Universidad Complutense

FACULTAD DE FARMACIA

DEPARTAMENTO DE
MICROBIOLOGA II
GUA DE PRCTICAS DE
INFECCIONES MICROBIANAS:
PATOGNESIS Y CONTROL

Segundo Ciclo
Apellidos,
nombre:........................................................................
Fecha: Mdulo de prcticas:
 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II - UCM

PRCTICA 1: ENSAYOS DE ADHESIN A POLMEROS Y DE

FORMACIN DE BIOFILMS.

OBJETIVO:

Cuantificar la capacidad de formacin de biofilms de diferentes cepas

aisladas de muestras clnicas del gnero Pseudomonas. Dicha caracterstica es un
factor de virulencia de la bacteria ensayada y una caracterstica crucial para los
pacientes con enfermedades respiratorias tipo EPOC, sobre todo fibrosis qustica.
Cuantificar la capacidad de adhesin de Candida albicans y de
Saccharomyces cerevisiae a polmeros. Candida albicans es capaz de adherirse a
superficies plsticas y provocar as infecciones sistmicas a partir de catteres,
sondas, prtesis, etc. Saccharomyces cerevisiae se utilizar como control de
levadura no patgena, aunque existen actualmente cepas de S. cerevisiae capaces
de adherirse y provocar tambin infecciones, aunque menos graves que las
provocadas por Candida.

Formacin de Biofilms de Pseudomonas

1er DA: Inoculacin de las cepas de Pseudomonas.

Se inocularn tubos de TSB lquido con las diferentes cepas a ensayar.

2 DA: Formacin de los biofilms.

1. A partir de un cultivo lquido crecido hasta saturacin, realizar diluciones
seriadas en medio TSB (caldo tripticasa-soja). Se utilizarn diferentes diluciones
para cada cepa de Pseudomonas a ensayar.
2. Se aaden 100 l a cada pocillo de una placa de 96 pocillos.
3. Se incuban a 37C durante toda la noche.

3er DA: Cuantificacin de la adhesin.

1. Se aaden 25 l por pocillo de una solucin de cristal violeta al 0,1% en etanol y

se deja actuar durante 5 min.
2. Se lava el exceso de colorante con agua.
3. Se despegan los biofilms con una solucin de Tritn X-100 al 0,25% en etanol
aadiendo 125 l por pocillo.
4. Se mide la absorbancia a 570 nm.

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RESULTADOS
Cepa Incul Blanco
o

1 1/100

1/10

2 1/100

1/10

3 1/100

1/10

4 1/100

1/10

Cepa Incul Blanco Media de los datos

o

1 1/100

1/10

2 1/100

1/10

3 1/100

1/10

4 1/100

1/10

De acuerdo con los datos obtenidos,

Qu aislamiento de Pseudomonas aeruginosa es ms propenso a formar biofilms?

Influye en alguna cepa la cantidad de inculo en la formacin de biofilm?

4
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Ensayo de adhesin a plstico de Candida albicans y Saccharomyces cerevisiae

1er DA: Inoculacin de las cepas de Candida albicans y Saccharomyces

cerevisiae.

Se inocularn tubos de medio lquido YPD (extracto de levadura, peptona, dextrosa)

con las diferentes cepas a ensayar.

2 DA: Ensayo de adhesin.

1. Se hacen diluciones de las diferentes cepas a ensayar
2. Se inoculan 12 pocillos por cada cepa ensayada
3. Se incuba a 37C durante 1h.

Cuantificacin de la adhesin.

1. Se aaden 25 l por pocillo de una solucin de cristal violeta al 0,1% en

etanol y se deja actuar durante 5 min.
2. Se lava el exceso de colorante con agua.
3. Se despegan los biofilms con una solucin de Tritn X-100 al 0,25% en
etanol aadiendo 125 l por pocillo.
4. Se mide la absorbancia a 570 nm.

RESULTADOS OBTENIDOS

Cepa ensayada DO % adhesin

media

Qu microorganismo se adhiere ms?

Cmo crees que influye en la patognesis?

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PRCTICA 2. HEMOCULTIVO
OBJETIVOS
La bacteriemia es la expresin ms neta y clara de la infeccin bacteriana, y no
hay que olvidar que las bacterias son causa del mayor nmero de infecciones que
pueden ser tratadas y curadas. Por tanto, una de las tcnicas ms tiles en un
laboratorio de microbiologa clnica es la realizacin de un hemocultivo para la
deteccin de dicha bacteriemia.

OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SANGRE

Se considera ideal para el diagnstico de cualquier bacteriemia la realizacin

de 3 hemocultivos (3 extracciones de sangre para inocular en dos frascos con medio
de cultivo cada una de ellas) tomados con un intervalo de tiempo mnimo de 15
minutos entre ellos, y utilizando lugares de venopuncin diferentes por cada
extraccin.
Hay que tener en cuenta que la extraccin de la sangre debe realizarse en
condiciones de asepsia para evitar contaminar la muestra con la flora que coloniza la
piel del paciente o de la persona que realiza la extraccin. Por este motivo, antes de
realizar la extraccin de la sangre se debe pintar ampliamente con povidona iodada la
piel prxima a la zona a pinchar, as como los dedos ndice, medio y pulgar de la
mano utilizada para la palpacin de la vena y la parte superior de los frascos con el
medio de cultivo por donde se va a inocular la sangre.
En cuanto al volumen de sangre necesario para la deteccin de la bacteriemia,
se considera adecuada la cifra de 10-20 ml de sangre por extraccin (5-10 ml por
frasco) en adultos y 2 ml en nios pequeos (1 ml por frasco). La sangre se inocula en
los frascos que se incuban inmediatamente en estufa a 370C hasta 7 das.

ANLISIS MICROBIOLGICO PRELIMINAR

Los frascos de hemocultivo deben vigilarse diariamente y observar si existe

crecimiento. La observacin macroscpica puede indicar la presencia de crecimiento
si aparece hemlisis, turbidez, sedimento o produccin de gas.
A partir de los frascos que presentan evidencia de crecimiento despues de la
incubacin se les debe realizar una tincin de Gram y un subcultivo en diferentes
medios y atmsferas de incubacin, que permitan el crecimiento de bacterias tanto
aerobias como anaerobias.

MATERIAL

1. Un frasco de hemocultivo previamente inoculado e incubado a 37C.

2. Jeringuillas con aguja.
3. Colorantes para la tincin de Gram.
4. Portaobjetos.
6. Una placa con medio de agar-sangre.
7. Una placa con medio de agar-chocolate.

1ER DA
1. Homogeneizar bien el frasco del hemocultivo mediante inversiones del mismo.
2. Utilizando la jeringuilla realizar una extraccin del hemocultivo aparentemente
positivo e inocular primero una placa de agar sangre y otra de agar chocolate con

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2 3 gotas cada una, y posteriormente extender otras 2 3 gotas en un porta

para realizar una tincin de Gram.
3. Extender el inculo en las placas de agar sangre y agar chocolate con el asa
estril, para obtener colonias aisladas.
4. Llevar a incubar a 36 C en atmsfera de CO2 (jarra con vela).
5. Dejar secar la extensin al aire y posteriormente fijar al calor suavemente.
6. Realizar la tincin de Gram.

RESULTADOS OBTENIDOS
1.- Anotar los resultados de la observacin
macroscpica del hemocultivo.
2.- Indicar el resultado de la tincin de Gram:

2 DA

1. Observar el crecimiento en las placas de agar

sangre y agar chocolate. Anotar si es positivo en
ambas y el aspecto de las colonias: tamao,
brillo, mucosidad, hemlisis en agar sangre.
2. Hacer una tincin de Gram de una colonia
representativa de cada placa y compararla con
la de la vspera:
3. Dependiendo del resultado, proceder como
sigue:

Cocos Gram-positivos en cadenas:

El resultado negativo en la prueba de la
catalasa permite sospechar que se trata de
Streptococcus o Enterococcus. Inocular un tubo de
bilis-esculina, para investigar si se trata de
Enterococcus, y una placa de agar sangre, colocando
discos de bacitracina (si es -hemoltico) y
optoquina (si es -hemoltico), para investigar
especies de Streptococcus (Prctica 4)

Cocos Gram-positivos en racimos:

El resultado positivo en la prueba de la catalasa permite sospechar que se
trata de Staphylococcus o de Micrococcus (procedente de una contaminacin de la piel
al tomar la muestra). Sembrar un tubo de Kligler en superficie y picadura para
distinguir el metabolismo fermentativo de Staphylococcus del oxidativo de Micrococcus.

Bacilos Gram-negativos:
Si se sospecha la presencia de Haemophilus, por la tincin de Gram y la
ausencia de crecimiento en agar sangre, sembrar una placa de agar Mueller-Hinton y
ensayar factores V y X (Prctica 3).
En otros casos, sembrar un tubo de Kligler en superficie y picadura, para
distinguir si se trata de bacilos no fermentadores (por ejemplo, Pseudomonas,
Alcaligenes o Acinetobacter), o de enterobacterias (fermentacin de glucosa positiva).

Bacilos Gram-positivos no esporulados:

Hacer la prueba de la catalasa y sembrar las pruebas de hidrlisis de esculina,
movilidad y CAMP segn se detalla en la Prctica 5.

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PRCTICA 3. IDENTIFICACIN DE Haemophilus spp.

OBJETIVOS

Los microorganismos pertenecientes al gnero Haemophilus son cocobacilos

Gram negativos aunque a veces forman filamentos cortos (son pleomrficos). Las
especies que con mayor frecuencia producen enfermedades en humanos son
Haemophilus influenzae y Haemophilus parainfluenzae. Estos microorganismos son
anaerobios facultativos y crecen mejor en una atmsfera enriquecida con CO2. La
mayora de las especies tienen requerimientos nutricionales especiales, por lo que no
crecen en medio agar sangre y s en agar chocolate. H. influenzae requiere hemina
exgena (factor X) y NAD (factor V), mientras que H.
parainfluenzae requiere solamente NAD. En el medio de agar
chocolate existe hemina y NAD debido a que se liberan del
interior de los hemates cuando se produce la lisis de los
mismos al preparar este medio. Estos factores X y V
V X
tambin se pueden proporcionar mediante discos
impregnados con los mismos, que depositados sobre la
superficie de un agar Mueller-Hinton, difunden al medio y
proporcionan una concentracin de hemina, NAD, o de VX
ambos, suficiente para permitir el desarrollo de las
diferentes especies de Haemophilus. Si el microorganismo
crece alrededor del disco con factores X + V, pero no crece
alrededor del disco solamente impregnado con factor X o con Crecimiento de Haemophilus
factor V, se trata de H. influenzae. Si el microorganismo influenzae en torno al disco XV
crece alrededor del disco de factores X + V, y del disco de
factor V, pero no del disco de factor X, se trata de H. parainfluenzae.

MATERIAL

1.- Una placa de agar chocolate con una especie problema de Haemophilus.
2.- Discos de papel impregnados con los factores X + V, X y V.
3.- Una placa de agar Mueller-Hinton.
4.- Un tubo con 5 ml de agua destilada estril.
5.- Una torunda estril de algodn.
6.- Portaobjetos y colorantes para la tincin de Gram.
7.- Jarras y velas para obtener atmsfera enriquecida en CO2.

TCNICA

1.- Realizar una suspensin homognea del microorganismo problema en el tubo con
agua.
2.- Impregnar la torunda con la suspensin del inculo y sembrar con ella toda la
superficie de la placa de Mueller-Hinton.
3.- Con la ayuda de las pinzas (previamente flameadas y fras) coger un disco de
factor V y colocarlo sobre la superficie del agar en un extremo de la placa. Coger un
disco de factor X y otro de factores X+V y colocarlos en los otros extremos de la placa.
Debe procurarse obtener la mayor distancia entre los 3 discos.
4.- Incubar a 37 C, 18-24 horas en atmsfera enriquecida en CO2 y observar cules
son los factores que necesita el microorganismo para crecer.

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RESULTADOS OBTENIDOS

1.- Indicar la especie de Haemophilus de que se trata y por

qu. V X
2.- Indicar en qu medios crece el microorganismo
problema y en cules no.
3.- Anotar la morfologa observada en la tincin de Gram.
VX

DETECCIN DE -LACTAMASA.
OBJETIVOS

Las pruebas de deteccin rpida de enzimas Dibujar el crecimiento observado.

modificantes de antibiticos, como la deteccin de -
lactamasa, proporcionan una informacin clnica muy rpida y muy til. Cuando se
realiza esta prueba, una reaccin positiva indica que el microorganismo es resistente
a todas las penicilinas sensibles a penicilinasas (penicilina, ampicilina, amoxicilina,
azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina). Una de las tcnicas
ms utilizadas en los laboratorios de microbiologa clnica para la deteccin de -
lactamasa es la prueba de la cefalosporina cromognica (nitrocefn). Consiste en un
disco impregnado con nitrocefn; esta cefalosporina cromognica en presencia de -
lactamasa, se hidroliza produciendo un cambio de electrones, lo que resulta en un
producto coloreado.

MATERIAL
1. Una placa con el microorganismo problema.
2. Discos de nitrocefn.
3. Portaobjetos.
4. Un tubo con agua estril.
5. Pinzas.
6. Pipeta Pasteur estril.

TCNICA
1. Con la ayuda de las pinzas previamente flameadas y fras, coger un disco de
nitrocefin y depositarlo sobre un portaobjetos.
2. Con la ayuda de una pipeta Pasteur estril humedecer el disco.
3. Coger un asa del cultivo del microorganismo problema, depositarlo sobre el disco
de nitrocefin y dejar a temperatura ambiente 5 minutos.
Observar si existe un cambio de color. La aparicin de un color rojo indica un
resultado positivo, es decir, el microorganismo produce -lactamasa y por tanto, es
resistente a todas las penicilinas sensibles a penicilinasas.

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PRCTICA 4. IDENTIFICACIN DE Streptococcus pneumoniae.

OBJETIVOS

El neumococo es un importante agente causal de neumona que en muchas

ocasiones se acompaa de bacteriemia. Tambin puede producir otitis media,
sinusitis, meningitis y endocarditis. Este microorganismo necesita para su
crecimiento medios ricos como el agar sangre y es sensible a optoquina y soluble en
bilis (desoxicolato sdico), caractersticas que se utilizan para su identificacin.
Estos microorganismos son cocos Gram positivos que habitualmente se
disponen en parejas con una morfologa lanceolada aunque tambin se pueden
disponer en cadenas. Las colonias presentan hemlisis alfa, es decir hemolizan
parcialmente los hemates en medio de agar sangre, lo que les da un aspecto verdoso.
Tambin suelen ser umbilicadas y mucosas, aunque a veces no presentan estas
caractersticas.

MATERIAL

1.- Una placa de agar sangre con crecimiento de Streptococcus pneumoniae.

2.- Discos de optoquina.
3.- Una placa de agar sangre.
4.- Solucin de desoxicolato sdico al 10%.
5.- Pinzas.
6.- Portaobjetos.
7.- Colorantes de tincin de Gram.

TCNICA

1.- Realizar una siembra del neumococo en la placa de agar sangre.

2.- Sensibilidad a la optoquina (etil-dihidrocuprena). Con la ayuda de unas pinzas
previamente flameadas y fras coger un disco de optoquina y colocarlo sobre la
superficie del medio de agar sangre previamente sembrada con el neumococo.
Incubar 18-24 horas a 37C, y observar el halo de inhibicin (cuando se utilizan
discos de 6 mm de dimetro, el halo de inhibicin debe ser 14 mm, y si se utilizan
discos de 10 mm de dimetro ser 16 mm).
3.- Prueba de solubilidad en bilis. Sobre la placa con el microorganismo crecido
aadir 1 gota de desoxicolato sdico al 10% e incubar 15-20 minutos a 37C. S.
pneumoniae experimenta autlisis inducida por el desoxicolato, y las colonias se
colapsan, desapareciendo.

RESULTADOS OBTENIDOS

1.- Anotar los mm del halo de inhibicin de la optoquina.

2.- Anotar las caractersticas de las colonias de neumococo.
3.- Anotar el fenmeno observado cuando se incuban las colonias en presencia de
bilis.
4.- Anotar la morfologa del microorganismo en la tincin de Gram.

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PRCTICA 5. IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM

POSITIVAS DE IMPORTANCIA CLNICA.

OBJETIVOS
Identificacin de algunos bacilos y coco-bacilos Gram positivos no
esporulados que se aslan con poca frecuencia en clnica, pero que tienen
importancia en infecciones humanas.

MATERIAL
1. Cultivo puro de la bacteria problema.
2. Colorantes para la tincin de Gram.
3. Agua oxigenada de 30 volmenes.
4. Tubos de medio bilis-esculina.
5. Placa de agar sangre.
6. Cepa de Staphylococcus aureus
productora de toxina .
7. Tubos de agar movilidad.
8. Tubos de urea de Kristensen.

TCNICA
Una vez comprobado que se trata
de cocos o bacilos Gram positivos no
esporulados y realizada la prueba de la
catalasa, se siembran los medios para
detectar movilidad, hidrlisis de esculina,
ureasa y prueba CAMP. Prueba CAMP
La prueba de movilidad se realizar
en dos tubos, incubando uno de ellos a
22-25 C durante 48-72 h., y el otro a 35-37 C durante 48 h.
-hemlisisa
Movilidad

Hidrlisis
Catalasa

esculina
Ureasa

Morfologa CAMP

Listeria monocytogenes Bacilos rectos + +/b + + Moderada

Corynebacterium Bacilos
+ + +
urealyticum irregulares
Arcanobacterium Bacilos
+ Inversad
haemolyticum irregulares
Bacilos
Actinomyces pyogenes +/ +
irregulares
Rhodococcus equi Cocos o bacilose + + Intensa
Streptococcus agalactiae Cocos + + Intensa

a La hemlisis puede no ser aparente hasta las 48 h.

c Depende de la especie; C. hemolyticum es -hemoltico.
b L. monocytogenes presenta una movilidad caracterstica, en forma de "paraguas", a 22-25 C. Es

inmvil a 35-37 C.
d Inhibe ligeramente la hemlisis producida por S. aureus.

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RESULTADOS OBTENIDOS

Tincin Hidrlisis
Identificacin: Catalasa Movilidad Ureasa Hemlisis
de Gram esculina

Dibujar el resultado de la prueba CAMP:

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PRCTICA 6.IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

PATGENOS
6.1. introduccin.

Se ofrecen aqu mtodos sencillos para la identificacin de los microorganismos que

pueden haber sido aislados en las prcticas anteriores. La identificacin completa
puede requerir otras pruebas, descritas en los manuales de laboratorio de
Microbiologa Clnica (ver Bibliografa).

Recurdese que para proceder a la identificacin debe partirse siempre de un

cultivo puro, o por lo menos de una colonia aislada.

Debe tenerse siempre en cuenta la diversidad que presentan los microorganismos,

que hace que una cepa en concreto no presente exactamente las caractersticas que
definen a la especie. Por tanto, hay que considerar la totalidad de los resultados
coincidentes y no coincidentes, y valorar la importancia taxonmica de cada uno.

6.2. TCNICA.

El primer paso es la tincin de Gram a partir de una colonia aislada, que nos
informar si se trata de una bacteria, de su morfologa, y de si es Gram-positiva o
Gram-negativa. A partir de estos datos pueden seguirse los protocolos de los
siguientes apartados.

6.3. COCOS GRAM POSITIVOS.

Slo se describen aqu los patgenos pertenecientes a los gneros Streptococcus y

Staphylococcus.

Material necesario:
Cultivo puro de la bacteria problema.
Colorantes para la tincin de Gram.
Agua oxigenada de 30 volmenes.

Tcnica:
a) Forma y disposicin: Se realiza una tincin de Gram. Los estreptococos suelen
aparecer en cadenas, los estafilococos en agrupaciones irregulares como racimos.
b) Catalasa: Poner en un portaobjetos una gota de agua oxigenada de 30 volmenes
e introducir el asa con las bacterias. En caso positivo se desprenden burbujas.

CATALASA (+): Staphylococcus

COCOS GRAM(+)

CATALASA (-): Streptococcus

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6.3.1. Identificacin de estafilococos.

Material necesario:
1 tubo con 0,5 ml de caldo comn.
Plasma de conejo.
1 placa con medio Chapman-Manitol (Manitol-Sal). Este medio es selectivo para
Staphylococcus al contener un 7,5% de ClNa, y se detecta la fermentacin del
manitol al virar el indicador de pH (rojo de fenol) de rosa a amarillo.

Tcnica:

Identificar las colonias sospechosas (catalasa positiva) segn el siguiente

esquema:
+, MANITOL + : Staphylococcus aureus
COAGULASA NOVOBIOCINAR: Staphylococcus saprophyticus
-, MANITOL + -
NOVOBIOCINAS: Staphylococcus epidermidis

a) Fermentacin del manitol: Sembrar la bacteria en placa de Chapman-manitol.

Incubar a 37C, 24-48 horas. Observar si hay fermentacin por viraje del
indicador a color amarillo.
b) Coagulasa: Sembrar la colonia en 0,5 ml de caldo comn. Incubar 18 horas a
37C. Aadir una gota de plasma de conejo. Incubar a 37C. En caso positivo
aparece un cogulo a las pocas horas (puede leerse la prueba al da siguiente).
c) Sensibilidad a novobiocina: Inocular una placa segn la tcnica del
antibiograma de difusin (Prctica 6). Colocar un disco de 5 g de novobiocina.
Incubar una noche a 37C. Un halo de menos de 16 mm significa resistencia.

6.3.2. Estreptococos.

La identificacin de estreptococos, una vez comprobada la tincin de Gram y el

carcter catalasa-negativa parte de la observacin de la hemlisis en agar sangre:

Examinar las colonias crecidas 24 horas en una placa de agar sangre. Observar si
hay -hemlisis: halo transparente alrededor de las colonias (S. pyogenes); -
hemlisis: halo verdoso (los grupos Streptococcus milleri, S. mutans, S. salivarius y S.
sanguis, denominados globalmente estreptococos viridans, y Streptococcus
pneumoniae); o no hay hemlisis (S. lactis y otros).
BacitracinaS S. pyogenes (Grupo A). Confirmar serolgicamente
-hemlisis: S. agalactiae (Grupo B). Hacer prueba CAMP e
hidrlisis del hipurato
BacitracinaR
Otros serogrupos (C, G)
OptoquinaS S. pneumoniae. Confirmar por solubilidad en bilis o
serologa
-hemlisis:
OptoquinaR Bilis-esculina ( ): estreptococos viridans

Sin hemlisis, BacitracinaR Bilis-esculina (+): Enterococcus (Grupo D)

o variable OptoquinaR

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Enterococcus spp. puede dar cualquier tipo de hemlisis (aunque no suele ser
hemoltico), y si se sospecha su presencia (por ejemplo, en orina) no es preciso este
primer paso.

Material necesario:
Placa con agar sangre.
Discos de optoquina y bacitracina.
Pinzas.
1 tubo con 0,5 ml de caldo glucosado.
NaOH 0,5 N.
Desoxicolato sdico al 10 %.
Pipetas de 1 ml. estriles.
1 tubo de agar bilis-esculina.

Tcnicas:
Sensibilidad a la bacitracina: Sembrar la bacteria por estra apretada en placa de
agar sangre, poniendo en la superficie un disco impregnado con 0,2 U de
bacitracina en la zona donde se espera crecimiento confluente. Incubar 24 horas
a 37C. Streptococcus pyogenes (Grupo A) es sensible, producindose un halo de
inhibicin alrededor del disco.
Sensibilidad a la optoquina: Se siembra la bacteria en la superficie de una placa
de agar sangre donde se deposita un disco impregnado con una solucin de
1/4000 de optoquina. Incubar a 37C, 24 horas. Streptococcus pneumoniae no
crece en la zona de accin de la optoquina, los dems estreptococos s.
Solubilidad en bilis: Se resiembra la bacteria en 0,5 ml de Caldo glucosado.
Incubar a 37C, 18 horas. Aadir una gota de sosa 0,5 N y una gota de
desoxicolato sdico al 10 por 100. En caso positivo se observar inmediatamente
el aclaramiento de la suspensin. Streptococcus pneumoniae se lisa en presencia
de bilis, los dems estreptococos no.
Hidrlisis del hipurato: Esta prueba se describe en el apartado 4.5.2.1.
Streptococcus agalactiae da
positiva esta prueba; son los
Staphylococcus
nicos estreptococos Streptococcus
aureus
-hemolticos que lo hacen. agalactiae
Prueba de bilis-esculina:
Sembrar por estra en la
superficie del agar inclinado
bilis-esculina. Incubar 24
horas. Si la bacteria crece e
hidroliza la esculina, el
producto de su hidrlisis
(esculetina) reacciona con el
citrato de hierro dando
coloracin negruzca. Los
enterococos dan positiva
esta prueba. Listeria
Prueba CAMP: Inocular una monocytogenes
cepa de Staphylococcus
aureus productora de - Figura 4.1. Prueba CAMP.
lisina en una placa de agar

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sangre, trazando una sola estra siguiendo un dimetro. Inocular las bacterias a
identificar trazando estras perpendiculares a la primera, pero que no lleguen a
tocarla (Figura 4.1). Incubar a 37C durante 18-24 h.
El resultado positivo se manifiesta por una zona de hemlisis intensa en la
confluencia de las estras, en forma de flecha apuntando a la estra de S. aureus.
Los estreptococos del grupo B (Streptococcus agalactiae) producen una hemolisina
cuyo efecto es potenciado por la -lisina de S. aureus, una fosfolipasa C que afecta a
la membrana de los hemates.

6.4. COCOS GRAM-NEGATIVOS.

Nos referiremos slo a los pertenecientes a los gneros Neisseria y Moraxella.

Se caracterizan preliminarmente por su morfologa de cocos Gram-negativos en

parejas, semejando granos de caf, y por dar positivas las pruebas de la catalasa y
de la oxidasa.

La identificacin se completara mediante pruebas bioqumicas. Los ensayos de

oxidacin de azcares son difciles de realizar, y se recomienda el empleo de alguno
de los mtodos comercialmente disponibles.

6.4.1. Material necesario:

Colonias aisladas de la bacteria problema.
Colorantes para tincin de Gram.
Agua oxigenada de 30 volmenes.
Tira de papel con reactivo de oxidasa.

6.4.2. Tcnica:
Catalasa: Ya descrita en el apartado 4.3.
Oxidasa: Se trazan rayas con el asa cargada de bacterias sobre tiras de papel
impregnadas en solucin acuosa al 1 por 100 de tetrametil-p-feniln-diamina. En
caso positivo el papel cambia de color pasando a azul oscuro o negro.
6.5. BACILOS GRAM-NEGATIVOS.

Dada la variedad de especies existentes, es preciso tener en cuenta el origen de la

muestra, la etiologa posible y los medios de cultivo empleados en su aislamiento.

En principio pueden distinguirse aquellas que crecen en medios no enriquecidos y

en medios propios para enterobacterias, que pueden pertenecer al grupo de las
enterobacterias o al de los no fermentadores de azcares. Son bacterias que se
aslan muy frecuentemente en laboratorios clnicos.

Otras bacterias se aslan slo como resultado de un bsqueda especfica, utilizando

medios especiales; podemos citar Vibrio y Campylobacter, y por otra parte los
nutricionalmente exigentes como Haemophilus, Brucella, Bordetella y Legionella.

Consideraremos aqu nicamente la identificacin de enterobacterias y de algunos

otros bacilos Gram-negativos.

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6.5.1. Identificacin de bacilos Gram-negativos no fermentadores.

La identificacin puede iniciarse por la prueba de la oxidasa y la de

oxidacin/fermentacin de glucosa (O/F) como se indica a continuacin, pero a
menudo las bacterias no fermentadoras se identifican tras un fracaso en el intento
de clasificarlas como enterobacterias, al comprobar que no fermentan ni lactosa ni
glucosa en el medio de Kligler (tubo "rojo/rojo").

Material necesario:
Cultivo puro de la bacteria problema.
Tiras de papel con reactivo de oxidasa.
Dos tubos con medio de Hugh y Leifson. Este medio contiene glucosa y azul de
bromotimol, como indicador de pH. Se dispensa en tubos estrechos y largos,
para dificultar la difusin del oxgeno, y se hierve brevemente antes de utilizarlo,
para eliminar el oxgeno disuelto. Permite distinguir el metabolismo oxidativo del
fermentativo.
Vaselina estril.
Pipetas Pasteur estriles.
1 placa con medio agar F (medio King B).
1 placa con medio agar P (medio King A).

Tcnicas:
a) Oxidasa: Se realiza como se explic en 4.4.2. El resultado de esta prueba
permite iniciar la clasificacin atendiendo al siguiente esquema:

OXIDASA O/F BACTERIA

+ +/- Pseudomonas
+ -/- Alcaligenes
+ +/+ Vibrio
- +/- Acinetobacter (INMVIL)
- +/- Stenotrophomonas maltophilia (MVIL)
- +/+ Enterobacteriaceae

b) Oxidacin/Fermentacin (O/F): Sembrar la bacteria en picadura en dos tubos

con medio Hugh y Leifson, utilizando una pipeta Pasteur con la punta cerrada.
Cubrir uno de ellos con vaselina estril. Incubar a 37 C, 48 horas.
Las bacterias fermentadoras producen cido de la glucosa independientemente de la
existencia de oxgeno; por tanto, los dos tubos viran a amarillo (+/+).

Las bacterias oxidativas (metabolismo respiratorio) slo utilizan la glucosa en el

tubo descubierto; el medio es capaz de detectar la acidificacin producida por el
CO2 disuelto y por tanto vira al amarillo slo el que est sin cubrir de vaselina (+/-).

Si no vira ninguno (-/-), la bacteria no utiliza azcares.

c) Deteccin de pigmentos: A partir de una colonia aislada sembrar dos o tres
estras paralelas en una placa de agar F y otra de agar P. Incubar a 37C.
La presencia de Pseudomonas aeruginosa sobre la placa de agar F se manifiesta por
la aparicin de un pigmento amarillo fluorescente (fluorescena) difusible en el
medio, y un pigmento azul (piocianina) sobre la placa de agar P. Pseudomonas

18
 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II - UCM

fluorescens slo produce fluorescena. La composicin de sales de cada uno de estos

medios potencia la produccin de uno de los pigmentos e inhibe la del otro.
Extraccin de piocianina: aadir 1-2 ml de cloroformo al medio para extraer el
pigmento piocianina que es soluble en cloroformo. Dejar en reposo el tubo y
esperar a que se formen dos capas: en la parte superior quedar el cloroformo
con el pigmento.
Observacin de fluorescencia: Iluminar las placas con una lmpara de luz
ultravioleta, en la oscuridad. La fluorescena emite fluorescencia, la piocianina
no.

P. aeruginosa : CRECE A 42C; PIOCIANINA +; FLUORESCEINA +

Pseudomonas P. fluorescens : CRECE A 4C; PIOCIANINA -; FLUORESCEINA +
Otras especies

6.5.2. Identificacin de enterobacterias (Enterobacteriaceae).

Son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, oxidasa-negativa, catalasa-

positiva, que fermentan la glucosa y reducen los nitratos. Su identificacin se basa
en pruebas bioqumicas, que pueden realizarse en una batera de tubos o utilizando
un sistema comercial (Prctica 7). Con fines didcticos, la batera de pruebas se
dividir en dos partes, escogiendo las pruebas de la segunda parte en base a los
resultados de la primera. La prueba ms importante es la que se realiza en medio
Kligler o T.S.I.

6.5.2.1. Primera batera de identificacin.

Material necesario:
1 tubo con medio de Kligler o T.S.I. (Hierro-Tres- Azcares)
1 tubo con agua de peptona.
1 tubo con medio agar movilidad.
1 tubo con agar citrato de Simmons.
1 tubo con agar urea Christensen.
Reactivo de Ehrlich (p-dimetil-amino-benzaldehido).

Tcnicas:
a) Siembra en medio Kligler: Con el hilo recto se toma de la colonia y se siembra
en picadura; despus se siembra en la superficie por estra. Incubar a 37C
durante 24 horas. Observar los resultados:
Fermentacin de glucosa: fondo amarillo.
Fermentacin de lactosa: superficie amarilla.
Produccin de SH2: picadura negra.
Produccin de gas: burbujas o rotura del agar.
Como la concentracin de glucosa es baja, su fermentacin afecta slo al fondo del
tubo, en condiciones poco aerbicas. En la superficie del agar la bacteria respira,
con lo que la produccin de cido es menor, ya que el CO2 se elimina. La
concentracin de lactosa es diez veces mayor, con lo que la produccin de cido es
suficiente para el viraje del indicador incluso en la superficie del agar inclinado. En
realidad, la fermentacin de lactosa enmascara la de glucosa, pero esto no importa,
pues para que una bacteria fermente lactosa debe ser capaz de fermentar glucosa.

19
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El SH2 producido se detecta en forma de sulfuro de hierro.

b) Produccin de indol: Se siembra en agua de peptona. Incubar a 37C, 24-48
horas. Aadir unas gotas de reactivo de Ehrlich resbalando por la pared del tubo.
En caso positivo aparece un anillo rojo en la interfase. Esto es debido a la
reaccin con el indol producido por la bacteria a partir del triptfano.
c) Movilidad: Sembrar por picadura con hilo recto en medio agar movilidad.
Incubar a 37C, 48 horas. Observar si el crecimiento est slo en la picadura o se
extiende a los lados de ella. La baja concentracin de agar de este medio (3 por
mil) permite que las bacterias lo invadan si son mviles.
d) Crecimiento en citrato: Sembrar en la superficie inclinada del medio de
Simmons. Cultivar a 37C, 24 horas. En caso positivo el medio vira de verde a
color azul. El medio contiene citrato sdico como nica fuente de carbono. Las
bacterias capaces de utilizarlo alcalinizan el medio, y hacen virar el indicador
azul de bromotimol, a la vez que muestran crecimiento en superficie.
e) Produccin de ureasa: Sembrar en estra en la superficie inclinada del agar urea
de Christensen. Incubar a 37 C, 24 horas. En caso positivo aparece color rojo
cereza. Es debido a la alcalinizacin del medio por produccin de amonio a partir
de la urea que contiene el medio, lo que hace virar el rojo de fenol.

Intentar la identificacin mediante la Tabla 4.1. Si no se puede completar, prepare

una segunda batera de pruebas.

6.5.2.2. Segunda batera de identificacin.

Si la bacteria no ha fermentado la lactosa en el medio de Kligler es imprescindible

hacer la prueba del O.N.P.G. para determinar si es fermentadora lenta o si
realmente no es fermentadora de lactosa. Las dems pruebas se escogern segn
necesidades de identificacin.

Material necesario:
2 tubos con medio de Clark y Lubs (caldo tamponado con glucosa)
1 tubo con agar de fenilalanina.
1 tubo con 0,5 ml de agua destilada estril.
1 disco de papel impregnado con O.N.P.G.
Solucin de alfa naftol al 6% en etanol de 60.
Solucin de sosa al 16 por 100.
Solucin de rojo de metilo al 0,5% en etanol de 60.
Solucin de cloruro frrico al 10%.

Tcnicas:
a) O.N.P.G. (orto-nitrofenil--D-galactopiransido): Hacer una suspensin espesa
de la bacteria en 0,5 cc de agua destilada estril, poner un disco de O.N.P.G.
Incubar a 37C, 2 horas. En caso positivo aparece color amarillo. El O.N.P.G.
penetra en la bacteria y es hidrolizado por la -galactosidasa, liberndose
nitrofenol de color amarillo.
b) Rojo de metilo: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37C. A 2 ml
del cultivo se aaden dos gotas de la solucin de rojo de metilo. En caso positivo
aparece color rojo. El rojo de metilo vira a pH muy bajo, detectando nicamente

20
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la produccin de grandes cantidades de cidos, tpico de la ruta fermentativa

cido-mixta.
c) Voges-Proskauer: Sembrar en medio Clark y Lubs e incubar 48 h a 37 C. A 1 ml
del cultivo se agrega 0,5 ml de solucin de alfa naftol y 1 ml de solucin sosa. Se
agita. En caso positivo a los 10 minutos aparece un color rosa. El alfa-naftol da
un complejo coloreado al reaccionar con la 2,3-butanodiona, formada por
oxidacin en medio alcalino del 2,3-butanodiol, que han producido las bacterias
que llevan a cabo la fermentacin butiln-gliclica.
d) Desaminacin de la fenilalanina (APP): Sembrar la bacteria en la superficie del
medio agar-fenilalanina. Incubar a 37C, 24 horas. Aadir unas gotas de
solucin de cloruro frrico. En caso positivo aparece coloracin verde. Las
bacterias que poseen fenilalanina desaminasa transforman dicho aminocido en
cido fenil pirvico (APP), que da reaccin coloreada con el cloruro frrico. Esta
prueba puede sustituirse por la desaminacin del triptfano (TDA: triptfano-
desaminasa), que da lugar a la formacin de cido indolil-pirvico.

Una vez realizadas todas las pruebas, determinar el gnero y la especie con ayuda
de la Tabla 6.1.

21
 MEDIO DE KLIGLER TSI INDOL CITRATO UREASA APP ONPG MVIL RM VP
INCLINADO FONDO GAS SH2
Escherichia coli A A + - + - - - + + + -
Klebsiella spp. A A + - -/+ + +/- - + - V V
Enterobacter spp. A A + - - + V - + + - +
Citrobacter freundii V A + + - + +/- - + + + -
Citrobacter diversus V A + - + + +/- - + + + -
Serratia spp. K A -/+ - - V -/+ - + +/- V V
Shigella spp. K A - - V - - - -/+ - + -
Salmonella typhi K A - + - - - - - + + -
Salmonella spp. K A -/+ +/- - + - - - + + -
Proteus mirabilis K A - + - +/- + + - + + +/-
Proteus vulgaris K A - + + -/+ + + - + + -
Yersinia enterocolitica K* A - - +/- - +/- - + - ** + -

TABLA 6.1. CLASIFICACIN DE ALGUNAS ENTEROBACTERIAS SEGN PRUEBAS BIOQUMICAS

A: acidifica; K: alcaliniza; V: variable segn especies (los resultados pueden variar segn la cepa, y muchos de ellos slo pueden
considerarse orientativos).
RM: Rojo de metilo; VP: Voges-Proskauer.
*E
 PRCTICA 7. TIPADO DE Enterococcus POR
BACTERIOCINOTIPIA Y ANTIBIOTIPIA
OBJETIVOS:
Diferenciar cepas de Enterococcus basndose en las propiedades de produccin y
sensibilidad a bacteriocinas y en el perfil de sensibilidad a antibiticos. Para la
bacteriocinotipia se utilizan como indicadores varias cepas de Enterococcus con
sensibilidad conocida a bacteriocinas. Las cepas a estudiar se ensayan para determinar
si producen bacteriocinas capaces de matar a una o varias de las cepas indicadoras. El
perfil de actividad de una cepa problema sobre las cepas indicadoras nos da su perfil
bacteriocinognico. Para la antibiotipia se realiza un antibiograma normal en placa. La
combinacin de los dos perfiles nos permite identificar la cepa con fines epidemiolgicos.

Bacteriocinotipia:

MATERIAL
1. Tubos de BHI de 3 ml (tantos como microorganismos indicadores)
2. Placas de TSA con 0,3 % extracto de levadura.
3. Tubos con 4-5 ml de medio TSA-semislido (TSB + 0,7% de agar) con 0,3 % de
extracto de levadura.
4. Tubos de solucin salina.
5. Palillos mondadientes estriles.
6. Placas de Agar Mueller-Hinton.
7. Torundas de algodn.
8. Discos con antibiticos y pinzas.

TCNICA

1er Da:
1. Inocular 3 ml de BHI con cada una de las cepas indicadoras y cultivarlo a 37C toda
la noche.

2 Da:
2. Rotular una placa de TSA por la cara inferior, marcando con un nmero la posicin
en la que se va a inocular cada microorganismo problema.
3. Fundir los tubos de TSA-semislido y dejarlos atemperar a 50 C. Aadir 50 l de la
suspensin de BHI de las cepas indicadoras a cada uno de los tubos, mezclar bien
con vrtex y volcarlo en la placa rotulada de TSA, repartindolo uniformemente. Dejar
solidificar a temperatura ambiente.
4. Tocar con el palillo una colonia de cada una de las cepas que vamos a ensayar para la
produccin de bacteriocinas y pincharla en la placa de TSA con el microorganismo
indicador sobre la posicin rotulada. (Precaucin: Tener en cuenta que con el mismo
palillo no se puede pinchar en ms de una placa porque se contaminan los
indicadores, as que usar un palillo diferente por cepa y por indicador).
5. Incubar las placas a 37 C 24 h.
 DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II - UCM

3er Da:

6. Observar la aparicin de halos de inhibicin y anotar para cada cepa problema cules
son las cepas indicadoras que se inhiben y cules no.

Antibiotipia:

MATERIAL

1. Tubos de solucin salina.

2. Placas de Agar Mueller-Hinton.
3. Torundas de algodn estril.
4. Discos con antibiticos (Pencilina G, Eritromicina, Clindamicina, Vancomicina y
Trimetoprim/Sulfametoxazol) y pinzas.

TCNICA

1. Tomar de una colonia aislada con el asa, y resuspender en el tubo de solucin salina
frotando en la pared del tubo, hasta obtener una suspensin homognea de turbidez
apenas visible.
2. Impregnar una torunda con la
suspensin; escurrirla contra la
pared del tubo y sembrar con ella
toda la superficie de la placa,
mediante estras cruzadas en tres
direcciones.
3. Antes de 15 minutos deben
colocarse los discos de antibiticos.
4. Leer los dimetros de los halos tras 20 horas de
incubacin a 36 C.
5. Interpretar el antibiograma con la siguiente
tabla:

1
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA II - UCM

Carga del R S
Antibitico:
disco (mm) (mm)
Penicilina G 10 U 14 15
Eritromicina 15 g 13 22
Clindamicina 2 g 14 21
Vancomicina 30 g 9 12
Trimetoprm/Sulfametoxazol 1,25/23,75 g 10 16

RESULTADOS:

Cepa indicadora: A B C Perfil de resistencia (R/I/S)

Cepa problema: Inhibicin (1/0) PG ER CD V SXT
1
2
3
4
5
6
7
8

En base a estos resultados, indicar que cepas estn relacionadas o son idnticas entre s.

2
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CALENDARIO DE PRCTICAS

GRUPO 1 LUNES 24 MARTES 25 MIRCOLES 26 JUEVES 27 VIERNES 28

Fijacin y tincin
Inoculacin de las
de placas de 96.
Formacin de Biofilms Siembra de las cepas de placas para la
Cuantificar por
de Pseudomonas Pseudomonas a ensayar. formacin de
intensidad de
biofilms.
tincin
Inoculacin de las
placas.
Ensayo de adhesin a Siembra de las cepas de
Fijacin y tincin
plstico de Candida y Candida albicans y
de placas de 96.
Saccharomyces. Saccharomyces cerevisiae.
Cuantificar por
intensidad de
tincin

Siembra en agar
sangre y agar Siembra de Lectura de
Lectura de las pruebas de
Hemocultivo chocolate. pruebas de pruebas
identificacin
Identificacin complementarias.
Tinciones de Gram.

Inocular cepas Ensayo de Leer resultados.

indicadoras de bacteriocinotipia.
Tipado de Enterococcus
Enterococcus en tubos Elaborar
de BHI Antibiograma conclusiones

3
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CALENDARIO DE PRCTICAS
GRUPO 2 LUNES 1 MARTES 2 MIRCOLES 3 JUEVES 4 VIERNES 5

Fijacin y tincin de
Formacin de Siembra de las cepas Inoculacin de las
placas de 96.
biofilms de de Pseudomonas a placas para la
Cuantificar por
Pseudomonas ensayar. formacin de biofilms.
intensidad de tincin

Inoculacin de las
placas.
Ensayo de adhesin Siembra de las cepas
a plstico de de Candida albicans y
Fijacin y tincin de
Candida y Saccharomyces
placas de 96.
Saccharomyces cerevisiae.
Cuantificar por
intensidad de tincin
Siembra en agar
Lectura de las pruebas
sangre y agar
Siembra de pruebas de identificacin.
chocolate. Lectura de las pruebas
Hemocultivo de Identificacin.
complementarias
Siembra de pruebas
Tinciones de Gram.
complementarias.

Inocular cepas Ensayo de

Leer resultados.
Tipado de indicadoras de bacteriocinotipia.
Enterococcus Enterococcus en tubos
Elaborar conclusiones.
de BHI. Antibiograma.