AVANCE

N 8 Octubre 2012

AVANCE
Publicacin de contenido cientfico editada por GT Laboratorio S.R.L. Necochea 3274 Rosario

Para la determinacin de Gonadotrofina Corinica

HCG ELISA Humana en orina, plasma o suero.
Mtodo ELISA visual.

GT Lab lleva desde hace varios aos produciendo un kit para la detec-
cin de gonadotrofina corinica humana (hCG) basado en un enzimo
inmuno ensayo (ELISA) directo.
Desde su lanzamiento, el kit tuvo un rpido xito por su excelente
performance.
No obstante, GT Lab est permanentemente revisando sus productos
segn su poltica de mejora permanente. En el caso de la tecnologa
ELISA, mucho ha evolucionado en lo referente a la preparacin de los
componentes de los reactivos que se emplean.
As, podemos sealar el fuerte desarrollo producido en la fabricacin
de materiales plsticos empleados en la preparacin de la fase slida
(microcubetas), logrndose procesos productivos que hacen que los
anticuerpos empleados en la sensibilizacin de las mismas queden
adheridos con mucha ms fuerza, lo que redunda en mejoras en la
sensibilidad y estabilidad de los reactivos.
Igualmente, se ha avanzado mucho en los mtodos de purificacin de
protenas, lo que ha redundado en anticuerpos y conjugados mucho
ms puros, en mejoras en la especificidad y, nuevamente, en su esta-
bilidad.
Igualmente, debemos sealar mejoras productivas en la preparacin
misma de los reactivos componentes del kit en cuanto a la obtencin
de insumos de mayor pureza y una evolucin lgica de la tecnologa
de produccin.
As se obtienen importantes resultados en la produccin de reactivos;
robustos, de alta calidad de resultados; y con una excelente constan-
cia de lote a lote.

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HCG ELISA
 AVANCE
INTRODUCCIN
Gonadotropina Corinica Humana (hCG)
La hCG es una hormona glicoproteica producida en el emba-
razo, fabricada por el embrin en desarrollo poco despus de
la concepcin y ms tarde por el sincitiotrofoblasto (parte de
la placenta). Su funcin es evitar la desintegracin del cuerpo
lteo del ovario y, por ende, mantener la produccin de pro-
gesterona que es fundamental para el embarazo en los seres
humanos. (1,2,3)
La hCG puede tener funciones adicionales; por ejemplo, se
cree que afecta a la tolerancia inmunolgica del embarazo.
Las pruebas de embarazo ms precoces se basan en la detec-
cin de hCG. (1,2,3)
Debido a que la hCG es producida tambin por algunos tipos
de tumores, es un importante marcador tumoral, pero no se
sabe si esta produccin es una causa o un efecto de la tumo-
rignesis. (4,5).
Al igual que otras gonadotropinas, la hCG se puede extraer
de la orina de mujeres embarazadas, que es la fuente ms
usual y abundante, o por recombinacin gentica. (6)
Estructura de la hCG
La hCG es una glicoprotena compuesta de 244 aminoci-
dos, con un peso molecular de 36,7 kDa. Sus dimensiones
totales son de 753530 angstroms (7,53,53 nanmetros).
(1,2,3). La Figura 1 ofrece una visin esquematizada de su
estructura.
Es heterodimrica, con una subunidad (beta) que es espe-
cfica de la hCG, y con una subunidad (alfa) idntica a la de
la hormona luteinizante (LH), la hormona folculo-estimulante
(FSH), y la hormona estimulante del tiroides (TSH). La subuni-
dad (alfa) tiene 92 aminocidos de largo y unas dimensiones
de 602515 angstroms (62,51,5 nm).
La subunidad de la hCG contiene 145 aminocidos y unas
dimensiones de 6,52,52 nm, codificados mediante seis ge-
nes muy homlogos que estn dispuestos en tndem y en
pares invertidos en el cromosoma 19q 13.3 - CGB (1, 2, 3, 5
, 7, 8).
Las dos subunidades crean un pequeo ncleo hidrfobo ro-
deado por una gran superficie con una proporcin rea volu-
men 2,8 veces mayor que la de una esfera. La gran mayora
de los aminocidos exteriores son hidrfilos.
Funciones de la hCG
La hCG interacta con el receptor LHCG y promueve el man-
tenimiento del cuerpo lteo durante el comienzo del embara-
zo, haciendo que ste secrete la hormona progesterona. La
progesterona enriquece el tero con un grueso revestimiento
de vasos sanguneos y capilares, de manera que pueda soste-
ner el crecimiento del feto. Debido a su alta carga negativa, la
hCG puede repeler las clulas inmunitarias de la madre, pro-
tegiendo al feto durante el primer trimestre. Tambin se ha
formulado la hiptesis de que la hCG placentaria puede ser
un vnculo para el desarrollo de la inmunotolerancia maternal.
Por ejemplo, las clulas endometriales tratadas con hCG indu-
HCG ELISA
cen un aumento en la apoptosis de las clulas T. Estos resulta-
dos sugieren que la hCG puede ser un enlace en el desarrollo
de la tolerancia inmunolgica peritrofoblstica, puediendo
facilitar la invasin del trofoblasto, un proceso que acelera el
desarrollo fetal en el endometrio. Tambin se ha sugerido que
los niveles de hCG estn vinculados con la gravedad de los
mareos matinales en mujeres embarazadas. (3)
Debido a su similitud con la hormona luteinizante (LH), la
hCG tambin puede usarse clnicamente para inducir la ovu-
lacin en los ovarios, as como la produccin de testosterona
en los testculos. (7,8)
La hCG tambin juega un papel en la diferenciacin y prolife-
racin celular, y puede activar la apoptosis. (3)
Pruebas de Gonadotropina Corinica Humana
Los niveles de hCG pueden medirse en la sangre o la orina. (9)
Con mayor frecuencia, se hace como una prueba de embara-
zo, destinada a indicar la presencia o ausencia de un embrin
implantado. Tambin pueden hacerse pruebas de hCG para
el diagnstico o seguimiento de clulas germinales y tumores
trofoblsticos.
La mayor parte de las pruebas emplean un anticuerpo mono-
clonal (MAb) especfico de la subunidad de la hCG (hCG).
Este procedimiento se emplea para asegurar que las pruebas
no dan falsos positivos por interferencia de la LH y la FSH en
la determinacin. Tanto la LH como la FSH estn siempre pre-
sentes en diferentes niveles, mientras que la presencia de hCG
casi siempre indica el embarazo. (9)
Prueba en orina
La prueba de orina puede ser un inmunoanlisis de distinto
fundamento (aglutinacin de ltex, ELISA, cromatogrfico,
etc.). Los umbrales de deteccin van de 20 a 100 mUI/ml (mili
unidades internacionales por mililitro), dependiendo del reac-
tivo y el mtodo empleado.
La realizacin del test sobre la primera orina matinal cobra
mayor importancia cuanto ms temprano es el embarazo a
detectar, ya que dicha miccin es ms concentrada. Cuando la
orina es ms diluida, con gravedad especfica inferior a 1.015,
la concentracin de hCG puede resultar fisiolgicamente baja
quedar por debajo de la sensibilidad del mtodo, dando even-
tuales falsos negativos.
Prueba de suero
La prueba en suero o plasma es tpicamente un inmunoa-
nlisis quimioluminiscente, ELISA o fluorimtrico, que puede
detectar niveles de hCG tan bajos como 5 mUI/ml y permite
la cuantificacin de la concentracin de hCG.
La determinacin cuantitativa de hCG es til en el segui-
miento de clulas germinales y tumores trofoblsticos, el se-
guimiento despus del aborto involuntario, y el diagnstico y
seguimiento despus de tratar un embarazo ectpico. La au-
sencia de un feto visible en la vagina por ultrasonido despus
de que la hCG haya alcanzado niveles de 1500 UI/ml es muy
indicativo de un embarazo ectpico.
2

Una enfermedad trofoblstica gestacional, como las molas
hidatidiformes (embarazo molar), o el coriocarcinoma, pue-
den producir altos niveles de hCG (debido a la presencia de
sincitioltrofoblastos, parte de las vellosidades que componen
la placenta), a pesar de la ausencia de un embrin.
Los altos niveles de hCG tambin son un componente del
triple test, una prueba de deteccin para determinadas anor-
malidades cromosmicas fetales y defectos de nacimiento.
En todos estos casos, un ensayo cualitativo por un mtodo
sensible y confiable como el ELISA, permite tener un dato
preliminar, a menudo suficiente para el diagnstico, antes de
recurrir a mtodos ms costosos como la cuantificacin.
Concentraciones usuales de hCG
La Tabla I indica los niveles de hCG tpicamente encontrados
en suero para una poblacin normal. Cada mujer puede te-
ner valores que escapen de estos rangos. La Tabla I indica los
niveles de hCG tpicamente encontrados en suero para una
poblacin normal. Cada mujer puede tener valores que esca-
pen de estos rangos.
Aplicaciones de la determinacin de hCG
En general excede la necesidad de determinar su presencia
en relacin al embarazo.
Efectivamente, existen varias situaciones vinculadas a dife-
rentes patologas y tratamientos donde la determinacin de
hCG adquiere importancia.
- como marcador tumoral
La subunidad de la gonadotropina corinica humana tam-
bin es secretada por algunos tipos de cncer como el corio-
carcinoma, los tumores de clulas germinales, la formacin de
mola hidatidiforme, el teratoma con elementos de coriocarci-
noma (es raro), y los islotes de clulas tumorales. Por esta ra-
zn, un resultado positivo en hombres puede ser una prueba
de cncer. El rango normal para los hombres es de 0-5 UI/ml,
aunque no debera sospecharse que hay cncer si el nivel es
menor de 30 UI/ml. (4,5)
- en tratamientos de fertilidad
La hCG se utiliza ampliamente como medicacin parenteral
en tratamientos de fertilidad en lugar de la hormona luteini-
zante. En presencia de uno o ms folculos ovricos maduros,
la ovulacin puede ser activada mediante la administracin de
hCG. Como la ovulacin ocurrir unas 36-48 horas despus
de la inyeccin de hCG, se pueden programar procedimientos
para tomar ventaja de esta secuencia temporal. Por lo tanto,
las pacientes que siguen una fertilizacin in vitro, en general,
reciben hCG para desencadenar la ovulacin, pero tienen sus
vulos recuperados en unas 36 horas despus de la inyeccin
(unas pocas horas antes de lo que los vulos seran liberados
normalmente en el ovario). (7,8)
La administracin de hCG tambin se utiliza, en determina-
das circunstancias, para aumentar la produccin de proges-
terona. (10)
3
HCG ELISA
AVANCE
En el varn, las inyecciones de hCG se utilizan para estimular
las clulas de Leydig que sintetizan la testosterona. La testos-
terona intratesticular es necesaria para la espermatognesis
en las clulas de Sertoli. Los usos tpicos de la hCG en los
hombres son el hipogonadismo y los tratamientos de fertili-
dad. (11,12)
Durante los primeros meses de embarazo, la transmisin del
VIH-1 de la mujer al feto es extremadamente rara. Se ha su-
gerido que esto se debe a la alta concentracin de hCG, y
que la subunidad beta de esta protena es activa contra el
VIH-1. (13)
- para la prdida de peso
Un uso polmico de la hCG es como complemento de una
dieta ultra-baja en caloras desarrollada por el endocrinlogo
britnico ATW Simeons (14). Esta tcnica permitira perder
grasa con una dieta muy baja en caloras sin perder tejido
muscular, combatiendo as la obesidad. Sin embargo, el uso
de la hCG para perder peso se considera ineficiente e insegu-
ro por la comunidad cientfica. (15,16,17)
- en combinacin con esteroides anabolizantes
En el mundo de las drogas que aumentan el rendimiento de-
portivo, la hCG se utiliza cada vez ms en combinacin con
varios ciclos de esteroides anablizantes andrognicos (EAA).
En los hombres, la hCG imita a la hormona luteinizante y
ayuda a restaurar y mantener la produccin de testosterona
en los testculos. Debido a esto, la hCG se utiliza comnmente
durante y despus de los ciclos de esteroides para mantener y
restaurar el tamao testicular, as como la produccin de tes-
tosterona endgena. Sin embargo, si la hCG se utiliza durante
demasiado tiempo y en una dosis demasiado alta (con el con-
siguiente aumento de la testosterona natural), eventualmente
inhibir su propia produccin a travs de retroalimentacin
negativa sobre el hipotlamo y la hipfisis. (18)
Principio del ensayo
Se trata de un ensayo ELISA que emplea anticuerpos mo-
noclonales y policlonales especficos para subunidad hCG,
permitiendo una determinacin especfica, rpida y sensible.
La hCG eventualmente presente en la muestra es capturada
por anticuerpos policlonales adsorbidos en la superficie inter-
na de los pocillos de una micro policubeta. Estas molculas
de hCG as retenidas, reaccionan simultneamente con un
anticuerpo monoclonal anti-beta hCG conjugado con peroxi-
dada, reteniendo as una actividad enzimtica proporcional a
la cantidad de hormona presente.
Tras lavar el exceso de muestra y conjugado, se podr revelar
la activad de peroxidasa retenida en el pocillo mediante la
accin de la tetrametilbenzidina. La aparicin de un color ce-
leste a azul ser indicador de una reaccin positiva.
Composicin de los Reactivos Provistos
Los reactivos son provistos listos para usar.
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Pocillos sensibilizados: 48 pocillos separables individual-
mente con anticuerpo policlonal anti-hCG adsorbidos en su
superficie.
Enzima-Conjugado: un frasco gotero con 2.5 ml de anti-
cuerpo monoclonal anti-hCG conjugado con peroxidasa. El
reactivo posee un colorante rosado en su composicin para
facilitar la visualizacin de su agregado en cada pocillo.
Reactivo A: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solucin
de perxido de hidrgeno.
Reactivo B: un frasco gotero conteniendo 4 ml de solucin
de tetrametilbenzidina en buffer fosfatos-citrato 50 mmol/l,
pH = 5.0
Control Negativo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de
una solucin proteica de, aproximadamente, 25 mUI/ml hCG
Control Positivo: un frasco gotero conteniendo 1 ml de una
solucin proteica de reaccn negativa para hCG
Solucin lavadora: 2 frascos goteros conteniendo, cada uno,
60 ml de solucin salina tamponada a pH = 7.4
Accesorios:
Un soporte para los pocillos.
Conservacin y estabilidad
Conserve los reactivos refrigerados (2-8C) sin congelar. La
estabilidad alcanza la fecha de vencimiento indicada en la
caja.
Precauciones y advertencias sobre su uso
Los reactivos son para uso IN VITRO exclusivamente.
Mantenga los Pocillos Sensibilizados protegidos de la hume-
dad. No exponga los reactivos a la luz directa. No introduzca
pipetas o tips en los reactivos.
Debe tenerse especial cuidado en no intercambiar las tapas
de los frascos, que estn identificadas con un cdigo de color.
La caja y los envases contenidos en este producto no deben
ser reusados, debiendo descartarse como residuos peligrosos
una vez empleados, de acuerdo a la legislacin vigente. El
personal que manipula los mismos debe ser debidamente ca-
pacitado para su manejo y descarte por la institucin o labo-
ratorio que lo emplea.
vadores. La muestra a analizar debe ser lmpida; centrifugue
antes de ensayar si fuera necesario.
Condiciones de conservacin de las muestras.
Las muestras deben ser preferentemente frescas.
Suero/Plasma: 24 horas en refrigerador (2-8C) o 30 das con-
gelada (-20C).
Orina: 48 horas en refrigerador (2-8C).
Sustancias interferentes
Hemlisis y bilirrubinemia moderadas, no interfieren. La he-
moglobina, glucosa, acetaminofeno, cido acetilsaliclico, ci-
do ascrbico, atropina, cafena, cido gentsico y otras drogas
en elevadas concentraciones pueden provocar falsos positivos
o falsos negativos, por lo que siempre es importante conocer
si el paciente est recibiendo alguna medicacin. Nunca se
debe dejar de tomar un medicamento sin hablar primero con
el mdico.
Manipulacin y descarte
Las muestras de pacientes deben manipularse considerndo-
las potencialmente infecciosas, al igual que el material descar-
table y los utilizados en el ensayo, que hayan estado en con-
tacto con las mismas, incluido el papel absorbente. El descarte
debe hacerse de acuerdo a las buenas prcticas de laboratorio
y a las regulaciones locales.
Un procedimiento sugerido para descartarlos es el autoclava-
do a 121C durante una hora y el tratamiento de los lquidos
residuales con hipoclorito de sodio durante una hora a una
concentracin final del 5%.
ENSAYO:
Antes de proceder a la ejecucin del ensayo, tanto los reacti-
vos como las muestras deben ser llevados a una temperatura
ambiente no inferior a los 20C. Homogeneice antes de usar.
Procedimiento de anlisis:
Coloque en el soporte la cantidad de pocillos necesarios para
los Controles y las muestras a ensayar.

Pocillos sensibilizados 1 2 3
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS
No son requeridos. Control Negativo 1 gota ----- ----
Control Positivo ---- 1 gota ----
REACTIVOS NECESARIOS PERO NO PROVISTOS Muestra ---- ---- 1 gota
Suero, plasma u orina Enzima-Conjugado 1 gota 1 gota 1 gota
Suero/plasma: Mezcle por movimientos laterales del pocillo.
Obtenga de la manera usual, libre de hemlisis. En caso de
Incube a temperatura ambiente NO INFERIOR a 20C
usar plasma, recoja con EDTA o heparina como anticoagu-
Elimine el contenido de los pocillos por inversin y sacudiendo enrgicamente para
lante. favorecer el vaciado. Lave 5 veces con la Solucin Lavadora provista. Escurra el
contenido remanente en los pocillos sobre papel absorbente.
Separe el paquete globular por centrifugacin dentro de los
30 minutos de obtenida la muestra. Reactivo A 1 gota 1 gota 1 gota

Orina: Reactivo B 1 gota 1 gota 1 gota

Es conveniente emplear la primera orina de la maana, la Mezcle por movimientos laterales del pocillo. Mantenga a temperatura ambiente
NO INFERIOR a 20C.
que al ser ms concentrada provee mayor sensibilidad a la
determinacin. Recoja en recipiente limpio, seco y sin conser-
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HCG ELISA
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(*) Para evitar contaminaciones cruzadas entre pocillos, es GT Elisa (1) Aglutinacin Directa (2) Terico (quimioluminiscencia)

conveniente colocarlos separados entre s en el soporte. El Neg Neg Neg (<5)

agregado de la Solucin Lavadora debe hacerse gota a gota Neg Neg Neg (<5)
Neg Neg Neg (<5)
SIN QUE REBALSE su contenido para evitar contaminacin Neg Neg Neg (<5)
Neg Neg Neg (<5)
cruzada. Neg Neg Neg (<5)
Para lograr un total escurrimiento del lquido de lavado, gol- Neg Neg Neg (<5)
Neg Neg Neg (<5)
pee varias veces el pocillo invertido sobre el papel absorbente. Neg Neg 15
Neg 25
+ Neg 50
TIEMPOS DE LECTURA DE RESULTADOS ++ Neg 125
+++ 250
Compare el color desarrollado por las muestras con los de los +++ ++ 300
Controles entre los 2 y los 5 minutos despus del agregado ++++ +++ 500
++++ ++++ 1000
del Reactivo B. ++++ ++++ 1500
++++ ++++ 2000
++++ ++++ 4000
INTERPRETACION DE RESULTADOS ++++ ++++ 8500
++++ ++++ 17000
CONTROL DE CALIDAD ++++ ++++ 170000
+++ ++++ 1.7x106
Se recomienda procesar juntamente con las muestras a ensa- +++ ++++ 3.4x106
yar, muestras positivas y negativas conocidas para controlar el
desempeo del ensayo.
Cada Laboratorio debe disear su propio sistema de Control (1) Las cruces indican intensidad del color desarrollado, con-
de Calidad Interno y establecer las medidas correctivas si se siderando el mximo como ++++.
superan los lmites de tolerancia aceptables. (2) Las cruces indican intensidad de aglutinacin observada,
considerando el mximo como ++++.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMENTO
Para concentraciones elevadas de hCG, la intensidad del co- b- Sensibilidad:
lor desarrollado no es directamente proporcional a la concen- La sensibilidad es de aproximadamente 25 mUI/ml.
tracin hormonal.
c- Especificidad:
NOTA No se han observa do reacciones cruzadas con otras hormo-
Si tras lo 5 minutos de incubacin se desarrollara un tenue nas, tales como FSH, TSH y
color celeste, cuya intensidad fuera menor a la del Control d- Reproducibilidad:
Positivo, esto podra deberse a: Tratndose de una determinacin visual cualitativa, la repro-
- Lavado defectuoso. ducibilidad solamente puede evaluarse por comparacin de
- Baja concentracin de hCG en la muestra observaciones efectuadas por un mismo operario y entre dis-
- Presencia de sustancias interferentes tintos operarios. No se observaron diferencias de criterio en
Se sugiere repetir el ensayo y, si el resultado se repite habien- ninguno de ambos casos, tanto al observar resultados dentro
do presuncin de embarazo, repita la determinacin sobre de una misma corrida como entre diferentes corridas.
una nueva muestra obtenida tras 72 horas.
SUSTANCIAS DE REFERENCIA
PRESENTACION En la calibracin del mtodo se ha empleado el 2do Estndar
Cdigo 380048: 48 determinaciones Internacional IRP WHO 75/537

EVALUACION DE DESEMPEO Figura 1

a- Comparacin con otros mtodos:
En el desarrollo del producto se efectuaron comparaciones
de muestras contra mtodos
comerciales aprobados por ANMAT y tomados como referen-
cia: un mtodo colorimtrico importado de igual fundamento
tcnico y un mtodo instrumental por in selectivo. Los resul-
tados se muestran seguidamente y en los Graficos 1 y 2.

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HCG ELISA
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Tabla I 11- Lunenfeld B, Olchovsky D, Tadir Y, Glezerman M.
Treatment of male infertility with human gonadotrophins: se-
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3 semanas 5-50 mUI/ml
4 semanas 5-426 mUI/ml 13- Lee-Huang S, Huang PL, Sun Y, Huang PL, Kung HF, Blithe
5 semanas 18-7340 mIU/ml
6 semanas 1080- 56500 mUI/ml DL, Chen HC (March 1999). Lysozyme and RNases as anti-HIV
7-8 semanas 7650-229000 mIU/ml components in beta-core preparations of human chorionic
9-12 semanas 25700-288000 mUI/ml
13-16 semanas 13300-254000 mUI/ml gonadotropin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (6): 267881.
17-24 semanas 4060-165400 mUI/ml
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HCG ELISA