Вы находитесь на странице: 1из 51

REKAYASA GENETIKA

1. Pengertian Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika adalah suatu teknik bioteknologi yang digunakan untuk


mentransfer gen dari suatu organisme ke organisme lain untuk mendapatkan
produk baru dengan cara membuat DNA Rekombinan.

DNA Rekombinan adalah DNA yang urutannya telah direkombinasikan agar


memiliki sifat- sifat atau fungsi yang kita inginkan sehingga organisme
penerimanya mengekspresikan sifat atau melakukan fungsi yang kita inginkan.
Misalnya, kita membuat DNA rekombinan yang memiliki fungsi membuat insulin.
DNA ini kemudian kita masukan ke dalam bakteri dengan harapan bakteri
tersebut dapat menghasilkan insulin. DNA rekombinan dilakukan melalui
penyisipan gen dengan plasmid sebagai vektornya/ kendaraan pemindah.

Adapun teknik pembuatan DNA rekombinan adalah sebagai berikut:

Teknik mengisolasi DNA;

Teknik memotong DNA dengan menggunakan enzim retriksi endonuklease;

Teknik menggabung/ menyambung DNA dengan menggunakan enzim ligase;

Teknik memasukkan DNA kedalam sel hidup (vektor)

Vektor berkembang dengan sisipan DNA yang direkayasa.

Dua komponen utama yang terlibat di dalam rekayasa genetika, yaitu plasmid
dan enzim.

1) Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA berantai rangkap dan berbentuk cincin. Plasmid
ditemukan didalam sel bakteri dan dapat berbiak secara bebas, lepas dari
kromosom induk. Dalam rekayasa genetika, plasmid berperan sebagai vektor
(kendaraan) yang digunakan untuk mentransfer dan memperbanyak gen asing.

Keuntungan penggunaan plasmid adalah dapat di pindahkan dari satu sel ke sel
yang lain, misalnya melalui cara transformasi. Ketika satu gen asing (biasanya
diekstrak dari satu kromosom sel eukariotik) telah disisipkan ke dalam satu
plasmid, ia akan bertindak seperti kendaraaan yang mengangkut gen ke dalam
sel bakteri. Plasmid yang membawa gen tersebut siap di absorpsi dan di
replikasikan oleh bakteri sehingga setiap anakan sel yang dihasilkan akan
mewarisi gen- gen baru. Selanjutnya, setiap bakteri didalam kultur gen- gen
akan menginstruksi, misalnya hasilkan hormon insulin manusia.

Adapun beberapa cara pemindahan DNA diantaranya adalah:


Konjugasi: pemindahan DNA dalam sel bakteri melalui kontak fisik antar kedua
sel.

Transformasi: pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan sekitarnya.

Transduksi: pemindahan DNA daribsatu sel ke sel lainnya melaui perantara

2) Enzim

Dalam rekayasa genetika dikenal dua macam bahan kimia yang berperan
penting. Kedua macam bahan kimia tersebut adalah enzim pemutus (retriksi
endonuklease) dan enzim perekat (ligase).

Enzim retriksi endonuklease merupakan enzim khusus dari bakteri yang berguna
sebagai alat pertahanan tubuh. Misalnya untuk melawan DNA asing yang
menyusup masuk, seperti yang berasal dari virus. Dalam dunia rekayasa
genetika, enzim tersebut bertindak sebagai gunting biologi yang berfungsi untuk
memotong/ menggunting rantai DNA pada tempat- tempat khusus. Enzim retriksi
endonuklease memiliki dua keutamaan. Pertama, memiliki fungsi kerja spesifik.
Dalam hal ini enzim mampu mengenal dan memotong urutan nukleotida tertentu
pada DNA. Kedua, mampu menghasilkan potongan- potongan runcingketika
memotong rantai ganda DNA. Fragmen- fragmen yang dihasilkannya adalah
berupa ujung runcing (ujung lengket) yang terdiri atas untaian tunggal. Setiap
ujung dari fragmen memiliki bagian yang menjorok dengan urutan basa yang
dapat dikenali dan dipasangi oleh basa yang terletak di ujung untaian lainnya.
Misalnya, ujung untaian tunggal dengan urutan basa AATT pada satu ujung dan
TTAA pada ujung yang lain. Kedua fragmen tersebut dapat disambungkan
sehingga membentuk satu untaian nukleotida lagi. Dalam hal ini, enzim
ligase berfungsi untuk merekatkan dan mempersatukan fragmen- fragmen/
potongan- potongan DNA.

2. Teknik- teknik Rekayasa Genetika

a) Teknik Plasmid Rekayasa Genetika

Melalui teknk plasmid dalam rekayasa genetika, para ahli dibidang bioteknologi
dapat mengembangkan tanaman transgenik yang resisten terhadap hama dan
penyakit, adaptif kekeringan dan kondisi tanah yang tidak subur, hewan
transgenik dan lain- lain.
Gambar. Rekayasa genetika dengan plasmid bakteri

b) Teknik Hibridoma

Teknik hibridoma adalah penggabungan dua sel dari organisme yang sama
ataupun dari sel organisme yang berbeda sehingga menghasilkan sel tunggal
berupa sel hibrid (hibridoma) yang memiliki kombinasi sifat dari kedua sel
tersebut.

Contoh teknik hibridoma adalah pembuatan antibodi monoklonal. Antibodi


monoklonal adalah antibodi yang diperoleh dari suatu sumber tunggal atau sel
klon yang hanya mengenal satu jenis antigen.

Pembentukan antibodi monoklonal dilakukan dengan menggunakan kelinci atau


tikus. Langkah pertama adalah menginjeksikan antigen ke tubuh kelinci atau
tikus percobaan, kemudian limpanya dipisahkan. Selanjutnya dilakukan
peleburan sel- sel limpa dengan sel- sel mieloma (sel- sel kanker). Sekitar 1%
dari sel limpa adalah sel plasma yang menghasilkan antibodi. Sedangkan 10%
sel hibridoma akhir terdiri dari sel yang menghasilkan antibodi. Setiap sel
hibridoma hanya menghasilkan 1 antibodi.

Disini teknik seleksi dikembangkan untuk mengidentifikasi sel hibridoma,


kemudian dilakukan pengembangan atau pengklonan berikutnya. Klon yang
diperoleh dari hibridoma berupa antibodi monoklonal. Antibodi monoklonal dapat
disimpan beku, kemudian dapat diinjeksikan ke dalam tubuh hewan atau
dibiakkan dalam suatu kultur untuk menghasilkan antibodi dalam jumlah besar.
Gambar. Tehnik pembuatan antibodi monoklonal oleh Kohler dan Milstein

Kegunaan antibodi monoklonal:

Para ilmuwan berharap dapat menggunakan antibodi monoklonal dalam


pemgobatan kanker.

Untuk mendeteksi kandungan hormon korionik gonadotropin (HCG) dalam


urine wanita hamil.

Untuk mengikat racun dan menonaktifkannya, contohnya racun tetanus dan


kelebihan obat digoxin dapat dinonaktifkan oleh antibodi ini.

Mencegah penolakan jaringan terhadap sel hasil transplantasi jaringan lain.

a) Teknik Terapi Genetik

Terapi gen diartikan sebagai upaya memperbaiki atau mengganti gen- gen yang
menyebabkan suatu penyakit. Terapi ini dilakukan dengan mengganti gen- gen
yang tidak dapat bekerja dengan salinan gen yang normal ke dalam sel. Pada
pertengahan tahun 1990, terapi genetik untuk mengobati penyakit menurun dan
kanker kulit ganas.

Para ahli berusaha melawan gen- gen perusak dalam inti sel itu dengan berbagai
cara, upaya yang dirintis tersebut dikenal dengan terapi genetik. Sayangnya
penemuan itu tidak segera dapat diterapkan. Dalam rekayasa genetika ada kode
etik yang melarang keras percobaan ini pada manusia. Rekayasa ini
dikhawatirkan disalahgunakan untuk mengubah gen pembawa sifat manusia,
misalnya untuk membuat manusia super.

Namun para ahli tidak selamanya bersikap kaku sebab berbagai penyakit fatal
memang susah disembuhkan kecuali dengan terapi genetik. Maka munculah
pendapat tentang perlu adanya dispensasi. Dispensasi itu dikeluarkan oleh
Komite Rekayasa Genetik Nasional Institut of Healt (NIH) di Amerika Serikat yang
mengizinkan penerapan terapi genetik untuk dua jenis penyakit yaitu penyakit
menurun yang sangat jarang seperti Adenosine Deaminase Deficiency (ADD) dan
sejenis kanker kulit yang ganas.

ADD adalah kelainan yang menyebabkan penderitanya tidak memiliki daya


tahan tubuh sama sekali. Kontak dengan kuman apapun akan menyebabkan
kematian. Rusaknya kekebalan pada ADD terjadi akibat sel- sel darah tidak
mampu memproduksi enzim Adenosine Deaminase (AD) yang diperlukan untuk
membangun daya tahan tubuh.

b) Teknik Kloning

Kloning berasal dari kata Yunani kuno, clone yang berarti ranting atau
cangkokan. Dalam bahasa Inggris,clone (klona) digunakan untuk menyebut
sekelompok makhluk hidup yang dilahirkan tanpa proses seksual. Istilah clone
(klona) pertama diusulkan oleh Herbert Webber pada tahun 1903. Kloning dapat
dilakukan dengan transfer gen, transfer embrio dan transfer inti. Organisme hasil
kloning akan memiliki salinan genetika yang sama persis dengan makhluk hidup
yang lain.

1. Transfer Gen

Kloning ini dilakukan dengan menyisipkan potongan gen yang dikehendaki dari
suatu spesies lain sehingga spesies ke spesies lain sehingga spesies yang di klon
tadi akan memiliki sifat tambahan sesuai dengan gen yang telah di sisipkan ke
dalam sel tubuhnya.

2. Transfer Embrio

Transfer embrio ini dilakukan dengan jalan mengambil ovum kemudian


membuahinya dengan sperma, setelah terjadi zigot yang akan berkembang
menjadi embrio, embrio- embrio ini di transfer atau ditanam dalam rahim
individu betina sampai lahir menjadi individu dewasa.

3. Transfer Inti

Prinsip dari transfer inti yaitu dengan memasukkan inti sel (nukleus) dari satu
spesies ke dalam sel spesies lain yang sebelumnya inti selnya telah dibuang atau
dikosongkan.

Pada tahun 1952, Robert Brigs dan Thomas J. King (AS) mencoba teknik kloning
pada katak. Sepuluh tahun kemudian (1962), John B. Gurdon juga mencoba
teknik kloning pada katak, namun prcobaannya menghasilkan banyak katak
yang abnormal atau cacat. Gurdon kemudian menyempurnakan percobaannya
sehingga menghasilkan banyak katak yang tumbuh normal dan berkembang
menjadi dewasa.

Pada tahun 1986, Steen Wikkadsen (Inggris) mengklona sapi dengan tujuan
komersial dengan metode transfer inti. Ia bekerja sama dengan Lembaga
Grenada Genetics.

Pada tahun 1996, Ian Wilmut mengklona domba. Ia menggunakan sel kelenjar
susu domba finn dorsetsebagai donor inti dan sel telur domba blackface sebagai
resipien. Sel telur domba blackface dihilangkan intinya dengan cara mengisap
nukleusnya keluar dari sel menggunakan pipet mikro. Kemudian, sel kelenjar
susu dombafinn dorset difusikan dengan sel telur blackface yang tanpa nukleus.
Hasil fusi ini kemudian berkembang menjadi embrio dalam tabung percobaan
dan kemudian dipindahkan ke rahim domba blackface. Kemudian embrio
berkembang dan lahir dengan ciri- ciri sama dengan finn dorset. Domba hasil
kloning ini diberi nama Dolly. Dolly disuntik mati pada tanggal 14 februari 2003
karena menderita penyakit yang sulit disembuhkan.

Perlu diperhatikan bahwa Wilmut melakukan 277 percobaan kloning dan dari
sekian banyak percobaan, hanya 29 yang berhasil menjadi embrio domba yang
dapat ditransplantasikan ke rahim domba, dan hanya satu yang menjadi domba
normal. Dengan demikian, tingkatkeberhasilan kloning domba masih sangat
rendah (Purves et al. 2004).

Gambar. Teknik cloning yang dilakukan untuk menghasilkan domba Dolly

http://edu-bio.blogspot.co.id/2012/01/rekayasa-genetika.html
2.1 Pengertian Rekayasa Genetika

Rekayasa genetika atau rekombinan DNA adalah kumpulan teknik-teknik


eksperimental memungkinkan peneliti untuk mengisolasi, mengidentifikasi, dan
melipatgandakan suatu fragmen dari materi genetika (DNA) dalam bentuk
murninya.Pemanfaatan teknik genetika di dalam bidang pertanian diharapkan
dapat memberihkan sumbangan,baik dalam membantu memahami mekanisme-
mekanisme dasar proses metabolisme tanaman maupun dari segi aplikasi
praktis seperti pengembangan tanaman-tanaman pertanian dengan sifat
unggul .Yang disebut terakhir bisa berupa pengklonan dan pemindahan gen-gen
penyandi sifat-sifat ekonomis penting pada tanaman,maupun pemanfaatan klon-
klon DNA sebagai masker (penanda) di dalam membantu meningkatkan efisiensi
seleksi dalam program pemulihan tanaman.

Keunggulan rekayasa genetika adalah mampu memindahkan materi genetika


dari sumber yang sangat beragam dengan ketepatan tinggi dan terkontrol dalam
waktu yang lebih singkat. Melalui proses rekayasa genetika ini, telah berhasil
dikembangkan berbagai organisme maupun produk yang menguntungkan bagi
kehidupan manusia.

Teknologi khusus yang digunakan dalam rekayasa genetika meliputi teknologi


DNA Rekombinan yaitu pembentukan kombinasi materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga
memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam
suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang.

2.2 Manfaat Rekayasa Genetika

1. Untuk mengurangi biaya dan meningkatkan penyediaan sejumlah besar


bahan yang sekarang di gunakan di dalam pengobatan, pertanian dan industri.

2. Untuk menggembangkan tanaman tanaman pertanian yang bersifat


unggul namun secara praktis.

3. Untuk menukar gen dari satu organisme kepada organisme lainnya


,menginduksi sel untuk membuat bahan-bahan yang sebelumnya tidak pernah
dibuat.

2.3 Prinsip dan Teknik Dasar Kloning DNA

Dasar dari pengembangan teknologi DNA Rekombinan adalah ditemukannya


mekanisme seksual pada bakteri yang telah dibuktikan pada tahun 1946.
Konsekuensi dari mekanisme seksual adalah:

1. Menyebabkan terbentuknya kombinasi gen-gen yang berasal dari dua sel yang
berbeda.
2. Terjadi pertukaran DNA atau gen dari satu sel ke sel yang lain. Mekanisme
seksual ini tidak bersifat reproduktif atau tidak menghasilkan keturunan.

Asam nukleat yang merupakan sumber informasi genetika didalam setiap


sel,adalah molekul yang bisa dimanipulasi .Ada dua macam asam nucleat yaitu
asam ribonucleat :Asam ribonucleat ( RNA ) dan asam deoksiribonucleat (DNA).

Asam nukleat adalah molekul besar berupa utas rantai yang panjang.Rantai
asam nukleat disusun ole(fragmen) DNA organisme komponen-komponen yang
terdiri dari :

1. Gula pentosa berkarbon 5 ( yaitu gula ribosa pada RNA,dan gula


Deoksiribosa pada DNA)

2. Gugus fosfat (PO4-2)

3. Basa

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri dapat melalui tiga
cara, yaitu konjugasi, transformasi, dan transduksi. DNA yang masuk ke dalam
sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan DNA atau kromosom bakteri
sehingga terbentuk kromosom rekombinan.

a. Konjugasi merupakan perpindahan DNA dari satu sel (sel donor) ke dalam
sel bakteri lainnya (sel resepien) melalui kontak fisik antara kedua sel. Sel donor
memasukkan sebagian DNA-nya ke dalam sel resepien. Transfer DNA ini melalui
pili seks yang dimiliki oleh sel donor. Sel resepien tidak memiliki pili seks. DNA
dari sel resepien berpindah ke sel resipien secara replikatif sehingga setelah
proses ini selesai, sel jantan tidak kehilangan DNA. Ke dua sel tidak mengalami
peningkatan jumlah sel dan tidak dihasilkan sel anak. Oleh karena itu, proses
konjugasi disebut juga sebagai proses atau mekanisme seksual yang tidak
reproduktif.

b. Transformasi merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di


sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa
potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri yang lain atau
organisme yang lain. Masuknya DNA dari lingkungan ke dalam sel bakteri ini
dapat terjadi secara alami. Pada tahun 1928 ditemukan strain bakteri yang tidak
virulen dapat berubah sifatnya menjadi virulen disebabkan adanya strain yang
tidak virulen dicampur dengan sel-sel bakteri strain virulen yang telah dimatikan.
Tahun 1944 ditemukan bahwa perubahan sifat atau transformasi dari bakteri
yang tidak virulen menjadi virulen disebabkan oleh adanya DNA dari sel bakteri
strain virulen yang masuk ke dalam bakteri strain yang tidak virulen.

c. Transduksi adalah cara pemindahan DNA dari satu sel ke dalam sel lainnya
melalui perantaraan bakteriofage. Beberapa jenis virus berkembang biak di
dalam sel bakteri. Virus-virus yang inangnya adalah bakteri sering disebut
bakteriofag atau fage. Ketika virus menginfeksi bakteri, fage memasukkan DNA-
nya ke dalam sel bakteri. DNA tersebut kemudian akan bereplikasi di dalam sel
bakteri atau berintegrasi dengan kromosom baketri. DNA fage yang dikemas
ketika membentuk partikel fage baru akan membawa sebagian DNA bakteri yang
menjadi inangnya. Selanjutnya jika fage tersebut menginfeksi bakteri yang lain,
maka fage akan memasukkan DNAnya yang sebagian mengandung DNA sel
inang sebelumnya. Jadi, secara alami fage memindahkan DNA dari satu sle
bakteri ke bakteri yang lain.

Unsur-unsur yang esensial diperlukan dalam kloning DNA adalah:

1. Enzim retraksi (enzim pemotong DNA)

2. Kloning vektor (pembawa)

3. Enzim ligase yang berfungsi menyambung rantai DNA

Adapun proses-proses dasar dalam kloning DNA meliputi :

1. Pemotongan DNA (DNA organisme yang diteliti dan DNA vektor)

2. Penyambungan potongan-potongan (fragmen) DNA organisme dengan DNA


vektor menggunakan enzim ligase

3. Transformasi rekombinan DNA (vektor + DNA sisipan) ke dalam sel


bakteriEschericia coli.

4. Seleksi (screening) untuk mendapatkan klon DNA yang diinginkan.

2.3.1 Perangkat teknologi DNA rekombinan

Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan


diantaranya enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk
menyambung DNA, vektoruntuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam
sel hidup dimana vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid dan
bakteriofag, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang
telah diklonkan, serta enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan
RNA (cDNA).

A. Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan enzim yang memotong molekul DNA. Karena enzim ini
memotong di bagian dalam molekul DNA, maka enzim ini juga
dinamakanendonuklease restriksi. Enzim ini memotong (menghidrolisis) DNA
pada rangka gula-fosfat tepatnya pada ikatan fosfodiester. Enzim restriksi akan
mengenali dan memotong DNA hanya pada urutan nukleotida tertentu, biasanya
sepanjang 4 hingga 6 pasang basa.

Enzim restriksi memiliki beberapa karakteristik, diantaranya:


a. Enzim restriksi mengenali urutan nukleotida spesifik.

b. Enzim restriksi memotong ikatan fosfodiester diantara basa spesifik, satu di


setiap helai DNA.

c. Hasil dari masing-masing reaksi tersebut yakni dua buah fragmen DNA
untai ganda.

d. Enzim restriksi tidak membeda-bedakan antara DNA yang berasal dari


organisme yang berbeda.

e. Sebagian besar enzim restriksi akan memotong DNA yang mengandung


urutan pengenalan mereka, tidak mempermasalahkan sumber DNA tersebut.

f. Enzim restriksi merupakan bagian alami dari sistem pertahanan bakteri.

Enzim retriksi disebut juga endonuklease. Enzim-enzim ini memotong rantai


ganda DNA pada tempat-tempat tertentu. Cara kerja enzim restriksi adalah
dengan mengenal sekuens (urutan basa) tertentu pada DNA, kemudian baru
melakukan pemotongan.

Ada tiga golongan enzim restriksi yang telah diketahui,yaitu enzim restriksi
golongan I, golongan II, dan golongan III. Enzim restriksi golongan I bekerja
dengan mengenal sekuens tertentu pada DNA, tetapi melakukan pemotongan di
luar (di sekitar) sekuens pengenal tersebut. Enzim restriksi yang berguna pada
prosedur kloning DNA adalah enzim restriksi dari golongan II karena golongan ini
memotong DNA pada posisi yang tertentu di dalam sekuens pengenal tadi.Enzim
restriksi golongan tiga memiliki cara kerja yang mirip dengan golongan I, dimana
pemotongan yang tidak spesifik dilakukan di sekitar sekuens pengenalnya.

Nama dari suatu enzim restriksi biasanya diambil dari nama bakteri asal enzim
tersebut diisolasi.Bakteria umumnya mensintesis satu atau lebih endonuklease
yang dapat memotong DNA.Endonuklease atau enzim restriksi ini berfungsi
terutama mengahalangi adanya DNA-DNA asing yang masuk ke dalam sel
bakteri tersebut. DNA dari sel yang mensintesis enzim restriksi itu sendiri
terlindungi dari aksi enzim restriksinya karena sel tersebut juga mensintesis
enzim modifikasi yang merubah struktur dari sekuens pengenal enzim restriksi
tadi.

Adapun tabel di bawah ini menunjukkan jenis-jenis enzim restriksi yang biasa
digunakan dalam teknologi DNA Rekombinan:

Enzim Sumber Sekuens Situs pemotongan


Mikroorganisme pengenal

EcoRI Escherichia coli 5GAATTC 5---G AATTC---3

3CTTAAG 3---CTTAA G---5

EcoRII Escherichia coli 5CCWGG 5--- CCWGG---3


3GGWCC

3---GGWCC---5

BamHI Bacillus 5'GGATCC 5'---GGATCC---


amyloliquefacien
s 3'CCTAGG 3'

3'---CCTAG G---

5'

HindIII Haemophilus 5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3'

Influenzae 3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5'

TaqI Thermus 5'TCGA 5'---T CGA---3'


aquaticus
3'AGCT 3'---AGC T---5'

NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC 5'---GC GGCCGC-

3'CGCCGGCG --3'

3'---CGCCGG CG-

--5'

HinfI Haemophilus 5'GANTCA 5'---G ANTC---3'


influenzae
3'CTNAGT 3'---CTNA G---5'

Sau3A Staphylococcus 5'GATC 5'--- GATC---3'


aureus
3'CTAG 3'---CTAG ---5'

PovII* Proteus vulgaris 5'CAGCTG 5'---CAG CTG---3'

3'GTCGAC 3'---GTC GAC---5'

SmaI* Serratia 5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3'


marcescens
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'

HaeIII* Haemophilus 5'GGCC 5'---GG CC---3'

Aegyptius 3'CCGG 3'---CC GG---5'

HgaI[33] Haemophilus 5'GACGC 5'---NN NN---3'


gallinarum
3'CTGCG 3'---NN NN---5'

AluI* Arthrobacter 5'AGCT 5'---AG CT---3'


luteus
3'TCGA 3'---TC GA---5'
EcoRV* Escherichia coli 5'GATATC 5'---GAT ATC---3'

3'CTATAG 3'---CTA TAG---5'

EcoP15I Escherichia coli 5'CAGCAGN25NN 5'---

3'GTCGTCN25NN CAGCAGN25NN --

-3'

3'---GTCGTCN25

NN---5'

KpnI[34] Klebsiella 5'GGTACC 5'---GGTAC C---3'


pneumoniae
3'CCATGG 3'---C CATGG---5'

PstI[34] Providencia 5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3'


stuartii
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5'

SacI[34] Streptomyces 5'GAGCTC 5'---GAGCT C---3'

Achromogenes 3'CTCGAG 3'---C TCGAG---5'

SalI[34] Streptomyces 5'GTCGAC 5'---G TCGAC---3'


albus
3'CAGCTG 3'---CAGCT G---5'

ScaI[34] Streptomyces 5'AGTACT 5'---AGT ACT---3'

Caespitosus 3'TCATGA 3'---TCA TGA---5'

SpeI Sphaerotilus 5'ACTAGT 5'---A CTAGT---3'


natans
3'TGATCA 3'---TGATC A---5'

SphI[34] Streptomyces 5'GCATGC 5'---G CATGC---3'

Phaeochromogen 3'CGTACG 3'---CGTAC G---5'


es

StuI[35][36] Streptomyces 5'AGGCCT 5'---AGG CCT---3'

Tubercidicus 3'TCCGGA 3'---TCC GGA---5'

XbaI[34] 5'TCTAGA 5'---T CTAGA---3'

Xanthomonas 3'AGATCT 3'---AGATC T---5'


badrii

B. Enzim DNA Ligase


DNA ligase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara ujung 5-fosfat dan 3-hidroksil pada DNA saat terjadinya
replikasi DNA, rekombinasi dan kerusakan. Sacara biologis, DNA ligase diperlukan
untuk menggabungkan fragmen okazaki saat proses replikasi, menyambung
potongan-potongan DNA yang baru disintesis serta berperan dalam proses
reparasi DNA. DNA ligase merupakan enzim yang sangat berguna baik di dalam
sel maupun di luar sel. Untuk penggunaan di luar sel , penggabungan dengan
enzim restriksi telah membuat terobosan baru di bidang teknologi DNA
rekombinan. Enzim restriksi diibaratkan sebagai gunting yang memungkinkan
untuk memotong DNA di tempat yang spesifik. Kemudian DNA ligase berperan
sebagai lem yang menyambung DNA yang telah terpotong sehingga menjadi
DNA yang fungsional.

C. Vektor

Sebagai salah satu cara untuk memanipulasi DNA di luar sel, para ilmuwan
dalam bioteknologi harus bisa membuat suatu tempat yang keadaannya stabil
dan cocok dengan tempat DNA yang dimanipulasi. Vektor disini bisa diartikan
sebagai alat yang membawa DNA ke dalam sel induk barunya. Agar suatu
metode dalam rekayasa genetika berhasil maka di dalam vektor DNA hasil
rekombinan hanya membawa DNA rekombinan yang digabungkan dengan DNA
vektor melalui enzim ligase. Namun di dalam vektor, DNA rekombinan tidak
termutasi lagi membentuk DNA dengan sifat baru. Adapun contoh dari vektor
yang terdapat di alam adalah plasmid dan virus ataubacteriophage.

1. Plasmid

Plasmid adalah molekul DNA yang terpisah dan dapat bereplikasi secara
independen dari DNA kromosom. Di dalam satu sel bakteri, dapat ditemukan
lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua
plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel
tersebut. Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat
bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan
kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang. Istilah ini pertama kali
diperkenalkan oleh ahli biologi molekuler Amerika Yosua Lederberg pada tahun
1952.

Pada awalnya penamaan plasmid didasarkan pada sifat fenotipe yang


dikodekan oleh DNA plasmid tersebut. Contohnya plasmid ColE1 yang berasal
dari E. coli dapat menyandikan bakteriocin colicin. Banyaknya laboratorium
ataupun institusi yang membuat plasmid kloning membuat sistem penamaan
tersebut berubah. Untuk standardisasi penulisan plasmid, digunakan huruf "p"
yang diikuti oleh inisial huruf kapital dan angka. Huruf kapital diambil dari nama
institusi atau laboratorium tempat plasmid tersebut berasal ataupun dari nama
penemu plasmid tersebut. Sedangkan angka yang ada merupakan kode antara
dua laboratorium tempat plasmid tersebut dibuat. Contohnya: pBR322, "p"
menyatakan plasmid, BR merupakan laboratorium tempat plasmid tersebut
pertama kali dikonstruksi (BR dari Bolivar dan Rodriguez, perancang plasmid
tersebut), sedangkan 322 menyatakan di laboratorium mana plasmid ini dibuat,
banyak pBR lainnya seperti pBR325, pBR327, dll.

Plasmid berfungsi sebagai alat penting dalam laboratorium genetika dan


bioteknologi, di mana mereka umumnya digunakan untuk memperbanyak
(membuat banyak salinan) atau mengekspresikan gen tertentu. Plasmid banyak
tersedia secara komersial untuk penggunaan tersebut. Gen dapat direplikasi
dimasukkan ke salinan gen yang mengandung plasmid yang membuat sel-sel
resisten terhadap antibiotik tertentu dan situs kloning ganda (MCS, atau
polylinker), yang merupakan daerah pendek yang mengandung situs restriksi
beberapa yang umum digunakan memungkinkan penyisipan DNA mudah
fragmen di lokasi tersebut. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam plasmid bakteri
dengan proses yang disebut transformasi. Kemudian, bakteri yang terkena
antibiotik tertentu. Hanya bakteri yang mengambil salinan plasmid bertahan
hidup, karena plasmid membuat mereka bertahan. Secara khusus, gen
melindungi diekspresikan (digunakan untuk membuat protein) dan protein
diekspresikan memecah antibiotik. Dengan cara ini, antibiotik bertindak sebagai
filter untuk bakteri yang dimodifikasi. Kemudian bakteri tersebut dapat tumbuh
dalam jumlah besar, dipanen, dan segaris (sering menggunakan metode lisis
alkali) untuk mengisolasi plasmid.

2. Bacteriophage

Salah satu vektor yang banyak digunakan dalam teknologi DNA rekombinan
adalah bacteriophage atau faga yaitu virus yang menginfeksi bakteri. Seperti
halnya virus, fage harus menginfeksi bakteri yang menjadi inangnya. Setelah
jumlahnya mencukupi, fage akan melisis sel inang dan dapat menghasilkan
banyak fage untuk setiap sel bakteri yang mengalami lisis. Oleh karena itu
jumlah fage menjadi sangat besar bila yang mengalami lisis adalah kumpulan
bakteri (koloni). Oleh karena itu vektor yang berupa bacteriophage sangat
menguntungkan jika DNA yang disisipkan ingin diperbanyak dalam jumlah besar.
Kontruksi pustaka genom juga banyak menggunakan fage sebagai vektornya.
Selain kemampuan membawa DNA sisipan lebih besar dari plasmid,
penyimpanan fage relatif lebih mudah dibandingkan dengan bakteri.
Penggunaan fage sebagai vektor juga menguntungkan dalam proses penapisan
untuk mengisolasi suatu gen atau DNA, karena rasio copy DNA atau gen target
terhadap genom total fage jauh lebih tinggi daripada rasio copy DNA terhadap
genom total bakteri bilamana menggunakan plasmid sebagai vektornua. Selain
itu proses purifikasi, denaturasi dan fiksasi DNA di membrane pada saat
persiapan hibridisasi dalam rangka penapisan DNA target, lebih mudah pada
fage yang menginfeksi bakteri sehingga membentuk plak (plaque) daripada
koloni bakteri yang mengandung plasmid.

D. Enzim Transkriptase Balik

Enzim transkriptase-balik adalah enzim yang secara alami digunakan


oleh Retrovirus untuk membuat copy DNA berdasarkan RNA-nya. Enzim
transkriptase balik ditemukan oleh Howard Temin dan David Baltimore secara
terpisah pada tahun 1970 tidak lama setelah penemuan enzim restriksi. Enzim
transkriptase balik ini kemudian digunakan untuk mengkonstruksi copy DNA
yang disebut cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan mRNA sebagai
cetakannya. Tujuan mengkonversi mRNA menjadi cDNA adalah karena DNA
sifatnya lebih stabil dari pada RNA. Setelah dikonversi, untai cDNA tersebut
dapat digunakan untuk PCR, sebagai probe untuk analisis ekspresi dan untuk
perbanyakan/ cloning sekuen mRNA. Jika seorang peneliti ingin mengekspresikan
suatu protein spesifik dalam sel yang tidak lazim memproduksi protein tersebut,
satu cara sederhana adalah dengan mentransfer cDNA yang mengkode protein
tersebut ke sel resipien.

Saat ini, enzim transkriptase balik sudah diproduksi secara komersial.


Ketersediaan enzim transkriptase-balik ini telah memberikan kemudahan bagi
para peneliti untuk mempelajari gen yang bertanggung-jawab terhadap sifat-
sifat tertentu.

E. Pustaka Genom

Pustaka genom merupakan sekumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu


organisme yang masing-masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk
memudahkan pemurnian, penyimpanan, dan analisisnya. Pada dasarnya
terdapat dua macam perpustakaan gen yang dapat dikonstruksi, bergantung
kepada sumber DNA digunakan. Jika DNA yang digunakan adalah DNA
genomik/kromosom, maka perpustakaan yang dihasilkan disebut perpustakaan
genom. Sementara itu, jika DNA yang digunakan merupakan hasil transkripsi
balik suatu populasi mRNA seperti yang umum dijumpai pada eukariot, maka
perpustakaan yang diperoleh dinamakan perpustakaan cDNA.

2.3.2 Proses dan Teknik Dasar Kloning DNA

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui
teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-
tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon,
pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran,
penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA
rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan,
pengklonaan vektor pembawa DNA rekombinan, dan identifikasi klon sel yang
membawa gen yang diinginkan. Bakteri merupakan sel inang yang paling umum
digunakan untuk mengklonaan gen, terutama karena mudahnya DNA dapat
diisolasi dari dan dimasukkan kembali ke dalam sel tersebut. Kultur bakteri juga
tumbuh cepat dan secara cepat mereplikasi setiap gen asing yang dibawanya.

1. Isolasi DNA

Isolasi DNA diawali dengan mempersiapkan dua jenis DNA yaitu plasmid bakteri
yang akan digunakan sebagai vektor dan DNA yang mengandung gen yang
diinginkan. Plasmid yang dipilih merupakan plasmid yang mengandung amp-R
(gen pengkode sifat resisten terhadap antibiotik amphisilin) dan lac Z (pengkode
enzim -galaktosidase). Kemudian dilakukan perusakan dan atau pembuangan
dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi,
tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian
lisozim. Langkah selanjutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak
dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik,
sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen
yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada
eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus.

Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya


pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa
dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk
kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase.
DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur
dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari
RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan
penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan
menggunakan CsCl.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik
maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam
molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama,
plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau
dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA
kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah
aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh
lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom.
Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA
plasmid dengan DNA kromosom.

2. Pemotongan Molekul DNA

Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik
maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat
ditemukannya enzim restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang
berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag (faga temperat).

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa
pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan
menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5 yang runcing karena masing-
masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan
ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung
runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung
kohesif.

3. Ligasi Molekulmolekul DNA

Pemotongan DNA genomik dan DNA vektor menggunakan enzim restriksi harus
menghasilkan ujung-ujung potongan yang kompatibel. Artinya, fragmen-fragmen
DNA genomik nantinya harus dapat disambungkan (diligasi) dengan DNA vektor
yang sudah berbentuk linier.

Ada tiga cara yang dapat digunakan untuk meligasi fragmen-fragmen DNA
secara in vitro. Pertama, ligasi menggunakan enzim DNA ligase dari bakteri.
Kedua, ligasi menggunakan DNA ligase dari sel-sel E. coli yang telah diinfeksi
dengan bakteriofag T4 atau lazim disebut sebagai enzim T4 ligase. Jika cara
yang pertama hanya dapat digunakan untuk meligasi ujung-ujung lengket, cara
yang kedua dapat digunakan baik pada ujung lengket maupun pada ujung
tumpul. Sementara itu, cara yang ketiga yaitu pemberian enzim deoksinukleotidil
transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3. Dengan untai
tunggal semacam ini akan diperoleh ujung lengket buatan, yang selanjutnya
dapat diligasi menggunakan DNA ligase.

Suhu optimum bagi aktivitas DNA ligase sebenarnya 37C. Akan tetapi, pada
suhu ini ikatan hidrogen yang secara alami terbentuk di antara ujung-ujung
lengket akan menjadi tidak stabil dan kerusakan akibat panas akan terjadi pada
tempat ikatan tersebut. Oleh karena itu, ligasi biasanya dilakukan pada suhu
antara 4 dan 15C dengan waktu inkubasi yang diperpanjang. Pada reaksi ligasi
antara fragmen-fragmen DNA genomik dan DNA vektor, khususnya plasmid,
dapat terjadi peristiwa religasi atau ligasi sendiri sehingga plasmid yang telah
dilinierkan dengan enzim restriksi akan menjadi plasmid sirkuler kembali. Hal ini
jelas akan menurunkan efisiensi ligasi. Untuk meningkatkan efisiensi ligasi dapat
dilakukan beberapa cara, antara lain penggunaan DNA dengan konsentrasi tinggi
(lebih dari 100g/ml), perlakuan dengan enzim alkalin fosfatase untuk
menghilangkan gugus fosfat dari ujung 5 pada molekul DNA yang telah
terpotong, serta pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan
enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal
homopolimerik 3.

4. Transformasi Sel Inang

Tahap berikutnya setelah ligasi adalah analisis terhadap hasil pemotongan DNA
genomik dan DNA vektor serta analisis hasil ligasi molekul-molekul DNA tersebut
menggunakan teknik elektroforesis. Jika hasil elektroforesis menunjukkan bahwa
fragmen-fragmen DNA genomik telah terligasi dengan baik pada DNA vektor
sehingga terbentuk molekul DNA rekombinan, campuran reaksi ligasi
dimasukkan ke dalam sel inang agar dapat diperbanyak dengan cepat. Dengan
sendirinya, di dalam campuran reaksi tersebut selain terdapat molekul DNA
rekombinan, juga ada sejumlah fragmen DNA genomik dan DNA plasmid yang
tidak terligasi satu sama lain. Tahap memasukkan campuran reaksi ligasi ke
dalam sel inang ini dinamakan transformasikarena sel inang diharapkan akan
mengalami perubahan sifat tertentu setelah dimasuki molekul DNA rekombinan.

Teknik transformasi pertama kali dikembangkan pada tahun 1970 oleh M. Mandel
dan A. Higa, yang melakukan transformasi bakteri E. coli. Sebelumnya,
transformasi pada beberapa spesies bakteri lainnya yang mempunyai sistem
transformasi alami seperti Bacillus subtilis telah dapat dilakukan. Kemampuan
transformasi B. subtilis pada waktu itu telah dimanfaatkan untuk mengubah
strain-strain auksotrof (tidak dapat tumbuh pada medium minimal) menjadi
prototrof (dapat tumbuh pada medium minimal) dengan menggunakan preparasi
DNA genomik utuh. Baru beberapa waktu kemudian transformasi dilakukan
menggunakan perantara vektor, yang selanjutnya juga dikembangkan pada
transformasi E.coli.

Hal terpenting yang ditemukan oleh Mandel dan Higa adalah perlakuan kalsium
klorid (CaCl2) yang memungkinkan sel-sel E. coli untuk mengambil DNA dari
bakteriofag l. Pada tahun 1972 S.N. Cohen dan kawan-kawannya menemukan
bahwa sel-sel yang diperlakukan dengan CaCl2 dapat juga mengambil DNA
plasmid. Frekuensi transformasi tertinggi akan diperoleh jika sel bakteri dan DNA
dicampur di dalam larutan CaCl2 pada suhu 0 hingga 5C. Perlakuan kejut panas
antara 37 dan 45C selama lebih kurang satu menit yang diberikan setelah
pencampuran DNA dengan larutan CaCl2 tersebut dapat meningkatkan frekuensi
transformasi tetapi tidak terlalu esensial. Molekul DNA berukuran besar lebih
rendah efisiensi transformasinya daripada molekul DNA kecil.

5. Pengklonaan Sel dan Gen Asing

Bakteri hasil transformasi ditempatkan pada medium nutrient padat yang


mengandung amphisilin dan gula yang disebut X-gal. Amphisilin dalam medium
yang akan memastikan bahwa hanya bakteri yang mengandung plasmid yang
dapat tumbuh karena adanya resistensi dari amp-R. Sedangkan X-gal akan
memudahkan identifikasi koloni bakteri yang mengandung gen asing yang
disisipkan. X-gal ini akan dihidrolisis oleh -galaktosidase menghasilkan produk
berwarna biru, sehingga koloni bakteri yang mengandung plasmid dengan gen -
galaktosidase utuh akan berwarna biru. Tetapi jika suatu plasmid memiliki DNA
asing yang diselipkan ke dalam gen lacZ-nya maka koloni sel yang mengandung
DNA asing ini akan berwarna putih karena sel tersebut tidak bisa menghasilkan
-galaktosidase untuk menghidrolisis X-gal.

6. Identifikasi Klon Sel yang Membawa Gen yang Diinginkan

Setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA rekombinan


diidentifikasi menggunakan metode hibridisasi asam nukleat. Dalam pengujian
hibridisasi DNA, DNA dari virus atau sel akan didenaturasi dengan larutan basa
sehingga kedua untai DNA-nya terpisah. Untaiuntai tunggal DNA dilekatkan
pada medium solid, misalnya membran nitroselulosa atau nilon, sehingga untai
untai tersebut tidak bersatu kembali. DNA akan menempel pada membran
melalui tulang punggung gula- fosfatnya sehingga basa nitrogennya terletak
menjulur kearah keluar. Untuk mengkarakterisasi atau mengidentifikasi DNA
target, maka pada membran ditambahkan molekul DNA dan RNA untai tunggal
yang disebut probe dan didalam larutan buffer. Akibatnya, akan terbentuk ikatan
hidrogen di antara basabasa yang komplementer. Probe yang dinamai
sedemikian rupa karena digunakan untuk mencari sekuens DNA, diberi label
dengan suatu gugus reporter. Reporter bisa berupa isotop radioaktif atau enzim
yang kehadirannya mudah dideteksi.
Setelah mengidentifikasi klon sel yang diinginkan, kemudian ditumbuhkan dalam
kultur cair dalam tangki besar dan selanjutnya dengan mudah mengisolasi gen
tersebut dalam jumlah besar. Selain itu juga dapat digunakan sebagai probe
untuk mengidentifikasi gen yang serupa atau identik di dalam DNA dari sumber
lain.

Pengklonaan DNA dalam sel tetap merupakan metode terbaik untuk


mempersiapkan gen tertentu atau urutan lainnya dalam jumlah banyak. Akan
tetapi terdapat beberapa metode yang dapat digunakan dalam pengklonaan sel
sehingga dapat mempermudah prosesnya, diantaranya:

a. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Ketika sumber DNA sedikit atau tidak murni, suatu metode yang disebut PCR bisa
melakukan lebih cepat dan lebih selektif. PCR adalah suatu metode untuk
mengamplifikasi/disalin beberapa kali sekuens gen (urutan DNA) target secara
eksponensial in vitro. Pada reaksi ini dibutuhkan: DNA target, sepasang primer,
polimerase DNA yang termostabil, buffer reaksi dan alat thermal cycler.

Prinsip dasar dari teknik PCR tersebut merupakan adanya enzim DNA polimerase
yang digunakan untuk membuat cetakan dari segmen DNA yang diinginkan.

Proses PCR terdiri dari 3 tahapan, yaitu:

1) Denaturasi adalah proses penguraian materi genetik (DNA/RNA) dari


bentuk heliksnya yang dipisahkan dengan suhu 90-96oC.

2) Annealing (pelekatan) atau hibridisasi adalah suatu proses penempelan


primer ke DNA template yang sekarang hanya dalam satu untai.

3) Polimerisasi (sintesis) adalah suatu proses pemanjangan rantai DNA baru yang
dimulai dari primer.

Aplikasi dari PCR yaitu:

1) Mendeteksi penyakit yang dapat menginfeksi, variasi dan mutasi dari gen.

2) Untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar spesies atau untuk


mengetahui dari mana spesies tersebut berasal.

3) DNA atau RNA yahg telah dianalisis dengan menggunakan teknik PCR
digunakan untuk meneliti penerapannya dalam bidang klinik dan obat-obatan
forensik, mengembangkan teknik-teknik dalam bidang genetika dan untuk
mendiagnosa.

4) Untuk membuat cDNA library, yaitu sebuah set dari hasil kloning yang
mewakili sebanyak mungkin mRNA dari suatu tipe sel tertentu dengan waktu
tertentu. Pembuatan cDNA library tersebut menggunakan teknik Transverse
Replication PCR.

PCR telah digunakan secara luas dalam bidang kedokteran, seperti dalam
pengobatan berbagai penyakit menular (deteksi berbagai bakteri, virus, jamur
dan parasit), keganasan sel (misalnya carcinoma, limfoma, leukimia,
retinoblastoma), kelainan genetika (Sickel cell anemia, -thalassemia,
Duchennes muscullar dystrophy, cystic fibrosis, hemophilia A, Tay-Sachs disease
dan phenylketonuria) dan kedokteran kehakiman.

b. Elektroforesis

Elektroforesis adalah suatu teknik yang mengukur laju perpindahan atau


pergerakan partikel-partikel bermuatan dalam suatu medan listrik. Elektroforesis
adalah suatu teknik yang menggunakan medan listrik untuk memisahkan
molekul berdasarkan ukuran. Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil
amplifikasi dari DNA. Karena mengandung fosfat yang bermuatan negatif, DNA
akan bergerak menuju elektroda positif dalam medan listrik. Prinsip alat ini
adalah kecepatan migrasi molekul DNA berbeda-beda tergantung pada beberapa
faktor diantaranya ukuran molekul. DNA bermigrasi di dalam gel padat yang
terletak di dalam larutan penyangga yang dialiri arus listrik. Hasil elektroforesis
yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil
amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya.

Teknik elektroforesis mempergunakan medium yang terbuat dari gel.


Perpindahan partikel pada medium gel tersebut dipengaruhi oleh faktor-faktor
seperti ukuran partikel, komposisi dan konsentrasi gel, densitas muatan, kuat
medan listrik dan sebagainya. Semakin kecil partikel tesebut, maka pergerakan
atau migrasinya akan semakin cepat, karena matriks gel mengandung jaringan
kompleks berupa pori-pori sehingga partikel-partikel tersebut dapat bergerak
melalui matriks tersebut.

Di dalam elektroforesis digunakan sumber arus listrik searah (DC), ruang untuk
elektroforesis (Comb, Well, platform dan cetakan wadah gel),
larutan buffer (bufferionik dan loading buffer), matriks elektroforesis, marker dan
gel.

c. Sekuens DNA

Molekul DNA rekombinan yang memperlihatkan hasil positif dalam reaksi


hibridisasi dengan fragmen pelacak sangat diduga sebagai molekul yang
membawa fragmen sisipan atau bahkan gen yang diinginkan. Namun, hal ini
masih memerlukan analisis lebih lanjut untuk memastikan bahwa fragmen
tersebut benar-benar sesuai dengan tujuan kloning. Analisis antara lain dapat
dilakukan atas dasar urutan (sekuens) basa fragmen sisipan.

Penentuan urutan (sekuensing) basa DNA pada prinsipnya melibatkan produksi


seperangkat molekul/fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya tetapi salah
satu ujungnya selalu sama. Selanjutnya, fragmen-fragmen ini
dimigrasikan/dipisahkan menggunakan elektroforesis gel poliakrilamid
atau polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE) agar pembacaan sekuens dapat
dilakukan. Di bawah ini akan diuraikan sekilas dua macam metode sekuensing
DNA.

1) Metode Maxam-Gilbert
Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang
dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode
ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu
ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada
ujung 3. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda
maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang
dilakukan dalam dua tahap.

Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan


piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan
menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya.
Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu.
Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G,
hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan
menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan
dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau
G, ujung C atau T, dan ujung C.

2) Metode Sanger

Dewasa ini metode sekuensing Maxam-Gilbert sudah sangat jarang digunakan


karena ada metode lain yang jauh lebih praktis, yaitu metode dideoksi yang
dikembangkan oleh A. Sanger dan kawan-kawan pada tahun 1977 juga.

Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim
DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah
kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan
ketidakmampuannya untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP
hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa,
molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH
pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester.
Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul
DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang
terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang
dibawa oleh molekul ddNTP.

Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA menggunakan metode dideoksi


dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP
sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing
reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi
akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang
ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA
yang ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang
sama. Sebagai contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh
fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai
basa A pada ujung 3nya.

Selama bertahun-tahun telah banyak sekuens DNA yang ditentukan oleh para
ilmuwan di seluruh dunia, dan saat ini kebanyakan jurnal ilmiah
mempersyaratkan penyerahan sekuens DNA terlebih dahulu untuk keperluan
pangkalan data publik sebelum mereka menerima naskah selengkapnya dari
para penulis/ilmuwan. Pengelola pangkalan data akan saling bertukar informasi
tentang sekuens-sekuens yang terkumpul dan menyediakannya untuk akses
publik sehingga semua pangkalan data yang ada akan menjadi nara sumber
yang sangat bermanfaat.

Sekuens-sekuens baru terus bertambah dengan kecepatan yang kian meningkat.


Begitu pula, sejumlah perangkat lunak komputer diperlukan agar data yang
tersedia dapat dimanfaatkan dengan lebih baik.

Ketika sekuens suatu fragmen DNA telah diketahui, hanya ada sedikit sekali
gambaran yang dapat diperoleh dari sekuens tersebut. Analisis sekuens perlu
dilakukan untuk mengetahui beberapa karakteristik pentingnya seperti peta
restriksi, rangka baca, kodon awal dan kodon akhir, atau kemungkinan tempat
promoternya. Di samping itu, perlu juga dipelajari hubungan kekerabatan suatu
sekuens baru dengan beberapa sekuens lainnya yang telah terlebih dahulu
diketahui. Biasanya, analisis semacam itu dilakukan menggunakan paket-paket
perangkat lunak.

2.4 Penerapan Rekayasa Genetika Dalam Kehidupan Manusia

Teknologi DNA rekombinan atau rekayasa genetika telah melahirkan revolusi


baru dalam berbagai bidang kehidupan manusia, yang dikenal sebagai revolusi
gen. Penerapan rekayasa genetika dalam kehidupan manusia menghasilkan
berbagai produk yang dapat meningkatkan kesejahteraan umat manusia sesuai
dengan kebutuhannya. Produk teknologi tersebut berupa organisme transgenik
atau organisme hasil modifikasi genetik (OHMG), yang dalam bahasa Inggris
disebut dengan Genetically Modified Organism (GMO). Namun, sering kali pula
aplikasi teknologi DNA rekombinan bukan berupa pemanfaatan langsung
organisme transgeniknya, melainkan produk yang dihasilkan oleh organisme
transgenik.

Dewasa ini cukup banyak organisme transgenik atau pun produknya yang
dikenal oleh kalangan masyarakat luas. Beberapa di antaranya bahkan telah
digunakan untuk memenuhi kebutuhan hidup sehari-hari. Berikut ini akan
dikemukakan beberapa contoh pemanfaatan organisme transgenik dan produk
yang dihasilkannya dalam berbagai bidang kehidupan manusia.

1. Bidang Pertanian dan Peternakan

Teknik bioteknologi tanaman di bidang pertanian telah dimanfaatkan terutama


untuk memberikan karakter atau sifat baru pada berbagai jenis tanaman.
Teknologi rekayasa genetika tanaman memungkinkan pengintegrasian gen-gen
yang berasal dari organisme lain untuk perbaikan sifat tanaman. Beberapa
contoh aplikasi rekayasa genetika di bidang pertanian adalah mengembangkan
tanaman transgenik yang memiliki sifat: 1) toleran terhadap zat kimia tertentu
(tahan herbisida); 2) tahan terhadap hama dan penyakit tertentu; 3) mempunyai
sifat-sifat khusus (misalnya tomat yang matangnya lama, padi yang
memproduksi beta-karoten dan vitamin A, kedelai dengan lemak tak jenuh
rendah, kentang dan pisang yang berkhasiat obat, dll.); 4) dapat mengambil
nitrogen sendiri dari udara (gen dari bakteri pemfiksasi nitrogen disisipkan ke
tanaman sehingga tanaman dapat memfiksasi nitrogen udara sendiri); dan 5)
dapat menyesuaikan diri terhadap lingkungan buruk (kekeringan, cuaca dingin,
dan tanah dengan kandungan garam tinggi).

Teknologi pemindahan gen atau transformasi gen untuk mendapatkan tanaman


transgenik dapat dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak langsung.
Contoh transfer gen secara langsung adalah perlakuan pada protoplas tanaman
dengan eletroporasi atau dengan polyethyleneglycol (PEG), penembakan eksplan
gen dengan gene gun atau di vortex dengan karbit silikon. Teknik pemindahan
gen secara tak langsung dilakukan dengan bantuan bakteri Agrobacterium
tumefaciens.

1) Metode elektroporasi.

Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman monokotil adalah
elektroporasi dari protoplas, perlakuan polythyleneglycol (PEG) pada protoplas
dan kombinasi antara dua perlakuan tersebut diatas. PEG memudahkan
presipitasi DNA dan membuat kontak lebih baik dengan protoplas, juga
melindungi DNA plasmid mengalami degradasi dari enzim nuklease. Sedangkan
elektroporasi dengan perlakukan listrik voltase tinggi meyebabkan permeabilitasi
tinggi untuk sementara pada membran sel dengan membentuk pori-pori
sehingga DNA mudah penetrasi kedalam protoplas. Integritas membran kembali
membaik seperti semula dalam beberapa detik sampai semenit setelah
perlakuan listrik. Jagung dan padi telah berhasil dengan sukses ditransformasi
melalui elektorporasi dengan efisien antatar 0,1 1 %. Salah satu kelemahan
penggunaan protoplas sebagai eksplan untuk transformasi adalah sulitnya
regenerasi dari protoplas, dan variasi somaklonal akibat panjang periode kultur

2) Karbid silikon (silicon carbide)

Metode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam transformasi
tanaman tetapi telah dilaporkan berhasil mentransformasi jagung, dan turfgrass
adalah penggunaan karbid silikon (silicon carbide). Suspensi sel tanaman yang
akan ditransformasi dicampur dengan serat silicon carbide dan DNA plasmid dari
gen yang diinginkan dimasukkan kedalam tabung Eppendorf, kemudian
dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan vortex. Serat karbid berfungsi
sebagai jarum injeksi mikro (micro injection ) untuk memudahkan transfer DNA
kedalam sel tanaman. Metode ini telah digunakan dan menghasilkan tanaman
jagung transgenik yang fertil.

3) Penembakan partikel (Particle bombardment)

Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah penggunaan metoda


gene gun atau particle bombardment. Metode transfer gen ini dioperasikan
secara fisik dengan menembakkan partikel DNA-coated langsung ke sel atau
jaringan tanaman. Dengan cara partikel dan DNA yang ditambahkan menembus
dinding sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam secara
independen. Telah didemonstrasikan bahwa teknik ini efektif untuk metransfer
gen pada bermacammacam eksplan. Penggunaan senjata gen memberikan
hasil yang bersih dan aman, meskipun ada kemungkinan terjadi kerusakan sel
selama proses penembakan berlangsung. Penggunaan particle bombardment
membuka peluang dan kemungkinan lebih muda dalam memproduksi tanaman
transgenik dari berbagai spesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan
Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan
turfgrass..

4) Metode transformasi yang dilakukan atau diperantara oleh Agrobacterium


tumefaciens.

Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui media
vektorAgrobacterium tumefaciens paling sering digunakan untuk melakukan
transformasi tanaman, terutama tanaman kelompok dikotil. Bakteri ini mampu
mentransfer gen kedalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa
potongan daun (leaf disc) atau bagian lain dari jaringan tanaman yang
mempunyai potensi beregenerasi tinggi.

Gen yang ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing). Segmen spesifik
DNA plasmid Ti disebut T-DNA (transfer DNA ) yang berpindah dari bakteri ke inti
sel tanaman dan berintegrasi kedalam genom tanaman. Karena Agrobacterium
tumefaciensmerupakan patogen tanaman maka A. tumefaciens yang digunakan
sebagai vektor untuk transformasi tanaman adalah jenis bakteri yang plasmid Ti
telah dilucuti virulensinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang ditransformasi
oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan membentuk suatu
tanaman sehat hasil rekayasa genetik.

Teknik transformasi melalui media vektor Agrobacterium pada tanaman dikotil


telah berhasil dengan baik tetapi sebaliknya tidak umum digunakan pada
tanaman monokotil. Namun beberapa peneliti telah melaporkan bahwa beberapa
strain Agrobacterium berhasil metransformasi tanaman monokotil seperti jagung
dan padi

Pada tahun 1996 luas areal untuk tanaman transgenik di seluruh dunia telah
mencapai 1,7 ha, dan tiga tahun kemudian meningkat menjadi hampir 40 juta
ha. Negara- negara yang melakukan penanaman tersebut antara lain Amerika
Serikat (28,7 juta ha), Argentina (6,7 juta ha), Kanada (4 juta ha), Cina (0,3 juta
ha), Australia (0,1 juta ha), dan Afrika Selatan (0,1 juta ha). Indonesia sendiri
pada tahun 1999 telah mengimpor produk pertanian tanaman pangan transgenik
berupa kedelai sebanyak 1,09 juta ton, bungkil kedelai 780.000 ton, dan jagung
687.000 ton. Pengembangan tanaman transgenik di Indonesia meliputi jagung
(Jawa Tengah), kapas (Jawa Tengah dan Sulawesi Selatan), kedelai, kentang, dan
padi (Jawa Tengah). Sementara itu, tanaman transgenik lainnya yang masih
dalam tahap penelitian di Indonesia adalah kacang tanah, kakao, tebu,
tembakau, dan ubi jalar.
Pada dasarnya rekayasa genetika di bidang pertanian bertujuan untuk
menciptakan ketahanan pangan suatu negara dengan cara meningkatkan
produksi, kualitas, dan upaya penanganan pascapanen serta prosesing hasil
pertanian. Peningkatkan produksi pangan melalui revolusi gen ini ternyata
memperlihatkan hasil yang jauh melampaui produksi pangan yang dicapai dalam
era revolusi hijau. Di samping itu, kualitas gizi serta daya simpan produk
pertanian juga dapat ditingkatkan sehingga secara ekonomi memberikan
keuntungan yang cukup nyata. Adapun dampak positif yang sebenarnya
diharapkan akan menyertai penemuan produk pangan hasil rekayasa genetika
adalah terciptanya keanekaragaman hayati yang lebih tinggi.

Di bidang peternakan hampir seluruh faktor produksi telah tersentuh oleh


teknologi DNA rekombinan, misalnya penurunan morbiditas penyakit ternak
serta perbaikan kualitas pakan dan bibit. Vaksin-vaksin untuk penyakit mulut dan
kuku pada sapi, rabies pada anjing, blue tongue pada domba, white-diarrhea
pada babi, dan fish-fibrosis pada ikan telah diproduksi menggunakan teknologi
DNA rekombinan.

Di samping itu, juga telah dihasilkan hormon pertumbuhan untuk sapi


(recombinant bovine somatotropine atau rBST), babi (recombinant porcine
somatotropine atau rPST), dan ayam (chicken growth hormone). Penemuan
ternak transgenik yang paling menggegerkan dunia adalah ketika keberhasilan
kloning domba Dolly diumumkan pada tanggal 23 Februari 1997.

2. Bidang Perkebunan, Kehutanan, dan Florikultur

Perkebunan kelapa sawit transgenik dengan minyak sawit yang kadar karotennya
lebih tinggi saat ini mulai dirintis pengembangannya. Begitu pula, telah
dikembangkan perkebunan karet transgenik dengan kadar protein lateks yang
lebih tinggi dan perkebunan kapas transgenik yang mampu menghasilkan serat
kapas berwarna yang lebih kuat dan juga ketahanan tanaman terhadap hama,
dengan mengintroduksi gen Bt yang berhubungan dengan ketahanan serangga
hama hasil isolasi bakteri tanah Bacillus thuringiensis yang dapat memproduksi
protein kristal yang bekerja seperti insektisida (insecticidal crystal protein) yang
dapat mematikan serangga hama (Macintosh et al., 1990). Bacillus
thuringiensis (Bt) adalah bakteri gram positif yang berbentuk batang, aerobik
dan membentuk spora. Banyak strain dari bakteri ini yang menghasilkan protein
yang beracun bagi serangga. Sejak diketahui potensi dari protein kristal atau
cry Btsebagai agen pengendali serangga, semakin banyak dikembangkan
isolasi Bt yang mengandung berbagai jenis protein kristal. Dan sampai saat ini
telah diidentifikasi protein kristal yang beracun terhadap larva dari berbagai ordo
serangga yang menjadi hama pada tanaman pangan dan hortikultura.
Kebanyakan dari protein kristal tersebut lebih ramah lingkungan karena
mempunyai target yang spesifik yaitu mematikan serangga dan mudah terurai
sehingga tidak menumpuk dan mencemari lingkungan.

Di bidang kehutanan telah dikembangkan tanaman jati transgenik, yang memiliki


struktur kayu lebih baik. Selain itu Fasilitas Uji Terbatas Pusat Penelitian
Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) menghasilkan tanaman
sengon (Albazia falcataria) transgenik pertama di dunia pada tahun 2010 lalu.
Kayu sengon bernilai ekonomis yang digunakan untuk tiang bangunan rumah,
papan peti kemas, perabotan rumah tangga, pagar, hingga pulp dan kertas. Akar
tunggangnya yang kuat, sehingga baik ditanam di tepi kawasan yang mudah
terkena erosi dan menjadi salah satu kebijakan pemerintah (Sengonisasi) di
sekitar daerah aliran sungai (DAS). Tanaman sengon transgenik yang
mengandung gen xyloglucanase terbukti tumbuh lebih cepat dan mengandung
selulosa lebih tinggi daripada tanaman kontrol. Tanaman ini berpotensi tumbuh
lebih cepat saat dipindah ke lapangan.

Florikultur merupakan ilmu yang mempelajari bagaimana cara budidaya bunga.


Florikultur merupakan praktek budidaya Hortikultura dan tumbuhan atau
tanaman untuk kebun, bunga segar untuk industri potong-Bunga dan dalam pot
untuk digunakan dalam ruangan. Hortikultura melibatkan ilmu bunga dan
budidaya tanaman dan diFloristry dengan menggunakan teknik biokimia,
fisiologi, pemuliaan tanaman serta berbagai produksi hasil tanaman, Florikultur
selalu mencari hal-hal baru bagaimana cara menghasilkan tanaman dengan
kualitas yang lebih baik dan meningkatkan kemampuan mereka untuk melawan
dampak lingkungan. Di bidang florikultur antara lain telah diperoleh tanaman
anggrek transgenik dengan masa kesegaran bunga yang lama serta lebih tahan
terhadap serangan hama. Demikian pula, telah dapat dihasilkan beberapa jenis
tanaman bunga transgenik lainnya dengan warna bunga yang diinginkan dan
masa kesegaran bunga yang lebih panjang.

3. Bidang Farmasi dan Industri

Di bidang farmasi, rekayasa genetika terbukti mampu menghasilkan berbagai


jenis obat dengan kualitas yang lebih baik sehingga memberikan harapan dalam
upaya penyembuhan sejumlah penyakit di masa mendatang. Bahan-bahan untuk
mendiagnosis berbagai macam penyakit dengan lebih akurat juga telah dapat
dihasilkan.

Teknik rekayasa genetika memungkinkan diperolehnya berbagai produk industri


farmasi penting seperti insulin, interferon, dan beberapa hormon pertumbuhan
dengan cara yang lebih efisien. Hal ini karena gen yang bertanggung jawab atas
sintesis produk-produk tersebut diklon ke dalam sel inang bakteri tertentu yang
sangat cepat pertumbuhannya dan hanya memerlukan cara kultivasi biasa.
Dengan mentransfer gen untuk produk protein yang dikehendaki ke dalam
bakteri, ragi, dan jenis sel lainnya yang mudah tumbuh di dalam kultur
seseorang dapat memproduksi protein dalam jumlah besar, yang secara alami
hanya terdapat dalam jumlah sangat sedikit.

1) Pembuatan insulin melalui proses rekayasa genetika

Insulin adalah suatu hormon polipetida yang diproduksi dalam sel-sel kelenjar
Langerhaens pankreas. Insulin berperan penting dalam regulasi kadar gula darah
(kadar gula darah dijaga 3,5-8,0 mmol/liter). Hormon insulin yang diproduksi oleh
tubuh kita dikenal juga sebagai sebutan insulin endogen. Namun, ketika kalenjar
pankreas mengalami gangguan sekresi guna memproduksi hormon insulin,
disaat inilah tubuh membutuhkan hormon insulin dari luar tubuh, dapat berupa
obat buatan manusia atau dikenal juga sebagai sebutan insulin eksogen.
Kekurangan insulin dapat menyebabkan penyakit seperti diabetes mellitus
tergantung insulin (diabetes tipe I). Insulin terdiri dari 51 asam amino. Molekul
insulin disusun oleh 2 rantai polipeptida A dan B yang dihubungkan dengan
ikatan disulfida. Rantai A terdiri dari 21 asam amino dan rantai B terdiri dari 30
asam amino.

Adapun proses pembuatan insulin dengan menggunakan plasmid pada bakteri


sebagai vektor pengklon (pembawa DNA) sebagai berikut:

a. Pengisolasian vektor dan DNA sumber gen

Rangkaian DNA yang mengkode insulin dapat diisolasi dari gen manusia yang
sebelumnya telah ditumbuhkan dalam kultur di laboratorium. Vektor yang
digunakan berupa plasmid dari bakteri Escherichia coli. Plasmid merupakan
molekul DNA kecil, sirkuler, dapat bereplikasi sendiri dan terpisah dari kromosom
bakteri. Adapun plasmid yang digunakan mengandung gen:

Amp-R yang terbukti memberikan resistensi pada sel inang terhadap


antibiotik amphisilin.

LacZ yang mengkode enzim -galaktosidase yang menghidrolisis


gula laktosa.

Plasmid ini memiliki pengenalan tunggal untuk enzim restriksi endonuklease


yang digunakan dan urutan ini terletak dalam gen lacZ.

1) Penyelipan DNA ke dalam vector

Plasmid maupun DNA manusia dipotong dengan menggunakan enzim


restriksi yang sama dimana enzim ini memotong DNA plasmid pada tempat
restriksi tunggalnya dan mengganggu gen lacZ.

Mencampurkan fragmen DNA manusia dengan plasmid yang telah


dipotong

Penambahan enzim ligase untuk membentuk ikatan kovalen antara


keduanya.

2) Pemasukan plasmid ke dalam sel bakteri

Plasmid yang telah termodifikasi dicampurkan dalam kultur bakteri

Bakteri akan mengambil plasmid rekombinan secara spontan melalui


proses transformasi namun tidak semua bakteri yang akan mengambil plasmid
rekombinan yang diinginkan

3) Pengklonaan sel dan gen asing

Bakteri hasil transformasi ditempatkan pada medium nutrient padat yang


mengandung amphisilin dan gula yang disebut X-gal. Amphisilin dalam medium
yang akan memastikan bahwa hanya bakteri yang mengandung plasmid yang
dapat tumbuh karena adanya resistensi dari amp-R. Sedangkan X-gal akan
memudahkan identifikasi koloni bakteri yang mengandung gen asing yang
disisipkan. X-gal ini akan dihidrolisis oleh -galaktosidase menghasilkan produk
berwarna biru, sehingga koloni bakteri yang mengandung plasmid dengan gen -
galaktosidase utuh akan berwarna biru.

Tetapi jika suatu plasmid memiliki DNA asing yang diselipkan ke dalam genlacZ-
nya maka koloni sel yang mengandung DNA asing ini akan berwarna putih
karena sel tersebut tidak bisa menghasilkan -galaktosidase untuk
menghidrolisis X-gal.

4) Identifikasi klon sel yang membawa gen yang diinginkan

Setelah tumbuh membentuk koloni, bakteri yang mengandung DNA rekombinan


diidentifikasi menggunakan probe asam nukleat. Probe adalah rantai RNA atau
rantai tunggal DNA yang diberi label isotop radioaktif atau bahan fluorescent dan
dapat berpasangan dengan basa nitrogen tertentu dari DNA rekombinan. Pada
langkah pembuatan insulin ini probe yang digunakan adalah RNAd dari gen
pengkode insulin pankreas manusia. Untuk memilih koloni bakteri mana yang
mengandung DNA rekombinan, caranya adalah menempatkan bakteri pada
kertas filter lalu disinari dengan ultraviolet. Bakteri yang memiliki DNA
rekombinan dan telah diberi probe akan tampak bersinar.

Setelah mengidentifikasi klon sel yang diinginkan, kemudian ditumbuhkan dalam


kultur cair dalam tangki besar dan selanjutnya dengan mudah mengisolasi gen
tersebut dalam jumlah besar. Selain itu juga dapat digunakan sebagai probe
untuk mengidentifikasi gen yang serupa atau identik di dalam DNA dari sumber
lain.

Pada industri pengolahan pangan, misalnya pada pembuatan keju, enzim renet
yang digunakan juga merupakan produk organisme transgenik. Hampir 40% keju
keras (hard cheese) yang diproduksi di Amerika Serikat menggunakan enzim
yang berasal dari organisme transgenik. Demikian pula, bahan-bahan food
additive seperti penambah cita rasa makanan, pengawet makanan, pewarna
pangan, pengental pangan, dan sebagainya saat ini banyak menggunakan
produk organisme transgenik.

4. Bidang Lingkungan

Rekayasa genetika ternyata sangat berpotensi untuk diaplikasikan dalam upaya


penyelamatan keanekaragaman hayati, bahkan dalam bioremidiasi lingkungan
yang sudah terlanjur rusak. Dewasa ini berbagai strain bakteri yang dapat
digunakan untuk membersihkan lingkungan dari bermacam-macam faktor
pencemaran telah ditemukan dan diproduksi dalam skala industri. Sebagai
contoh, sejumlah pantai di salah satu negara industri dilaporkan telah tercemari
oleh metilmerkuri yang bersifat racun keras baik bagi hewan maupun manusia
meskipun dalam konsentrasi yang kecil sekali. Detoksifikasi logam air raksa
(merkuri) organik ini dilakukan menggunakan tanamanArabidopsis
thaliana transgenik yang membawa gen bakteri tertentu yang dapat
menghasilkan produk untuk mendetoksifikasi air raksa organik.

Keragaman metabolisme mikroba juga digunakan dalam menangani limbah dari


sumber-sumber lain. Pabrik pengolahan air kotor mengandalkan kemampuan
mikroba untuk mendegradasi berbagai senyawa organik menjadi bentuk
nontoksik. Akan tetapi, peningkatan jumlah senyawa yang secara potensial
berbahaya yang dilepas ke lingkungan tidak lagi bisa didegradasi oleh mikroba
yang tersedia secara alamiah, hidrokarbon klorinasi merupakan contoh
utamanya. Para ahli bioteknologi sedang mencoba merekayasa mikroba untuk
mendegradasi senyawa-senyawa ini. Mikroba ini dapat digunakan dalam pabrik
pengolahan air limbah atau digunakan oleh para manufaktur sebelum senyawa-
senyawa itu dilepas ke lingkungannya.

5. Bidang Hukum dan Forensik

Pada kriminalitas dengan kekerasan, darah atau jaringan lain dengan


jumlah kecil dapat tertinggal di tempat kejadian perkara atau pada pakaian atau
barang-barang lain milik korban atau penyerangnya. Jika ada perkosaan, air mani
dalam jumlah kecil dapat ditemukan dari tubuh korban. Pengujian yang
digunakan biasanya menggunakan antibodi untuk menguji protein permukaan
sel yang spesifik. Namun pengujian ini membutuhkan jaringan yang agak segar
dengan jumlah yang relatif banyak. Pengujian DNA dapat mengidentifikasi pelaku
dengan derajat kepastian yang jauh lebih tinggi karena urutan DNA setiap orang
itu unik. Analisis RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) dengan
Southern blotting merupakan metode ampuh untuk pendeteksian kemiripan dan
perbedaan sampel DNA dan hanya membutuhkan darah atau jaringan lain dalam
jumlah yang sangat sedikit. Misalnya dalam kasus pembunuhan metode ini dapat
digunakan untuk membandingkan sampel DNA dari tersangka, korban, dan
sedikit darah yang dijumpai di TKP. Probe radioaktif menandai pita elektroforesis
yang mengandung penanda RFLP tertentu. Biasanya saintis forensik menguji
kira-kira lima penanda, dengan kata lain hanya beberapa bagian DNA yang diuji.
Akan tetapi, rangkaian penanda dari suatu individu yang demikian sedikitpun
sudah dapat memberikan sidik jari DNA atau pola pita spesifik yang berguna
untuk forensik karena probabilitas bahwa dua orang akan memiliki rangkaian
penanda RFLP yang tepat sama adalah kecil. Autoradiografi meniru jenis bukti
yang disajikan kepada para juri dalam pengadilan percobaan pembunuhan.

Seperti yang diungkapkan oleh analisis RFLP, DNA dari noda darah pada
pakaian terdakwa sama persis dengan sidik jari DNA korban tetapi berbeda dari
sidik jari terdakwa. Ini membuktikan bahwa darah dari pakaian terdakwa berasal
dari korban bukan dari terdakwa sendiri.

2.5 Dampak dari Penerapan Rekayasa Genetika

Meskipun terlihat begitu besar memberikan manfaat dalam berbagai bidang


kehidupan manusia yang tentunya memberikan dampak positif bagi
kesejahteraan umat manusia, produk teknologi DNA rekombinan (organisme
transgenik beserta produk yang dihasilkannya) telah memicu sejumlah
perdebatan yang menarik sekaligus kontroversial apabila ditinjau dari berbagai
sudut pandang. Adapun kontroversi pemanfaatan produk rekayasa genetika
antara lain dapat dilihat dari aspek sosial, ekonomi, kesehatan, dan lingkungan.

1. Aspek Sosial

a. Aspek agama

Penggunaan gen yang berasal dari babi untuk memproduksi bahan makanan
dengan sendirinya akan menimbulkan kekhawatiran di kalangan pemeluk agama
Islam. Demikian pula, penggunaan gen dari hewan dalam rangka meningkatkan
produksi bahan makanan akan menimbulkan kekhawatiran bagi kaum
vegetarian, yang mempunyai keyakinan tidak boleh mengonsumsi produk
hewani. Sementara itu, kloning manusia, baik parsial (hanya organ-organ
tertentu) maupun seutuhnya, apabila telah berhasil menjadi kenyataan akan
mengundang kontroversi, baik dari segi agama maupun nilai-nilai moral
kemanusiaan universal. Demikian juga, xenotransplantasi(transplantasi organ
hewan ke tubuh manusia) serta kloning stem cell dari embrio manusia untuk
kepentingan medis juga dapat dinilai sebagai bentuk pelanggaran terhadap
norma agama.

b. Aspek etika dan estetika

Penggunaan bakteri E. coli sebagai sel inang bagi gen tertentu yang akan
diekspresikan produknya dalam skala industri, misalnya industri pangan, akan
terasa menjijikkan bagi sebagian masyarakat yang hendak mengonsumsi pangan
tersebut. Hal ini karena E coli merupakan bakteri yang secara alami menghuni
kolon manusia sehingga pada umumnya diisolasi dari tinja manusia.

2. Aspek Ekonomi

Berbagai komoditas pertanian hasil rekayasa genetika telah memberikan


ancaman persaingan serius terhadap komoditas serupa yang dihasilkan secara
konvensional. Penggunaan tebu transgenik mampu menghasilkan gula dengan
derajat kemanisan jauh lebih tinggi daripada gula dari tebu atau bit biasa. Hal ini
jelas menimbulkan kekhawatiran bagi masa depan pabrik-pabrik gula yang
menggunakan bahan alami. Begitu juga, produksi minyak goreng canola dari
tanaman rapeseedstransgenik dapat berpuluh kali lipat bila dibandingkan
dengan produksi dari kelapa atau kelapa sawit sehingga mengancam eksistensi
industri minyak goreng konvensional. Di bidang peternakan, enzim yang
dihasilkan oleh organisme transgenik dapat memberikan kandungan protein
hewani yang lebih tinggi pada pakan ternak sehingga mengancam keberadaan
pabrik-pabrik tepung ikan, tepung daging, dan tepung tulang.

3. Aspek Kesehatan

a. Potensi toksisitas bahan pangan

Dengan terjadinya transfer genetik di dalam tubuh organisme transgenik akan


muncul bahan kimia baru yang berpotensi menimbulkan pengaruh toksisitas
pada bahan pangan. Sebagai contoh, transfer gen tertentu dari ikan ke dalam
tomat, yang tidak pernah berlangsung secara alami, berpotensi menimbulkan
risiko toksisitas yang membahayakan kesehatan. Rekayasa genetika bahan
pangan dikhawatirkan dapat mengintroduksi alergen atau toksin baru yang
semula tidak pernah dijumpai pada bahan pangan konvensional. Di antara
kedelai transgenik, misalnya, pernah dilaporkan adanya kasus reaksi alergi yang
serius. Begitu pula, pernah ditemukan kontaminan toksik dari bakteri transgenik
yang digunakan untuk menghasilkan pelengkap makanan (food
supplement) triptofan. Kemungkinan timbulnya risiko yang sebelumnya tidak
pernah terbayangkan terkait dengan akumulasi hasil metabolisme tanaman,
hewan, atau mikroorganisme yang dapat memberikan kontribusi toksin, alergen,
dan bahaya genetik lainnya di dalam pangan manusia.

Beberapa organisme transgenik telah ditarik dari peredaran karena terjadinya


peningkatan kadar bahan toksik. Kentang Lenape (Amerika Serikat dan Kanada)
dan kentang Magnum Bonum (Swedia) diketahui mempunyai kadar glikoalkaloid
yang tinggi di dalam umbinya. Demikian pula, tanaman seleri transgenik
(Amerika Serikat) yang resisten terhadap serangga ternyata memiliki kadar
psoralen, suatu karsinogen, yang tinggi.

b. Potensi menimbulkan penyakit/gangguan kesehatan

WHO pada tahun 1996 menyatakan bahwa munculnya berbagai jenis bahan
kimia baru, baik yang terdapat di dalam organisme transgenik maupun
produknya, berpotensi menimbulkan penyakit baru atau pun menjadi faktor
pemicu bagi penyakit lain. Sebagai contoh, gen aad yang terdapat di dalam
kapas transgenik dapat berpindah ke bakteri penyebab kencing nanah Neisseria
gonorrhoeae (GO). Akibatnya, bakteri ini menjadi kebal terhadap antibiotik
streptomisin dan spektinomisin. Padahal, selama ini hanya dua macam antibiotik
itulah yang dapat mematikan bakteri tersebut. Oleh karena itu, penyakit GO
dikhawatirkan tidak dapat diobati lagi dengan adanya kapas transgenik.
Dianjurkan pada wanita penderita GO untuk tidak memakai pembalut dari bahan
kapas transgenik.

Contoh lainnya adalah karet transgenik yang diketahui menghasilkan lateks


dengan kadar protein tinggi sehingga apabila digunakan dalam pembuatan
sarung tangan dan kondom, dapat diperoleh kualitas yang sangat baik. Namun,
di Amerika Serikat pada tahun 1999 dilaporkan ada sekitar 20 juta penderita
alergi akibat pemakaian sarung tangan dan kondom dari bahan karet transgenik.

Selain pada manusia, organisme transgenik juga diketahui dapat menimbulkan


penyakit pada hewan. A. Putzai di Inggris pada tahun 1998 melaporkan bahwa
tikus percobaan yang diberi pakan kentang transgenik memperlihatkan gejala
kekerdilan dan imunodepresi. Fenomena yang serupa dijumpai pada ternak
unggas di Indonesia, yang diberi pakan jagung pipil dan bungkil kedelai impor.
Jagung dan bungkil kedelai tersebut diimpor dari negara-negara yang telah
mengembangkan berbagai tanaman transgenik sehingga diduga kuat bahwa
kedua tanaman tersebut merupakan tanaman transgenik.
4. Aspek Lingkungan

a. Potensi erosi plasma nutfah

Penggunaan tembakau transgenik telah memupus kebanggaan Indonesia akan


tembakau Deli yang telah ditanam sejak tahun 1864. Tidak hanya plasma nutfah
tanaman, plasma nutfah hewan pun mengalami ancaman erosi serupa. Sebagai
contoh, dikembangkannya tanaman transgenik yang mempunyai gen dengan
efek pestisida, misalnya jagung Bt, ternyata dapat menyebabkan kematian larva
spesies kupu-kupu raja(Danaus plexippus) sehingga dikhawatirkan akan
menimbulkan gangguan keseimbangan ekosistem akibat musnahnya plasma
nutfah kupu-kupu tersebut. Hal ini terjadi karena gen resisten pestisida yang
terdapat di dalam jagung Bt dapat dipindahkan kepada
gulma milkweed (Asclepia curassavica) yang berada pada jarak hingga 60 m
darinya. Daun gulma ini merupakan pakan bagi larva kupu-kupu raja sehingga
larva kupu-kupu raja yang memakan daun gulma milkweed yang telah
kemasukan gen resisten pestisida tersebut akan mengalami kematian. Dengan
demikian, telah terjadi kematian organisme nontarget, yang cepat atau lambat
dapat memberikan ancaman bagi eksistensi plasma nutfahnya.

b. Potensi pergeseran gen

Daun tanaman tomat transgenik yang resisten terhadap


serangga Lepidopterasetelah 10 tahun ternyata mempunyai akar yang dapat
mematikan mikroorganisme dan organisme tanah, misalnya cacing tanah.
Tanaman tomat transgenik ini dikatakan telah mengalami pergeseran gen karena
semula hanya mematikan Lepidoptera tetapi kemudian dapat juga mematikan
organisme lainnya. Pergeseran gen pada tanaman tomat transgenik semacam ini
dapat mengakibatkan perubahan struktur dan tekstur tanah di areal
pertanamannya.

c. Potensi pergeseran ekologi

Organisme transgenik dapat pula mengalami pergeseran ekologi. Organisme


yang pada mulanya tidak tahan terhadap suhu tinggi, asam atau garam, serta
tidak dapat memecah selulosa atau lignin, setelah direkayasa berubah menjadi
tahan terhadap faktor-faktor lingkungan tersebut. Pergeseran ekologi organisme
transgenik dapat menimbulkan gangguan lingkungan yang dikenal sebagai
gangguan adaptasi.

Tanaman transgenik dapat menghasilkan protease inhibitor di dalam sari bunga


sehingga lebah madu tidak dapat membedakan bau berbagai sari bunga. Hal ini
akan mengakibatkan gangguan ekosistem lebah madu di samping juga terjadi
gangguan terhadap madu yang diproduksi.

d. Potensi terbentuknya barrier species

Adanya mutasi pada mikroorganisme transgenik menyebabkan


terbentuknyabarrier species yang memiliki kekhususan tersendiri. Salah satu
akibat yang dapat ditimbulkan adalah terbentuknya superpatogenitas pada
mikroorganisme.

e. Potensi mudah diserang penyakit

Tanaman transgenik di alam pada umumnya mengalami kekalahan kompetisi


dengan gulma liar yang memang telah lama beradaptasi terhadap berbagai
kondisi lingkungan yang buruk. Hal ini mengakibatkan tanaman transgenik
berpotensi mudah diserang penyakit dan lebih disukai oleh serangga.

Sebagai contoh, penggunaan tanaman transgenik yang resisten terhadap


herbisida akan mengakibatkan peningkatan kadar gula di dalam akar. Akibatnya,
akan makin banyak cendawan dan bakteri yang datang menyerang akar
tanaman tersebut. Dengan perkataan lain, terjadi peningkatan jumlah dan jenis
mikroorganisme yang menyerang tanaman transgenik tahan herbisida. Jadi,
tanaman transgenik tahan herbisida justru memerlukan penggunaan pestisida
yang lebih banyak, yang dengan sendirinya akan menimbulkan masalah
tersendiri bagi lingkungan.

BAB III

PENUTUP

3.1 Kesimpulan

Rekayasa genetika merupakan penerapan teknik-teknik genetika molekuler


untuk mengubah susunan genetik dalam kromosom atau mengubah sistem
ekspresi genetik yang diarahkan pada kemanfaatan tertentu. Dasar dari
pengembangan teknologi DNA Rekombinan adalah ditemukannya mekanisme
seksual pada bakteri. Perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan
diantaranya enzim restriksi, enzimligase, vektor, pustaka genom, serta
enzim transkripsi balik

Tahapan-tahapan yang umum digunakan dalam teknologi DNA rekombinan


adalah isolasi DNA, pemotongan molekul DNA, penyisipan fragmen DNA ke
dalam vektor, transformasi sel inang, pengklonaan vektor pembawa DNA
rekombinan, dan identifikasi klon sel yang membawa gen yang diinginkan.

Adapun perangkat yang digunakan dalam teknik DNA rekombinan diantaranya


enzim restriksi untuk memotong DNA, enzim ligase untuk menyambung
DNA, vektoruntuk menyambung dan mengklonkan gen di dalam sel hidup
dimana vektor yang sering digunakan diantarnya plasmid dan
bakteriofag, pustaka genom untuk menyimpan gen atau fragmen DNA yang
telah diklonkan, serta enzim transkripsi balik untuk membuat DNA berdasarkan
RNA (cDNA).

Adapun penerapan rekayasa genetika dalam kehidupan manusia yaitu di bidang


pertanian, peternakan, perkebunan, kehutanan, florikultur, farmasi, industri,
lingkungan, hukum dan forensik.

http://tirmaputri.blogspot.co.id/2015/03/makalah-rekayasa-genetika.html
1.1 LATAR BELAKANG
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme
biologis. Virus hanya dapat bereproduksi di dalam material hidup dengan
menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena virus tidak memiliki
perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri. Dalam sel inang, virus
merupakan parasit obligat dan di luar inangnya menjadi tak berdaya. Biasanya
virus mengandung sejumlah kecil asam nukleat (DNA atau RNA, tetapi tidak
kombinasi keduanya) yang diselubungi semacam bahan pelindung yang terdiri
atas protein, lipid, glikoprotein, atau kombinasi ketiganya. Genom virus
menyandi baik protein yang digunakan untuk memuat bahan genetik maupun
protein yang dibutuhkan dalam daur hidupnya.Istilah virus biasanya merujuk
pada partikel-partikel yang menginfeksi sel-sel eukariota (organisme multisel dan
banyak jenis organisme sel tunggal), sementara istilah bakteriofag atau fag
digunakan untuk jenis yang menyerang jenis-jenis sel prokariota (bakteri dan
organisme lain yang tidak berinti sel).

Virus sering diperdebatkan statusnya sebagai makhluk hidup karena ia tidak


dapat menjalankan fungsi biologisnya secara bebas. Karena karakteristik
khasnya ini virus selalu terasosiasi dengan penyakit tertentu, baik pada manusia
(misalnya virus influenza dan HIV), hewan (misalnya virus flu burung), atau
tanaman (misalnya virus mosaik tembakau/TMV).

1.2 RUMUSAN MASALAH


Bagaimana Sejarah singkat virus?
Bagaimana struktur dan anatomi virus?
Bagaimana virus bereproduksi?
Apa saja contoh-contoh virus?
Bagaimana Ciri-ciri dan klasifikasi virus?
Bagaimana macam-macam virus penyebab penyakit dan cara pengobatannya?

1.3 TUJUAN PENULISAN


Adapun makalah ini dibuat adalah untuk memenuhi tugas mikrobiologi dan
parasitologi yang telah diberikan kepada mahasiswa dan juga supaya mahasiswa
mengetahui tentang pengertian,sejarah singkat,ciri-ciri,Klasifikasi,dan macam-
macam virus dan cara menanggulanginya.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DEFENISI VIRUS


Virus adalah parasit intraseluler obligat dan ukurannya 20-200 nm, bentuk dan
komposisi kimianya bervariasi, tetapi hanya mengandung RNA or DNA.
Partikelnya secara utuh disebut VIRION yang terdiri dari Capsid yang dapat
terbungkus oleh sebuah Glycoprotein/membrane lipid. Virus resisten terhadap
antibiotics Virus merupakan Partikel yang bersifat parasit obligat pada
sel/makhluk hidup Aseluler (bukan merupakan sel) Berukuran sangat renik Di
dalam sel inang virus menunjukkan ciri makhluk hidup, sedangkan di luar sel
menunjukkan ciri bukan makhluk hidup.Bentuk virus berbeda beda ada yang
bula, batang, polihidris dan seperti huruf T.

2.2 SEJARAH SINGKAT VIRUS


Penelitian mengenai virus dimulai dengan penelitian mengenai penyakit mosaik
yang menghambat pertumbuhan tanaman tembakau dan membuat daun
tanaman tersebut memiliki bercak-bercak. Pada tahun 1883, Adolf Mayer,
seorang ilmuwan Jerman, menemukan bahwa penyakit tersebut dapat menular
ketika tanaman yang ia teliti menjadi sakit setelah disemprot dengan getah
tanaman yang sakit. Karena tidak berhasil menemukan mikroba di getah
tanaman tersebut, Mayer menyimpulkan bahwa penyakit tersebut disebabkan
oleh bakteri yang lebih kecil dari biasanya dan tidak dapat dilihat dengan
mikroskop.Pada tahun 1892, Dimitri Ivanowsky dari Rusia menemukan bahwa
getah daun tembakau yang sudah disaring dengan penyaring bakteri masih
dapat menimbulkan penyakit mosaik. Ivanowsky lalu menyimpulkan dua
kemungkinan, yaitu bahwa bakteri penyebab penyakit tersebut berbentuk
sangat kecil sehingga masih dapat melewati saringan, atau bakteri tersebut
mengeluarkan toksin yang dapat menembus saringan. Kemungkinan kedua ini
dibuang pada tahun 1897 setelah Martinus Beijerinck dari Belanda menemukan
bahwa agen infeksi di dalam getah yang sudah disaring tersebut dapat
bereproduksi karena kemampuannya menimbulkan penyakit tidak berkurang
setelah beberapa kali ditransfer antartanaman.Patogen mosaik tembakau
disimpulkan sebagai bukan bakteri, melainkan merupakan contagium vivum
fluidum, yaitu sejenis cairan hidup pembawa penyakit.Setelah itu, pada tahun
1898, Loeffler dan Frosch melaporkan bahwa penyebab penyakit mulut dan kaki
sapi dapat melewati filter yang tidak dapat dilewati bakteri. Namun demikian,
mereka menyimpulkan bahwa patogennya adalah bakteri yang sangat
kecil.Pendapat Beijerinck baru terbukti pada tahun 1935, setelah Wendell
Meredith Stanley dari Amerika Serikat berhasil mengkristalkan partikel penyebab
penyakit mosaik yang kini dikenal sebagai virus mosaik tembakau.Virus ini juga
merupakan virus yang pertama kali divisualisasikan dengan mikroskop elektron
pada tahun 1939 oleh ilmuwan Jerman G.A. Kausche, E. Pfankuch, dan H. Ruska.

2.3 STRUKTUR DAN ANATOMI VIRUS


Virus merupakan organisme subselular yang karena ukurannya sangat kecil,
hanya dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop elektron. Ukurannya lebih
kecil daripada bakteri sehingga virus tidak dapat disaring dengan penyaring
bakteri. Virus terkecil berdiameter hanya 20 nm (lebih kecil daripada ribosom),
sedangkan virus terbesar sekalipun sukar dilihat dengan mikroskop cahaya.
Asam nukleat genom virus dapat berupa DNA ataupun RNA. Genom virus dapat
terdiri dari DNA untai ganda, DNA untai tunggal, RNA untai ganda, atau RNA
untai tunggal. Selain itu, asam nukleat genom virus dapat berbentuk linear
tunggal atau sirkuler. Jumlah gen virus bervariasi dari empat untuk yang terkecil
sampai dengan beberapa ratus untuk yang terbesar. Bahan genetik kebanyakan
virus hewan dan manusia berupa DNA, dan pada virus tumbuhan kebanyakan
adalah RNA yang beruntai tunggal.Bahan genetik virus diselubungi oleh suatu
lapisan pelindung. Protein yang menjadi lapisan pelindung tersebut disebut
kapsid. Bergantung pada tipe virusnya, kapsid bisa berbentuk bulat (sferik),
heliks, polihedral, atau bentuk yang lebih kompleks dan terdiri atas protein yang
disandikan oleh genom virus. Kapsid terbentuk dari banyak subunit protein yang
disebut kapsomer.

Untuk virus berbentuk heliks, protein kapsid (biasanya disebut protein


nukleokapsid) terikat langsung dengan genom virus. Misalnya, pada virus
campak, setiap protein nukleokapsid terhubung dengan enam basa RNA
membentuk heliks sepanjang sekitar 1,3 mikrometer. Komposisi kompleks
protein dan asam nukleat ini disebut nukleokapsid. Pada virus campak,
nukleokapsid ini diselubungi oleh lapisan lipid yang didapatkan dari sel inang,
dan glikoprotein yang disandikan oleh virus melekat pada selubung lipid
tersebut. Bagian-bagian ini berfungsi dalam pengikatan pada dan pemasukan ke
sel inang pada awal infeksi.Kapsid virus sferik menyelubungi genom virus secara
keseluruhan dan tidak terlalu berikatan dengan asam nukleat seperti virus
heliks.

Struktur ini bisa bervariasi dari ukuran 20 nanometer hingga 400 nanometer dan
terdiri atas protein virus yang tersusun dalam bentuk simetri ikosahedral. Jumlah
protein yang dibutuhkan untuk membentuk kapsid virus sferik ditentukan
dengan koefisien T, yaitu sekitar 60t protein. Sebagai contoh, virus hepatitis B
memiliki angka T=4, butuh 240 protein untuk membentuk kapsid. Seperti virus
bentuk heliks, kapsid sebagian jenis virus sferik dapat diselubungi lapisan lipid,
namun biasanya protein kapsid sendiri langsung terlibat dalam penginfeksian
sel.Seperti yang telah dijelaskan pada virus campak, beberapa jenis virus
memiliki unsur tambahan yang membantunya menginfeksi inang. Virus pada
hewan memiliki selubung virus, yaitu membran menyelubungi kapsid. Selubung
ini mengandung fosfolipid dan protein dari sel inang, tetapi juga mengandung
protein dan glikoprotein yang berasal dari virus. Selain protein selubung dan
protein kapsid, virus juga membawa beberapa molekul enzim di dalam
kapsidnya. Ada pula beberapa jenis bakteriofag yang memiliki ekor protein yang
melekat pada kepala kapsid. Serabut-serabut ekor tersebut digunakan oleh fag
untuk menempel pada suatu bakteri.Partikel lengkap virus disebut virion. Virion
berfungsi sebagai alat transportasi gen, sedangkan komponen selubung dan
kapsid bertanggung jawab dalam mekanisme penginfeksian sel inang.

2.4 REPRODUKSI VIRUS


Reproduksi virus secara umum terbagi menjadi 2 yaitu siklus litik dan siklus
lisogenik.

SIKLUS LITIK
Siklus litik dari bakteriofage
1. adsorbsi & penetrasi
2. Pengabungan DNA virus dengan DNA sel
3. Replikasi DNA virus
4. Pembentukan kapsid
5. Pembentukan tubuh dan ekor bakteriofage
6. Lisis

Siklus litik dalam virologi merupakan salah satu siklus reproduksi virus selain
siklus lisogenik. Siklus litik dianggap sebagai cara reproduksi virus yang utama
karena menyangkut penghancuran sel inangnya.Siklus litik, secara umum
mempunyai 3 tahap yaitu adsorbsi & penetrasi, replikasi (biosintesis) dan lisis.
Setiap siklus litik dalam prosesnya membutuhkan waktu dari 10-60 menit.

Tahap adsorbsi yaitu penempelan virus pada inang. Virus mempunyai reseptor
protein untuk menempel pada inang spesifik.Setelah menempel, virus kemudian
akan melubangi membran dari sel inang dengan enzim lisozim. Setelah
berlubang, virus akan menyuntikkan DNA virusnya kedalam sitoplasma sel
inang.
Replikasi (Biosintesis)

Setelah disuntikkan kedalam sel inang, DNA dari virus akan menonaktifkan DNA
sel inangnya dan kemudian mengambil alih kerja sel inang, lalu menggunakan
sel tersebut untuk memperoleh energi dalam bentuk ATP untuk melanjutkan
proses reproduksinya.DNA dari virus, akan menjadikan sel inang sebuah tempat
pembentukan virus baru, kemudian DNA akan mengarahkan virus untuk
menghasilkan protein dan mereplikasi DNA virus untuk dimasukkan ke dalam
virus baru yang sedang dibuat.Molekul-molekul protein (DNA) yang telah
terbentuk kemudian diselubungi oleh kapsid, kapsid dibuat dari protein sel inang
dan berfungsi untuk memberi bentuk tubuh virus.
Lisis

Tahap lisis terjadi ketika virus-virus yang dibuat dalam sel telah matang. Ratusan
virus-virus kemudian akan berkumpul pada membran sel dan menyuntikkan
enzim lisosom yang menghancurkan membran sel dan menyediakan jalan keluar
untuk virus-virus baru. Sel yang membrannya hancur itu akhirnya akan mati dan
virus-virus yang bebas akan menginvasi sel-sel lain dan siklus akan berulang
kembali.

SIKLUS LISOGENIK
Siklus lisogenik dalam virologi merupakan siklus reproduksi virus selain siklus
litik. Tahapan dari siklus ini hampir sama dengan siklus litik, perbedaannya yaitu
sel inangnya tidak hancur tetapi disisipi oleh asam nukleat dari virus. Tahap
penyisipan tersebut kemudian membentuk provirus.Siklus lisogenik secara
umum mempunyai tiga tahap, yaitu adsorpsi dan penetrasi, penyisipan gen virus
dan pembelahan sel inang.

Virus menempel pada permukaan sel inang dengan reseptor protein yang
spesifik lalu menghancurkan membran sel dengan enzim lisozim, virus
melakukan penetrasi pada sel inang dengan menyuntikkan materi genetik yang
terdapat pada asam nukleatnya kedalam sel.

Asam nukleat dari virus yang telah menembus sitoplasma sel inang kemudian
akan menyisip kedalam asam nukleat sel inang, tahap penyisipan tersebut
kemudian akan membentuk provirus (pada bakteriofage disebut profage).
Sebelum terjadi pembelahan sel, kromosom dan provirus akan bereplikasi.

Sel inang yang telah disisipi kemudian melakukan pembelahan, provirus yang
telah bereplikasi akan diberikan kepada sel anakan dan siklus inipun akan
kembali berulang sehingga sel yang memiliki profage menjadi sangat banyak.

Provirus yang baru dapat memasuki keadaan Litik dalam kondisi lingkungan yang
tepat tetapi kemungkinannya sangat kecil. Kemungkinan akan bertambah besar
apabila diberi agen penginduksi.

2.5 CIRI-CIRI VIRUS

Virus memiliki ciri-ciri sebagai berikut:

Virus bersifat aseluler (tidak mempunyai sel)

Virus berukuran amat kecil , jauh lebih kecil dari bakteri, yakni berkisar antara 20
m - 300m (1 mikron = 1000 milimikron). untuk mengamatinya diperlukan
mikroskop elektron yang pembesarannya dapat mencapai 50.000 X.
Virus hanya memiliki salah satu macam asam nukleat (RNA atau DNA)

Virus umumnya berupa semacam hablur (kristal) dan bentuknya sangat


bervariasi. Ada yang berbentuk oval , memanjang, silindris, kotak dan
kebanyakan berbentuk seperti kecebong dengan "kepala" oval dan "ekor"
silindris.

Tubuh virus terdiri atas: kepala , kulit (selubung atau kapsid), isi tubuh, dan
serabut ekor.

virus memiliki lapisan protein yang disebut kapsid

Virus hanya dapat berkembang biak di sel hidup lainnya. Seperti sel hidup pada
bakteri, hewan, tumbuhan, dan sel hidup pada manusia.

Virus tidak dapat membelah diri.

Virus tidak dapat diendapkan dengan sentrifugasi biasa, tetapi dapat


dikristalkan.

2.6 CONTOH-CONTOH VIRUS

HIV (Human Immunodeficiency Virus)

Termasuk salah satu retrovirus yang secara khusus menyerang sel darah putih
(sel T). Retrovirus adalah virus ARN hewan yang mempunyai tahap ADN. Virus
tersebut mempunyai suatu enzim, yaitu enzim transkriptase balik yang
mengubah rantai tunggal ARN (sebagai cetakan) menjadi rantai ganda kopian
ADN (cADN). Selanjutnya, cADN bergabung dengan ADN inang mengikuti
replikasi ADN inang. Pada saat ADN inang mengalami replikasi, secara langsung
ADN virus ikut mengalami replikasi.

Virus herpes
Virus herpes merupakan virus ADN dengan rantai ganda yang kemudian disalin
menjadi mARN.

Virus influenza
Siklus replikasi virus influenza hampir sama dengan siklus replikasi virus herpes.
Hanya saja, pada virus influenza materi genetiknya berupa rantai tunggal ARN
yang kemudian mengalami replikasi menjadi mARN.

Paramyxovirus
Paramyxovirus adalah semacam virus ARN yang selanjutnya mengalami replikasi
menjadi mARN. Paramyxovirus merupakan penyebab penyakit campak dan
gondong

2.7 PERANAN VIRUS DALAM KEHIDUPAN


Beberapa virus ada yang dapat dimanfaatkan dalam rekombinasi genetika.
Melalui terapi gen, gen jahat (penyebab infeksi) yang terdapat dalam virus
diubah menjadi gen baik (penyembuh) disebut vaksin. Contohnya pembuatan
vaksin polio, rabies, hepatitis B, influenza, cacar, dan vaksin MMR (Measles,
Mumps, Rubella) untuk cacar gondong, dan campak.

Pada umumnya virus bersifat rnerugikan. Virus sangat dikenal sebagai penyebab
penyakit infeksi pada manusia, hewan, dan tumbuhan. Sejauh ini tidak ada
makhluk hidup yang tahan terhadap virus. Tiap virus secara khusus menyerang
sel-sel tertentu dari inangnya. Virus dapat menginfeksi tumbuhan, hewan, dan
manusia sehingga menimbulkan penyakit.

BAB III
PENUTUP

3.1 KESIMPULAN
Virus adalah parasit berukuran mikroskopik yang menginfeksi sel organisme
biologis. Virus hanya dapat bereproduksi di dalam material hidup dengan
menginvasi dan memanfaatkan sel makhluk hidup karena virus tidak memiliki
perlengkapan selular untuk bereproduksi sendiri.

Struktur dan anatomi virus. Model skematik virus berkapsid heliks (virus mosaik
tembakau): 1. asam nukleat (RNA), 2. kapsomer, 3. kapsid. Virus merupakan
organisme subselular yang karena ukurannya sangat kecil, hanya dapat dilihat
dengan menggunakan mikroskop elektron.

Beberapa virus ada yang dapat dimanfaatkan dalam rekombinasi genetika.


Melalui terapi gen, gen jahat (penyebab infeksi) yang terdapat dalam virus
diubah menjadi gen baik (penyembuh). David Sanders berhasil menjinakkan
cangkang luar virus Ebola sehingga dapat dimanfaatkan sebagai pembawa gen
kepada sel yang sakit (paru-paru).

Penyakit pada manusia akibat virus yang menyebabkan selesma menyerang


saluran pernapasan, virus campak menginfeksi kulit, virus hepatitis menginfeksi
hati, dan virus rabies menyerang sel-sel saraf. Begitu juga yang terjadi pada
penyakit AIDS (acquired immune deficiency syndrome), yaitu suatu penyakit
yang mengakibatkan menurunnya daya tahan tubuh penderita penyakit tersebut
disebabkan oleh virus HIV yang secara khusus menyerang sel darah putih. Selain
itu, penyakit hewan akibat virus yaitu penyakit tetelo penyebabnya adalah new
castle disease virus (NCDV), penyakit kuku dan mulutPenyakit kanker pada ayam
oleh rous sarcoma virus (RSV) dan penyakit rabies. Sedangkan penyakit
tumbuhan akibat virus diantaranya : penyakit mosaik, penyakit degenerasi
pembuluh tapis pada jeruk, dan vein phloem degeneration (CVPD).

Virus sangat sulit untuk dibunuh. Metode pengobatan sejauh ini yang dianggap
paling efektif adalah vaksinasi, untuk merangsang kekebalan alami tubuh
terhadap proses infeksi, dan obat-obatan yang mengatasi gejala akibat infeksi
virus. Selain itu, diperlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk memastikan apakah
suatu penyakit disebabkan oleh bakteri atau virus.

http://www.e-sbmptn.com/2014/11/makalah-biologi-sma-tentang-virus.html#

Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi


secara autonom dan bisa ditemukan pada sel hidup[1]. Di dalam satu sel, dapat
ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun
semua plasmid tidak mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel
tersebut[1]. Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar
dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila
lingkungan kembali normal, DNA plasmid dapat dibuang.[1]

Struktur plasmid[sunting | sunting sumber]

Sebagian besar plasmid memiliki struktur sirkuler, namun ada juga plasmid
linear yang dapat ditemukan pada mikroorganisme tertentu, seperti Borrelia
burgdorferi danStreptomyces.[2] Plasmid ditemukan dalam bentuk DNA utas
ganda yang sebagian besar tersusun menjadi superkoil atau kumparan terpilin.
[3] Struktur superkoil terjadi karenaenzim topoisomerase membuat sebagian
DNA utas ganda lepas (tidak terikat) selama replikasi plasmid berlangsung.
[3] Struktur superkoil akan menyebabkan DNA plasmid berada dalam konformasi
yang disebut lingkaran tertutup kovalen atau covalently closed circular (ccc),
namun apabila kedua utas DNA terlepas maka akan plasmid akan kembali dalam
keadaan normal (tidak terpilin) dan konformasi tersebut disebut sebagai open
circuler (oc).[3]

Sejarah plasmid[sunting | sunting sumber]

Penemuan akan plasmid telah dimulai sejak tahun 1887, ketika Robert
Koch mempublikasikan penelitiannya tentang bakteri Bacillus anthracis sebagai
penyebab penyakitantraks.[4] Sekitar 100 tahun kemudian, para ilmuwan
menemukan bahwa bakteri tersebut memiliki 2 plasmid yang merupakan faktor
virulensi penyebab antraks.[4] Keyakinan akan keberadaan DNA plasmid berhasil
dibuktikan oleh J. Lederberg dan dan W. Hayes pada tahun 1950-an.[4] Kedua
ilmuwan tersebut berhasil menyelidiki tentang
peristiwakonjugasi pada Escherichia coli yang melibatkan plasmid.[4] Tidak
beberapa lama setelah itu, plasmid terbukti merupakan DNA ekstrakromosomal
yang menyebabkan resistensiantibiotik pada golongan bakteri enterik dan dapat
ditransmisikan antarsel[4]. Sejak saat itu, beberapa laboratorium mulai
membuat plasmid yang dapat ditransfer ke sel hidup, seperti sel bakteri dan
tanaman.[4]

Fungsi plasmid[sunting | sunting sumber]

Dewasa ini, plasmid telah diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan
untuk digunakan sebagai vektor kloning[5]. Agar dapat digunakan
sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria, yaitu
berukuran kecil, relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number),
memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs
pemotongan enzim restriksi untuk memudahkan penyisipan DNA ke dalam
vektor plasmid[5].

Penamaan plasmid[sunting | sunting sumber]

Pada awalnya penamaan plasmid didasarkan pada sifat fenotipe yang dikodekan
oleh DNA plasmid tersebut.[6] Contohnya plasmid ColE1 yang berasal dari E.
coli dapat menyandikan bakteriocin colicin.[6] Banyaknya laboratorium ataupun
institusi yang membuat plasmid kloning membuat sistem penamaan tersebut
berubah. Untuk standardisasi penulisan plasmid, digunakan huruf "p" yang
diikuti oleh inisial huruf kapital dan angka[6]. Huruf kapital diambil dari
nama institusi atau laboratorium tempat plasmid tersebut berasal ataupun dari
nama penemu plasmid tersebut[6]. Sedangkan, angka yang ada merupakan
kode antara dua laboratorium tempat plasmid tersebut dibuat[6].
Contohnya:pBR322, "p" menyatakan plasmid, BR
merupakan laboratorium tempat plasmid tersebut pertama kali dikonstruksi (BR
dari Bolivar dan Rodriguez, perancang plasmid tersebut), sedangkan 322
menyatakan di laboratorium mana plasmid ini dibuat, banyak pBR lainnya
seperti pBR325, pBR327, dll.[6]

Mekanisme mencegah pembuangan plasmid[sunting | sunting sumber]

Untuk mencegah pembuang plasmid dari sel yang tidak lagi membutuhkannya,
terdapat beberapa mekanisme yang sudah diketahui.[4] Salah satunya adalah
beberapa plasmid menyandikan protein yang dapat membunuh sel yang
membuangnya.[4] Mekanisme ini disebut ketergantungan plasmid (plasmid
addiction) yang diklasifikasikan menjadi tiga jenis berdasarkan aksi yang
dilakukan protein antitoksin yang disandikan plasmid.[4] Ketiga jenis aksi
tersebut adalah berinteraksi dengan toksin, melindungi target yang akan
diserang toksin, dan menghambat ekspresi toksin tersebut.[4]

https://id.wikipedia.org/wiki/Plasmid

Plasmid dan Penggunaannya dalam Rekayasa Genetika


A. Pengertian Plasmid Sebagai Vektor dalam Rekayasa Genetika

Vektor merupakan molekul DNA yang membawa suatu DNA asing kedalam sel
inang, dengan harapan sifat yang ada pada DNA asing tersebut dapat terekspresi
dalam sel inang. Salah satu vektor yang bisa digunakan untuk membawa
molekul DNA asing masuk dalam sel inang adalah plasmid. Plasmid digunakan
untuk melakukan rekayasa pada berbagai organisme yang tidak bisa diperoleh
secara alami. Rekayasa ini dilakukan pada tingkat genetik sehingga disebut
sebagai rekayasa genetika.

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler (lingkaran tertutup) yang berantai


ganda dan dapat bereplikasi sendiri di luar kromosom dan tidak mengandung
gen-gen esensial. Plasmid terdapat secara alami maupun sudah mengalami
modifikasi yang disesuaikan dengan keperluan manipulasi genetik. Plasmid
terdapat pada organisme prokariot maupun eukariot. Plasmid inilah yang
berfungsi sebagai pembawa sifat rekombinan pada organisme yang akan
direkayasa. Plasmid memilki ciri-ciri antara lain :

a. berbentuk lingkaran tertutup dan untaiannya ganda (double stranded)

b. dapat melakukan replikasi sendiri di luar kromosom inti

c. terdapat di luar kromosom

d. secara genetik dapat ditransfer secara stabil

Agar dapat digunakan sebagai vektor, plasmid harus memiliki syarat-


syarat diantaranya sebagai berikut :

1. ukurannya relatif kecil dibanding dengan pori dinding sel inangnya

2. mempunyai sekurang-kurangnya 2 gen marker yang dapat menandai masuk


tidaknya plasmid ke dalam sel inang

3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah


satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA
asing

4. memiliki titik awal replikasi sehingga dapat melakukan replikasi dalam sel
inang

Menurut tujuan penggunaannya, plasmid dibedakan menjadi 2 yaitu :

1. plasmid untuk kloning prokariot, sebagai contoh adalah plasmid pUC 19 dan
pBR 322

2. plasmid yang digunakan untuk kloning eukariot yang digunakan adalah


plasmid Ti

Gambar plasmid pBR 322 dengan tempat pengenalan pemotongan


DNAnya dapat dilihat pada gambar1.
Gambar 1. Plasmid pBR 322

Gambar plasmid pUC 19 dan tempat pengenalan pemotongan DNAnya dapat


dilihat pada gambar2.

Gambar 2. Plasmid pUC 19

B. Kegunaan Plasmid
Plasmid digunakan sebagai vektor dalam rekayasa genetika. Dalam hal ini
plasmid digunakan untuk membawa suatu rangkaian fragmen DNA asing masuk
dalam sel inang dengan harapan plasmid rekombinan itu mengalami replikasi
dan mengekspresikan sifat baru pada DNA asing tersebut, sehingga sifat yang
diinginkan dapat diperoleh dari plasmid rekombinan tersebut.

C. Proses penggunaan plasmid di dalam rekayasa genetika

Penggunaan plasmid untuk rekayasa genetika harus disesuaikan


kebutuhannya sebab ada berbagai macam plasmid yang digunakan. Proses
penggunaan plasmid dalam rekayasa genetika melalui langkah-langkah sebagai
berikut :

1. penentuan terlebih dahulu jenis plasmid yang hendak digunakan sebab ada
beberapa jenis plasmid seperti pBR 322 dan pUC19 yang bisa digunakan untuk
prokariot dan plasmid Ti yang bisa digunakan untuk organisme eukariot

2. bila plasmid telah ditentukan maka selanjutnya adalah menentukan tempat


pengenalan enzim restriksi (pemotongan) yang hendak digunakan sebagai
tempat penyisipan DNA asing dan marker untuk menandai masuk tidaknya
plasmid pada sel inang

3. apabila telah diketahui tempat pengenalan restriksi dan markernya maka


langkah selanjutnya adalah menyiapkan enzim restriksi sebagai pemotong
plasmid. Enzim yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan
pemotong DNA asing sehingga nanti keduanya bisa bersatu misal : EcoR1

4. langkah selanjutnya adalah plasmid dipotong dengan enzim restriksi yang


sesuai pada daerah potongannya

5. plasmid siap disambungkan dengan DNA asing yang memiliki sifat tertentu, yang
telah dipotong juga dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotong
plasmid

D. Enzim restriksi sebagai pemotong plasmid

Untuk memotong plasmid digunakan enzim restriksi. Enzim restriksi


adalah enzim yang digunakan untuk memotong DNA secara spesifik. Enzim
restriksi disebut sebagai gunting biologi. Enzim ini diisolasi dari bakteri. Restriksi
yang digunakan untuk memotong plasmid harus sama dengan pemotong DNA
asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid dan DNA asing
yang disisipkan bisa bersatu. Prinsip kerja enzim restriksi adalah:

1. Enzim restriksi yang digunakan adalah enzim endonuklease restriksi. Enzim


pemotong ini mengenali DNA pada situs kusus dan memotong pada situs
tersebut
2. Situs pengenalan enzim restriksi adalah daerah yang simetri dengan
poliandrom, artinya bila kedua utas DNA tersebut masing-masing dibaca dengan
arah yang sama akan memberikan urutan yang sama pula nukleotidanya

3. Pemotongan enzim restriksi akan menghasilkan potongan yaitu ujung kohesif


(sticky end) dan ujung rata (blunt end).

Perbedaan antara hasil pemotongan yang berupa sticky end dan blunt end
dapat dilihat pada tabel 1. berikut ini.

Berbagai contoh restriksi enzim yang mengenali pada situs pemotongan


tertentu pada DNA dapat dilihat pada tabel 2.

Proses pemotongan DNA digambarkan pada gambar 3. berikut ini


Gambar 3. Pemotongan enzim restriksi pada DNA

E. Enzim Ligase sebagai penyembung plasmid dengan DNA asing

Enzim ligase adalah enzim yang berfungsi untuk menyambung dua


ujung potongan DNA. Enzim ligase yang sering digunakan adalah DNA ligase
dari E. Coli dan DNA ligase dari Fage T4. Prinsip kerja enzim ligase sebagai
berikut:

1. Enzim ligase menyambung dua ujung DNA yang semulanya terpotong

2. penyambungan dilakukan dengan cara menyambung 2 ujung DNA melalui


ikatan kovalen antara ujung 3OH dari utas satu dengan ujung 5P dari utas yang
lain

3. Penggunaan ligasi DNA ini mengkatalis ikatan fosfodiester antara kedua ujung
DNA sehingga kedua fragmen DNA yang berupa potongan bisa bersatu menjadi
satu.

Gambar struktur enzim ligase dapat dilihat pada gambar 4 berikut ini :

Gambar 4. Struktur enzim ligase


Proses penyambungan DNA ligasi pada daerah pemotongan
digambarkan pada gambar 5.

Gambar 5. Penyambungan DNA ligase pada potongan DNA

F. Pemotongan dan penyambungan plasmid dan DNA asing sehingga


dihasilkan Plasmid Rekombinan

Untuk menciptakan plasmid rekombinan yang mengandung sifat DNA


asing tertentu yang dilakukan adalah dengan menyambung DNA asing tersebut
dengan plasmid yang ada. Plasmid rekombinan terbentuk sebagai sambungan
antara plasmid dengan DNA asing, sehingga plasmid tersebut mengandung sifat
tertentu yang telah disesuaikan dengan kebutuhan. Secara sederhana prosedur
untuk menciptakan plasmid rekombinan dapat dilakukan sebagai berikut:

1. menyiapkan bakteri yang mengandung DNA asing dengan sifat tertentu

2. menyiapkan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor

3. pemotongan DNA asing dengan sifat yang dibutuhkan dengan enzim restriksi
semisal dari E. coli

4. pemotongan plasmid yang akan digunakan sebagai vektor dengan enzim


restriksi yang sama yaitu E. Coli
5. hasil potongan DNA dengan sifat tertentu disambungkan pada plasmid dngan
menggunakan enzim penyambung yaitu DNA ligase. DNA ligase akan mengikat
ujung 3OH dengan ujung 5P dan membentuk ikatan fosfodiester sehingga
plasmid dan DNA asing dengan sifat tertentu bisa bersatu

6. terbentuklah plasmid rekombinan yang membawa DNA asing dengan sifat


tertentu tersebut. Plasmid ini siap ditransfer ke dalam sel inang untuk
memperoleh organisme transgenik

Gambar proses terbentuknya Plasmid rekombinan sebagai hasil


penyambungan plasmid dengan DNA asing dengan sifat tertentu dapat dilihat
pada gambar 6 berikut ini.

Gambar 6. Penyambungan Plasmid dengan DNA asing

G. Plasmid Ti

Sel-sel tumbuhan tidak mengandung plasmid alami yang dapat


digunakan sebagai vektor kloning, akan tetapi ada suatu bakteri
yaituAgrobacterium tumefaciens yang dapat membawa plasmid berukuran 200
kb dan disebut dengan plasmid Ti (Tumor inducing atau penyebab tumor).
BakteriAgrobacterium tumefaciens dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti
tomat dan tembakau serta tanaman monokotil khususnya padi. Ketika infeksi
berlangsung bagian tertentu plasmid Ti yang disebut dengan T-DNA, akan
terintegrasi ke dalam DNA kromosom tanaman menyebabkan pertumbuhan sel-
sel yang tak terkendali, akibatnya akan terbentuk tumor.

Plasmid Ti rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada


daerah T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman.
Gen target ini selanjutnya akan diekspresikan dengan menggunakan sistem DNA
tanaman. Dalam prakteknya ukuran plasmid yang begitu besar sangat sulit
untuk dimanipulasi. Namun ternyata apabila bagian T-DNA dipisahkan dari
bagian-bagian lain plasmid Ti, integrasi DNA tanaman masih dapat terjadi
asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada dalam satu
selAgrobacterium tumefaciens. Dengan demikian, manipulasi atau penyisipan
fragmen DNA asing hanya dilakukan pada T-DNA dengan cara seperti halnya
yang dilakukan pada plasmid E. Coli. Selanjutnya plsmid T-DNA rekombinan yang
dihasilkan ditransformasikan ke dalam sel Agrobacterium tumefaciensyang
membawa plamid Ti tanpa bagian T-DNA. Perbaikan prosedur berikutnya adalah
pembuangan gen-gen pembentuk tumor yang terdapat pada T-DNA.

Gambar. Plasmid Ti

Pemanfaatan plasmid Ti dalam rekombinan tumbuhan sudah banyak


dimanfaatkan seperti plasmid Ti Agrobacterium tumefaciens yang digunakan
untuk pembuatan tanaman kapas Bt yang tahan terhadap hama ulat. Ulat yang
memakan tanaman akan mengalami kematian. Pemanfaatan plamid ini juga
untuk meningkatkan produksi tanaman. Misalkan saja tanaman yang
mengandung protein tertentu setelah direkayasa dengan menggunakan plasmid
rekombinan ini. Sehingga pada saat makan tanaman ini sudah mengandung
protein tertentu.
Gambar. Rekayasa tanaman dengan menggunakan Plasmid Ti
Dari gambar di atas dapat dijelaskan bahwa penggunaan plasmid Ti
dilakukan dengan cara menyambung plasmid dengan DNA asing. Pemotongan
DNA dilakukan dengan menggunakan enzim restriksi kemudian masing-masing
potongan dilekatkan dengan ligasi DNA terbentuklah plasmid rekombinan.
Sebagai hasilnya plasmid rekombinan dimasukan dalam nukleus tanaman
melalui fusi protoplasma dan plasmid rekombinan akan berfusi dengan inti
tanaman. Protopalasma selanjutnya dikulturkan dalam media kultur jaringan
kemudian setelah terbentuk tanaman, setelah itu tanaman ditumbuhkan pada
habitatnya. Tanaman yang dihasilkan akan memiliki sifat tertentu sesuai dengan
sifat DNA asing yang digunakan. Sehingga apabila kita memakan tanaman
tersebut berarti telah mengkonsumsi protein tertentu. Sifat inilah yang mulai
dikembangkan pada tanaman
http://dunianyabiosains.blogspot.com/2014/08/plasmid-dan-penggunaannya-
dalam_20.html#