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Trabajo final de Maestra presentado como requisito para optar al ttulo de:
Magister en Ciencias Qumica
Directora:
Dr. Sc. Blanca Laura Ortiz Quintero
Grupo de Investigacin:
Estudio de cambios qumicos y bioqumicos de alimentos frescos y procesados
A Dios porque me gua en cada paso que doy, en cada meta que me
propongo.
Agradecimientos
sta investigacin.
investigacin.
investigacin.
The main purpose of this work was to perform the nutritional analysis, which
include: moisture, ashes, protein, fat, total dietary fiber, minerals and
carbohydrates, and to evaluated the antioxidant activity in pulp extracts of: gulupa
(Passiflora edulis Sims), banana passion fruit (Passiflora tripartida var. Mollissima)
avocado (Persea americana Mill.), gooseberry (Physalis peruviana L.), tomate de
rbol (Cyphomandra betacea Sendt.) and lulo (Solanum quitoense Lam.). Total
phenolic content was quantified and the antioxidant activity was determined by the
chemical methods: DPPH (2, 2-diphenyl-2-picrilhidrazilo) and FRAP (ferric ion
reducing antioxidant power), and by the biological methods: oxidation of low
density lipoproteins (LDL) and inhibition of oxidative stress on Saccharomyces
cerevissiae growth. The quantification by HPLC of vitamins with important
antioxidant activity, like vitamin C, in all fruits, and vitamin E in the avocado, which
include the validation of the method, was also performed.
The fruit with the highest value for total fiber content (14.43 4.37% in fresh weight
(F.W.)) and fat (3.59 0.42% F.W.) was the avocado; analysis of the mineral
content showed that potassium was cation in higher proportion in all six fruit, with
values between 109 and 280 mg / 100 g sample on dry weight (D.W.). Respect to
the antioxidant activity it was found that banana passion fruit extract showed the
the highest content of total phenolics, with a value of 683.48 19.48 mg gallic acid
/ 100 g acid F.W. In the DPPH assay the avocado extract exhibited the highest
antioxidant activity, with a value of 161.15 4.25 mol Trolox / 100g sample F.W.
and the highest FRAP activity was obtained for the banana passion fruit extract,
with a value of 148.07 12.07 mol Trolox / g F.W. In the LDL oxidation assay the
extracts from banana passion fruit and gooseberry presented the best protective
effect, the extracts from banana passion fruit, gulupa and avocado showed the
greatest ability to inhibit oxidative stress on growing yeast.
1. INTRODUCCIN ............................................................................................ 21
2. MARCO TERICO ......................................................................................... 22
2.1 Frutas tropicales de estudio............................................................................... 22
2.1.1 Gulupa (Passiflora edulis Sims.) ................................................................ 22
2.1.2 Curuba (Passiflora tripartida var. Mollissima) .......................................... 23
2.1.3 Aguacate (Persea americana Mill.) ............................................................. 24
2.1.4 Uchuva (Physalis peruviana L.) .................................................................. 24
2.1.5 Tomate de rbol (Cyphomandra betacea Sendt.) ..................................... 25
2.1.6 Lulo (Solanum quitoense Lam.).................................................................. 27
2.2 Anlisis proximal ...................................................................................................... 27
2.2.1 Humedad ....................................................................................................... 28
2.2.2 Cenizas y minerales ..................................................................................... 28
2.2.3 Grasa total ..................................................................................................... 29
2.2.4 Nitrgeno orgnico total.............................................................................. 30
2.2.5 Fibra dietara total ........................................................................................ 30
2.3 Actividad antioxidante ........................................................................................ 31
2.3.1 Contenido total de fenoles por el mtodo de Folin-Ciocalteu ................ 32
2.3.2 Actividad antioxidante por mtodos qumicos ......................................... 32
2.3.2.1 Mtodo DPPH ............................................................................................ 32
2.3.2.2 Mtodo FRAP ............................................................................................ 33
2.3.3 Actividad antioxidante por mtodos biolgicos ...................................... 34
2.3.3.1 Ensayo de oxidacin de lipoprotenas de baja densidad (LDL) ......... 34
2.3.3.2 Ensayo de estrs oxidativo sobre Saccharomyces cerevisiae .......... 34
2.4 Vitaminas con importante actividad antioxidante ........................................... 35
2.4.1 Vitamina C ..................................................................................................... 35
2.4.2 Vitamina E ..................................................................................................... 36
3. HIPTESIS..................................................................................................... 39
4. OBJETIVOS ................................................................................................... 40
4.1 Objetivo General ........................................................................................................... 40
4.1 Objetivos Especficos ................................................................................................. 40
5. METODOLOGA ............................................................................................. 41
5.1 Recoleccin de muestras ........................................................................................... 42
5.2 Determinacin del ndice de madurez .................................................................... 43
5.3 Anlisis proximal .......................................................................................................... 43
5.3.1 Humedad................................................................................................................. 43
5.3.2 Cenizas .................................................................................................................... 44
5.3.3 Grasa total .............................................................................................................. 44
5.3.4 Protena ................................................................................................................... 44
5.3.5 Minerales ................................................................................................................ 45
5.3.6 Fibra dietara total ................................................................................................ 45
5.4 Ensayos de actividad antioxidante.......................................................................... 46
5.4.1 Extraccin de compuestos con actividad antioxidante .......................... 46
5.4.2 Contenido total de fenoles .......................................................................... 47
5.5 Ensayo de actividad antioxidante por mtodos qumicos ............................. 47
5.5.1 Mtodo DPPH ................................................................................................ 47
5.5.2 Mtodo FRAP ................................................................................................ 48
5.6 Ensayos de actividad antioxidante por mtodos biolgicos ......................... 49
5.6.1 Ensayo de oxidacin de lipoprotenas de baja densidad (LDL) ............. 49
5.6.2 Ensayo de estrs oxidativo sobre Saccharomyces cerevisiae .............. 50
5.7 Cuantificacin de vitaminas ............................................................................... 52
5.7.1 Vitamina C ..................................................................................................... 52
5.7.2 Vitamina E ..................................................................................................... 53
5.8 Anlisis de datos ................................................................................................. 55
6. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS .......................................... 56
6.1 ndice de madurez ............................................................................................... 56
6.2 Caracterizacin bromatolgica .......................................................................... 57
6.3 Contenido total de fenoles ................................................................................. 61
6.4 Actividad antioxidante mtodos qumicos: DPPH y FRAP ............................ 62
6.5 Actividad antioxidante por mtodos biolgicos .............................................. 65
6.5.1 Ensayo de oxidacin de lipoprotenas de baja densidad (LDL) ............. 65
6.5.2 Ensayo de estrs oxidativo sobre Saccharomyces cerevisiae .............. 67
6.6 Cuantificacin de vitaminas con importante actividad antioxidante ............ 72
6.6.1 Cuantificacin de vitamina C ...................................................................... 72
6.6.2 Cuantificacin de vitamina E ...................................................................... 74
7. CONCLUSIONES ........................................................................................... 79
8. BIBLIOGRAFA .............................................................................................. 81
Lista de figuras
Por esta razn se hace necesario abordar el estudio de diferentes frutas tropicales
que son parte de la biodiversidad vegetal con que cuenta Colombia. Esta
propuesta de investigacin busca contribuir con la caracterizacin bromatolgica y
con el estudio de la actividad antioxidante de algunas frutas pertenecientes a la
familia de la pasiflorceas, laurceas y solanceas, para generar informacin
acerca de la obtencin de sustancias promisorias para uso industrial, tecnolgico y
cientfico. Este trabajo se desarroll dentro del grupo de investigacin Estudio de
los cambios qumicos y bioqumicos de alimentos frescos y procesados, en el cual
se han evaluado las caractersticas qumicas y de actividad antioxidante de
diversas frutas tropicales y sus residuos con el propsito de buscar un mximo
aprovechamiento. La presente investigacin se centr en la pulpa de seis frutas de
tres familias: Pasiflorceas (gulupa y curuba), Laurceas (aguacate) y Solanceas
(uchuva, tomate de rbol y lulo), de las cuales en la actualidad la informacin que
existe acerca de su composicin nutricional y actividad antioxidante es precaria o
inexistente. Esta investigacin permitir complementar la informacin de las frutas
antes mencionadas y establecer su potencial como sustancias funcionales que
corresponden a aquellas que benefician la salud humana ms all de lo
estrictamente nutricional.
21
2. MARCO TERICO
La gulupa es una baya, redonda con pericarpio poco grueso y con arilo pulposo y
jugoso de color anaranjado. En promedio contiene 150 semillas de color negro y
de forma lenticular, aplanada u ovoide. Es una fruta climatrica, por lo que puede
tener color verde a morado indicando un estado maduro. Tiene carbohidratos
como fructosa, glucosa y sacarosa, as mismo altos contenidos de cidos
orgnicos no fenlicos como cido ctrico, mlico, lctico, succnico y ascrbico.
22
La fruta es consumida en fresco en forma de jugo o como aderezo de ensaladas.
La pulpa es utilizada en la industria de alimentos para elaborar gelatinas,
mermeladas, salsas, cocteles y helados. Su consumo tambin se ha encontrado
asociado a un tranquilizante, antiespasmdico, regulador de la tensin, sedativo y
diurtico (Carvajal, Turbay, Rojano, lvarez, Restrepo, lvarez, Bonilla, Ochoa &
Snchez, 2011).
23
En la industria de alimentos esta fruta se emplea para la elaboracin de jugos,
helados, postres, y a nivel farmacutico las hojas de este fruto pueden emplearse
para preparacin de ansiolticos en forma de aromticas u otras formulaciones.
El aguacate variedad Hass es una fruta tropical que pertenece a la familia de las
laurceas, se caracteriza por tener una amplia aceptacin de su consumo en
fresco y procesado debido a las excelentes caractersticas sensoriales que
presenta la pulpa: textura cremosa, color y sabor muy agradable. Esta variedad
pertenece a la raza guatemalteca (Persea nubigena var. Guatemalensis) y fue
patentada en 1935 por Rudolph Hass en Habra Height (California, Estados
Unidos).
Es una planta que pertenece a la familia de las solanceas, se caracteriza por ser
perenne, herbcea, arbustiva y ramificada. Debido a que Colombia es el mayor
24
productor mundial de uchuva ha adquirido gran importancia econmica siendo los
principales compradores de uchuva colombiana en el 2009: Alemania, Blgica,
Suecia, Inglaterra y Suiza (Miranda & Fischer, 2012).
25
El cultivo de esta fruta se da a alturas entre 1.200 a 3.000 m.s.n.m., y se adapta
eficientemente a condiciones de clima fro moderado (13 20 C). Es una fruta
climatrica, puede tener color verde oscuro a anaranjado o rojo indicando un
estado maduro, no obstante el color de maduracin est estrechamente
relacionado con la variedad del tomate de rbol. El fruto maduro se puede
conservar de 20 a 25 das a temperaturas entre 18 a 25 C y en refrigeracin
puede mantenerse de 50 a 60 das.
De acuerdo a su forma y color los ecotipos de tomate de rbol pueden ser: tomate
comn, tomate amarillo comn, tomate amarillo redondo, tomate sin semilla,
tomate rojo morado y tomate casana. Una de estas variedades la del tomate rojo-
morado (Cyphomandra betacea Sendt) es comnmente conocido como tomate
injerto o tomate mora, su origen es de Nueva Zelanda, su corteza es roja o vino
tinto intenso, la pulpa es naranja y las semillas son de color rojo a vino tinto.
Se considera que es una fruta importante a nivel agrcola por su valor nutricional y
comercial para consumir en fresco o para la elaboracin de jugo u otras recetas
gastronmicas ya que presenta un sabor amargo-agridulce que lo hace apetecido
por los consumidores.
26
2.1.6 Lulo (Solanum quitoense Lam.)
La fruta es redonda de color amarillo dorado, puede contener entre 6.000 a 1.200
semillas pequeas (Bonnet & Crdenas, 2012) y presenta color amarillo
anaranjado cuando se encuentra en estado maduro. La pulpa es verde cristalina,
cida y jugosa (Osorio, Morales & Duque, 2005). Las condiciones del cultivo son
las siguientes: altura en un rango de 2.300 a 2.400 m.s.n.m y temperaturas entre
14 a 18 C. Obtenido el fruto en estado pintn se puede conservar hasta 16 das a
8 C o hasta por 10 das si se obtiene en estado maduro. La fruta es utilizada en la
industria de alimentos para la preparacin de jugos, nctares, sorbetes, helados,
mermeladas, conservas y en general una gran variedad de postres y dulces.
Esta fruta se caracteriza por su olor, sabor agridulce y acidez (Cern, Higuita, &
Cardona, 2010) lo cual lo hace muy apetecido para consumir en bebidas
refrescantes lo que permite que sea muy atractivo para el mercado interno y de
exportacin (Bonnet & Crdenas, 2012.).
27
experimentales pueden realizarse como requisito de control de calidad o como
descripcin previa del producto alimenticio en investigacin. Las tcnicas a utilizar
dependern de la propiedad que se va a medir y del tipo de alimento (Greenfield &
Southgate, 2006).
Las determinaciones bsicas que son realizadas para dicho anlisis son:
humedad, cenizas, protena total, minerales, fibra dietara total y carbohidratos.
Estos procedimientos fueron establecidos en 1984 por la Asociacin de
Comunidades Analticas (Association of Official Analytical Chemist - AOAC) y
estn especificados segn la muestra a analizar, en este caso son pulpa de frutas
tropicales.
2.2.1 Humedad
28
El procedimiento que permite realizar una aproximacin del contenido total de
cenizas presentes en la muestra y minerales que se encuentran presentes en la
muestra, consiste principalmente en llevar a la mufla crisoles previamente tarados
a 500 C con una porcin de la muestra a una temperatura de 500 550 C hasta
obtener una muestra color blanco grisceo. A mayor temperatura habr prdida de
carbonatos presentes y elementos como el fsforo, arrojando datos errneos del
anlisis.
29
grasa de modo semi-continuo con un disolvente orgnico, por lo general ter. En
estas estrategias analticas el solvente es calentado, volatilizado y condensado
sobre la muestra extrayendo la grasa que contiene.
30
Entre los alimentos ms importantes como fuente fibra dietaria se ubican las
frutas, verduras, semillas, granos secos entre los ms importantes. Se ha
postulado que la fibra soluble tiene numerosos efectos fisiolgicos en los que se
incluye la disminucin en el riesgo de cncer de colon cuando se incluye en la
dieta alimentos con un contenido alto de fibra dietara (Hollmann, Themeier, Neese
& Lindhauer, 2013). La proporcin de fibra dietara soluble o insoluble en los
alimentos es variable, por lo que su cuantificacin es importante y permite
determinar el valor agregado de un alimento en trminos de este macronutriente.
Los antioxidantes de origen vegetal son un conjunto de fitoquimicos tales como las
antocianinas, carotenoides, flavonoides y vitaminas, entre los ms importantes.
Este tipo de compuestos puede encontrarse en productos como tomate, uvas,
zanahorias, mango, brocoli, aguacate, meln y muestran un amplio espectro de
funciones biolgicas cuando son consumidos en la dieta (Charles, 2013). Ademas
ha sido reconocida la relacin entre el consumo de estos alimentos y la
disminucin en el riesgo de aparicin de enfermedades crnicas y degenerativas
(Kou, Yen, Hong, Wang, Lin & Wu, 2009). En especial alimentos como las frutas y
verduras son conocidas como una buena fuente de fitoqumicos esenciales para
prevenir enfermedades degenerativas como el cncer y de tipo cardiovascular
(Frassinetti, Maria, Croce, Caltavuturo & Longo, 2012).
31
de extractos crudos) para inhibir procesos de oxidacin. A continuacin se
exponen los ensayos que fueron empleados para esta investigacin.
2H3 (P(W3 O10 )4 ) + 2H3 (P(Mo3 O10 )4 ) + 12OH + W8 O23 + 3Mo8 O23 + 4PO33 + 18H2 O +
(Amarillo) (Azul)
Figura 1. Reaccin qumica por el metodo de Folin Ciocalteu.
La intensidad del color azul formado se mide por espectrofotometria visible a una
longitud de onda de 760 nm y su intensidad es proporcional a la cantidad total de
fenoles. Los resultados se expresan como mg de cido glico / 100 g de muestra
en base humeda (B.H.).
32
DPPH +AH DPPH H + A
DPPH +A DPPH A
Radical libre DPPH
: Compuesto con actividad antioxidante
: radical libre producido en la reaccin
: Radical DPPH estabilizado por el radical A
Figura 2. Posible secuencia de reaccion del radical DPPH y el antioxidante.
33
2.3.3 Actividad antioxidante por mtodos biolgicos
34
Adems , S. cerevissiae se destaca como un excelente sistema para investigar
mecanismos de resistencia de medicamentos y toxicidad a nivel celular (Valrico,
Vilares, Campos, Pereira & Vasconcelos, 2014). Dichas caracteristicas permiten
evaluar la actividad antioxidante en funcin del efecto protector que tienen los
compuestos antioxidantes sobre el crecimiento de esta levadura cuando es
sometida a estrs oxidativo.
2.4.1 Vitamina C
35
industria de alimentos como conservante (Gutirrez, Hoyos, & Pez, 2007) pero su
actividad antioxidante es mucho mayor cuando proviene de alimentos frescos
como frutas y verduras.
2.4.2 Vitamina E
36
R1
HO
CH3
R2 O CH3
CH3 CH3
CH3 H3C
R1
HO
CH3
R2 O CH3
CH3 CH3
CH3 H3C
37
Teniendo en cuento el marco terico planteado se establecieron estas frutas como
promisorias en trminos de composicin nutricional de macroelementos y
microelementos. Adems, se consideran como una fuente de compuestos
bioactivos que pueden ser objetivo de investigacin para la caracterizacin de la
fruta o para ser empleados a nivel industrial.
38
3. HIPTESIS
39
4. OBJETIVOS
40
5. METODOLOGA
Recoleccin de muestras
(Aprox. 500 g /fruta)
Humedad
Triplicado
Grasa total Extraccin de compuestos Vitamina C Vitamina E
con actividad antioxidante
Cenizas
Protena
Fibra
dietara
total
Minerales
41
5.1 Recoleccin de muestras
Las frutas que fueron seleccionadas para el estudio son curuba, gulupa, aguacate,
uchuva, tomate de rbol y lulo. En la figura 6 se pueden observar las variedades
empleadas para el estudio.
El peso final de muestra de pulpa por fruta fue de aproximadamente 500 g la cual
fue homogenizada durante 2 min, parte de esta muestra fue utilizado
inmediatamente para las determinaciones de ndice de madurez, humedad,
vitamina C y vitamina E; el material restante fue almacenado a -80 C durante 4
das luego fue liofilizado, molido y almacenado a -80 C para anlisis de grasa,
protena, fibra dietara total y actividad antioxidante.
42
5.2 Determinacin del ndice de madurez
5.3.1 Humedad
43
5.3.2 Cenizas
5.3.4 Protena
Para llevar a cabo el primer paso se pes 0,3 0,5 g de muestra y se depositaron
en un tubo de digestin previamente marcado. Se adicionaron 6 g de catalizador
kjeldahl (tabletas sin selenio) y 15 mL de cido sulfrico concentrado en cada
44
tubo. Luego se calent el digestor gradualmente hasta 440 C durante una hora.
Seguido de ello se llev a la seccin de destilacin colocando el tubo sobre una
fuente de hidrxido de sodio 40 % p/v y el destilado se recibi sobre una solucin
de cido brico 4% p/v con dos gotas de indicador Tashiro en un erlenmeyer de
250mL. El tiempo de destilacin fue de 5 min.
5.3.5 Minerales
45
6.0 y 50 L de -amilasa, se agit en vrtex 10 s y se incub a 95C con agitacin
vigorosa por 15 min. Seguidamente las muestras fueron llevadas a temperatura
ambiente con un bao de hielo y se ajust el pH 7,5 0,2 mediante la adicin de
NaOH 0,275 N y HCl 0,325 M. Inmediatamente se prepar una solucin de 2,5
mg/ml de proteasa en buffer de fosfatos y se adicionaron 50 L de esta solucin a
cada una de las muestras analizadas, se agitaron en vrtex durante 15 s y se
incub a 60 C en agitacin vigorosa durante 30 min. Estas muestras se llevaron a
temperatura ambiente, se ajust el pH a 4,0 0,6 con la ayuda de las soluciones
anteriormente mencionadas y se adicion 50 L de amiloglucosidasa a cada tubo
falcn. Se incub a 60C con agitacin durante 30 min y finalmente la matriz de
cada tubo falcn se llev a un vaso de precipitado de 250 mL y se adicionaron 100
mL de etanol al 95% v/v, se dej durante 12 h precipitar la fibra dietara tanto
soluble como insoluble. Luego se realiz una filtracin en crisoles de vidrio
sinterizado de 30 mL previamente pesados con celite (aprox. 0,5 g), se transfiri
cuantitativamente el precipitado y la suspensin de cada vaso al crisol respectivo.
Se lav el precipitado con 5 ml de etanol al 78% v/v y 5 mL de acetona. Luego los
residuos fueron secados en una estufa a 60 C durante 12 h. Se dejaron enfriar en
un desecador y posteriormente se registr el peso de los crisoles (crisoles +
residuo + celite). Por ltimo, se realiz la correccin del valor obtenido de fibra
dietaria total por la cuantificacin de protena en los residuos por el mtodo de
Kjeldahl usando como factor 6,25. Adems se hall la cantidad de cenizas
presentes en los residuos llevndolo a 525 C durante 5 h. Para este ensayo se
realizaron cuatro repeticiones (n=4) para las muestras y en las determinaciones
para la correccin fueron realizadas por duplicado (n=2).
46
a 4 C. El sobrenadante se recuper y fue almacenado a 4 C mientras se
contina la extraccin. Sobre el pellet obtenido de la centrifugacin se adicion 2
mL de acetona 70% v/v, se agit durante 30 min a 50 C y se centrifug a 5000
rpm durante 10 min a 4C y el sobrenadante se mezcl con el extracto anterior y
se almacen a 4 C, este procedimiento se repiti tres veces. El extracto se agit
en vrtex 30 s y se almacen a -80 C hasta el momento de los anlisis de
actividad antioxidante. Las extracciones se realizaron por triplicado para cada fruta
(n=3).
Para llevar a cabo ste ensayo se prepar una solucin de DPPH 0.1 mM en
etanol con una absorbancia a 515 nm de 1,100 y a 5 mL de sta solucin y se
incub a temperatura ambiente durante 7 min. Luego se midi la absorbancia a
47
esta longitud de onda y el valor obtenido correspondi a la absorbancia inicial. La
curva de calibracin se construy adicionando 500 L de soluciones patrn de
Trolox en etanol en concentraciones entre 0 a 70 M (Anexo 1), 870 L de etanol
y 130 L de solucin de DPPH. Se incub a temperatura ambiente en oscuridad
durante 10 min y se midi la absorbancia a 515 nm. Las muestras se analizaron
de la misma manera utilizando 130 L de solucin de DPPH, 870 L etanol y 500
L del extracto etanlico. Se agit en un vrtex durante 30 s y se incub a
temperatura ambiente en oscuridad durante 1 h. Se midi la absorbancia a 515 nm
y los resultados de los extractos fueron interpolados en la curva de calibracin.
Los resultados se expresaron como mol equivalente al Trolox (ET) / 100 g de
fruta (B.H.). Las mediciones fueron realizadas por triplicado (n=3) para cada
extracto de fruta.
48
5.6 Ensayos de actividad antioxidante por mtodos biolgicos
El tercer paso se bas en la lo planteado por Lin, Chen, Hsieh, & Chu en el 2014,
el cual consisti en inicialmente detener la oxidacin haciendo pasar las muestras
por una columna de Sephadex G25. Del eludo se tomaron 550 L y se
49
adicionaron 500 L de cido tricloroactico (ATA) 25% p/v preparado en cido
clorhdrico 0,1 M, se agit durante un minuto y seguidamente se adicionaron 500
L de cido tiobarbitrico 1% p/v preparado en NaOH al 0,3 % p/v. Se agit
nuevamente en vrtex durante 1 min, luego se incub a 95 C por 1 h en
oscuridad. Finalmente se dej enfriar durante 1 h hasta tener una temperatura de
aproximadamente 20 C, se centrifug a 5000 rpm durante 10 min y seguidamente
se registraron las absorbancias a 532 nm. Se realiz una curva de calibracin de
TBARS y se utiliz como estndar 1, 1, 3, 3 Tetrametoxipropano (TMP) en
concentraciones de 0 a 10 M (Anexo 1), este ensayo se realiz por triplicado para
cada extracto de fruta (n=3), los resultados fueron expresados como g TMP / 100
g de fruta (B.H.).
Este ensayo busca evaluar la capacidad que tienen los compuestos presentes en
los extractos para promover el crecimiento de la levadura cuando es sometida a
estrs oxidativo con perxido de hidrgeno, para ello se llev a cabo la siguiente
secuencia experimental la cual fue tomada de Espinal (2010):
50
(aprox. 0,300) y se hall el volumen ptimo de cultivo celular para inocular
con los extractos a evaluar.
51
10 s en vrtex para asegurar homogeneidad de las clulas en el medio de
cultivo, luego se tom 100 L de cada ensayo y este volumen se llev a
placas Elisa BIO-RAD con capacidad de 96 pocillos. Antes de cada lectura
se realiz agitacin orbital durante 20 s y se tomaban las lecturas de
D.O.595nm.
52
Para la cuantificacin de cido ascrbico total se emple como agente
reductor tris (2-carboxietil fosfina) conocido como TCEP y el mtodo fue el
siguiente: a 500 L del extracto de cido metafosfrico se adicion 500 L
de TCEP (1,25 mM), se agit en vrtex 30 s y se incub en la oscuridad
durante 30 min; posteriormente se analiz por HPLC con las siguientes
condiciones.
5.7.2 Vitamina E
53
La metodologa de extraccin se bas en lo planteado por Huang & Teik
(2011) y se llev a cabo de la siguiente manera: se pesaron 0,5 g de pulpa
fresca y homogenizada de aguacate, se adicionaron 3 mL de hexano la
mezcla se agit por 30 s y posteriormente se incub a 60 C durante 20 min
con agitacin constante. Luego se centrifug a 5000 rpm durante 10 min, la
capa de hexano se almacen a 4 C y sobre el pellet se realizaron dos
extracciones. El extracto final se agit en un vrtex, se filtr en un filtro de
membrana de nylon con un dimetro de poro de 0,45 m y se almaceno a 4
C hasta el momento de analizar por HPLC.
54
un ESI el cual oper en modo positivo y negativo en un rango de 50 600
m/z. El voltaje del detector fue de 1,8 kV a una temperatura de 250 C y se
emple un flujo de N2 a 1, 5 L/min.
En las grficas las letras iguales indican que no hay diferencia significativa
en los valores obtenidos en las diferentes frutas.
55
6. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS
As mismo debido a que las frutas fueron de origen comercial segn la NTC 1291
de Generalidades de frutas y hortalizas es posible establecer que se encontraban
en estado de madurez comercial, el cual caracteriza a la fruta que ha alcanzado el
grado desarrollo suficiente para su comercializacin y consumo inmediato.
57
100
d d d
90 c
b
80 a
70
% Humedad
60
50
40
30
20
10
0
Gulupa Curuba Aguacate Lulo Tomate de Uchuva
rbol
100
90
Gulupa
80
Curuba
70 f Aguacate
60
Lulo
%
50
Tomate de rbol
40
Uchuva
30 e
e e f d c c b b b
20 c
d
b c e b b a
10 a c b c c d a a b c a
0
Cenizas Grasa total Protena total Fibra dietaria Carbohidratos
total
58
El contenido de cenizas en las frutas fue menor al 7% B.S. siendo la fruta que
particularmente resalta por el bajo contenido de este macronutriente la gulupa con
un valor de 0,02% B.S. Por otro lado, el contenido de grasa en las frutas es bajo
0,74% - 1,71 % B.S. no obstante el aguacate present el mayor porcentaje con un
valor de 14,43 2,42 % B.S. El contenido de protena presente en las frutas
analizadas est en un rango de 3,08- 16,94 % B.S., en el cual resalta la uchuva
por ser la de mayor contenido de protena.
Por ltimo, se realizaron los anlisis del contenido de minerales en la pulpa de las
frutas, los resultados se pueden observar en la grfica 3. Cada una de las
determinaciones corresponde al promedio del duplicado de la medicin (n=2)
desviacin estndar.
59
300
Gulupa
mg / 100 g de muestra B.S.
250
Curuba
200
Aguacate
150 Uchuva
100 Tomate de
rbol
50
0
Calcio Fosforo Potasio Magnesio Sodio
60
junto con el arroz y pasta los cuales no podran brindar en igual o mayor
proporcin los macronutrientes y micronutrientes analizados en estas frutas, por lo
que se resalta la importancia de incluir en la alimentacin productos frutcolas
(ENSIN, 2010)
61
800
Otra fruta que present alto contenido total de fenoles fue el aguacate con un valor
de 582,96 18,83 mg equivalentes al cido glico / 100 g de muestra B.H., el cual
comparado con lo reportado en la literatura tiene un valor de 490 70 mg
equivalentes al cido glico / 100 g de muestra B.H. (Wang, Bostic & Gu, 2010).
En ste estudio resaltan la variedad Hass con respecto a otras variedades ya que
present el mayor contenido de fenoles tanto en pulpa como en como en cscara.
62
180 e
B.H.
90 c
b
a
a
60
30
0
Aguacate Gulupa Uchuva Tomate de Lulo Curuba
rbol
63
Estudios en el aguacate han encontrado algunas propiedades funcionales
posiblemente por estos compuestos con actividad antioxidante especialmente por
la capacidad de reducir el riesgo de padecer enfermedades cardiovasculares
principalmente por contener cidos grasos monoinsaturados (Dembitsky,
Poovarodom, Leontowicz, Verasilp, Trakhtenberg & Gorinstein, 2011) capaces de
reducir el colesterol en la sangre.
175
mol Trolox/ g muestra B.H.
150
125
FRAP
100
75 d
c
50
25 b
a a
0
Curuba Lulo Tomate de Aguacate Gulupa Uchuva
rbol
64
fenoles encontrados en el extracto de curuba son las principales compuestos
encargados de dar mayor actividad antioxidante por este mtodo.
Al realizar una comparacin con los resultados que se obtuvieron por los mtodos
qumicos (DPPH y FRAP) se encontr que los extractos de frutas
de mayor actividad fueron diferentes: aguacate y curuba debido a que la
especificidad de los mtodos son diferentes en el primer caso son lipoflicos y en
el segundo caso son hidroflicos lo cual permite inferir la composicin en trminos
generales compuestos con actividad antioxidante presentes en los extractos.
35
e
nmol TMP/ g muestra B.H.
30
Oxidacin de LDLs
25
d
20
c
15
10 b
5 a a
0
Tomate de Aguacate Gulupa Lulo Uchuva Curuba
rbol
65
Los extractos que permitieron inhibir en mayor proporcin la oxidacin de las LDL
fueron los de curuba y uchuva posiblemente debido a la presencia de compuestos
fenlicos (lvarez, De la Rosa, Amarowicz & Shahidi, 2012). As mismo otros
compuestos como el cido ascrbico y la vitamina E, presentes en los extractos
pueden generar un efecto protector sobre las LDL, estos compuestos pueden
actuar de forma individual o combinada para inhibir la oxidacin (Osorio, Montoya
& Bastida, 2009).
El extracto que tuvo una menor proteccin sobre las LDL fue el tomate de rbol, lo
cual puede estar relacionado con las condiciones de oxidacin del ensayo
experimental o por las reacciones de auto-oxidacin de enzimas como las
peroxidasas y polifenol oxidasa (PPO) en la fruta lo que puede disminuir su
actividad antioxidante, por lo cual un estudio de oxidacin de estas enzimas en las
frutas permitira establecer la relacin con la capacidad antioxidante.
Las posibles vas o mecanismos que permiten que los compuestos polifenlicos
acten inhibiendo la oxidacin de las LDL son los siguientes: donacin de un
hidrgeno, captura de radicales lipdicos, metales de quelacin (lvarez, De la
Rosa, Amarowicz & Shahidi, 2012).
66
6.5.2 Ensayo de estrs oxidativo sobre Saccharomyces cerevisiae
67
0,800
0,700 Aguacate
Curva de crecimiento de
0,600
Control
D.O. 600 nm 0,500
S. cerevisiae
Positivo
0,400 Control
Negativo
0,300
0,200
0,100
0,000
60 180 300 420 540 660
Tiempo (min.)
68
En la grfica 9 se pueden observar los perfiles de crecimiento de la levadura con
los extractos de las frutas pasiflorceas (curuba y gulupa) y de igual forma se
emplean los controles para poder comparar los diferentes comportamientos que
tuvo la levadura. Al igual que en el caso del extracto de aguacate, los extractos de
curuba y gulupa promovieron un crecimiento mayor en comparacin con el control
positivo. En la etapa de latencia haba una concentracin celular mayor en el
control positivo (con cido ascrbico) pero a medida que se inici la etapa de
crecimiento exponencial los extractos de estas frutas fueron capaces de promover
una mayor proteccin sobre la levadura y la velocidad de crecimiento fue mayor,
siendo ms notorio en el extracto de curuba, el cual segn la cuantificacin de
fenoles fue el extracto como mayor cantidad de estos compuestos con actividad
antioxidante. Finalmente en la etapa estacionaria se evidenci que estos extractos
permitieron mantener una mayor concentracin mayor de la levadura con respecto
a los extractos.
0,800
Curuba
0,700
Curva de crecimiento de
0,600 Gulupa
D.O. 600 nm
S. cerevisiae
0,500
Control
0,400
Positivo
0,300 Control
0,200 Negativo
0,100
0,000
60 180 300 420 540 660
Tiempo (min.)
69
En el caso de las frutas de la familia de las solanceas, de las cuales sus perfiles
de crecimiento se pueden evidenciar en la grfica 10, se encontr que el
crecimiento de las levaduras fue muy similar con respecto al control positivo. La
etapa de latencia en el control tuvo mayor concentracin celular mientras que en la
etapa de crecimiento exponencial el extracto de lulo sobresale por un leve
crecimiento mayor que los dems extractos y el control positivo. Esto significa que
aunque los extractos de estas frutas no promovieron un crecimiento mayor si hay
un efecto protector similar al control positivo que promovi el crecimiento de la
levadura.
0,800
Uchuva
0,700
Curva de crecimiento de
Tomate de
0,600
rbol
S. cerevisiae
D.O. 600 nm
0,500 Lulo
0,400 Control
0,300 Positivo
Control
0,200 Negativo
0,100
0,000
60 180 300 420 540 660
Tiemo (min.)
Aunque no se conoce con certeza cuales son los mecanismos que lleva a cabo la
S. cerevisiae para promover su crecimiento en un medio de estrs oxidativo con
extractos de frutas con actividad antioxidante, se logr evidenciar que los
compuestos presentes en estas sustancias son capaces de estimular
funcionamiento celular para seguir su ruta de crecimiento normal, quizs puede
estar relacionado con la capacidad de los extractos para activar o desactivar vas
70
genticas asociadas a la proteccin de la levadura o si consiste simplemente en la
neutralizacin de H2O2 (Espinal, 2010).
71
6.6 Cuantificacin de vitaminas con importante actividad antioxidante
70 Curuba
Uchuva
60 d
e Gulupa
cd
mg/100g muestra B.H
50 Tomate de rbol
c bc
d Lulo
40 d
b c Aguacate
30
d
c
20 ab
ab
b ab
10 a a
a
0
cido ascrbico total cido ascrbico cido dehidroascrbico
La fruta con el mayor contenido de vitamina C fue la curuba con un valor de 52,04
0,4 mg/ 100 g de muestra B.H. el cual es un valor ms alto comparado con lo
reportado por Valente, Albuquerque, Snchez & Costa (2011) con un valor de 40,5
0,37 mg/ 100 g de muestra B.H. En estos resultados tambin se evidenci que
en las seis frutas analizadas siempre hay mayor contenido de vitamina C en forma
de cido ascrbico, en el caso de la curuba tuvo el mayor contenido de cido
ascrbico (aprox. 98%) el cual es muy importante debido a que es la forma ms
activa a nivel biolgico (Valente, Albuquerque, Snchez & Costa, 2011).
72
Caso contrario ocurri en el aguacate el cual contiene 0,05 0,01 mg/ 100 g de
muestra B.H., el cual corresponde al 0,96 % de la vitamina C total presente en
esta fruta.
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
73
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
74
gases debido a que es un mtodo ms sofisticado donde permite tener una mayor
exactitud en su cuantificacin. En el mtodo de cromatografa de gases debe
contemplarse que los ismeros se deben derivatizar para disminuir los puntos de
volatilizacin y permitir de forma eficaz la cuantificacin de estos ismeros. Otra
tcnica que tambin puede ser empleada para el anlisis de vitamina E es la
cromatografa liquida de alta resolucin (HPLC) el cual permite una buena
resolucin de los tocoferoles y tocotrienoles empleando como detector ultra violeta
(UV) o fluorescencia. Esta tcnica ha sido ampliamente usada y es capaz de
separar eficientemente cada uno de los ismeros. Adems, se ha encontrado que
tiene mayor selectividad que los mtodos anteriormente mencionados.
En ste estudio emple la tcnica de HPLC en fase reversa con una columna C -
18, el cual permite tener una buena estabilidad, reproducibilidad en los tiempos de
retencin, adems es posible realizar los anlisis en tiempos cortos (Huang & Ng,
2011). Inicialmente la metodologa fue puesta a punto para la cuantificacin de la
vitamina E en el extracto de aguacate. La metodologa experimental consisti en
realizar la separacin cromatografa de cada uno de los ismeros, es decir de , ,
y -Tocoferol as como , , y -Tocotrienol. El cromatograma de -Tocoferol
se muestra en la figura 10 y los restantes ismeros se muestran en el Anexo 4.
Columna C-18
13,820
MeOH : ACN : 50:50 v/v
1,00ml/min
: 295 nm
75
Tabla 6. Promedio de los tiempos de retencin (n=3) desviacin estndar
obtenidos por HPLC de los ismeros de vitamina E.
2 Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50 v/v
1,00ml/min
: 295 nm
Rs 1,5
5
1 4
6
76
Tabla 7. Promedio de los tiempos de retencin (n=3) desviacin estndar
obtenidos por HPLC en la mezcla de los ismeros de la vitamina E.
Despus de que se realiz ste anlisis por HPLC con los estndares de vitamina
E, se realiz la extraccin en la muestra de aguacate fresco y se inyect en el
HPLC. En la figura 12 se puede observar el perfil cromatogrfico obtenido.
En un estudio realizado por Chun, Lee, Ye, Exler, & Eitenmiller (2006) determin
que el contenido -Tocoferol en el aguacate variedad Hass es de 1,93 mg / 100 g
B.H., y menciona que la cuantificacin de esta vitamina en aguacate depende de
las caractersticas del cultivo, tiempo y condiciones de almacenamiento,
preparacin de la muestra y variacin en los mtodos analticos para la
cuantificacin.
78
7. CONCLUSIONES
En el anlisis de fibra dietara se encontr que las frutas que tienen mayor
contenido son el aguacate y la uchuva.
Las frutas que tuvieron mayor actividad antioxidante por los mtodos qumicos
DPPH y FRAP fueron el aguacate y la curuba respectivamente.
79
Para la tcnica de vitamina E se realiz cualitativamente la separacin
cromatografica de , , , y -Tocoferol as como , , , y -Tocotrienol, no
obstante la cuantificacin de los ismeros se realiz nicamente para -
Tocoferol en el cual se coloc a punto parmetros como repetibilidad,
reproducibilidad y linealidad.
80
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88
89
Anexo 1. Curvas de calibracin para actividad antioxidante y cuantificacin de
vitaminas C y E.
Actividad antioxidante
DPPH y = -0,009x + 0,731 0,997
FRAP y = 0,070x + 0,172 0,995
Oxidacin de LDL y = 0,170x + 0,146 0,999
Vitamina C
cido ascrbico y = 82558x + 183618 0,999
cido ascrbico total y = 82293x + 57266 0,998
Vitamina E
Alfa-tocoferol y = 5189,4x + 90663 0,999
90
Anexo 2. Perfiles cromatogrficos de vitamina C en las frutas de estudio.
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
91
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
v v v
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
92
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
93
Columna C-18
[NH4H2PO4] = 0,01M pH=2,6
0,500ml/min
: 254 nm
94
Anexo 3. Perfiles cromatogrficos de vitamina E.
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
11,820
: 295 nm
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
11,967
v/v 1,00ml/min
: 295 nm
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
12,258
v/v 1,00ml/min
: 295 nm
95
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
5,232
: 295 nm
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
5,930
: 295 nm
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
5,991
: 295 nm
96
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
6,702
: 295 nm
Columna C-18
MeOH : ACN : 50:50
v/v 1,00ml/min
: 295 nm
14,138
97
Anexo 4. Espectro de masas de vitamina E.
Inten.(x1,000,000)
CH3
430.35
6.0 HO
CH3
3.0
2.0
Inten.(x100,000)
7.5
577.35
114.95 284.25
5.0
430.25 522.55
2.5 550.55 595.70
369.35
339.15
145.95 401.30 471.40 494.65
194.95212.00 455.00
257.90 309.15
0.0
100.0 125.0 150.0 175.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 425.0 450.0 475.0 500.0 525.0 550.0 575.0 m/z
98
Anexo 5. Datos de puesta a punto de la metodologa para vitamina E.
Alfa tocoferol
3000000
2500000
y = 5189,4x + 90663
2000000
rea
1500000
1000000
500000
0
0 100 200 300 400 500 600
mcg/ml
99