencidina.

Tabla 2. Datos para muestras nativas con bencidina en diferentes componentes.

TUBO CONTENIDO
S Coloracin inicial
Sangre diluida + 3
gotas de perxido de
hidrogeno + 0.5 mL de
bencidina
E
Muestra de espinaca +
3 gotas de perxido de
hidrogeno + 0.5 mL de
bencidina
FOTO OBSERVACIN
transparente al agregar
perxido de hidrogeno,
forma capa de espuma (~ 5
cm), despus de agregar la
bencidina disminuyen
burbujas y toma coloracin
oscura casi negro.
Se observa un precipitado,
y una capa de burbujas
(~2cm), despus de un
minuto toma coloracin
verde oscura

Tabla 2. Datos para muestras desnaturalizadas.

TUBO CONTENIDO FOTO OBSERVACIN
S DES Sangre diluida + 3 Coloracin rojo claro con
gotas de perxido de presencia de burbujas en la
 hidrogeno + agente
fsico desnaturalizante superficie
(calor)

Muestra de espinaca +
3 gotas de perxido de Se observan dos fases, y
E DES hidrogeno + agente en la parte superior
fsico desnaturalizante presencia de burbujas
(calor)

Muestra de zanahoria
Se evidencia un cambio de
+agente fsico
color en la muestra. Es
desnaturalizante
Z DES soluble.
(calor) + 3 gotas de
perxido de hidrgeno
+ 0,5 mL de bencidina.
R DES

3. DISCUSIN
Las peroxidasas son un grupo de enzimas encargadas de eliminar el perxido de
hidrogeno (H2O2). Este compuesto que es txico para la mayora de los organismos,
el perxido de hidrogeno se ve descompuesto en molculas de agua (H 2O) y oxigeno
(O2) bajo la actividad de las peroxidasas.

Las peroxidasas estn ampliamente distribuidas en plantas, catalizan la oxidacin de

varios fenoles donadores de electrones en presencia de perxido de hidrgeno,
generando radicales libres que reaccionan entre s y producen dmeros. Algunas de
las funciones fisiolgicas de las peroxidasas en las plantas son: su participacin en la
biosntesis del etileno, la defensa contra infecciones, en la curacin de heridas y en la
lignificacin de la pared celular.1

En esta prctica se analiz la presencia de peroxidasas en algunos componentes

tales como la sangre, la zanahoria, la espina y el rbano. El ltimos, tiene como
peroxidasa a la horsderadish peroxidase o tambin conocida como HRP, la que posee
un gran potencial de conjugacin con inmunoglobulinas y su facilidad para ser
observada en pruebas colorimtricas2. En las muestras de los vegetales slo se utiliz
el extracto, ya que en este se encuentra la mayor concentracin de enzimas, evitando
que otras protenas presentes en los vegetales puedan afectar la actividad de la
enzima.

Inicialmente se agreg perxido de hidrogeno (H 2O2) a cada una de las muestras, al

aadir unas gotas de ste, se observaron capas de burbujas. Esto se debe a que al
mezclar el perxido de hidrogeno, con las muestras que presentan actividad
peroxidasa, se cataliza la oxidacin de sustratos acoplados a la reduccin del H 2O2,
formando H2O y O2, el desprendimiento de este oxigeno es el que genera el burbujeo 3.

Al agregarle perxido de hidrogeno a la muestra de sangre se observ una capa de

espuma que subi casi hasta la mitad del tubo de ensayo, esto se pueden atribuir
principalmente a la presencia de la enzima peroxidasas que como se mencion
anteriormente desprende oxgeno en forma de espuma o burbujas. Posteriormente al
agregarle la bencidina se pudo observar un cambio en la coloracin, inicialmente fue
transparente, redujo totalmente la espuma y en este caso se form una leve capa de
burbujas; despus de dos minutos la muestra tom una coloracin oscura casi negro.
El grupo hemo de la hemoglobina (Figura 2) posee esa actividad enzimtica, que
puede catalizar la ruptura del perxido de hidrgeno. Mientras no estn presentes
otras sustancias orgnicas oxidantes, esta actividad de la hemoglobina, descompone
el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, que al reaccionar con la bencidina la
oxidarn formando un compuesto intenso4, de ah la coloracin que tom a medida
que transcurra el tiempo.

La teora plantea que la bencidina al entrar en contacto con la solucin de sangre y

perxido de hidrogeno debe tomar una coloracin azul intensa, lo cual es un indicador
de oxgeno, sin embargo, nuestra muestra no present tal coloracin y tal como se
presenta en la tabla 2 (Datos para muestras nativas con bencidina en diferentes
componentes), nuestro resultado fue una coloracin oscura casi negra; esto se pudo
haber presentado debido a factores que contaminaran la muestra, otra de las causas
pudo haber sido la poca cantidad de muestra pura que obtuvimos y que se diluy en
agua destilada.
La bencidina es un indicador analtico para determinar oxidantes, puesto que en
presencia de un oxidante se oxida por prdida de dos protones y dos electrones, a
esto se le denomina meriquinoidea; es decir, que presenta un color azul, por lo tanto,
en presencia de un oxidante cambia de color, lo que permite determinar si hay
presencia de oxidantes como la peroxidasa y el grupo hemo de la hemoglobina. 5

Figura 1. Estructura bencidina Figura 2. Estructura del grupo hemo

Por otro lado, en la muestra de vegetales (Rbano, espinaca y zanahoria) se pudo

determinar la presencia de actividad peroxidasas, ya que estas son necesarias para
descomponer el perxido de hidrogeno, dado que si se genera un exceso puede
causar anormalidades y dao mutagnico. La descomposicin del perxido produce
daos al ADN y membranas celulares.
En la espinaca una vez se agreg la bencidina en la muestra nativa se observ un
cambio en la coloracin pasando de verde intenso a un verde oscuro casi negro, que
da cuenta de la actividad enzimtica por parte de las peroxidasas.
 En la muestra de zanahoria al agregar la bencidina, se evidenci un cambio en la
coloracin (amarillo a naranja) y la formacin de dos fases, una lquida y una slida
(precipitado) de color caf oscuro.

Ac se pone lo de las nativas y el fundamento de cada

uno
En la desnaturalizacin de protenas se utiliz como agente desnaturalizante el calor,
las muestras se dispusieron en un bao mara a una temperatura de 150
aproximadamente durante 10 minutos en ebullicin. Si en una disolucin de
protenas se producen variaciones bruscas de temperatura, la solubilidad de
las protenas puede verse reducida hasta el punto de producirse su
precipitacin. Esto se debe a que los enlaces que mantienen la conformacin
globular se rompen y la protena adopta la conformacin filamentosa. De
este modo, la capa de molculas de agua no recubre completamente a las
molculas proteicas, las cuales tienden a unirse entre s dando lugar a
grandes partculas que precipitan. Las protenas que se hallan en ese estado
no pueden llevar a cabo la actividad para la que fueron diseadas, en
resumen, no son funcionales6. Esta desnaturalizacin se pudo observar en las
diferentes pruebas, ya que en la mayora de estas se generaron dos fases
notorias, tal como se reporta en la tabla 3 ( Datos para muestras
desnaturalizadas.) Sin embargo, la muestra de sangre no precipit, ya que la
hemoglobina es termoestable, resistiendo temperaturas elevadas, con lo cual
mantienen la actividad pseudoperoxidasa.

4. CONCLUSIONES

Se reconocieron protenas en los alimentos utilizados en la prctica

5. BIBLIOGRAFA
1. http://bioprodin.com/files/services_peroxidasa_es.pdf
2. . http://tauja.ujaen.es/handle/10953.1/3931
3 http://www2.vernier.com/sample_labs/CMV-03-enigma.pdf

4. http://www.uv.es/acastell/1.-Introduccion.pdf

5.. MACARULLA Jos, GOI Flix. 1994. Bioqumica Humana. Segunda

edicin. Revert.
6. http://pendientedemigracion.ucm.es/info/analitic/Asociencia/DesnatProteinas.pdf