Manual de Procedimientos Bacteriologia CNDR 2004

Edicin 2004
Levantado de Texto:
Dr. Sergio Lpez y Sra. Xiomara Aguilar
Revisin de texto:
Dr. Sergio Lpez, Lic. Victoria Caldern, TM Teresa Videa,
Tc. Julissa vila, Lic. Javiera Meja
Cuidado de la Edicin:
Dr. Sergio Lpez
Diagramacin:
Martha Medina Ruiz
Diseo de portada:
Dr. Sergio Lpez
Impresin:
Litografa Nicaragense
(LITONIC)
La edicin 2004 del Manual de Procedimientos

de Bacteriologa Mdica del CNDR/MINSA fue
financiada por el PMSS.
Componente Modernizacin de Hospitales
ii
MARCO LEGAL
El presente documento, como Manual de Procedimientos tiene su sustento

legal dentro del marco jurdico y regulatorio existente para el Sector
Salud, principalmente lo dispuesto en la Constitucin Poltica (Arto.59),
Ley No.423 Ley General de Salud, su Reglamento y en la Ley Ejecutivo,
y su Reglamento, encaminados a garantizar el derecho a la salud de
todos los nicaragenses.
La Ley No. 423 Ley General de Salud, en su Arto.4 establece:

Corresponde al Ministerio de Salud, como ente rector del Sector,
coordinar, organizar, supervisar, inspeccionar, controlar, regular, ordenar
y vigilar las acciones en salud, sin perjuicio de las funciones que deba
ejercer frente a las instituciones que conforman el sector salud, en
concordancia con lo dispuesto en disposiciones legales especiales.
De igual manera, la Ley General de Salud, en su Arto.2 establece que

este Ministerio es el rgano competente para aplicar, supervisar, controlar
y evaluar el cumplimiento de la presente Ley y su Reglamento; as como
elaborar, aprobar, aplicar, supervisar y evaluar normas tcnicas, formular
polticas, planes, programas, proyectos, manuales e instructivos que sean
necesarios para su aplicacin.
Es responsabilidad de los representantes de establecimientos proveedores

de servicios de salud, entre otras consignadas en la Ley General de
Salud, y su Reglamento, independientemente de su naturaleza jurdica,
garantizar el cumplimiento de los manuales relativos a la salud y
estndares de calidad establecidos por el rgano Rector de la Salud.
iii
REPBLICA DE NICARAGUA
MINISTERIO DE SALUD
Dr. Jos Antonio Alvarado Correa
Ministro de Salud
Lic. Margarita Gurdin

Vice Ministra de Salud
Dr. Enrique Alvarado Abaunza

Secretario General
Dr. Alcides Gonzlez Mairena

Director General
Centro Nacional de Diagnstico y Referencia
Equipo Tcnico de Bacteriologa del CNDR
Dr. Sergio R. Lpez Cruz

Jefe de Departamento y
Coordinador del Equipo de Bacteriologa
Lic. Victoria Caldern

Analista del Departamento de Bacteriologa
Lic. Juan Carlos Matute

Ex-analista del Departamento de Bacteriologa
TM Teresa Videa
Lic. Anielka Baltodano

Ex-analista del Departamento de Bacteriologa
Tc. Julissa vila

Lic. Javiera Meja

iv
Elaborado por el Equipo Tcnico Cientfico del Centro Nacional de Diagnstico y
Referencia (CNDR) del Ministerio de Salud de Nicaragua:
Dr. Sergio R. Lpez: Captulos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 16, 17
Lic. Victoria Caldern: Captulos 2, 6, 13, 17
Lic. Juan Carlos Matute: Captulos 3, 7, 14, 15, 16, 17
TM. Teresa Videa: Captulos 5, 12, 16, 17
Lic. Anielka Baltodano: Captulos 6, 12, 16, 17
Tc. Julissa vila: Captulos 7, 9, 11, 16, 17
Lic. Javiera Meja: Captulos 6, 8, 10, 12, 17
El presente documento constituye un esfuerzo del Equipo Tcnico Cientfico del Centro Nacional
de Diagnstico y Referencia del Ministerio de Salud, reservndose dicho Ministerio, todos los
derechos de autor conforme lo dispuesto en la legislacin civil de la materia.
El presente Manual de Procedimientos de Bacteriologa Mdica, edicin 2004, no puede

reproducirse o transmitirse por mtodo o forma alguna, sea electrnico o mecnico, incluyendo
copias fotostticas, cintas magnetofnicas, acumulacin de informacin con memoria ni atravs
de ninguna otra forma, sin autorizacin por escrito del Ministerio de Salud de Nicaragua.
www.minsa.gob.ni
Complejo Nacional de Salud Dra. Concepcin Palacios.

PBX (505) 289-4700. Apartado Postal: 107. Managua.
v
Indice
Pgina
Presentacin ........................................................................................ ix
Prlogo .............................................................................................................................................................. xi
Captulo 1. Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa ................. 1
Captulo 2. Control de calidad en bacteriologa ................................................................................. 5
Captulo 3. Procedimientos para la tincin de Gram ....................................................................... 15
Captulo 4. Procedimientos para la identificacin de enterobacterias ....................................... 19
Captulo 5. Procedimientos para el aislamiento de enterobacterias
y otras bacterias menos frecuentes en el urocultivo ...............................................35
Captulo 6. Procedimientos para bacterias aisladas comnmente en
exudados de heridas ..........................................................................................................43
6.1 Procedimientos para la identificacin de Pseudomonas aeruginosa ..................47
6.2 Procedimientos para la identificacin de Acinetobacter spp ............................ 61
6.3 Procedimientos para la identificacin de Staphylococcus aureus ....................73
6.4 Procedimientos para la identificacin de Enterococcus spp ..............................79
Captulo 7. Procedimientos para bacterias aisladas del lquido cefalorraqudeo .....................89
7.1 Procedimientos para la identificacin de Haemophilus influenzae ...................93
7.2 Procedimientos para la identificacin de Streptococcus pneumoniae ........... 107
7.3 Procedimientos para la identificacin de Neisseria meningitidis .................... 115
7.4 Procedimientos para la identificacin de Listeria monocytogenes ................. 123
Captulo 8. Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos ....................................... 133
8.1 Procedimientos para la identificacin de
Streptococcus grupo viridans ............................................................................... 137
Captulo 9. Procedimientos para bacterias aisladas en exudado tico .................................... 147
Captulo 10. Procedimientos para bacterias aisladas en exudado farngeo .............................. 151
10.1 Procedimientos para la identificacin de
Streptococcus pyogenes (Grupo A) y otros -Hemolticos ............................... 153
Captulo 11. Procedimientos para la identificacin de Bordetella pertussis ............................. 165
Captulo 12. Procedimientos para bacterias aisladas en coprocultivo ......................................... 173
12.1 Procedimientos para la identificacin de Shigella spp ...................................... 177
12.2 Procedimientos para la identificacin de Salmonella spp ................................. 195
12.3 Procedimientos para la identificacin de Eschericha coli 0157:H7 ............... 213
vii
Captulo 13. Procedimientos para la identificacin de Vibrio cholerae .................................... 225
Captulo 14. Procedimientos para la identificacin de microorganismos
aislados en exudado vaginal ........................................................................................... 245
14.1 Procedimientos para la identificacin de Trichomonas vaginalis .................... 249
14.2 Procedimientos para la identificacin de Gardnerella vaginalis ...................... 251
14.3 Procedimientos para la identificacin de Mobiluncus spp ............................... 255
14.4 Procedimientos para la identificacin de Candida spp ..................................... 257
14.5 Procedimientos para la identificacin de otras levaduras ............................... 259
Captulo 15. Procedimientos para la identificacin de Neisseria gonorrhoeae ........................ 263
Captulo 16. Susceptibilidad antimicrobiana: Procedimientos para la sensibilidad

por el mtodo de difusin en Agar............................................................................. 273
16.1 Deteccin de betalactamasas en Haemophilus influenzae,
Neisseria gonorrhoeae, Staphylococcus spp y Enterococcus spp.
Mtodo cromognico .............................................................................................. 283
16.2 Mtodos para la deteccin de betalactamasas de espectro
extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos ....................................................... 287
16.3 Determinacin de Cloranfenicol Acetil Transferasa (CAT) ............................ 293
16.4 Lista oficial de discos de susceptibilidad y tablas de discos
con antimicrobianos que deben emplearse segn bacterias ............................ 297
Captulo 17. Fundamentos fisiolgicos y bioqumicos de las pruebas......................................... 305
viii
REPBLICA DE NICARAGUA
MINISTERIO DE SALUD
CENTRO NACIONAL DE DIAGNSTICO Y REFERENCIA
PRESENTACIN
El propsito de esta nueva edicin del Manual de Procedimientos de Bacteriologa Mdica sigue siendo
como en las anteriores ediciones, poner a la disposicin de todos los Especialistas de Laboratorio que
laboran en esta rea de la ciencia, los ltimos conocimientos y metodologas en bacteriologa en forma
sencilla y didctica, tomando en cuenta las disposiciones normadas por los organismos internacionales
para este tipo de textos.
No se puede hablar de Bacteriologa sin recordar algo de la historia de esta disciplina cientfica.
Si bien es cierto que la humanidad ya utilizaba los microorganismos desde pocas muy remotas para
elaborar pan, cerveza, quesos y vinos, lo hacan por intuicin y sin conocerlos verdaderamente.
Fue necesario el desarrollo de la microscopia que se inici en el siglo XVII, para que en verdad la bacteriologa
emergiera como conocimiento real de los microorganismos.
Sin duda, Pasteur y Koch son los padres de esta ciencia y a partir de ellos se inicia un desarrollo sostenido
a lo largo de los aos hasta culminar con los ltimos avances alcanzados que han llegado al surgimiento
de ramas cada vez ms vigorosas y especializadas como la Virologa, la Inmunologa, la Biologa Molecular
con sus aplicaciones biotecnolgicas no slo mdicas, sino en la agricultura, la ganadera y la industria.
Han pasado varios aos desde la ltima edicin que hiciera el Centro Nacional de Diagnstico y Referencia
(CNDR) del MINSA de un Manual de Procedimientos de Bacteriologa y por eso el Ministerio de Salud ha
apoyado al equipo de cientficos del CNDR en la elaboracin del presente Manual.
Estos procedimientos de laboratorio estn basados en las normativas de la Ley General de Salud y deben
de servir para que todos los que laboran en bacteriologa en el pas tengan una gua clara y precisa de los
procedimientos ms frecuentemente utilizados.
Felicitamos al equipo de trabajo del CNDR del Ministerio de Salud, que luego de varios aos de esfuerzo
han logrado concretar la edicin de este Manual.
Con la firme conviccin de que este Manual servir para mejorar la calidad de la atencin a nuestros
conciudadanos, les saludo.
Jos Antonio Alvarado C.

Ministro de Salud
ix
Prlogo
El Manual de Procedimientos de Bacteriologa Mdica ha tenido una transformacin total en
relacin a la Tercera Edicin. El Manual dej de ser de Normas para transformarse en uno de
Procedimientos. La razn es que esto permite una mejor utilizacin como herramienta de docencia sin
soslayar los exhaustivos pasos para realizar los procedimientos o tcnicas que se requieren en la
identificacin de las bacterias y su respectiva sensibilidad a los antimicrobianos.
El principal eje del Manual es la identificacin de bacterias que estn asociadas a los problemas
infecciosos bacterianos ms comunes en los hospitales y la comunidad. Para ello se estn siguiendo
los mtodos recomendados por las instituciones que funcionan como centros subregionales para el
control de calidad de las subredes latinoamericanas que vigilan la resistencia a los antimicrobianos,
de las cuales es miembro el CNDR/Nicaragua: Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas (INEI)
de Argentina, Instituto Nacional de Salud (INS) de Colombia y National Laboratory for Enteric
Pathogens (NLEP) del Canadian Science Centre for Human and Animal Health, Canad.
El formato de identificacin que se incorpor fue el de las Normas ISO 17025, aunque el propsito
no fue mas que acercar esta Cuarta Edicin a una posible edicin futura siguiendo meticulosamente
los parmetros que dichas normas demandan.
El captulo 2 que aborda de manera suscinta pero profunda el control de calidad en bacteriologa
es nuevo. El captulo 4, sobre los procedimientos para la identificacin de enterobacterias ha sido
reelaborado totalmente en base a facilitar la identificacin de las mismas utilizando diagramas de
flujo y no tablas. Esto requiri un largo perodo de prueba en el Departamento de Bacteriologa hasta
garantizar la certeza y facilidad de uso.
El tema de los procedimientos para la sensibilidad antimicrobiana se aborda por primera vez de
manera exhaustiva y profunda, incluyendo pruebas especiales como la deteccin de betalactamasas,
betalactamasas de espectro extendido y cloranfenicol acetiltransferasas. La gua para el uso de discos
de sensibilidad segn bacterias fue revisada, ampliada y enriquecida con todas las notas que indican
su valor predictivo, as como sus lmites, segn las normas NCCLS 2004. Todo esto en vista de la
vigencia del grave problema de la resistencia a los antimicrobianos a nivel mundial.
Por ltimo, para poder garantizar el empleo de este Manual, fue requerido que la Lista Bsica de
Insumos de Bacteriologa del MINSA fuera ampliada, tanto en medios de cultivo, reactivos y discos
de sensibilidad, despus de una exitosa coordinacin con la Direccin de Normacin de Insumos
Mdicos.
Deseamos agradecer el formidable y paciente trabajo para la presente edicin realizada por la
seora Xiomara Aguilar, quien hizo posible una mejor presentacin del Manual.
Dr. Sergio Lpez

Coordinador de la Cuarta Edicin
xi
CAPTULO 1.
Conceptos fundamentales para
comprender la enfermedad infecciosa
I. INFECCIN:
Es el establecimiento de la interaccin entre el husped y el agente (microorganismo). Debido a que slo
requiere la presencia del microorganismo en el husped, la interaccin husped-agente ocurre
frecuentemente. Cuando el microorganismo entra y se instala en el husped, su siguiente fase es la
proliferacin. Esto no implica necesariamente dao al husped ni reaccin del mismo.
1. COLONIZACIN:
Es la instalacin y proliferacin del agente en el husped. No implica ningn tipo de interaccin.
Cuando nace un nio, a las pocas horas le han colonizado varios microorganismos en su piel, in-
testino y garganta. A partir de ese momento se considera que existe una infeccin, es decir, el esta-
blecimiento de la interaccin es de comensalismo y en el mismo, no hay dao o injuria contra el husped.
II. ENFERMEDAD INFECCIOSA:

Cuando hay manifestaciones clnicas como resultado de la injuria al husped por parte de mi-
croorganismos. El carcter de la interaccin ha variado: el microorganismo est produciendo dao.
III. PATOGENICIDAD:
Es la capacidad de los microorganismos de producir dao. Como no todos tienen la misma capacidad,
la magnitud que existe para producir ese dao es la manera de determinar si es ms patgeno o menos
patgeno.
IV. VIRULENCIA:
Es la magnitud de patogenicidad que tienen los microorganismos. La virulencia se determina por
la capacidad de invadir tejidos (invasividad) o producir toxinas (toxigenicidad).
1. INVASIVIDAD:
Capacidad de expandirse y daar tejidos.
Algunos microorganismos son virulentos por su invasividad:
En la faringoamigdalitis bacteriana el Streptococcus pyogenes se expande por la faringe y destruye el
tejido debido principalmente a la hialuronidasa. Las manifestaciones clnicas se deben a la invasividad.
Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa 1

MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE BACTERIOLOGA MDICA EDICIN 2004
2. TOXIGENICIDAD:
Capacidad de producir sustancias que causan las manifestaciones clnicas ms importantes.
Algunos microorganismos son virulentos por su toxigenicidad:
2.1. Vibrio cholerae 01:

Coloniza temporalmente el intestino delgado y produce una exotoxina. Las manifestaciones clnicas se
deben a la toxina.
En los dos ejemplos anteriores ha habido una infeccin, pero como los microorganismos han producido
dao, se ha producido una enfermedad infecciosa. En ambos casos los microorganismos son patgenos
y su virulencia la han manifestado de dos formas distintas.
Algunos microorganismos son ms patgenos que otros:
2.2. Shigella dysenteriae 1:

Se necesita alrededor de 200 bacterias para desencadenar disentera. Hay invasin al tejido intestinal
(a veces perforacin). Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratacin.
2.3. Vibrio cholerae 01:

Se necesitan alrededor de 100 millones de bacterias para desencadenar la diarrea. No hay invasin a
los tejidos. Elabora una exotoxina que produce diarrea y luego deshidratacin.
2.4. Shigella dysenteriae 1:

Es ms patgena que Vibrio cholerae 01 por que con menores cantidades y ms mecanismos virulentos
produce mayores daos a un individuo.
Cualquier miembro de la microbiota local puede producir enfermedad si previamente se le abre una
puerta de entrada a los tejidos, ya que ellos por s mismos no tienen capacidad para lograrlo.
El agente causal que con ms frecuencia se asocia a la endocarditis bacteriana es Streptococcus
viridans, un miembro de la microbiota local de boca y faringe. Esta enfermedad ocurre en personas con
dao en las vlvulas cardacas, despus de extracciones dentales o lavados vigorosos de dientes que
abren la puerta de entrada al estreptococo.
En este o cualquier otro caso, a los microorganismos de la microbiota local que producen enfermedad
se les denomina OPORTUNISTAS.
Un microorganismo oportunista no es patgeno en tanto es miembro de la microbiota local, pero se
convierte en patgeno cuando con mecanismos ajenos a ellos penetran e invaden tejidos cercanos o
lejanos. Los mecanismos o puertas que facilitan esta entrada son varios, pero he aqu algunos ejemplos:
heridas, traumatismos, enfermedades sistmicas como diabetes, administracin prolongada de
antimicrobianos, o por infecciones virales previas.
2 Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

Aqu una pequea lista de enfermedades producidas por oportunistas:

a. Sinusitis
b. Otitis media y externa
c. Infeccin urinaria
d. Neumona
e. Peritonitis aguda por traumatismos
En cambio, cualquier microorganismo que no es parte de la microbiota local pero que necesita al humano
como husped para perpetuar el ciclo de la infeccin (ejemplos: gonococos, shigellas, estreptococos beta
hemolticos del grupo A) son patgenos estrictos ya que cuentan con mecanismos genticos propios para
desencadenar la enfermedad. Algunas veces estos microorganismos no la producen y se pueden aislar
en personas sin sintomatologa. A estas personas se les denomina portadores, pero de igual manera,
en algunos casos se les prescriben medicamentos para erradicar a los microorganismos.
Aqu una pequea lista de enfermedades producidas por patgenos estrictos.
a. Fiebre Tifoidea
b. Faringoamigdalitis Bacteriana
c. Shigellosis
d. Enfermedad de Lyme
e. Gonorrea
ENFERMEDAD MICROORGANISMO OPORTUNISTA PATGENO VIRULENTO VIRULENTO

INVASIVO TOXIGENICO
Endocarditis Streptococcus
viridans SI SI (*) SI NO
Faringoamigdalitis Streptococcus
pyogenes NO SI SI NO
Shigellosis Shigella spp NO SI SI SI
Clera Vribrio cholerae
01 y 0139 NO SI NO SI
Otitis Externa Pseudomonas
aeruginosa SI SI (*) SI NO
* Slo en condiciones especiales.
V. BIBLIOGRAFA:
1. Hoeprich PD. Host-Parasite Relationschips and the patogenesis of infecious Disease in Infectious
Diseases, Chap 4, Paul D. Hoeprich editor, Fifth edition, 1994, JB Lippicott Co, Philadelphia.
2. Patogenia de la infeccin bacteriana en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo
F. Brooks, editor, captulo 9, 16 edicin (de la 21a edicin en ingls) 1998, editorial El Manual
Moderno S.A. de C.V. Mxico D.F.
Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa 3

4 Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa
CAPTULO 2.
Control de Calidad
en Bacteriologa
En bacteriologa se tiene en cuenta dos conceptos fundamentales, para medir el control de calidad.
I. EXACTITUD:
Es la correspondencia entre los resultados de los anlisis y los valores reales medidos a travs de un
control. Los controles utilizados son cepas estables con respecto a su bioqumica y sensibilidad. Estas
cepas se conocen como ATCC (American Type Culture Collection)
II. PRECISIN:
Es la dispersin de datos obtenidos, para una muestra procesada varias veces. Se debe tener en cuenta
que para poder medir la precisin se realiza por medio de la Reproducibilidad, es decir una misma
muestra se siembra peridicamente, los resultados deben ser iguales o similares todo el tiempo.
Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa 5

1. MEDICIN DE LA EXACTITUD Y PRECISIN DE LA SENSIBILIDAD

ANTIMICROBIANA:
Ejemplo 1 con el antimicrobiano amicacina 30g y la cepa de Escherichia coli ATCC 25922 (rango
NCCLS de 19-26 mm). Grfica No.1
2. EXPLICACIN DE CMO INTERPRETAR LOS VALORES DE LAS GRFICAS DE

LOS EJEMPLOS DE EXACTITUD Y PRECISIN:
2.1. Las lneas rojas muestran los puntos de corte superior de 26 mm, e inferior de 19 mm (rango
de referencia) de las normas NCCLS.
2.2. Observamos que la curva azul es nuestro control de calidad, con un valor inicial que est dentro
del rango de las normas NCCLS.
Grfica No. 1. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIN:

Es notorio que en los controles semanales (curva azul) hubo buena exactitud, ya que todas las lecturas
estuvieron dentro de los rangos, pero no hubo precisin ya que todos los puntos cayeron dispersos del
punto inicial (23mm).
30
25
20
mm
15
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SEMANAS

Ejemplo 2: con el antimicrobiano Sulfametoxazol Trimetoprim 23.75/1.25g y la cepa de

Staphylococcus aureus ATCC 25923 (rango NCCLS de 24 - 32 mm). Grfica No. 2.
Grfica No. 2. BUENA PRECISIN Y MALA EXACTITUD:

En esta segunda grfica se observa que la lectura del primer control est dentro del rango esperado. A
partir de la segunda semana se observa que los resultados estn fuera de rango (mala exactitud) pero
con valores muy similares (buena precisin).
35
30
25
20
mm
15
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SEMANAS

Ejemplo 3: con el antimicrobiano ciprofloxacina 5g, y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC

25923 (rango NCCLS de 22 - 30 mm). Grfica No. 3.
Grfica No. 3. BUENA PRECISIN Y BUENA EXACTITUD:

En esta tercera grfica se observa que no hubo resultados fuera de rango y que los mismos tienen valores
parecidos a los del punto de corte inicial (26mm), por lo tanto, en esta grfica los resultados son exactos
y precisos.
35
30
25
20
mm
15
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SEMANAS

Ejemplo 4: con el antimicrobiano eritromicina 15g y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923
(rango NCCLS de 22 - 30 mm). Grfica No. 4.
Grfica No. 4. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIN:

En esta grfica se observa que los resultados semanales estn alejados del punto de corte inicial (27mm)
pero ninguno de ellos est fuera del punto de corte (buena exactitud). Sin embargo, los valores obtenidos
difieren del punto de corte inicial y entre si (mala precisin).
35
30
25
20
mm
15
10
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
SEMANAS

3. TIPO DE ERROR:
La determinacin del tipo de error se aplica tanto a los resultados de la bioqumica con los cuales se llega
a la conclusin diagnstica de gnero y especie, como a los resultados de la sensibilidad antimicrobiana
en relacin a la interpretacin (sensible, intermedio, resistente).
3.1. Error menor (em):

3.1.1. En relacin al gnero y especie:
Cuando se reporta el gnero sin especie (informacin incompleta)
3.1.2. En relacin a la sensibilidad antimicrobiana:
Cuando el resultado obtenido es sensible en relacin a una cepa control o de referencia que con valor
intermedio, cuando el valor obtenido es intermedio y el de la cepa de referencia es sensible, o cuando
el valor obtenido es resistente y el de la cepa de referencia es intermedio o cuando el valor obtenido es
intermedio y el de la cepa de referencia es resistente.
3.2. Error mayor (ema):

Cuando se reporta el gnero correcto con especie incorrecta
Cuando el resultado obtenido es resistente en relacin a una cepa control o de referencia que es sensible.
3.3. Error muy mayor o grave (emm):

Cuando se reporta gnero incorrecto. En este caso, la especie no tiene ninguna trascendencia.
Cuando el resultado obtenido es sensible en relacin a una cepa control o de referencia que es resistente
III. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FIABILIDAD Y LA REPRODUCIBILIDAD

DE LOS RESULTADOS:
1. FUENTES DE ERROR:
1.1. Personal:
El rendimiento del auxiliar o tcnico de laboratorio depende directamente de la calidad de su formacin
y adiestramiento, de su experiencia personal, de sus condiciones de empleo y de la actitud que asuma
frente a los obstculos.

1.2. Factores ambientales:

Los resultados pueden verse afectados por la falta de espacio, iluminacin o ventilacin en el lugar de
trabajo, las temperaturas extremas, el ruido excesivo o la inseguridad de las condiciones de trabajo.
1.3. Muestras:
La procedencia de la muestra, el mtodo de toma de la muestra y el momento de la obtencin escapan
a menudo al control directo del laboratorio, pero ejercen una influencia directa en la capacidad de ste
para obtener resultados fiables. Otros factores que el laboratorio puede controlar y que afectan a la
calidad del trabajo son el transporte, la identificacin, el almacenamiento y la preparacin
(procesamiento) de las muestras. Por consiguiente, el laboratorio debe participar en la formacin de los
que las toman y transportan. Hay que dar al personal clnico y de enfermera instrucciones por escrito,
que se deben revisar cada cierto tiempo con ayuda de los interesados.
1.4. Materiales de laboratorio:

La calidad de los resultados puede verse afectada por la utilizacin de insumos de mala calidad o
variaciones entre los lotes. La falta de disponibilidad de los mismos incidir en diagnsticos incompletos
o incapacidad de identificacin de otros gneros bacterianos. Igual sucede con los reactivos, colorantes
y medios de cultivo.
1.5. Mtodo de prueba:

Algunos mtodos son ms sensibles y especficos que otros. Por ejemplo, el hemocultivo para aislar
neumococos en caso de neumonas bacterianas tienen una sensibilidad del 8% en relacin a la puncin
pulmonar que es mayor del 80%. Pero esto puede ocurrir en la fase previa al diagnstico: un pH de un
Mueller Hinton tomado con un pHmetro tiene una mayor exactitud que uno tomado con una cinta y por
lo tanto se pueden esperar menos errores en el primer caso.
1.6. Equipos:
La falta de equipo o el empleo de instrumentos de mala calidad o el mal cuidado dar resultados poco
fiables.
1.7. Examen y lectura:

La lectura apresurada de los resultados o el examen de un nmero insuficiente de campos microscpicos
pueden ocasionar errores. Por ejemplo, una lectura poco cuidadosa del Gram de un sedimento de LCR
puede llevar a la conclusin de ausencia de bacterias o a la conclusin de un grupo distinto al agente
causal si la tincin est mal hecha.
1.8. Notificacin:
La transcripcin poco cuidadosa de los resultados da lugar a errores que pueden hacer que un paciente
deje de recibir el tratamiento requerido o reciba uno que no es el apropiado. Los resultados de buena
calidad pero notificados fuera de tiempo son tan dainos como si el anlisis no se hubiera practicado.

2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS EQUIPOS:

2.1. Autoclave:
2.2.1. Limpiar y cambiar el agua cada mes. Utilice agua destilada.
2.2.2. Comprobar y ajustar el nivel del agua antes de cada perodo de trabajo.
2.2.3. Registrar el tiempo y la temperatura o presin en cada periodo de trabajo.
2.2.4. Registrar el funcionamiento con ampollas de esporas de Bacillus stearothermophilus una vez por
semana.
2.2. Horno para esterilizar cristalera:

2.2.1. Limpiar el interior.
2.2.2. Registrar el tiempo y la temperatura de cada periodo de trabajo.
2.3. Incubadora:
2.3.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y las parrillas cada mes.
2.3.2. Registrar la temperatura al comienzo de cada jornada de trabajo y al final la jornada (lmite,
35oC +/- 2).
2.4. Refrigerador:
2.4.1. Limpiar y descongelar cada 2 meses y despus de cualquier interrupcin del suministro elctrico.
2.4.2. Registrar la temperatura dos veces al da (2-8oC).
2.5. Microscopio:
2.5.1. Limpiar los lentes con un pao o papel especial al final de cada jornada de trabajo.
2.5.2. Limpiar y lubricar la platina mecnica cada semana.
2.5.3. Cubrirlo con la funda guardapolvo cuando no se use.
2.5.4. Comprobar cada mes la alineacin del condensador.
2.6. Bao de Mara:

2.6.1. Limpiar la superficie interna de las paredes y cambiar el agua cada mes.
2.6.2. Verificar el nivel del agua a diario y registrar la temperatura en cada jornada de trabajo.
2.7. Centrifugadora:
2.7.1. Limpiar la superficie interna de las paredes con solucin antisptica cada semana o en caso de
rotura de los tubos que contienen las muestras.
Nota: Para todos los equipos se debe dar mantenimiento cada 6 meses.

IV. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
1. ALMACENAMIENTO Y VENCIMIENTO DE LOS MEDIOS PREPARADOS:

Ver en la tabla No. 1 la referencia de almacenamiento y vencimiento, para cada medio.
TABLA No. 1
MEDIOS REFRIGERADOR 4 oc REFRIGERADOR 4 oc

SIN BOLSA PLSTICA CON BOLSA PLSTICA
Agar Sangre 15 das 50 das
Agar Chocolate 15 das 60 das
Agar MacConkey 15 das 70 das
Agar SS 6 das 10 das
2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS:
2.1. Control del pH:

Cuando el medio se prepara correctamente a partir de polvo deshidratado no es necesario comprobar
sistemticamente el pH. Si el medio se elabora con sus ingredientes bsicos, habr que dejarlo enfriar
antes de hacer esta comprobacin. En el caso de los medios slidos, la comprobacin deber hacerse
con un electrodo de superficie o tras maceracin en agua destilada. Si el pH difiere en mas de 0,2
unidades del valor especfico, ajstese con cido o lcali o preprese un nuevo lote.
2.2. Control de Esterilidad:

Comprubese sistemticamente la esterilidad de los medios a los que, despus de pasar por el autoclave,
se les agrega sangre u otros componentes. Tmese un 3-5 % de cada lote e incbese a 35 o C durante
dos dias.
Refrigrese el resto. Si se observan mas de dos colonias por placa, deschese todo el lote.
2.3. Control de crecimiento:

A cada lote preparado se le debe de hacer control utilizando cepas de referencia (ATCC).
2.4. Control de Caducidad:

Cada lote debe marcarse con la fecha de preparacin. El lmite de utilizacin vara de acuerdo con el
tipo de medio.

V. BIBLIOGRAFA:
1. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks Sus-
ceptibility Test; Approved Standard-Eighth Edition. National Comittee for Clinical Laboratory
Standards, Document M2-A8, Volumen 23 No.1, 2004. Pensylvania, USA.
2. Gabastou J.M. Sistema de Garanta de Calidad: Conceptos Generales para los Laboratorios de Salud
Pblica en la Regin Amricas. Organizacin Panamericana de la Salud (OPS), Organizacin
Mundial de la Salud (OMS), (Borrador), Washington, D.C. 2001.
3. Manual de Control de Calidad del Laboratorio Clnico. Captulos I y VII, Instituto de Salud Pblica
de Chile, Departamento Laboratorios de Salud, Ministerio de Salud, 1998, Santiago de Chile.

CAPTULO 3.
Procedimiento para la
tincin de Gram
I. ALCANCE:
Todos los laboratorios de la Red y Centro de Referencia.
II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS:

La tincin de Gram es la prueba ms simple utilizada en el laboratorio de microbiologa. Es el
procedimiento diferencial ms comnmente usado para el examen directo de gran variedad de gneros
bacterianos. Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se mantiene hasta el
momento sin modificaciones sustanciales. Divide a las bacterias en dos grupos: Microorganismos
grampositivos que retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul oscuro o
prpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser decolorados, esto es que pierden el colorante
primario. Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y aparecen de color rojo o rosa.
Este espectro de coloracin incluye a casi todas las bacterias y a otros gneros que incluyen hongos y
parsitos. Los gneros bacterianos Treponema, y Mycobacterium no se tien bien y otros como
Micoplasma, Chlamydia o Rickettsia son muy pequeos y requieren otros colorantes para poder ser
visualizados al microscopio ptico. La tincin de Gram tambin es til para la diferenciacin de clulas
epiteliales y leucocitos.
No se ha dilucidado completamente el modo de accin de esta tincin, sin embargo se cree que los
microorganismos grampositivos retienen el cristal violeta debido a la gran cantidad de cido teicico y
la disminucin de la permeabilidad de la pared celular para solventes orgnicos. Por el contrario, la pared
celular de los gramnegativos contienen mas cantidad de lpidos y por lo tanto al ser disueltos por los
solventes orgnicos (alconol-acetona o alcohol) el cristal violeta no puede ser retenido en el citoplasma,
el cual escapa por los virtuales espacios dejados por los lpidos disueltos.
La tincin de Gram de exudados puede dar al mdico informacin preliminar acerca del o los
microorganismos causales de la infeccin y servirle de base para el inicio de o los antimicrobianos
apropiados en tanto obtiene el resultado del cultivo.
Los problemas con la tincin de Gram generalmente resultan por errores de preparacin de la lmina,
frotis muy gruesos, calor excesivo cuando se fija la preparacin, inapropiada decoloracin e
inexperiencia. Un exceso de decoloracin ocasionar que las bacterias grampositivas aparezcan
gramnegativas, mientras que con insuficiente decoloracin ocurrir el fenmeno inverso.
La tincin de Gram puede hacerse a todo tipo de muestras clnicas que tengan indicacin comprobada.
Por ejemplo, no tienen ningn soporte los Gram de exudados farngeos para la comprobacin de
Captulo 3: Procedimientos para la tincin de Gram 15

faringoamigdalitis por Streptococcus pero s para un exudado de herida. Por lo dems, es til para
conocer inicialmente el posible gnero bacteriano en las UFCs de cultivos iniciales o comprobar el
crecimiento y posibles gneros bacterianos obtenidos de caldos, como el hemocultivo.
II. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPOS INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

1.1. Equipos:
1.1.1 Microscopio con objetivo de inmersin 100x y ocular de 10x.
1.2. Materiales y reactivos

1.2.1 Lminas portaobjetos
1.2.2 Mechero tipo Bunsen
1.2.3 Marcadores indelebles
1.2.4 Reloj de mesa
1.2.5 Palillos de madera
1.2.6 Bandeja de tincin
1.2.7 Cristal violeta
1.2.8 Lugol.
1.2.9 Alcohol 70 o o alcohol acetona (1:1)
1.2.10 Safranina o fucsina acuosa
1.2.11 Agua de chorro
1.2.12 Aceite de inmersin
1.2.13 Solucin salina al 0.85% estril
1.3. Cepas para control de calidad:

1.3.1 Eschericha coli ATCC 25922
1.3.2 Staphylococcus aureus ATCC 25923
III. PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACIN DEL FROTIS:

1.1. Colocar una pequea gota de solucin salina en el centro de la lmina. Si son varias muestras,
divida la lmina portaobjetos en su parte posterior en 6 y o ms cuadrantes y coloque una
pequea gota de solucin salina en cada uno de ellos, segn la cantidad de muestras que teir.
Las gotas pequeas hacen que el secado sea rpido. En caso de muestras obtenidas de caldos,
no se requiere la solucin salina.
1.2. Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla
con la gota de solucin salina. Al mismo tiempo que se hace la mezcla, se dispersa en un rea
de aproximadamente 1cm por lado. El grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura
de letras pequeas a travs del frotis.
16 Captulo 3: Procedimientos para la tincin de Gram

1.3. Ponga la lmina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente.
1.4. Rotular la lmina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lmina cercirese que
con la rotulacin le ser posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra.
1.5. Una vez que el frotis est seco, fijar la muestra pasndola rpidamente dos veces por encima de
la flama del mechero. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las
bacterias grampositivas se observaran como gramnegativas. Para saber la temperatura adecuada
coloque inmediatamente la lmina flameada sobre el dorso de una mano. En estos casos, la
temperatura se debe tolerar sin hacer ningn esfuerzo de resistencia al calor.
1.6. Dejar que el frotis se enfre.
2. TINCIN:
2.1. Cubrir el frotis ya fijado y fro con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto.
2.2. Enjuagar, dejando resbalar el agua con un chorro suave. Escurrir muy bien.
2.3. Cubrir con lugol y dejar por un minuto.
2.4. Repita el numeral 2.2
2.5. Aplicar 2 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lmina de tal manera
que se pueda observar la decolaracin. El tiempo adecuado es aquel en que las partes mas
gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo.
2.6. Inmediatamente repita el numeral 2.2
2.7. Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.
2.8. Repita el numeral 2.2
2.9. Dejar secar a temperatura ambiente.
2.10. Examinar en el microscopio con lente de inmersin, empleando aceite de inmersin.
3. RECOMENDACIONES:
3.1. Empezar a colorear el frotis cuando la lmina portaobjetos est bien fra ya que si se colorea
caliente se precipitan los colorantes.
3.2. Si la muestra que se va a colorear contiene mucha sangre, el frotis debe hemolizarse con agua
ya que esta destruye los eritrocitos y permite observar las bacterias. Proceda as:
3.2.1 Dejar secar el frotis, fijar con calor, cubrir el frotis completamente con agua por un minuto y luego
proceder con la tincin normalmente.
3.3. La decoloracin es crucial y debe ser muy breve en frotis delgados y mas prolongada en frotis
gruesos. Tambin cuando se ocupa alcohol-acetona el tiempo de decoloracin es menor que
cuando se decolora con alcohol 70 o.
3.3. El frotis puede secarse dentro de la incubadora a 35oC, flamear levemente si es urgente o secarlo
con aire expulsado de un pera de hule o un secador de manos.
Captulo 3: Procedimientos para la tincin de Gram 17

4. RESULTADOS:
Bacterias grampositivas: Se observan al microscopio de color azul oscuro o prpura.
Bacterias gramnegativas: Se observan al microscopio de color rojo o rosado.
Nota: Las clulas epiteliales y los leucocitos deben observarse completamente de color rojo. La presencia
de partes violeta indican que la preparacin del frotis estaba muy gruesa o el tiempo de
decoloracin ha sido muy corto. En todo caso, valore repetir la muestra.
5. CONTROL DE CALIDAD:
5.1. Escherichia coli ATCC 25922
Resultado: Bacilos gramnegativos: se observan de color rojo o rosado intenso.
5.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923
Resultado: Cocos grampositivos: se observan de color azul a prpura.
6. INFORME:
6.1. Mencionar primero las bacterias observadas y la agrupacin seguido de la cantidad (escasos,
regular cantidad o abundantes).
6.2. Reportar los leucocitos en la muestra, su clase y cantidad. Tambin reportar si se observan
bacterias en el citoplasma de los leucocitos.
6.3. Indicar siempre la presencia y cantidad de levaduras con o sin seudohifas, as como la presencia
de micelio de hongos.
Ejemplos:
6.3.1 Diplococos gramnegativos abundantes extra celulares e intracelulares. Polimorfonucleares regular
cantidad.
6.3.2 Cocos grampositivos en cadenas cortas, abundantes.
6.3.1 Cocobacilos pleomrficos gramnegativos escasos. Polimorfonucleares escasos.
6.3.2 Levaduras con seudohifas abundantes. Polimorfonucleares abundantes.
VI. BIBLIOGRAFA:
1. Principios del Diagnstico Microbiolgico en Medicina en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick
y Adelberg. Geo F. Brooks editor, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), captulo 47, 1999,
editorial El Manual Moderno, Mxico, Bogot.
18 Captulo 3: Procedimientos para la tincin de Gram

CAPTULO 4.
Procedimientos para la
identificacin de enterobacterias
Rutinariamente se utilizan tablas de identificacin de enterobacterias en las que todas ellas aparecen
en una sola tabla o el mismo gnero, pero con sus diferentes especies en otras. En ambos casos, la
bsqueda se hace prolongada y engorrosa. Para facilitar la rpida identificacin se han diseado 4
diagramas de flujo, tomando en consideracin la totalidad de informacin del captulo de
enterobacteriaceae del Manual of Clinical Microbiology (Farmer III J.J. Enterobacteriaceae: Introduction
and Identification en: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray Editor. 7 th. Ed., 1999, chap.
27, American Society for Microbiology, Washington, D.C. )
Para poder hacer uso de estos diagramas es necesario tener en cuenta algunas consideraciones:
1. Es necesario que al momento de hacer la lectura del plato donde ha sido sembrada la muestra, la
UFC seleccionada para ser sembrada en TSI y LIA, sea marcada. Esto se hace trazando un crculo
en la parte posterior del plato, alrededor de la UFC y agregndole un nmero o letra si de ese mismo
plato van a identificarse otras UFC. La utilidad de este procedimiento se explica en el paso No. 3.
2. Se requiere que la cepa que se estudia haya sido sembrada en TSI y LIA simultneamente. Estos
diagramas no tienen aplicacin si la cepa slo ha sido sembrada en TSI. El objetivo de LIA es
precisamente adelantar informacin acerca de si las enterobacterias poseen o no descarboxilasa o
desaminasa de la lisina.
3. La bacteria no se podr localizar en los diagramas si la cepa estudiada est contaminada con otras
bacterias o si no es una enterobacteria. Esto ltimo puede descartarse haciendo la prueba de la
oxidasa. De esta manera se puede establecer la diferencia con otros bacilos gramnegativos
anaerobios facultativos.
4. Las lecturas en TSI y LIA son vlidas si el perodo de incubacin es de 18 a 24 horas. Mayores
tiempos pueden dar lecturas falsas.
5. Los diagramas de flujo han sido numeradas del 1 al 4:
Diagrama de Flujo No. 1: Enterobacterias que desaminan la lisina.
Diagrama de Flujo No. 2: Enterobacterias que producen H2S
Diagramas de Flujo Nos. 3A/3B: Enterobacterias que fermentan la lactosa.
Diagramas de Flujo Nos. 4A/4B: Enterobacterias que no fermentan la lactosa.
Captulo 4: Procedimientos para la identificacin de enterobacterias 19

Lo primero es seleccionar el diagrama de flujo que nos servir para identificar la bacteria. Para eso siga
minuciosamente los siguientes pasos:
PASO 1:
Observe cuidadosamente los resultados de las bioqumicas tanto en TSI como en LIA. Inicialmente
observe el tubo de LIA y pregntese:
La bacteria desamin la lisina? (color rojo en la parte inclinada).
Si la respuesta es s, busque el gnero y especie en el diagrama No. 1. Si la bacteria tambin produjo
H2S y desamin la lisina, la caracterstica predominante para seleccionar el diagrama es la de haber
desaminado la lisina
Si la respuesta es no, siga el paso 2.
PASO 2:
Observe los tubos de TSI y LIA y pregntese:
Se produjo H2S? (color Negro en la parte profunda de TSI, el LIA o ambos).
Si la respuesta es s, busque el gnero y especie en el diagrama No. 2.
Si la respuesta es no, siga el paso 3.
PASO 3:
Observe el tubo de TSI y pregntese:
Ferment la lactosa? (color amarillo en la parte inclinada).
Para responder esta pregunta hay que tomar ciertas precauciones:

1. Recuerde que el medio de TSI tiene 3 azcares: lactosa, sacarosa y glucosa.
2. La glucosa se fermenta en la parte profunda.
3. La lactosa y sacarosa se fermentan en la parte inclinada. As que, el color amarillo en la parte
inclinada puede ser por fermentacin de la lactosa o de la sacarosa. Cmo establecer la
diferencia?
Revise el plato donde sembr la muestra (McConkey, SS agar). Observe atentamente la UFC que
marc y sembr en TSI y LIA. Si la UFC es fermentadora de lactosa (rosado en McConkey y SS
agar, oscura pero diferentes tonos en EMB, amarilla en Tergitol 7), el color amarillo del TSI en la
parte inclinada se debe a la fermentacin de la lactosa. Si la bacteria es no fermentadora
(lactosa negativa), y el TSI vir amarillo en la parte inclinada, la reaccin es por fermentacin de
la sacarosa, lo cual es una valiosa informacin en el caso de algunas enterobacterias.
Como puede notarse, algunas enterobacterias estn clasificadas tanto en el diagrama 3 como en
el 4, ya que los porcentajes de fermentacin de la lactosa varan entre el 45 al 80%.
20 Captulo 4: Procedimientos para la identificacin de enterobacterias

Si la respuesta es s, busque el gnero y la especie en los diagramas Nos. 3A o 3B segn las

variaciones de las reacciones en TSI y LIA.
Si la respuesta es no, se asume que la enterobacteria es no fermentadora de la lactosa y en ese
caso deben utilizarse los diagramas Nos. 4A y B.
NOTAS:
Se sabe que hasta un 6% de las E. coli producen H2S en pocas cantidades. En ese caso, pueden
confundirse con una Salmonella. Si usted tiene una bacteria cuyo crecimiento en TSI es A/AG+ y en
LIA K/Kg+ y no pudo identificarla en la tabla 2, considere que puede tener ms de una bacteria en sus
tubos de TSI y LIA. En ese caso reaisle con un inculo tomado del plato original.
Algunas bacterias fermentan lentamente la lactosa o la sacarosa y la parte inclinada se observa amarilla
en la porcin inferior y roja en la porcin superior (por ejemplo: Klebsiella spp). En este caso, la bacteria
se toma como fermentadora de lactosa o de sacarosa, segn el caso. Debe insistirse que el tiempo de
incubacin no debe exceder las 24 horas, pues con mayor tiempo las bacterias que fermentaron la
lactosa van muriendo y este proceso se acompaa de alcalinizacin (viraje a color rojo de la parte
inclinada).
Una vez seleccionada el diagrama, note que en la parte inferior se anotan las posibles reacciones que
se pueden obtener en el TSI y LIA. Si en el diagrama seleccionado no aparecen las reacciones que Ud.
obtuvo, considere la posibilidad de contaminacin. En tal caso reaisle una UFC del plato original. Si las
reacciones son similares a la primera vez, enve la cepa al CNDR.
En la parte superior de la primera hoja de cada diagrama se indica toda la bioqumica que
simultneamente debe hacerse para esa cepa. Es vital que se realicen todas las bioqumicas que ah estn
escritas, pues la falta de una de ellas puede ser que no le permita discriminar entre los diferentes gneros
o especies.
Una vez realizada la bioqumica, proceda a leer los resultados segn el esquema que se presenta en cada
diagrama de flujo. Esto significa que para cada diagrama, la bioqumica clave o llave de entrada de
identificacin vara:
Diagrama de flujo No. 1: La bioqumica llave es la produccin de H2S en TSI o LIA.
Diagrama de flujo No. 2: La bioqumica llave es la descarboxilacin (+ o -) de lisina en LIA.
Diagrama de flujo No. 3A: La bioqumica llave es la descarboxilacin de lisina en LIA.
Diagrama de flujo No. 3B: La bioqumica llave es la no descarboxilacin de lisina en LIA.
Diagrama de flujo No. 4A: La bioqumica llave es la descarboxilacin de lisina en LIA.
Diagrama de flujo No. 4B: La bioqumica llave es la no descarboxilacin de lisina en LIA
A partir de ah, los gneros y especies se van agrupando en dependencia de bioqumicas especficas que
siguen un riguroso orden. No siempre es necesario leer todas las reacciones bioqumicas para llegar a
una conclusin de gnero y especie. Sin embargo, s es necesario realizarlas todas, ya que de antemano
no sabr si se requerir de todas ellas para tener una conclusin diagnstica.
Captulo 4: Procedimientos para la identificacin de enterobacterias 21

22
Bioqumica que debe realizarse para la identificacin de bacterias
que Desaminan la Lisina (Lisinadesaminasas)
(Diagrama de Flujo No. 1)
MANUAL
DE
1. Mio
2. Urea
3. Adonitol
4. Citrato
PROCEDIMIENTOS
DE
5. Trealosa
Reacciones esperadas en TSI/LIA
TSI LIA
1. K/A+ R/A 3. K/Ag+ R/Ag+
Captulo 4: Procedimientos para la identificacin de enterobacterias

2. K/A+ R/A+ 4. K/A R/A
NOTA:1. La produccin de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).
2. La produccin de H2S puede ser escasa ( + ) o abundante ( = ).
BACTERIOLOGA MDICA EDICIN 2004
DIAGRAMA DE FLUJO No. 1
LISINA DESAMINASAS
H2S
+ M. morganii
M. morganii P. penneri
P. vulgaris P. stuartii
P. mirabilis P. rettgeri
P. penneri P. alcalifaciens
P. rustigianii
Ornitina
+ Urea
+
P. vulgaris
M. morganii
P. penneri M. morganii P. alcalifaciens
P. mirabilis
P. penneri P. rustigianii
P. stuartii P. stuartii
P. rettgeri
Indol Indol
t
+ + Adonitol
Ornitina Ornitina
Indol +
Indol +
P. vulgaris Ornitina +
Indol P. alcalifaciens P. rustigianii
P. stuartii
P. stuartii
P. penneri P. rettgeri P. penneri
P. mirabilis
M. morganii
M. morganii
Trealosa
P. rettgeri
+
+
P. stuartii
Adonitol

P. stuartii P. rustigianii
24
productoras de Sulfuro de Hidrgeno
(Diagrama de Flujo No. 2)
MANUAL
1. Mio
DE
2. Citrato
3. Malonato
4. Trealosa
5. Ramnosa
PROCEDIMIENTOS
DE
6. Rojo de Metilo
TSI LIA
1.K/A+g K/A 3. A/A +g K/A+g

2.K/A+g K/A+ 4. K/A +g K/K+g
NOTA:1. La produccin de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).
2. La produccin de H2S puede ser escasa (+) o abundante ( = ).
DIAGRAMA DE FLUJO No. 2
PRODUCTORAS DE H 2S
Lisina
+
C. freundii
E. tarda
C. diversus
S. Choleraesuis
C. amalonaticus
S. Typhi
S. Parathyphi A
Salmonella spp
L. grimontii
L. richardii
B. aquatica
Ornitina + Ornitina + Ornitina

Indol + Indol Indol Citrato
Movilidad +
+ Movilidad +
Indol
Indol +
Ornitina +
E. tarda S. Choleraesuis S. Typhi

L. grimontii L. richardii C. freundii C. diversus
Salmonella spp B. aquatica S. Paratyphi A C. amalonaticus
Lactosa -
Trealosa Ramnosa +
Rojo de Metilo
+ Ornitina + Ornitina + Malonato
+ Ornitina
Citrato + Citrato +
Salmonella spp S. Choleraesuis

B. aquatica L. richardii C. freundii S. Paratyphi A C. freundii C. diversus C. amalonaticus
26
Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)
MANUAL
(Diagrama de Flujo No. 3 A)

DE
1. Mio
2. Urea
3. Citrato
PROCEDIMIENTOS
4. Malonato
DE
5. Vogues Proskauer
6. Dulcitol
7. Salicina
8. Sacarosa

TSI LIA
1. A/Ag K/Kg
2. A/A K/K
NOTA: 1. La produccin de gas es variable y la cantidad puede ser escasa (g) o abundante (G).
DIAGRAMA DE FLUJO No. 3 A
LACTOSA POSITIVAS
Lisina +
Indol
Ornitina + Indol
Indol + Indol + Ornitina
Ornitina Ornitina +
E. aerogenes E. coli E. coli K. pneumoniae

E. gergoviae K. oxitoca K. ascorbata S. rubidea
S. odorifera S. odorifera bio 2 K. kryocrescens S. odorfera 2
S. fonticola S. odorifera bio 1
Citrato Urea
Urea
Urea + +
+
+ -
E. aerogenes K. ascorbata E. coli K. pneumoniae S. rubidea

E. gergoviae
S. odorifera 1 E. coli K. cryocrescens K. cryocrescens S. odorifera 2
S. fonticola K. oxytoca
S. fonticola S. odorifera 2 S. odorifera 1
Malonato Sacarosa
VP VP Malonato + +
VP
+ + +
+
S. odorifera
E. coli
K. cryocrescens K. cryocrescens
E. gergoviiae S. fonticola E. aerogenes S. odorifera 1 S. odorfera 2 S. rubidea
S. odorifera 1 S. fonticola
K. ascorbata S. odorifera 1
K. cryocrescens K. cryocrescens
-
E. coli E. coli
Gas de glucosa Dulcitol
+
Salicina
+ + Gas de Glucosa
Kluyvera spp +
E. coli Enviar al
E. aerogenes S. odorifera 1 S. fonticola S. odorifera 1 K. cryocrescens S. odorfera 1 K. cryocrescens CNDR
28
Fermentadoras de Lactosa (Lactosa Positiva)
(Diagrama de Flujo No. 3 B)
MANUAL
DE
1. Mio
2. Citrato
3. Malonato
4. Vogues Proskauer
PROCEDIMIENTOS
5. Arginina
DE
6. Sorbitol
7. Adonitol
8. Sacarosa
9. Arabinosa
10. Ramnosa

11. Determinacin de pigmento amarillo en Mueller Hinton o Agar Nutritivo
TSI LIA
1. A/Ag K/Ag
DIAGRAMA DE FLUJO No 3 B
Lisina LACTOSA POSITIVAS
Indol Indol + Indol + Indol

Ornitina + Ornitina Ornitina +
Ornitina
E. cloacae P. agglomerans
E. sakasakii
E. sakasakii L. adecarboxilata
E. hermanii P. agglomerans
K. cryocrescens E. americana
C. lapagei
S. rubidea
S. plymutica
Arginina
Sorbitol Adonitol
+ VP
+
+
Sacarosa
+
E. cloacae E. sakasakii E. sakasakii E. hermanii
L. adecarboxilata P. agglomerans
K. cryocrescens
S. rubidea
P. agglomerans
S. plymutica
E. americana
P. agglomerans
C. lapagei
Citrato
+
Malonato
Arabinosa
K. cryocrescens E. hermanii +
+
K. criocrescens
P. agglomerans P. agglomerans E. americana

P. agglomerans
S. rubidea S. plymutica C. lapagei
Pigmento
Amarillo*
+ Pigmento Amarillo *
Ramnosa Malonato
+
+ +
E. hermanii
P. agglomerans C. lapagei
*24 horas en MH, AN o BHI P. agglomerans
(85%)
K. cryocrescens
S. rubidea S. plymutica E. americana
30
MANUAL
No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)

DE
(Diagrama de Flujo No. 4 A)
1. Arabinosa
2. Indol (MIO)
3. Ornitina (MIO)
PROCEDIMIENTOS
DE
4. Sacarosa
5. Citrato
TSI LIA
1. K/Ag K/Kg

2. K/Ag K/K
3. A/Ag K/Kg
Lisina + DIAGRAMA DE FLUJO No 4 A
LACTOSA NEGATIVAS
S. marcescens
S. liquefaciens
S. odorifera bio 1
H. alvei
E. fergusonii
E. vulneris
Arabinosa
+
S. marcescens S. liquefaciens
H. alvei
E. fergusonii
E. vulneris
S. odorifera bio 1
Indol
+
E. fergusonii S. liquefaciens
S. odorifera bio 1 H. alvei
E. vulneris
S. odorifera bio 1
Sacarosa
Citrato
+ Ornitina
+
S. odorifera E. fergusonii S. liquefaciens E. vulneris

S. odorfera bio 1
H. alvei
S. odorifera bio 1

Sacarosa
H. alvei + S. liquefaciens
S. odorfera bio 1
Citrato
+
S. liquefaciens
32
No fermentadoras de Lactosa (Lactosa Negativa)
MANUAL
(Diagrama de Flujo No. 4 B)

DE
1. Arabinosa
2. Indol (Mio)
3. Sacarosa
4. Citrato
PROCEDIMIENTOS
DE
5. Urea
6. Ramnosa
7. Sorbitol
TSI LIA

1. K/Ag K/Ag
2. K/A K/A
3. A/Ag K/Ag
DIAGRAMA DE FLUJO No 4 B
Lisina LACTOSA NEGATIVAS
S. plymutica
Shigella spp
Y. enterocolitica
T. ptyseos
C. davisae
C. neteri
C. lapagei
E. hermannii
E. vulneris
K. rhinoscleromatis
Movilidad
Indol Urea
Ornitina Urea Citrato
Urea Citrato +
Citrato
E. vulneris
S. plymutica E. hermannii
S. plymutica C. davisae Y. enterocolitica
T ptyseos C. neteri Shigella spp
K. rhinoscleromatis C. lapagei S. plymutica
Arabinosa
+ Ornitina
+ Movilidad
+
S. plymutica T. ptyseos C. davisae C. lapagei E. hermannii

K. rhinoscleromatis C. neteri E. vulneris Y. enterocolitica Shigella spp Serologa
S. plymutica S. plymutica
Ramnosa Sacarosa
Ornitina Ornitina
+ Sorbitol
+ +
+
K. rhinoscleromatis S. plymutica E. hermanii E. vulneris

S. plymutica Y. enterocolitica S. plymuthica
C. neteri C. lapagei
+ Sacarosa
Ramnosa +
S. plymutica E. vulneris
CAPTULO 5.
Procedimiento para el aislamiento de
enterobacterias y otras bacterias menos
frecuentes en el urocultivo
I. TOMA DE LA MUESTRA:
Para un cultivo de orina apropiado es esencial la recoleccin apropiada de la muestra. Las
recomendaciones que deben cumplirse son las siguientes:
El paciente no debe estar tomando, ni haber tomado antimicrobianos tres das antes de recolectar la
muestra para el cultivo.
Recolectar la primera orina de la maana, como se describe a continuacin:
1. Lavar los genitales externos con abundante agua y jabn (no secarse).
2. La muestra de orina se toma a medio chorro: Indicar al paciente que orine aproximadamente
la mitad de lo que calcule tener en su vejiga.
3. Parar la miccin.
4. Orinar entre 50-100 mL en un frasco estril, teniendo cuidado de que los genitales no toquen
el borde del mismo.
5. Cerrar el frasco hermticamente.
6. Las muestras deben refrigerarse de 4 o a 8 oC hasta el momento de realizar el cultivo. No deben
procesarse muestras que no se refrigeraron y tienen media hora o ms a temperatura ambiente.
Si esto ltimo sucede, la muestra debe repetirse.
7. Si es un recin nacido, adems de las instrucciones anteriores, la muestra se recoger en bolsa
estril colectora de orina. Estas bolsas son exclusivas para tomas de muestras de orinas y se
adquieren en las farmacias.
II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA:
1. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN

PACIENTE NO HOSPITALIZADO:
Cuando el tiempo entre la toma de la muestra y el transporte al laboratorio se calcula que durar ms
de media hora, la muestra debe ser transportada en refrigeracin. Para ello, el frasco con la muestra debe
ser colocada en un contenedor plstico con tapadera y luego llenado hasta la mitad con hielo picado
o con refrigerantes si fuera posible.
Captulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias 35

2. TRANSPORTE AL LABORATORIO CUANDO LA MUESTRA PROVIENE DE UN

PACIENTE HOSPITALIZADO:
En estos casos las muestras deben ser transportadas sin refrigeracin.
II. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA:

Una vez que la muestra llega al laboratorio debe ser guardada inmediatamente en refrigeracin hasta el
momento de la siembra. Ninguna muestra debe quedar a temperatura ambiente. Recuerde que en el caso
de las enterobacterias, se reproducen logartmicamente aproximadamente cada 20 minutos, lo cual
alterar el conteo de UFCs.
1. MEDIOS DE CULTIVO REQUERIDOS:

1.1. Agar Sangre de Carnero
1.2. Agar Mac Conkey
III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:

1. TOMA DE LA MUESTRA:
1.1. Equipo: Ninguno
2. MATERIALES Y REACTIVOS:
2.1. Frasco estril, boca ancha, con tapa de rosca.
2.2. Bolsas recolectoras estriles, en casos de que la muestra sea de un infante.
3. MEDIOS DE CULTIVO:
Ninguno.
4. TRANSPORTE:
4.1. Equipo: Ninguno.
4.2. Materiales y reactivos:
4.2.1 Contenedor plstico con tapa y hielo picado o refrigerantes.
4.3. Medios de cultivo: Ninguno.
5. PROCESAMIENTO:
5.2. Materiales y reactivos: Ninguno.
5.1. Medios de cultivo:
5.3.1 Agar Sangre de Carnero
5.3.2 Agar Mac Conkey
36 Captulo 5: Procedimiento para el aislamiento de enterobacterias y otras bacterias

V. ALCANCE
Depende del nivel de complejidad de la bacteria aislada. Para determinar el alcance en relacin de la
identificacin debe revisarse el captulo correspondiente.
VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS:

La orina excretada en el rin es estril, salvo que dicho rgano est infectado. La orina sin contaminar
de la vejiga tambin es normalmente estril, sin embargo, en la uretra existe una microbiota normal, de
modo que la orina expulsada en forma normal contiene una pequea cantidad de bacterias. Debido a
esto es necesario distinguir los microorganismos contaminantes de los de importancia etiolgica. Slo
el examen cuantitativo de la orina puede producir resultados significativos en cuanto a esta diferencia.
El urocultivo se realiza para demostrar la presencia de un nmero significativo de bacterias, que
usualmente se limitan a unos pocos microorganismos de crecimiento rpido. Las principales bacterias que
afectan el sistema urinario son las enterobacterias y dentro de ellas Escherichia coli es la ms frecuente.
En mujeres no embarazadas las ms frecuentes son E. coli y Staphylococcus saprophyticus. Sin tomar
en cuenta la edad, sexo ni patologas primarias, se pueden aislar otras enterobacterias y gramnegativos,
as como otros grampositivos, sobre todo en instituciones donde las infecciones urinarias asociadas a
catter constituyen la primera causa de infecciones intrahospitalarias.
El examen microscpico de la orina es una prctica previa al cultivo que puede revelar importante
informacin a la hora de hacer una interpretacin o tomar la decisin de concluir el diagnstico, sin
embargo no se describe en el presente manual debido a que en los laboratorios de bacteriologa del pas,
este anlisis le corresponde al laboratorio clnico.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:
1.1. Equipo:
1.1.1 Microscopio
1.1.2 Mechero de Bunsen
1.1.3 Incubadora
1.1.4 Refrigeradora

1.2.1 Asas bacteriolgicas redondas y rectas
1.2.2 Asas redondas calibradas (0.001 mL)
1.2.3 Guantes descartables
1.2.4 Lminas portaobjeto
1.2.5 Lminas cubreobjeto
1.2.6 Colorantes para tincin de Gram
1.2.6 Reactivo de Kovac Erlich
1.2.7 Reactivo de alfanaftol

1.2.8 Reactivo de KOH al 40%

1.2.9 Reactivo de cloruro frrico
1.2.10 Reactivo de cido clorhdrico 0.1 N
1.3. Medios de cultivo: Ver procesamiento.

1.4. Pruebas para la identificacin: Ver apartado correspondiente segn la bacteria aislada.
2. PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA:

2.1. Agitar manualmente el frasco de orina por unos segundos, hasta obtener una solucin
homognea.
2.2. Con el asa de platino calibrada de 0.001 ml , inocular la muestra en los medios de Agar Sangre
de Carnero y Agar MacConkey, depositando el inculo en el centro del plato, extendindolo
hacia arriba y hacia abajo, sin esterilizar el asa. Luego estriar en tres direcciones: vertical,
horizontal y transversalmente en toda la superficie del plato.
2.3. Incubar los medios de cultivo por 24 hrs. de 35-37 0C.
3. LECTURA DE LOS PLATOS:

Deben tomarse en cuenta varios parmetros. En los siguientes casos debe tomarse el urocultivo como
positivo y debe hacerse la identificacin del o los microorganismos y su respectivo antibiograma.
3.1. Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL
(unidades formadoras de colonias por mililitro de orina).
3.2. Una muestra se manda a repetir:
3.2.1 Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con ms de
una bacteria.
3.2.2 En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC X mL con una o ms bacterias.
4. PROCEDIMIENTO PARA CALCULAR EL TOTAL DE UNIDADES FORMADORAS DE

COLONIAS QUE SE VAN A REPORTAR AL MDICO:
4.1. Realizar la lectura, contando el total de UFCs y multiplicarlas por el factor de dilucin
correspondiente con el asa utilizada (las asas de platino utilizadas estn calibradas para tomar
un volumen de 0.001 mL, o sea la milsima parte de 1 mL, por lo tanto el factor de dilucin es
1000). Este dato es muy importante y debe ser reportado en el resultado final que se enva al
mdico.
A continuacin algunos ejemplos, utilizando asa de 0.001 mL.
4.1.1 Ejemplo 1.
Si usted cuenta 50 Unidades Formadoras de Colonia (UFCs), multiplique 50 x 1,000 y esto da
como resultado 50,000 UFC por mililitro de orina (mL).

4.1.2 Ejemplo 2.
Si usted cuenta 75 UFC, multiplique 75 x 1,000 y esto da como resultado 75,000 UFC x mL de
orina.
4.1.3 Ejemplo 3.
Si el crecimiento es excesivo y no se puede contar, considere que hay ms de 100 UFCs y reporte
el recuento como mayor de 100,000 UFC x mL de orina.
5. SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:
5.1. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ver captulo 16.
5.2. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de concentracin Mnima Inhibitoria

(en caso de Streptococcus viridans):
5.2.1 Penicilina.
6. REPORTE:
6.1. Negativo: No hubo crecimiento bacteriano.
6.2. Positivo:
6.2.1 Todo cultivo puro (un solo tipo de bacteria) con recuento mayor de 20,000 UFC x mL debe
reportarse el gnero y especie, con su respectivo antibiograma. Por ejemplo:
6.2.1.1. Escherichia coli, 30 mil UFC x mL de orina.
6.2.2 Cultivos con 2 o ms bacterias en las que el recuento total sobrepasa los 100,000 UFC, pero
individualmente cada una tiene un recuento mayor de 20,000 UFC.
6.2.2.1. Escherichia coli >100,000 UFC x mL de orina.
6.2.2.2. Enterobacter cloacae 40 mil UFC x mL de orina
6.3. Repetir muestra:

6.3.1. Todo cultivo en el que el recuento sea mayor de 20,000 UFC x mL con ms de una bacteria con
gnero o especie diferentes. Si en el segundo cultivo se aslan las mismas bacterias y en
cantidades similares al primer cultivo, se reportan los gneros y especies aisladas con sus
respectivos recuentos y antibiogramas.
6.3.2. En caso que el recuento sea menor de 20,000 UFC x mL. El hecho de que haya menos de 20,000
UFC x mL (en especial de varios tipos de bacterias) como sucede a menudo, sugiere que los
microorganismos provienen de la microbiota normal o son contaminantes. Si en el segundo cultivo
se asla la misma bacteria y en cantidad similar al primer cultivo, se reporta el gnero y especie
aislado con su respectivo antibiograma.

FLUJOGRAMA PARA REALIZAR UN UROCULTIVO
MUESTRA
SIEMBRA
AGAR SANGRE AGAR

DE CARNERO Mac Conkey
Grampositivos:
COLONIAS LACTOSA
S. saprophyticcus, aureus,
(+) (-)
Streptococcus beta hemolticos
PRUEBAS PRESUNTIVAS TSI Y LIA

Dependiendo de los resultados Dependiendo de las reacciones
PRUEBAS CONFIRMATIVAS BIOQUMICA COMPLEMENTARIA
ANTIBIOGRAMA ANTIBIOGRAMA
Nota: Para realizar la identificacin de grampositivos y gramnegativos, consultar en este manual los
captulos correspondientes a cada microorganismo aislado.

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Lpez SR, Reyes C J, Gonzlez MA, Centeno R.: Normas Tcnicas para el Urocultivo en Normas
Tcnicas de Bacteriologa, captulo V, 3 ed. 1996, DANIDA/MINSA, Editorial Imprimatur,
Managua, Nicaragua.
2. Trrez MF. Urocultivo en Manual Prctico de Bacteriologa Mdica, Cap. 3, 1 ed., 1996, Editorial
Serviprensa, C.A., Guatemala.
3. Introduccin a la Microbiologa en Diagnstico Microbiolgico. Texto Atlas a color, Elmer W.
Koneman editor, Cap. 3, 5 ed. 1999, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
4. Principios del diagnstico microbiolgico en medicina en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick
y Adelberg Geo. F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno, 16 edicin, (traduccin
de la 21 edicin en ingls). Mxico D.F. 1998.
5. Principios del diagnstico microbiolgico en medina en: Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y
Adelberg. Geo F. Brooks editor, Cap. 47, Editorial El Manual Moderno 16 edicin (traduccin de la
21 edicin en ingls). Mxico, D.F. 1998.

CAPTULO 6.
Procedimientos para bacterias aisladas
comnmente en exudados de heridas
1. RECOMENDACIONES A LOS PACIENTES:

No haber recibido tratamiento local o sistmico con antimicrobianos 3 das antes de la toma de muestra.
2. TIPO DE MUESTRA:
Exudados o pus obtenidos de heridas infectadas, furnculos y abscesos de tejidos u rganos.
3. OBTENCIN DE LA MUESTRA:
3.1. Retirar la costra o pstulas en la piel con un bistur y pinzas estriles, previa limpieza con agua
destilada o solucin salina estril, para remover sta con mayor facilidad.
3.2. En heridas, primero se debe realizar una limpieza en la superficie con el propsito de remover la
suciedad o tejido muerto.
3.3. Si en el interior de la herida hay pus, debe removerse haciendo uso de hisopos o torundas de
gasa estriles. El pus no es un material apropiado para el cultivo por contener clulas vegetativas
bacterianas muertas o predominantemente semidestruidas.
3.4. Una vez removido el pus, la muestra debe tomarse con un hisopo estril, frotando vigorosa pero
gentilmente las paredes de la herida, o cavidad.
3.5. Abscesos cerrados superficiales: en estos casos el mdico debe drenar el absceso y eliminar el
pus. La muestra para cultivo de bacterias se toma de las paredes de la cavidad, como se describe
en el numeral 3.3.
3.6. Abscesos cerrados profundos, rganos o tejidos internos, ojos (humor acuoso o vtreo), odo
medio y otros: La muestra debe ser tomada exclusivamente por el mdico. Si no es posible tome
la muestra como en el numeral 3.3, el pus debe aspirarse por medio de una jeringa estril de 3
o 5 mL. La cantidad de la muestra depende de la naturaleza de la lesin, pero no es necesario
tomar ms de 1mL.
Captulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comnmente en exudados de heridas 43


1. Para los numerales 3.4 y 3.5 los hisopos deben introducirse en el medio de transporte de Stuart,
teniendo cuidado que el hisopo quede completamente introducido en el medio.
2. En el tubo o jeringa con la muestra deben anotarse el cdigo de la muestra, fecha y hora en que
fue tomada.
3. Todas las muestras deben acompaarse con una hoja que contenga como mnimo la siguiente
informacin:
3.1. Institucin
3.2. Sala
3.3. Nmero de expediente
3.4. Nombre del paciente
3.5. Edad
3.6. Sexo
3.7. Resumen de historia clnica. Si existe un Comit de Infecciones Intrahospitalarias (CIIH) que
requiera informacin adicional sobre los casos de infeccin, debe elaborarse una hoja con los
datos que el CIIH determine.
4. Transportar la muestra contenida en el medio de transporte a temperatura ambiente.
5. Si la muestra obtenida est contenida en una jeringa (numeral 3.6), debe transportarse con
refrigerante. Esto tiene el propsito que las enzimas lticas y autolticas contenidas en el pus dis-
minuyan su accin destructiva contra las bacterias.
III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

1. Rotular un plato de Agar Sangre de Carnero (ASC) y otro con Agar Mac Conkey (MacC).
2. Con unas pinzas previamente flameadas en el mechero, extraiga el hisopo del medio de transporte.
3. Haga un inculo en una de las orillas del medio de ASC y luego en MacC. El inculo debe ser
hecho friccionando el hisopo en forma circular sobre un rea de aproximadamente 1 cm de
dimetro. Con el mismo hisopo haga un frotis para tincin de Gram.
4. Si la muestra fue transportada en una jeringa, deposite una gota sobre una de las orillas de los
medios de ASC y MacC. Haga un frotis para tincin de Gram.
5. Dejar los inculos durante un tiempo aproximado de 5 minutos para que el agar absorba el
exceso de lquido y luego estre en la forma convencional.
6. Incubar de 35 a 37 oC durante 18 a 24 horas. El ASC se incuba en atmsfera de CO 2 (mtodo
de la jarra si no tiene incubadora con CO 2).
44 Captulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comnmente en exudados de heridas

IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS:
1. TOMA DE MUESTRA:
1.1. Jeringa estril 3-5 mL
1.2. Bistur estril
1.3. Agua destilada estril
1.4. Solucin salina estril
1.5. Hisopo de algodn estril
1.6. Solucin antisptica
2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA
2.1. Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart.
2.2. Jeringas estriles descartables de 3 5mL.
3. PROCESAMIENTO:
3.1. Equipos:
3.1.1. Incubadora a 35-37oC
3.1.2. Incubadora con CO 2 a 35-37 oC
3.1.3. Refrigeradora a 6-8oC
3.1.4. Jarra con vela de parafina blanca (si no tiene incubadora con CO 2)
3.1.6. Mechero Bunsen
3.1.7. Reloj de mesa
3.1.8. Microscopio con objetivo de 40X y 100X.
3.2. Materiales:
3.2.1. Marcadores indelebles
3.2.2. Asas bacteriolgicas rectas y redondas
3.2.4. Guantes descartables
3.2.5. Gradilla
3.2.6. Contenedores con cloro al 0.5% para desechar material contaminante
3.3. Reactivos: Colorantes y reactivos para la tincin de Gram.
3.4. Medios de Cultivo:

3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC)
3.4.2. Agar MacConkey (MacC)

6.1 Procedimientos para la identificacin
de Pseudomonas aeruginosa
I. TOMA DE LA MUESTRA: ver captulo 6.
II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: ver captulo 6.
III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: ver captulo 6.
IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: ver captulo 6.
CARACTERSTICAS GENERALES DE LOS BACILOS GRAMNEGATIVOS NO

FERMENTADORES
Los bacilos gram negativos no fermentadores son un grupo de bacterias aerobias no esporuladas que
o bien no utilizan hidratos de carbono como fuente de energa o los degradan a travs de vas
metablicas diferentes de la fermentacin.
Estas vas de degradacin de la glucosa son tres:
1. Va de Embden- Meyerhof -Parnas (EMP)
2. Va de Entner- Doudoroff (ED)
3. Va de la hexosa monofosfato de Warburg Dickens (HMP)
La va de EMP o va glucoltica o anaerobia, la utilizan las bacterias anaerobias y hasta cierto punto
tambin las anaerobias facultativas. Muchas bacterias incluidas todas las bacterias de la familia
Enterobacteriaceae fermentan la glucosa a travs de la va EMP para formar cido pirvico, producto
intermediario de la fermentacin de carbohidratos.
Los gneros de bacilos gramnegativos no fermentadores que se describen en este capitulo utilizan las vas
de ED y HMP.
La va de ED es denominada va aerobia debido a que necesita oxigeno para que haya gluclisis es decir,
degradacin de la glucosa.
Los bacilos gramnegativos fermentadores oxidativos utilizan vas alternativas a la va de EMP a travs
de las cuales la glucosa es oxidada. El termino oxidacin significa la forma en que el cido pirvico
transfiere sus iones hidrgeno. Al carecer de las enzimas deshidrogenasa necesarias para oxidar el cido
pirvico a cido lctico y otros cidos mixtos, las bacterias oxidativas transfieren los iones hidrgeno
del cido pirvico al ciclo de Krebs, donde se une al oxgeno para formar agua. Debido que el producto
final es agua, las bacterias oxidativas no forman gas a partir de carbohidratos. Los medios bioqumicos
usados para las bacterias fermentativas no pueden ser aplicados a las bacterias oxidativas, ya que

producen cidos dbiles insuficientes para hacer virar el indicador de pH y debido a esto, Hugh y Leifson
fueron los primeros en disear un medio OF (oxidativo-fermentativo) que se adapta a las propiedades de
los bacilos gramnegativos no fermentadores. (ver tabla 1).
TABLA No. 1: METABOLISMO DE LA GLUCOSA EN EL MEDIO DE OF
METABOLISMO TIPO DE
DE LA GLUCOSA OXIDASA REACCIN FAMILIA / GNERO / ESPECIE
FERMENTATIVA
Negativa I Enterobacteriaceae
Chromobacterium violaceum
Aeromonas (hydrophila,salmonicida)
Plesiomonas shigelloides
Vibrio cholerae
Positiva II Actinobacillus (lignieresi, suis)
Chromobacterium violaceum
Pasteurella (aerogenes, haemolytica, pneumotropica)
Kingella kingae
OXIDATIVA Acinetobacter baumannii
Acinetobacter haemolyticus
Negativa III Stenotrophomonas maltophila
Pseudomonas (luteola, oryzihabitans)
Pseudomonas (aeruginosa,fluorescens, putida)
Pseudomonas (stutzeri, mendocina)
Positiva IV Burkholderia (pseudomallei, cepacia)

Achromobacter xylosoxidans
Chryseobacterium gleum
Empedobacter brevis
INACTIVA Acinetobacter lwoffii
Negativa V Acinetobacter junnii
Acinetobacter johnsonii
Alcaligenes faecalis
Pseudomonas (alcaligenes, pseudoalcaligenes)
Comamonas (acidovorans, testosteroni)
Positiva VI Bordetella bronchiseptica

Myroides odoratus
Moraxella (osloensis, atlantae)
Oligella urethralis
Psychrobacter phenylpyruvicus

La va de HMP de Warburg Dickens es en realidad un hbrido o mezcla de las vas EMP y ED.
Las bacterias no sacarolticas como algunos gneros de bacilos no fermentadores que no utilizan hidratos
de carbono, son inertes en el medio OF, el cual conserva su pH alcalino despus de la incubacin.
Las bacterias anaerobias facultativas pueden utilizar las dos vas EMP y ED indistintamente dependiendo
de las condiciones ambientales en que se desarrollen.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.8 y del 1.4.10 al 1.4.16 con respecto a pruebas
de identificacin.
CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificacin.

El gnero Pseudomonas est constituido por bacilos gram negativos aerobios que no forman esporas y
son rectos o ligeramente curvos, miden de 1.5 a 5 m de largo y 0.5 a 1.0 m de ancho.
Las Pseudomonas spp son mviles debido a la presencia de uno o ms flagelos polares. Los aislamientos
obtenidos de muestras clnicas son oxidasa y catalasa positiva y crecen en Agar MacConkey como
UFCs no fermentadoras de lactosa. La mayora de las especies degradan la glucosa oxidativamente y
reducen nitratos a gas nitrgeno.
Las colonias son usualmente extendidas y planas, tienen bordes irregulares y un brillo metlico
caracterstico, el cual es frecuentemente asociado con la autlisis de las colonias.
Existen otras variantes de colonias incluyendo formas lisas, gelatinosas y mucoides.
Pseudomonas aeruginosa produce varios pigmentos solubles en agua, como el pigmento verde ama-
rillento fluorescente llamado pioverdina (tambin producida por P. fluorescens y P. putida). Cuando la
pioverdina se combina con un pigmento azul hidrosoluble, pigmento fenazina, se produce piocianina, un
color azul turqueza-verde brillante caracterstico de P. aeruginosa. Unas pocas cepas de Pseudomonas
aeruginosa pueden producir pigmentos de otros colores como piorubrina (rojo) o piomelanina ( marrn
a negro).
Pseudomonas aeruginosa puede ser identificada sobre la base de la prueba de oxidasa, TSI, crecimiento
a 42oC y produccin de pigmentos ya sea fluorescente, azul verde, rojo o caf en Agar Mueller Hinton.
Algunas cepas de Pseudomonas aeruginosa producen solo pioverdina (verde amarillo fluorescente)
caracterstica que comparte con P. fluorescens y P. putida pero la habilidad de P. aeruginosa de crecer
a 42oC la distingue de las otras dos especies.
P. fluorescens puede ser diferenciada de P. putida basndose en su habilidad de degradar la gelatina.
(ver tabla No. 2).

TABLA 2. BIOQUMICA DIFERENCIAL DEL GRUPO FLUORESCENTE
Pseudomonas Pseudomonas Pseudomonas

aeruginosa fluorescens putida
AP (pyocianina) +
AF (pyoverdina) + (65)* + (96) + (93)
Reduccin de nitratos + (98) V (19) (0)
Gas de nitratos (desnitrificacin) + (93) (3) (0)
Crecimiento a 42 C o
+ (100) (0) (0)
Gelatina V (82) + (100) (0)
* Porcentajes.
El gnero Pseudomonas pertenece a la familia Pseudomonadaceae. Se han creado dos esquemas para
clasificarlos. Un esquema popularizado por Gilardi se basa en las caractersticas fenotpicas y las divide
en los grupos:
1. GRUPO FLUORESCENTE:
1.1. Pseudomonas aeruginosa
1.2. Pseudomonas fluorescens
1.3. Pseudomonas putida
2. GRUPO STUTZERI:
2.1. Pseudomonas stutzeri
2.2. Pseudomonas mendocina
2.3. CDC grupo Vb-3
3. GRUPO ALCALGENES:
3.1. Pseudomonas alcaligenes
3.2. Pseudomonas pseudoalcaligenes
3.3. Pseudomonas spp. CDC Grupo I
4. HOMOLOGA DE CIDOS NUCLEICOS DESCONOCIDA (OXIDASA NEGATIVA):

4.1. Pseudomonas luteola
4.2. Pseudomonas oryzihabitans
Pseudomonas aeruginosa es la especie que con mayor frecuencia se recupera de muestras clnicas. Las
infecciones se observan habitualmente en los sitios en los que tiende a acumularse humedad:
quemaduras, heridas cutneas exudativas, odo externo. Tambin producen infecciones del tracto
urinario, tracto respiratorio, fibrosis qustica, infecciones oculares, endocarditis e infecciones seas por
diseminacin hemtica. Por otro lado, se asocian a infecciones del torrente sanguneo asociada al empleo
de dispositivos intravasculares como catteres permanentes.

VII. IDENTIFICACION:
1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACION:
1.1. Equipo:
1.1.1. Incubadora de 35 oC a 37 oC
1.1.2. Incubadora de 42oC
1.1.3. Microscopio con objetivo de 40x
1.1.4. Mechero tipo Bunsen
1.2. Materiales y Reactivos:

Materiales:
1.2.1. Guantes descartables no estriles
1.2.2. Lminas portaobjetos
1.2.3. Asas bacteriolgicas con punta redonda y recta
1.2.4. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeo
1.2.6. Lmpara de Wood (luz ultravioleta) de onda larga (400nm)
1.2.7. Palillos de madera
Reactivos:
1.2.8. Solucin A: Alfa naftilamina
1.2.9. Solucin B: cido sulfanlico
1.2.10. Solucin Salina estril al 0.85%
1.2.11. Polvo de Cinc
1.2.12. Tiras de oxidasa
1.2.13. Aceite mineral inerte estril

1.3.1 Agar MacConkey
1.4. Pruebas para Identificacin:

1.4.1 TSI
1.4.2 LIA
1.4.3 Prueba de la oxidasa
1.4.4 Prueba de movilidad al fresco
1.4.5 Prueba de reduccin de nitratos
1.4.6 Prueba de produccin de gas a partir de nitratos
1.4.7 Determinacion de la piocianina en Agar P
1.4.8 Determinacion de la pioverdina en Agar F
1.4.9 Hidrlisis de gelatina

1.4.10 Dihidrolisis de arginina

1.4.11 Degradacin de Glucosa OF (oxidacinfermentacin)
1.4.12 Crecimiento en Agar Cetrimida
1.4.13 Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC

1.5.1 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
1.5.2 Escherichia coli ATCC 25922
1.5.3 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
1.5.4 Enterococcus faecalis ATCC 29212
SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS:

1.6 Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ver captulo 16.
1.7 Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria:
Ninguno.
1.8 Pruebas Especiales:

Ninguna.
2 CRECIMIENTO EN Mac CONKEY

2.1. Fundamento del medio de cultivo: ver captulo 17.
2.2. Procedimiento: ver captulo 17.
2.3. Fundamento bioqumico de la bacteria:
Pseudomonas spp carece de las enzimas galactsidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la
capacidad de fermentar la lactosa. Por lo tanto, las UFC aparecen incoloras o transparentes, con un brillo
metlico caracterstico, planas, de bordes irregulares, con olor caracterstico a uvas o a tamal pizque.
2.4. Resultado:
Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, con un brillo metlico caracterstico, planas, de bordes
irregulares, con olor caracterstico a uvas o a tamal pizque, despus de 24 horas de incubacin.
2.5. Control de calidad:

2.5.1. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metlico caracterstico,
planas, de bordes irregulares, con olor caracterstico a uvas o a tamal pizque.
2.5.2. Escherichia coli ATCC 25922
Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaos entre 2-4 mm.

3 PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON AGAR):

3.1. Fundamento de la prueba: ver captulo 17.
Pseudomonas spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfatos deshidrogenasa, por lo que no tienen la
capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la
sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa frmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.
3.4. Resultado:
Caractersticas del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay produccin de gas: K/K
(alcalino /alcalino = rojo / rojo).
Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con produccin de abundante gas: A/A G
(cido /cido gas abundante = amarillo / amarillo, gas).
4 PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

Las especies de Pseudomona spp no poseen la enzima lisina descarboxilasa por lo tanto no
descarboxilan la lisina. Tampoco poseen la enzima lisina desaminasa por lo que no desaminan la lisina.
4.4. Resultado:
Caractersticas del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/
alcalino = violeta / violeta).
Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta).

5. PRUEBA DE LA OXIDASA:
Las especies de Pseudomonas poseen la enzima citocromooxidasa (excepto luteola y orizyhabitans).
5.4. Resultado:
Presencia de indofenoloxidasa positiva: Hay viraje de color a prpura intenso en los primeros 10 segundos.

Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color a prpura intenso en los primeros 10 segundos.
Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color
amarillo.
6. PRUEBA DE MOVILIDAD AL FRESCO:

6.3. Fundamento fisiolgico de la bacteria:
Pseudomonas aeruginosa posee 1 flagelo polar que le confiere gran movilidad sin direccin fija.
6.4. Resultado:
Movilidad positiva: Se observa al microscopio bacilos con movimientos en diferentes direcciones y
desplazamientos repentinos a larga distancia.

Resultado: Movilidad positiva: Se observan bacilos con movimientos en diferentes direcciones y
6.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 13883
Resultado: Movilidad negativa: Se observan bacilos sin movimientos. Existe movimiento giratorio
(movimiento Browniano) que no debe confundirse con movimiento bacteriano.

7. PRUEBA DE REDUCCIN DE NITRATOS:

Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de reducir nitratos a nitritos y de producir gas nitrgeno
derivado de los nitratos. Usualmente en las bacterias que convierten los nitratos a nitritos pero no a otro
productos como el gas nitrgeno, los nitritos suelen detectarse al agregar en partes iguales el reactivo
A (alfa naftilamina) y B (cido sulfanlico). Cuando los nitritos estn presentes se da un viraje del caldo
a un color rojo intenso en los primeros 30 minutos de la reaccin. Sin embargo, en bacterias como el
caso de Pseudomonas aeruginosa que convierten los nitratos a nitritos pero que tambin producen gas
de nitrgeno en gran cantidad, la deteccin de los nitritos despus de agregar los reactivos no es
observable. Esto se puede comprobar fcilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando
los nitratos no fueron convertidos a nitritos, el cinc hace la conversin y el viraje a color rojo intenso
se hace presente. Sin embargo, en el caso de las Pseudomonas aeruginosa este viraje no se presenta,
lo que comprueba la conversin. La produccin de gas nitrgeno es detectada por la presencia de
burbujas en la parte superior del tubo de Durham.
7.4. Resultado:
Reduccin de nitratos a nitratos positiva: Hay viraje a color rojo despus de agregar los reactivos de
prueba.
Produccin de gas nitrgeno positiva: Hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

Resultado: Reduccin de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, despus de agregar los
reactivos de prueba, ni al agregar 20 mg de polvo de cinc.
Produccin de gas nitrgeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte
superior del tubo de Durham invertido.
7.5.2. Enterococcus faaecalis ATCC 29212
Resultado: Reduccin de nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color despus de agregar los
reactivos de prueba.
Confirmacin: Luego de la adicin de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo despus
de 5 a 10 minutos.
Produccin de gas nitrgeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de
Durham. Todo el tubo aparece lleno del caldo.

8. DETERMINACION DE PIOCIANINA EN AGAR P:

Pseudomonas aeruginosa tiene la habilidad de producir el pigmento piocianina, el cual es un pigmento
azul verde o azul turquesa no fluorescente bajo luz ultravioleta, soluble en agua y que se puede observar
a simple vista.
8.4. Resultado:
Produccin del pigmento piocianina positiva: Se observa un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre
el crecimiento bacteriano.

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Resultado: Produccin de piocianina positiva: se observa un pigmento verde azulado o azul turquesa
sobre el crecimiento bacteriano.
Escherichia coli ATCC 25922
Resultado: Produccin de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin pigmento.
9. DETERMINACIN DE PIOVERDINA EN AGAR F:

Pseudomonas aeruginosa produce pioverdina, un pigmento orgnico luminiscente que con la luz
ultravioleta de onda larga emite una fluorescencia verde amarillenta intensa.
9.4. Resultado:
Resultado: Produccin de pioverdina positiva: Bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde
amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento.

Resultado: Produccin de pioverdina positiva: bajo luz ultravioleta se observa fluorescencia verde
amarillenta intensa en toda la zona de crecimiento.
Resultado: Produccin de pioverdina negativa: bajo luz ultravioleta no hay fluorescencia en la zona de
crecimiento.

10.HIDRLISIS DE GELATINA:
El 82% de Pseudomonas aeruginosa posee enzimas gelatinolticas (gelatinasas) que hidrolizan la gelatina
provocando la licuefaccin del medio slido de gelatina.
10.4. Resultado:
Hidrlisis de la gelatina variable: Puede observarse o no un halo opaco alrededor del crecimiento de la
colonia.
10.5. Control de Calidad:

Resultado: Hidrlisis de gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del crecimiento de la
colonia.

Resultado: Hidrlisis de gelatina negativa: Se observa crecimiento bacteriano sin halo opaco alrededor.
11.DIHIDRLISIS DE ARGININA:

Pseudomonas aeruginosa posee la enzima deshidrogenasa y por consiguiente la arginina es convertida
a citrulina y ornitina para formar putrescina, la cual acenta el pH alcalino.
11.4. Resultado:
Dihidrlisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un prpura ms
acentuado.

Resultado: Hidrlisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un prpura
mas intenso.
Resultado: Hidrlisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentacin de la
glucosa.

12.GLUCOSA OF (OXIDACINFERMENTACIN):
Pseudomonas aeruginosa oxida la glucosa, por lo que produce cido solo en aerobiosis. Esta reaccin
se observa en la parte superior del tubo que no lleva aceite mineral, con viraje al color amarillo. No hay
reaccin en el tubo con aceite mineral (anaerobiosis).
12.4. Resultado:
Oxidacin de la glucosa positiva: Hay viraje de color a amarillo en la parte superior del tubo que no lleva
aceite mineral (ver tabla No. 1). En el tubo con aceite mineral (reaccin en anaerobiosis) no hay cambios
y por lo tanto, no hay viraje de color.

Resultado: Oxidacin de la glucosa positiva. Se observa viraje de color al amarillo en la parte superior
del tubo sin aceite mineral (reaccin en aerobiosis). No hay actividad en el tubo con aceite mineral
(reaccin en anaerobiosis). No hay viraje de color.
Resultado: Oxidacin de la glucosa negativa. Fermentacin de la glucosa positiva. Hay viraje de color
a lo largo de los dos tubos (aerobiosis y anaerobiosis).
13.CRECIMIENTO EN AGAR CETRIMIDA:

Pseudomonas aeruginosa tiene la capacidad de crecer en presencia de cetrimida (bromuro de cetil tri-
metil amonio), un agente que acta como detergente, disminuyendo la tensin superficial en el medio.
Como resultado, muchas bacterias son inhibidas por esta accin a excepcin de Pseudomonas
aeruginosa. La presencia de cloruro de magnesio y sulfato de potasio estimulan la formacin del
pigmento azul verde o azul turquesa no fluorescente piocianina y el pigmento verde-amarillo fluorescente
de pioverdina que puede ser detectado bajo luz ultravioleta de onda larga (400nm).
13.4. Resultado:
Crecimiento en cetrimida positivo: Hay crecimiento de colonias en las que se observa pigmentacin azul
turquesa (piocianina) y verde amarillo fluorescente (pioverdina) detectado bajo luz ultravioleta.

Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: hay buen crecimiento con pigmento azul verdoso y verde
amarillento fluorescente que detecta la fluorescena o pioverdina en presencia de luz ultravioleta..
Resultado: Crecimiento en cetrimida negativo. No hay crecimiento ni pigmentos.
14.CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY A 42C

Peudomonas aeruginosa es tolerante a la temperatura de 42oC en agar Mac Conkey, lo que la distingue
de las especies P. fluorescens y P. putida del grupo fluorescente.
14.4. Resultado:
Crecimiento en agar MacConkey a 42 oC positivo: hay crecimiento bacteriano.

Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano de UFCs
caractersticas.
14.5.2. Enterococcus faecalis ATCC 29212
Resultado: Crecimiento en Mac Conkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.

60
1. DIAGRAMA DE FLUJO PARA NO FERMENTADORES MOVILIDAD POSITIVA
+ OXIDASA -
P. luteola P. stutzeri P. alcaligenes P. luteola

MANUAL
P. orizyhabitans P. mendocina Pseudomonas spp. CDC P. orizyhabitans

DE
P. putida P. pseudoalcaligenes grupo 1
Glucosa OF
P. pseudoalcaligenes P. alcaligenes
PROCEDIMIENTOS
P. aeruginosa P. stutzeri Pseudomonas spp. CDC grupo 1

DE
P. fluorescens P. mendocina P. putida
+ Pigmentos verdes brillante en Cetrimida o Agar P y F

+ Gelatina
+ Arginina
P. aeruginosa P. stutzeri
P. fluorescens P. mendocina
P. putida
+ Crecimiento a 42 o C
+ Gas de nitrgeno
Reduccin de nitratos a nitritos
Captulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comnmente en exudados de heridas

P. fluorescens
P. aeruginosa P. putida
de Acinetobacter spp
I. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.11 con respecto a pruebas de identificacin.

El gnero Acinetobacter esta constituido por cocobacilos gramnegativos frecuentemente agrupados en
pares, estrictamente aerobios, que miden de 1 a 1.5 m de largo por 1.5 a 2.5 m de ancho.
Carecen de la enzima indofenoloxidasa, inmviles, y no poseen las enzimas para convertir los nitratos
a nitritos. En fase estacionaria de crecimiento y en agares no selectivos predominan formas
cocobacilares. Las colonias son lisas, opacas y ligeramente pequeas. Muchas cepas en Agar Mac
Conkey aparecen ligeramente rosadas.
El gnero fue originalmente ubicado en la familia Neisseriaceae pero actualmente esta ubicado en la
familia Moraxellaceae. Estudios basados en hibridacin del DNA los han clasificado en 21
genomaespecies, de los cuales solo 7 han sido nombrados y de estos, las especies mas frecuentemente
aisladas son: Acinetobacter baumannii, seguido por Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus,
Acinetobacater johnsonii y Acinetobacter junnii.
Las especies de Acinetobacter estn ampliamente distribuidas en la naturaleza y en el ambiente

hospitalario. Son el segundo aislamiento ms comn luego de Pseudomonas aeruginosa. Son capaces de
sobrevivir en la mayora de superficies secas y hmedas y tambin pueden estar presentes
transitoriamente en la piel humana.
Acinetobacter spp son generalmente considerados como no patognicos pero pueden causar infecciones
en individuos debilitados. La mayora de las infecciones adquiridas en los hospitales afectan el tracto
respiratorio, urinario y heridas. Ya sea de estos sitios o por su crecimiento en dispositivos como
catteres, las infecciones pueden progresar a infecciones del torrente sanguneo.
La facilidad de estos microorganismos para adquirir resistencia a mltiples antimicrobianos y su alta

capacidad de sobrevivir en muchas superficies ha conducido a su incremento en infecciones
hospitalarias.

III. IDENTIFICACION:
1.1. Equipo:
1.1.2. Incubadora de 42oC
1.1.3. Microscopio con objetivo de 40x

Materiales:
1.2.4. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material pequeo
Reactivos:
1.2.7. Solucin A: Alfa Naftilamina
1.2.8. Solucin B: cido Sulfanlico
1.2.10. Polvo de Cinc

1.3.1. Agar Mac Conkey

1.4.1. Triple Sugar Iron Agar
1.4.2. Lisine Iron Agar
1.4.3. Oxidasa
1.4.4. Movilidad
1.4.5. Reduccin de nitratos
1.4.6. Crecimiento en agar Mac Conkey a 42 oC
1.4.7. Glucosa OF (oxidacinfermentacin)
1.4.8. Utilizacin del malonato

1.4.9. Dihidrolisis de arginina

1.4.10. Utilizacin del citrato
1.4.11. Hidrlisis de gelatina
1.5 Cepas para control de calidad:

1.5.4 Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver captulo 16.
1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentracion Minima Inhibitoria:
Ninguno
1.8. Pruebas Especiales:

Ninguna
2. CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY:

Acinetobacter spp carecen de las enzimas galactsidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la
capacidad de fermentar la lactosa y las colonias aparecen lisas, opacas y pequeas. Algunas cepas de
Acinetobacter baumannii tienen aspecto ligeramente rosado.
2.4. Resultado:
Crecimiento en agar Mac Conkey: UFCs lisas, opacas, pequeas y ligeramente rosadas despus de 24
horas de incubacin.
Acinetobacter johnsonii crece con dificultad en agar Mac Conkey.

Resultado: Crecimiento de colonias incoloras o transparentes, con un brillo metlico caracterstico,
planas, de bordes irregulares, con olor caracterstico a uvas o a tamal pizque.
Resultado: Crecimiento de colonias rosadas, convexas, umbilicadas con tamaos entre 2-4 mm.

3. PRUEBA DE TSI (TRIPLE SUGAR IRON):

3.3. Fundamento bioquimico de la bacteria:
Acinetobacter spp carecen de la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo que no tienen la
capacidad de fermentar la glucosa. No poseen la enzima invertasa por lo tanto no pueden fermentar la
sacarosa. No poseen la enzima hidrogenasa frmica por lo que no producen gas a partir de la glucosa.
3.4. Resultado:
Caractersticas del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = rojo / rojo)

Resultado: Fermentan la lactosa / Fermentan la glucosa, con produccin de abundante gas: A/A G
(cido /cido gas abundante = amarillo / amarillo, gas)
Resultado: No fermentan la lactosa / No fermentan la glucosa. No hay produccin de gas: K/K
(alcalino /alcalino = rojo / rojo).
4. PRUEBA DE LIA (LISINE IRON AGAR):

Acinetobacter spp no poseen la enzima lisinadescarboxilasa por lo tanto no descarboxilan la lisina.
Tampoco poseen la enzima lisinadesaminasa por lo que no desaminan la lisina.
4.4. Resultado:
Caractersticas del crecimiento: K /K (alcalino / alcalino = violeta / violeta)

Resultado: No desaminan la lisina / No descarboxilan la lisina ni fermentan la glucosa: K/K (alcalino/
alcalino = violeta / violeta)
Resultado: No desaminan la lisina / Descarboxilan la lisina: K/K (alcalino alcalino = violeta / violeta)

5. PRUEBA DE OXIDASA:
5.3. Fundamento bioqumica de la bacteria:
Todas las especies de Acinetobacter no poseen la enzima citocromooxidasa por lo que no hay viraje de
color en la tira reactiva dentro de los 10 segundos de reaccin.
5.4. Resultado:
Presencia de indofenoloxidasa negativa: Hay viraje de color al prpura intenso en los primeros 10
segundos.

Resultado: Oxidasa positiva: hay viraje de color al prpura intenso en los primeros 10 segundos.
Resultado: Oxidasa negativa: No hay viraje de color en los primeros 10 segundos. Se observa de color
amarillo.
6. MOVILIDAD AL FRESCO:

Todas las especies de Acinetobacter no poseen flagelos por lo que se observa al microscopio, coco-
bacilos inmviles.
6.4. Resultado:
Movilidad negativa: Se observa al microscopio cocobacilos inmviles.


7. REDUCCIN DE NITRATOS A NITRITOS:

Todas las especies del genero Acinetobacter carecen de la capacidad de reducir los nitratos a nitritos
y a otros productos, por lo que no hay viraje de color despus de agregar los reactivos de prueba ni
produccin de gas en el tubo de Durham.
7.4. Resultado:
Reduccin de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color dentro de los primeros 10 minutos
despus de agregar los reactivos de prueba. Al agregar 20 mg de polvo de cinc hay viraje de color a
rosado intenso en los primeros 5 a 10 minutos (reaccin verdaderamente negativa).
Produccin de gas nitrgeno negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham.

Resultado: Reduccin de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color, despus de agregar los
Produccin de gas de nitrgeno a partir de nitratos positiva: se observan burbujas de gas en la parte
superior del tubo de Durham.
Resultado: Reduccin de Nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color despus de agregar los
Confirmacin: Luego de la adicin de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo despus
de 5 a 10 minutos.
Produccin de gas nitrgeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de Durham.
Todo el tubo aparece lleno con el caldo.
8. CRECIMIENTO EN AGAR MacCONKEY A 42C:

8.3. Fundamento de la bacteria:
De las dos especies de Acinetobacter ms comunes en infecciones hospitalarias, Acinetobacter
baumannii crece a 42 C. Acinetobacter lwoffi carece de la habilidad de crecer a 42 oC.

8.4. Resultado:
Crecimiento a 42 oC positivo: Acinetobacter baumannii , Acinetobacter junnii. Desarrollo de colonias
opacas, pequeas y ligeramente rosadas.
Crecimiento a 42o negativo: Acinetobacter lwoffii, Acinetobacter haemolyticus y Acinetobacter johnsonii

Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42oC positivo: hay crecimiento bacteriano.de UFCs
caractersticas.
Resultado: Crecimiento en MacConkey a 42 oC negativo: no hay crecimiento bacteriano.
9. GLUCOSA OF (OXIDACINFERMENTACIN):

La especie Acinetobacter baumannii oxida la glucosa en el medio de OF y como resultado, hay
acidificacin en la parte superior del tubo que no est recubierto con aceite mineral (aerobiosis).
Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no son oxidativos para la glucosa, por lo que las tres
especies son inactivas en este medio, tanto en el tubo con aerobiosis como en el de anaerobiosis
(recubierto con aceite mineral). A. haemolyticus puede o no oxidar la glucosa.
9.4. Resultado:
Oxidacin de la glucosa: Viraje de color al amarillo en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis
(sin aceite mineral): Acinetobacter baumannii y A. haemolyticus.
Oxidacin de la glucosa variable: Puede o no haber oxidacin de la glucosa: A. haemolyticus
Inactivo (no hay oxidacin de la glucosa): No hay viraje de color en el tubo incubado en anaerobiosis
(con aceite mineral). Viraje de color al azul en la parte superior del tubo incubado en aerobiosis (sin
aceite mineral): Acinetobacter junnii, A. johnsonii y A. lwoffii.

Resultado: Oxidacin de la glucosa positiva. Se observa viraje de color a amarillo en el tercio superior
del tubo incubado en aerobiosis (sin aceite mineral). En el tubo con aceite mineral (reaccin en
anaerobiosis) no hay cambios y por lo tanto, no hay viraje de color.


Resultado: Fermentacin de la glucosa positiva en aerobiosis y anaerobiosis. Hay viraje de color al
amarillo en los dos tubos.
10.UTILIZACIN DEL MALONATO:

Acinetobacter baumannii y A. johnsonii utilizan el malonato como nica fuente de carbono, a di-
ferencia de Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii que no lo utilizan.
10.4. Resultado:
10.4.1. Utilizacin del malonato como nica fuente de carbono positiva: Hay viraje de color al azul:
Acinetobacter baumannii y A. johnsonii.
10.4.2. Utilizacin del malonato como nica fuente de carbono negativa: No hay viraje de color:
Acinetobacter haemolyticus, A. junnii y A. lwoffii.

Resultado: Malonato positivo. Hay viraje de color al azul.
Resultado: Malonato negativo. No hay viraje de color. El caldo se observa de color verde.
11.DIHIDRLISIS DE ARGININA.

Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. junnii poseen la enzima deshidrogenasa y por
consiguiente la arginina es convertida a citrulina y ornitina para luego formar putrescina. Este compuesto
es alcalino, lo cual intensifica el color prpura del medio. Acinetobacter lwoffii no hidroliza la arginina
y Acinetobacter johnsonii da reacciones variables.
11.4. Resultado:
11.4.1. Hidrlisis de la arginina positiva: Intensificacin del color prpura en el medio: Acinetobacter
baumannii, A. haemolyticus y A. junnii.

11.4.2. Hidrlisis de la arginina negativa: Viraje de color del prpura a amarillo: Arginina: Positiva.
El caldo se observa de color prpura.
11.4.3. Hidrlisis de la arginina variable: Intensificacin del color prpura o viraje de color a amarillo:
Acinetobacter johnsonii.

Resultado: Hidrlisis de arginina positiva. El caldo se observa turbio y de color prpura.
Resultado: Hidrlisis de arginina negativa: Hay viraje de color a amarillo por la fermentacin de la
glucosa.
12.UTILIZACIN DEL CITRATO:

Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii utilizan el citrato como nica fuente de
carbono. Acinetobacter iwoffii no lo utiliza y Acinetobacter junnii puede o no utilizarlo.
12.4. Resultado:
Utilizacin del citrato positiva: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del medio:
Acinetobacter baumannii, A. haemolyticus y A. johnsonii.
Utilizacin del citrato negativa. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio. El medio
se observa de color verde: Acinetobacter iwoffii .
Utilizacin del citrato variable: Puede o no haber viraje de color y crecimiento en la superficie del medio.
El medio se puede observar de color azul o verde: Acinetobacter junnii.

Resultado: Utilizacin del citrato positivo: Hay viraje de color a azul y crecimiento en la superficie del
medio.
Resultado: Utilizacin del citrato negativo. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del
medio. El medio se observa de color verde.

13.HIDRLISIS DE GELATINA:
A excepcin de Acinetobacter haemolyticus que hidroliza la gelatina, las especies de Acinetobacter
baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. iwoffii no poseen la enzimas gelatinaza que hidrolizan la ge-
latina y por lo tanto no se producir licuefaccin del medio.
13.4. Resultado:
13.5.1. Hidrlisis de la gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del inculo: Acineto-
bacter haemolyticus
13.5.2. Hidrlisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inculo:
Acinetobacter baumannii, A. junnii, A. johnsonii y A. lwoffii:

13.5.2. Resultado: Hidrlisis de la gelatina positiva. Se observa un halo opaco alrededor del inculo.
Resultado: Hidrlisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inculo.
Tabla No 1.
Pruebas para diferenciar especies de Acinetobacter spp
37 o C 42 o C Reduccin Glucosa Arginina Gelatina Citrato Malonato

de nitratos OF
Acinetobacter + (100)** + (100) Oxidativo + (98) ( 0) + (100) + (98)

baumannii (95)
Acinetobacter + (100) ( 0) Variable + (96) + (96) + (91) ( 0)

haemolyticus* (52)
Acinetobacter + (100) + (90) ( 0) + (95) ( 0) + -(82) ( 0)

junii
Acinetobacter ( 0) ( 0) ( 0) + (35) ( 0) +(100) + (13)

johnsonii
Acinetobacter +(100) ( 0) ( 6) ( 0) ( 0) ( 0) ( 0)
iwoffii
* A. haemolyticus: hemolisa la sangre de carnero.

** Porcentajes.

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACION DE NO FERMENTADORES OXIDASA NEGATIVA
OXIDASA NEGATIVA
MANUAL
DE
MOTILIDAD
NEGATIVA POSITIVA
Acinetobacter baumannii Pseudomonas luteola

A. lwoffii, A. haemolyticus Flaviomonas oryzihabitans
Stenotrophomonas maltophila
A. junii, A. johnsonni Burkholderia gladioli
Group NO-1
PROCEDIMIENTOS
DE
REDUCCION NITRATOS A NITRITOS+ ESCULINA +
A. baumennii, A. Iwoffii F. oryzihabitans C. luteola

Group NO-1
A. haemolyticus, A. junnii, A. johnsonnii B. gladioli S. maltophila
o
CRECIMIENTO A 42 C + MALTOSA OF + DNAsa +
en MacConkey + MANITOL OF
A. johnsonii, A. Iwoffii A. junnii

B. gladioli F. oryzihabitans P. luteola S. maltophila
A. haemolyticus A. baumannii
o GLUCOSA OF +
CRECIMIENTO A 37 C +
En MacConkey MALONATO +
A. Iwoffii
A. johnsonnii A. haemolyticus A. junnii A. baumennii
ARGININA +
CITRATO +
GELATINA +
Captulo 6: Procedimientos para bacterias aisladas comnmente en exudados de heridas

A. Iwoffi A. haemolyticus
71
IV. BIBLIOGRAFA UTILIZADA:

1. Kiska DL and Gilligan PH. Pseudomonas in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray
editor in chief. Chap 33, 7th edition, ASM, Washington, 1999.
2. Schereckenberger PC and Von Graevenitz A. Acinetobacter in Manual of Clinical Microbiology,
Patrick R. Murray editor in chief. Chap 35, 7th edition, ASM, Washington, 1999.
3. Bacilos Gramnegativos No Fermentadores en: Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman,
Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Captulo 5.
5 Edicin, 1996. Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
4. Pseudomonas, Acinetobacter en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks
editor, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), captulo 17, 1999, Editorial El Manual Moderno,
Mxico, Bogot.
5. Pseudomonas y Acinetobacter en Manual de Procedimientos para el diagnstico de bacilos
gramnegativos no fermentadores. Servicio de Bacteriologa Especial del Departamento de
Bacteriologa del Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas. Administracin Nacional de
Laboratorios e Institutos de Salud. Ministerio de Salud, Argentina / Organizacin Panamericana de
la Salud, Organizacin Mundial de la Salud. Sin fecha.
6. Le Minor L, Claude R. Milieux de Culture , Reactifs, Milieux de Diagnostic en Mthodes de laboratoire
pour lidentification des enterobactries. Deuxieme partie: Notes techniques. Editeur: Institut Pasteur.
1 ed. 1993. Paris, France.
7. Dehydrated Culture Media and Reagents for Microbiology in Difco Manual. Difco Laboratories. Tenth
edition, 1984, Detroit, Michigan, USA.
8. Manual of BBL Products and Laboratory Procedures. Power David editor. Sixth edition. 1998.
Cockeysville, Maryland.

de Staphylococcus aureus
I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra de exudado de heridas.
II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver transporte de exudado de heridas.
III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA: Ninguno.
IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS:

Ver equipo, materiales y reactivos en exudado de heridas.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificacin.
CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a pruebas de identificacin

Los estafilococos son clulas esfricas de alrededor de 1m de dimetro, gram positivas generalmente
agrupadas en racimos. En cultivos lquidos se observan adems cocos aislados, en pares, ttradas y
cadenas. Son microorganismos no mviles y no forman esporas.
Los estafilococos crecen con facilidad en la mayor parte de los medios de cultivos y son activos desde
el punto de vista metablico, fermentan muchos carbohidratos y producen pigmentos que varan desde
el color blanco hasta el amarillo intenso bajo condiciones aerobias o microaerfilas. Crecen con mayor
rapidez a 37oC, pero forman mejor el pigmento a temperatura entre 20o-25oC. Las colonias desarrolladas
en medios slidos son redondas, lisas, elevadas y resplandecientes. S. aureus forma colonias de color
gris a amarillo dorado intenso. Las colonias de S. epidermidis tienen tonos de grises a blancas.
Los estafilococos producen catalasa , lo que los distingue de los estreptococos.
Los estafilococos patgenos generalmente son hemolticos y coagulan el plasma. Algunos son miembros
de la microbiota normal de la piel y mucosas de los humanos, en tanto que otros producen supuracin,
formacin de abscesos, diversas infecciones pigenas e incluso septicemia mortal. Un tipo comn de
envenenamiento por alimentos es causado por una enterotoxina termoestable producida por algunas
cepas de estafilococo.
El gnero Staphylococcus tiene por lo menos 20 especies. Staphylococcus aureus es un microorganismo
patgeno de gran importancia para el ser humano por ser el causante de muchas infecciones graves.

Entre el 20 al 40 % de los adultos suelen portarlo en las narinas, tambin se le encuentra en otros sitios
como pliegues cutneos, perin, axilas y vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la
microbiota humana normal, puede producir infecciones oportunistas en huspedes susceptibles. Los
estafilococos coagulasa negativos tambin constituyen parte de la microbiota humana normal.
Staphylococcus epidermidis es el microorganismo recuperado con mayor frecuencia: entre el 50% y
80% de los aislamientos de esta especie se incluyen, endocarditis originada en vlvulas cardiacas
naturales y protsicas, infecciones producidas por catteres intravenosos, infecciones de sistemas para
derivaciones del LCR, peritonitis asociada con catteres para dilisis peritoneal, bacteriemia,
osteomielitis, infecciones de heridas, infecciones de injertos vasculares, infecciones de prtesis articulares
e infecciones de las vas urinarias. Staphylococcus saprophyticus es la segunda causa de infeccin del
tracto urinario en mujeres jvenes no embarazadas.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:

1.1. Equipos:
1.1.1. Incubadora
1.1.2. Microscopio con objetivo de 100 X y 10 X

1.2.4. Tubos de ensayo de vidrio 12 x 75 y de plstico 15 x 100
1.2.5. Contenedores con cloro al 0.5 % para descarte de materiales no reusables
1.2.6. Lminas portaobjetos.
1.2.7. Solucin salina al 0.85 %
1.2.8. Peroxido de Hidrgeno al 3 % (H2O2)
1.2.9. Colorantes para tincin de Gram: Cristal violeta, Lugol, Safranina y Alcohol etlico al 95%
(o Alcohol-Acetona 1:1)
1.2.10. Plasma diluido con solucin salina 1:5
1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en exudados de heridas.

1.4.1. Presencia de b-hemlisis y caractersticas macroscpicas
1.4.2. Gram
1.4.3. Catalasa
1.4.4. Coagulasa


1.5.3 Streptococcus pyogenes ATCC 19615
1.6. Antimicrobianos a utilizar por el metodo de Kirby y Bauer: ver captulo 16.
1.7. Antimicrobianos a utilizar para la Concentracin Mnima inhibitoria:

Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados)
1.7.1 Vancomicina
1.7.2 Penicilina
1.8. Pruebas Especiales: Ninguna.
2. CARACTERSTICAS DE LAS UFC EN AGAR SANGRE DE CARNERO:

Staphylococcus aureus posee la enzima hemolisina, por lo tanto hemolisa la sangre en el medio de Agar
Sangre de Carnero.
El cultivo en ASC presenta colonias de color gris a amarillo dorado intenso de 1 a 2 mm de dimetro
con zonas de b-hemlisis alrededor de la colonia.
3. COLORACIN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A

PARTIR DEL AGAR SANGRE DE CARNERO:
Permite observar la tincin, agrupacin y morfologa microscpica caracterstica.
3.1. Procedimiento para la preparacin del frotis: ver captulo 3.

3.2. Procedimiento para la tincin del frotis de Gram: ver captulo 3.
3.3. Resultado:
Cocos grampositivos en racimos predominantemente, diplos, ttradas y cadenas cortas.
3.4. Control de Calidad a la Prueba de Gram:

3.4.1. Staphylococcus aureus ATCC 25923
Resultado: Predominantemente cocos grampositivos en racimos, diplococos, ttradas y cadenas cortas.
3.4.2. Escherichia coli ATCC 25922.
Resultado: Bacilos gramnegativos
4. PRUEBA DE CATALASA:


4.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria:
Staphylococcus aureus posee la enzima catalasa, por lo tanto da reaccin positiva que se caracteriza
por la formacin inmediata e intensa de burbujas al aplicar perxido de hidrgeno al 3%.
4.4. Resultado:
Prueba de catalasa positiva: produccin inmediata e intensa de burbujas.

Resultado: Produccin inmediata e intensa de burbujas.
4.5.2. Streptococcus pyogenes ATCC 19615
Resultado: No hay produccin de burbujas.
PRUEBAS CONFIRMATIVAS
5. PRUEBA DE COAGULASA:
5.1. Fundamento de la prueba:
Es una sustancia similar a la trombina presente en los cultivos capaz de convertir el fibringeno en
fibrina, lo que da como resultado la formacin de un cogulo visible.
5.2. Preparacin del plasma diluido 1:5

En un tubo estril de plstico 15 x 100 se agrega 1mL de plasma oxalatado o citratado y 4 mL de
solucin salina 0.85 %. Este plasma diluido al 1:5 se mantiene en congelacin en viales estriles de 1mL
en pequeos lotes listos para su uso a 4oC.
5.3. Procedimiento:
En un tubo de 10 x 75 se agrega 0.5 1mL de plasma diluido.
Se inocula de 1 a 2 UFC sospechosas de Staphylococcus aureus.
Se incuba a una temperatura de 35 37 oC por un tiempo de 1 a 4 horas.

Staphylococcus aureus produce coagulasa, proteina de tipo enzimtico que coagula el plasma oxalatado
o citratado en presencia de un factor contenido en muchos sueros.
5.5. Resultado:
Positivo: Formacin de cogulo.


Resultado: Formacin de cogulo en menos de 4 horas.
Resultado: No hay formacin de cogulo en 4 horas.
En la tabla No. 1 se presentan la pruebas requeridas para diferenciar Staphylococcus epidermidis y
saprophyticus de otros estafilococos coagulasa negativos, dos de los estafilococos mas frecuentes
aislados en los cultivos. La identificacin de otras especies es compleja y poco til, a menos que se trate
de infecciones intrahospitalarias. Por tal razn, a parte de las especies aureus, epidermidis y
saprophyticus, los otros estafilococos deben informarse como Staphylococcus spp. o Staphylococcus
coagulasa negativa.
Tabla No. 2
Pruebas bioqumicas para diferenciar Staphylococcus epidermidis de otras especies
Especies Catalasa Ornitina Urea Manosa Xilosa Sacarosa Trealosa Maltosa Lactosa Reduccin
e Nitratos
S. epidermidis + v1 + +1 + + v +
S. saprophyticus + + v + + + v
S. warneri + + + + +1 v v
S. hominis + + +1 v + v v
S. simulans + + v + v +1 + +
S. xylosus + + + + + + + v v
S. lugdunensis + + v + + + + + +
v1, 11 89 % de las cepas son positivas, con reaccin lenta; +1, > 90% de las positivas con reaccin
lenta; v, 11 89 % cepas positivas.
6. INFORME:
Resultado positivo: Staphylococcus aureus
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus spp o coagulasa negativa
Resultado negativo: No hubo crecimiento bacteriano.

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Estafilococos en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor,
Cap. 14, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico D.F.
2. Identificacin de Staphylococcus aureus en: Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman,
Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn, Cap. 11.
5 ed., 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
3. Kloos WE and Bannerman TL. Staphylococcus and Micrococcus in Manual of Clinical Microbiology,
Patrick R. Murray ed in chief, chap16, ASM Press, 7 th ed., 1999,Washington D.C.

de Enterococcus spp
I. TOMA DE LA MUESTRA: Ver toma de muestra en heridas y abscesos.
II. TRANSPORTE DE LA MUESTRA: Ver Transporte de la muestra en heridas y abscesos.
III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA: Ver Procesamiento de la muestra en heridas

y abscesos.
IV. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS: Ver equipos, instrumentos y reactivos en

heridas y abscesos.
V. ALCANCE:
CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.6.2 con respecto a pruebas de identificacin.

El gnero Enterococcus spp incluye los Enterococcus clasificados previamente dentro de los estrep-
tococos del grupo D. Son cocos son grampositivos esfricos u ovoides y se disponen en cadenas, las
colonias miden de 0.5 a 1mm de dimetro, son lisas, de bordes definidos y producen hemlisis alfa o
ninguna.
Existen 18 especies de enterococos ordenadas en 4 grupos (I, II, III, IV). Enterococcus faecalis (pertenece
al grupo II) es la especie ms comn, y causa del 85 al 90% de las infecciones enterococicas, mientras
que Enterococcus faecium (pertenece al grupo II) causa del 5 al 10% de las infecciones. Estas dos
especies son las mas frecuentemente aisladas.
Estos microorganismos son parte de la microbiota del sistema gastrointestinal, vagina y uretra. Los
Enterococcus se asocian a las causas ms frecuentes de infecciones nosocomiales, en particular en
unidades de cuidados intensivos. Suelen transmitirse de un paciente a otro a travs de las manos del
personal hospitalario. En los pacientes, los sitios ms comunes de infeccin son las vas urinarias,
heridas, vas biliares y sangre, han sido asociados a cistitis, pielonefritis, prostatitis, abscesos
perinefrticos y endocarditis. En neonatos estn asociados a meningitis y bacteremias.
Son agentes cada vez ms importantes como causa de enfermedad humana, principalmente debido a
su resistencia a agentes antimicrobianos a los cuales son en general sensible los estreptococos.
Enterococcus faecium suele ser mucho ms resistentes a los antimicrobianos que Enterococcus faecalis.

Pruebas realizadas in vitro con Enterococcus spp han demostrado que estos microorganismos presentan
CIM para Penicilina 10 a 100 veces mayores que los dems estreptococos.
Debido a su resistencia a la penicilina y cefalosporinas de diversas generaciones, a la adquisicin de
resistencia de alto nivel a los aminoglucosidos y, en la actualidad, a la reciente aparicin de resistencia
a la vancomicina, estas bacterias con frecuencia estn involucradas en sobreinfecciones graves en
pacientes que estn en tratamiento con estos antimicrobianos.
Los Enterococcus spp se diferencian de los estreptococos por su capacidad de desarrollarse a 10 oC y
45oC, crecer en concentraciones de cloruro de sodio al 6,5%, por su tolerancia a altas concentraciones
de bilis y por producir la enzima pirrolidonil arilamidasa ( pirrolidonasa o PYR por sus siglas en ingls).
Mas del 90% de las cepas poseen el antgeno para el grupo D de Lancefield.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos: Ver equipos en heridas y abscesos.

1.2.2. Gradillas
1.2.3. Rotador
1.2.4 Contenedores con cloro del 5 al 10% para desechar material contaminante
1.2.8. Tubos para coagulasa de 13 x 75
1.2.9. Pinzas estriles
1.2.11. Solucin salina al 0.85%
1.2.12. Colorantes para tincin de Gram
1.2.13. Peroxido de hidrgeno (H2O2)al 30%
1.2.14. Discos de optoquina de 6mm
1.2.15. Desoxicolato de Sodio al 10%
1.2.16. Discos de bilis esculina
1.2.17. Lminas (dispositivos) comerciales para prueba de PYR.
1.2.18. Caldo nutritivo con 6.5% de NaCl
1.2.19. Arabinosa
1.2.20. Sorbitol

Ver medios de cultivo en heridas y absceso.

1.4. Pruebas para la identificacin:

1.4.1. Coloracin de Gram de las colonias.
1.4.2. Prueba de catalasa
1.4.3. Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus
grupo viridans:
1.4.3.1. Prueba de optoquina
1.4.3.2. Prueba de solubilidad en bilis
1.4.4. Pruebas para diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans:
1.4.4.1. Prueba de bilis esculina.
1.4.4.2. Prueba de PYR.
1.4.4.3. Prueba de crecimiento en caldo nutritivo al 6.5%.
1.4.5. Serologa con antisuero Grupo D.
1.4.6. Prueba para diferenciar la especies de Enterocococcus spp.
1.4.6.1. Prueba de fermentacin de la arabinosa.
1.4.6.2. Prueba de fermentacin del sorbitol.

1.5.3 Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
1.5.4 Streptococcus viridans INS 003
1.7. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Concentracin Inhibitoria Mnima

(CIM/MIC): Ninguno.
1.8. Pruebas especiales para sensibilidad a los antimicrobianos: Ninguna.
2. CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):
2.1. Fundamento del medio: ver captulo 17.

2.3. Fundamentos fisiolgicos de la bacteria ante el medio:
Las dos especies que ms frecuentemente se aslan de muestras clnicas carecen o tienen hemolisinas S,
las cuales son responsables de la hemlisis alfa de los eritrocitos, al realizar una estra profunda en el
medio, observndose un color verde musgo dentro de esta. Las UFCs miden entre 0,5 a 1mm de
dimetro, lisas, bordes definidos, ligeramente convexas, grisceas.

2.4. Resultado:
Colonias 0.5-1mm de dimetro, grisceas, bordes definidos, ligeramente convexas, con zona de alfa
hemlisis en estra profunda.

Enterococcus faecalis ATCC 29212
Resultado: Crecimiento en el medio y no se observa hemlisis verde alrededor de la colonia nicamente
en la estra profunda .
3. COLORACIN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs):
3.1. Fundamento de la tincin: ver captulo de tincin de Gram.

3.2. Procedimiento: ver captulo de tincin de Gram.
3.3. Fundamentos fisiolgicos de la bacteria:
Los Enterococcus spp son cocos redondos o ligeramente elongados que se agrupan predominantemente
en cadenas y se observan como grampositivos.
3.4. Resultado:
Se observa cocos gram positivos esfricos u ovoides dispuestos en cadenas.

Resultado: Se observa cocos grampositivos esfricos u ovoides dispuestos en cadenas.
Los Enterococcus spp carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en oxgeno y agua.
Eventualmente se observan cepas que dan reacciones dbiles
4.4. Resultado:
Negativo: No hay produccin de burbujas.
4.5. Control de Calidad de la prueba:

Resultado: Negativo: No hay produccin de burbujas.
Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo
viridans (Ver diagrama de flujo despus de la prueba de arabinosa):

5. PRUEBA DE OPTOQUINA:
La sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etil hidrocuprena) se utiliza para diferenciar Streptococcus
pneumoniae, Streptococcus grupo viridans y Enterococcus spp. Los Enterococcus spp son resistentes
a la optoquina. Cuando se colocan discos de optoquina de 6mm, el dimetro del halo de inhibicin del
crecimiento es menor de 14 mm.
5.4. Resultado:
Negativo: El halo de inhibicin con discos de 6mm es menor de 14mm.

Resultado: Negativo. El halo de inhibicin con discos de 6mm es menor de 14mm.
5.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619
Resultado: Positivo. El halo de inhibicin con discos de 6mm es mayor de 14 mm.
6. PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS:

Los Enterococcus spp carecen de las enzimas autolticas (autolisinas) que son las que actan con el
reactivo para acelerar la reaccin ltica natural. Por lo tanto, al agregarle el reactivo desoxicololato de
Sodio al 0.5% no se activa la autlisis.
6.4. Resultado:
Negativo: Se observa turbidez en el tubo.

Resultado: Negativo. Se observa turbidez en el tubo.
Resultado: Positivo. El tubo se observa transparente.
Pruebas para diferenciar Enterococcus spp del Streptococcus grupo viridans (Ver diagrama de flujo
despus de la prueba de arabinosa).

7. PRUEBA DE BILIS ESCULINA:

7.1. Fundamento de la Prueba: ver captulo 17.
Los Enterococcus spp son tolerantes a las altas concentraciones de bilis, por lo tanto hidrolizan la
esculina presente en el disco.
7.4. Resultado:
Positiva: Se observa ennegrecimiento del disco.

Resultado: Positiva. Se observa ennegrecimiento del disco.
7.5.2. Streptococcus grupo viridans INS 003
Resultado: Negativa: Se observa el disco color amarillo.
8. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL:

La prueba de tolerancia a la sal en concentraciones de 6.5% de NaCl diferencia las especies de
Enterococcus spp de los Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).

Los Enterococccus spp son halo tolerantes a concentraciones de cloruro de sodio al al 6.5%.
8.4. Resultado:
Positivo: Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.

Resultado: Positivo.Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.
Resultado: Negativo. No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.
9. PRUEBA DE PYR (DETERMINACIN DE LA ENZIMA PIRROLIDONIL ARILAMIDASA):



Los Enterococcus spp poseen la enzima pirrolidonilopeptidasa, por lo tanto hidroliza el sustrato y libera
la b-naftilamida.
9.4. Resultado:
Positivo: Desarrollo de un color rojo cereza oscuro

Resultado: Positivo. Desarrollo de un color rojo cereza oscuro
Resultado: Negativo. Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).
10.SEROLOGA:
10.1. Fundamento de la Prueba: ver captulo 10.1.
10.2. Fundamentos inmunolgicos de la prueba: ver captulo 10.1
10.3. Procedimiento:
Ver descripcin del mtodo como se describe en el captulo de Streptococcus hemolticos numerales
7.3.1.1 al 7.3.1.8 y 7.3.2.1 al 7.3.2.8
10.4. Fundamentos inmunolgicos de la bacteria:

A diferencia de los dems estreptococos cuyos antgenos estn constituidos por polisacridos (en base
a un carbohidrato especfico), el Grupo D es la nica excepcin pues su antgeno est constituido por
cido glicerolteicico.
10.5. Resultado:
Positivo: Se observa aglutinacin.
DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DE ENTEROCOCCUS SPP.
11.FERMENTACIN DE ARABINOSA:
Las cepas de Enterococcus faecium fermentan la arabinosa. Las cepas de Enterococcus faecalis no la
fermentan.

11.4. Resultado:
Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecium).
Negativo. No hay viraje del color, se observa violeta (Enterococcus faecalis).

Resultado: Negativa. No hay viraje de color. El medio se observa de color violeta.
Resultado: Positiva. Hay viraje de color del violeta al amarillo.
12.FERMENTACIN DE SORBITOL:

12.2. 12.2 Procedimiento: ver captulo 17.
Las cepas de Enterococcus faecalis fermentan el sorbitol. Las cepas de Enterococcus faecium no lo
fermentan.
12.4. Resultado:
Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo (Enterococcus faecalis).
Negativo. No hay viraje del color, el medio se observa violeta (Enterococcus faecium).

Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo.

FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIN DE

STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS
ASC
Alfa hemolticas
Gram: Cocos Gram + en cadenas
Catalasa: negativa
OPTOQUINA
Discos 6 mm: 14mm
Discos 10 mm: 16mm
RESULTADO
POSITIVO
DUDOSO
S. pneumoniae SOLUBILIDAD EN BILIS

(Desoxicolato de Na al 10%)
NEGATIVA POSITIVA
BILIS ESCULINA BILIS ESCULINA +

CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl PYR: S. pneumoniae
PYR CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl:
POSITIVO NEGATIVO Streptococcus bovis
Enterococcus spp Streptococcus grupo

viridans
Arabinosa + Arabinosa
Sorbitol Sorbitol +
Enterococcus faecium Enterococcus faecalis

TABLA DE DIFERENCIACIN DE LAS ESPECIES DE Enterococcus spp
Pruebas Enterococcus faecalis Enterococcus faecium
Frecuencia en humanos 90% 5-10%

Hemlisis* alfa alfa
Desarrollo NaCl 6.5% + +
Bilis esculina + +
PYR + +
Sorbitol +
Arabinosa +
+ : >90% son positivos

: <10% son positivos
* : Se observa hemlisis alfa al realizar estra profunda en Agar Tripticasa Soya con sangre de carnero
al 5%
INFORME DE RESULTADO:
Negativo: No hubo crecimiento bacteriano.
Positivo: Gnero y especie con su respectivo antibiograma
VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Facklam R R, Sahm DF and Martins L., Enterococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R.
Murray Editor in chief. Chap 18, 7th ed. 1999, ASM, Washington.
2. Reyes Cerros J. y Lpez Cruz S.R, Normas Tcnicas de Piel, Heridas y Abscesos en Normas Tcnicas
de Bacteriologa, Cap. X. 3. ed., 1996, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnstico y
Referencia CNDR. Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur,
Managua, Nicaragua.
3. Meja Sandino M J. Exudado Farngeo II en Manual de Bacteriologa Mdica 3 ed. 2001, Ministerio
de Salud. Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de
Laboratorios Post Huracn MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua.
4. Los cocos grampositivos Parte II en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, Captulo
12, 5 ed., 1996. Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
5. Estreptococos en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks Editor,
Cap. 15, 16 ed. (de la 21 edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico D.F.

CAPTULO 7.
del lquido cefalorraqudeo
Las muestras de lquido cefaloraqudeo (LCR) deben ser tomadas nicamente por el mdico, antes de la
administracin de antimicrobianos.

El lquido cefalorraqudeo (LCR) debe ser transportado al laboratorio INMEDIATAMENTE, bajo
condiciones de temperatura ambiente. Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis son muy
susceptibles a las temperaturas extremasy a la desecacin, por lo tanto las muestras clnicas deben ser
enviadas al laboratorio sin refrigerar.
Cuando el LCR no puede se transportado inmediatamente al laboratorio, la muestra debe ser inoculada
en Agar Sangre de Carnero (ASC). En cuanto a las condiciones de incubacin bajo estas circunstancias,
es ms importante colocar los platos inoculados en un ambiente de CO 2 que tratar de conseguir
temperaturas de incubacin entre 35 o - 37oC. Bajo esas condiciones, los meningococos se mantienen
vivos por encima de las 5 horas, sin que su viabilidad se vea seriamente afectada.
Si las muestras deben ser transportadas a travs de largas distancias, el medio inoculado (ASC) debe ser
previamente incubado durante 18-24 horas. Bajo esas condiciones el transporte no debe durar ms de
48 horas.
III. PROCESAMIENTO DEL LQUIDO CEFALORAQUDEO:

En adultos deben colectarse de 5-10mL de LCR en dos tubos estriles 13 x 100mm con tapn de rosca.
En nios, la cantidad colectada debe ser de 2-3 mL.
El transporte de la muestra debe realizarse inmediatamente y su procesamiento debe tener mxima
prioridad sobre cualquier otro tipo de anlisis. Las muestras deben ser transportadas a temperatura
ambiente, porque Haemophilus influenzae y N. meningitidis, suelen ser muy susceptibles a temperaturas
extremas y desecacin.
Tubo No. 1: Realizar qumica del LCR: Glucosa, protenas y recuento total de leucocitos.
Tubo No. 2: La muestra debe centrifugarse a 2000 g x 15 minutos. Remover el sobrenadante utilizando
una pipeta de Pasteur con un bulbo de hule (nunca succione con la boca) y transferir a otro tubo para
pruebas serolgicas adicionales (en caso que se disponga de ellas). Si hay seguridad que estas no se
realizarn, descartar el tubo en un contenedor conteniendo cloro para posterior eliminacin por medio
Captulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del lquido cefalorraqudeo 89

de autoclave. Del sedimento debe realizarse un frotis y teirlo por el mtodo de Gram para determinar
el recuento diferencial de leucocitos y la presencia de bacterias, de la siguiente manera:
Utilizando un aza redonda, extienda una gota del sedimento sobre la superficie de una lmina
portaobjetos nueva. El grosor debe ser tal que se pueda ver o leer a travs de ella. Tome en cuenta que
cuando la extensin tiene un dimetro muy corto, los leucocitos polimorfonucleares suelen observarse
muy compactados y la visibilidad de los diplococos intracelulares se dificulta.
1. Deje secar.
2. Fije al calor.
3. Coloree con Gram:
4. 30 segundos con cristal violeta
5. 30 segundos con lugol
6. Decolore con alcohol acetona o alcohol 70 o
7. Un minuto con safranina
8. Observe al microscopio con un objetivo de inmersin (100x) y reporte la tincin y morfologa bacteriana.
Luego, con el resto del sedimento realice la siembra de la siguiente manera:

Ponga unas gotas en Agar Chocolate enriquecido con factores (ACh) y Agar Sangre de Carnero (ASC).
Deje secar un poco y estre por agotamiento.
Incbelo a 35-37 oC, con ambiente de humead y CO 2 durante 18-24 horas.
El ambiente hmedo puede lograrse de varias maneras:

Si se trata de un incubador de CO 2 colocando un recipiente con agua en la bandeja inferior.
Si es una jarra de vidrio para usar el mtodo de la vela, colocando en el fondo de la jarra, toallas de
papel ligeramente empapadas de agua. Estas toallas deben ser reemplazadas al mnimo semanalmente
para evitar la contaminacin, sobre todo con hongos.
Si se trata del mtodo de una bolsa de plstico con cierre tipo zipper, en las cuales se utilizan tabletas
generadoras de CO2, se consigue poniendo unas pocas gotas de solucin salina estril en la superficie
del medio de cultivo.
90 Captulo 7: Procedimientos para bacterias aisladas del lquido cefalorraqudeo

DIAGRAMA DE FLUJO PARA CULTIVO DE LCR
LCR
TOMADO POR MDICO
NIOS: 2-3 mL
ADULTOS: 5-10 ML
CENTRIFUGACIN
GLUCOSA, PROTEINAS
2000 g x 15 MINUTOS
SEDIMENTO
GRAM: CULTIVO:
BACTERIAS ACh
% PMNs ASC
H. influenzae b S. pneumoniae
Enterobacterias y
N. meningitidis No Fermentadores
Grampositivos
Sensibilidad
Kirby y Bauer
ENVIAR AL
CNDR

Dos tubos estriles 13 x 100 mm con tapn de rosca.
2. TRANSPORTE:
Un contenedor irrompible para el traslado de las muestras.
3. PROCESAMIENTO:
3.1. Equipo:
3.1.1 Centrfuga que alcance 2000 g
3.1.2 Incubadora de CO2
3.1.3 Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x
3.1.5 Reloj de mesa
3.2. Materiales y Reactivos

3.2.1 Guantes descartables no estriles.
3.2.2 Lminas portaobjetos.
3.2.3 Asas bacteriolgicas con punta redonda y recta.
3.2.4 Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables.
3.2.5 Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2).
3.2.6 Colorantes para tincin de Gram: cristal violeta, lugol, alcohol acetona (1:1) o alcohol 70 o,
fucsina acuosa o safranina.
3.2.7 Marcadores indelebles.

3.1.1 Agar Chocolate (suplementado).
3.1.2 Agar Sangre de Carnero.

de Haemophilus influenzae
I. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a pruebas de identificacin.

Est constituido por bacilos o cocobacilos gramnegativos, generalmente menores de 1 m de ancho y de
longitud variable; a veces forman filamentos largos con marcado pleomorfismo. Son inmviles, no
esporulados, aerobios y anaerobios facultativos. Se desarrollan a una temperatura ptima de 35-37oC
en atmsfera con CO 2 al 5%.
Son organismos quimiorganotrficos exigentes: requieren del factor X (hemina), que es un pigmento
que contiene hierro y suministra los compuestos tetrapirrlicos necesarios para la sntesis de cito-
cromos y enzimas y del factor V (NAD), que es una coenzima que participa en las reacciones de
xido reduccin del metabolismo, esta coenzima es termolbil y normalmente es producida por varias
especies bacterianas, levaduras, tejidos animales y vegetales. Hay otros factores nutricionales que
estimulan el crecimiento del Haemophilus, tales como el cido pantotico, la tiamina, el uracilo, la purina
y la cistena.
Haemophilus influenzae est clasificado en 8 biotipos cuya caracterizacin tiene utilidad epidemiol-
gica, ya que se ha demostrado que el biotipo de una cepa est relacionado con la fuente de aislamiento.
La cpsula de Haemophilus influenzae juega un papel importante en la virulencia. De acuerdo a los an-
tgenos que la constituyen existen 6 grupos o serotipos, denominndolos con las letras a, b, c, d, e y f.
Estos antgenos son de naturaleza polisacrida y son serolgicamente especficos; algunos aislamientos
no poseen cpsulas, por lo que no pueden serotipificarse y se les denomina no tipificables (NT).
La cpsula de H. influenzae serotipo b est constituida por el polisacrido polirribosil-ribitol-fosfato
(PRP), el cual se ha considerado como un elemento importante en la patogenicidad de la bacteria.
H. influenzae serotipo b es el que ms frecuentemente se asocia a meningitis, especialmente en nios
menores de 5 aos de edad. Sin embargo, los serotipos a, e y f, tambin pueden producir meningitis.
En todos los aislamientos de H. influenzae debe determinarse el serotipo. Adicionalmente, debido a la
frecuencia de cepas resistentes a los antibiticos betalactmicos, hay que determinar la sensibilidad del
aislamiento y la produccin de beta lactamasa. Todo estos datos deben ser informados al mdico que est
a cargo del tratamiento y control del caso para que pueda establecer la mejor conducta teraputica.
Estos mismos datos deben tenerse disponibles para poder analizar la prevalencia de los aislamientos que
circulan en una poblacin, con fines epidemiolgicos.

III. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipo:
1.1.4 Reloj de mesa

1.2.1 Guantes descartables no estriles
1.2.3 Asas bacteriolgicas con punta redonda y recta
1.2.4 Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables
1.2.5 Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2)
1.2.7 Lmpara de Wood
1.2.9 Lugol
1.2.10 Alcohol al 70% o alcohol acetona (1:1)
1.2.11 Fucsina acuosa o safranina
1.2.12 Dihidrocloruro de Tetrametilparafenilendiamina al 1%
1.2.13 Perxido de Hidrgeno al 30%
1.2.14 Factores X y V
1.2.15 Tripticasa Soya Agar
1.2.16 cido delta aminolevulnico
1.2.17 Na2HPO4
1.2.18 KH2PO4
1.2.19 Aceite mineral inerte estril
1.2.20 Suero para aglutinacin de H. influenzae tipo b
1.2.21 ONPG
1.2.22 Caldo Prpura de bromocresol enriquecido, que contenga una concentracin al 1% de los
diferentes carbohidratos
1.2.23 Tiras de acetato de Plomo
1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR.


1.4.1 Observar Morfologa macroscpica y condiciones de cultivo
1.4.2 Coloracin de Gram de la colonia
1.4.3 Prueba de la oxidasa
1.4.4 Prueba de la catalasa
1.4.5 Satelitismo a colonias de Stphylococcus aureus
1.4.6 Determinacin del requerimiento de factores X y V
1.4.7 Prueba de sntesis de porfirinas
1.4.8 Serotipificacin. (Aglutinacin en lmina).
1.4.9 Diferenciacin de especies de Haemophilus dependientes de NAD y/o de hemina.
1.4.10 Hemlisis
1.4.11 Fermentacin de carbohidratos
1.4.12 Prueba de ONPG
1.4.13 Produccin de H2S
1.4.14 Dependencia de CO2

1.5.3. Haemophilus influenzae ATCC 10211
1.5.4. Haemophilus influenzae ATCC 49247
1.5.5. Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901
1.5.6. Haemophilus haemolyticus INS 001
1.5.7. Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146
1.5.7. Haemophilus aphrophilus INS 002
1.6 Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ver captulo 16.
1.7 Antimicrobianos a utilizar para la Concentracin Mnima Inhibitoria:

Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados).
1.7.1. Ampicilina
1.7.2. Cloranfenicol.
1.8 Pruebas Especiales:

1.8.1. Betalactamasa
1.8.2. Cloranfenicol acetil transferasa (CAT)

2. CARACTERSTICAS DE LAS UFC EN AGAR CHOCOLATE:

Colonias pequeas, redondas, convexas, con iridiscencia, que miden aproximadamente 1-1.5 mm de
dimetro.
3. COLORACIN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A PARTIR

DEL AGAR CHOCOLATE:
3.1. Procedimiento para la preparacin del frotis:

Utilizando un asa recta, tome del Agar Chocolate una UFC y emulsinela en una gota de solucion salina
estril sobre un portaobjetos limpio, dispersndola en una area de 1x1cm. El grosor de la muestra debe
ser tal que se debe leer a travs de ella. Deje secar a temperatura ambiente y luego flamee rpidamente
en el mechero para fijar.
3.2. Procedimiento para la tincin del frotis: ver captulo 17.
3.3. Resultado:
Cocobacilos gramnegativos pleomrficos.

3.4.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211
Resultado: Cocobacilos gramnegaivos pleomrficos.
Resultado: Cocos grampositivos en racimos.
NOTA: La coloracin de Gram a partir de cultivos de ms de 48 horas es difcil de interpretar.
Haemophilus influenzae posee la enzima citocromo oxidasa. Por lo tanto da reaccin positiva, que se
caracteriza por la aparicin de un color prpura en la tira reactiva.
4.4. Resultado:
Oxidasa positiva: se observa un color prpura en la tira reactiva.
NOTA: Para Haemophilus influenzae siempre utilice el sustrato Dihidrocloruro Tetrametil-para-
fenilendiamina al 1%.


4.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211.
Resultado: Oxidasa positiva: Se observa un color prpura en la tira reactiva.
Resultado: Oxidasa negativa: Se observa un color amarillo plido en la tira reactiva.
Haemophilus influenzae posee la enzima catalasa, por lo tanto da reaccin positiva, que se caracteriza
por la formacin inmediata y moderada de burbujas.
5.4. Resultado:
Prueba de catalasa positiva: produccin inmediata y moderada de burbujas.

5.5.1 Staphylococcus aureus. ATCC 25923
Resultado: Catalasa positiva: produccin inmediata e intensa de burbujas.
5.5.2 Haemophilus paraphrophilus ATCC 49146.
Resultado: Catalasa netativa: no hay produccin de burbujas.
6. PRUEBA PRESUNTIVA DE SATELITISMO (Para gnero):

Esta prueba se ha dejado de utilizar para la identificacin de las especies de Haemophilus, debido a
que tambien es positiva para otros microorganismos como Pastereulla, Corynebacterium y Actinobaillus.
7. PRUEBA DE REQUERIMIENTO DE FACTORES X y V:

Existen nutrimentos esenciales para algunas de las especies de Haemophilus, conocidos como factores
X (hemina) y V (nicotinamida adenina dinucletido). Estos factores son agregados a algunos medios para
estimular su crecimiento o si la bacteria ya ha sido aislada, pueden utilizarse para determinar la especie
en relacin a su utilizacin para el crecimiento.
El mtodo mas habitual para determinar estos requisitos de desarrollo es el que emplea tiras o discos de
papel filtro impregnadas de factor X y V. Estos factores deben colocarse en un medio que no los contenga.


Haemophilus influenzae requiere de los factores X (hemina) y V (NAD) para su desarrollo, por lo tanto
se va a observar crecimiento entre las dos tiras o discos.
7.3. Procedimiento:
7.3.1 A partir de un aislamiento puro obtenido en Agar Chocolate, realice una siembra masiva en un
plato con Agar Tripticasa Soya (sercirese que no contenga levadura). Evite el contacto del asa
con el agar chocolate, para no arrastrar los factores contenidos en el medio.
7.3.2 Coloque los discos o tiras X y V sobre la superficie del agar en el rea de inoculacin, a una
distancia de 1 cm entre ellos.
7.3.3 Incube el plato a 35 oC en ambiente con CO 2 al 5% durante 18 a 24 horas.
7.4. Resultado
Prueba de requerimiento de factores positiva: se observa crecimiento entre las dos tiras o discos.

7.5.1 Haemophilus influenzae ATCC 10211.
Resultado: Se observa crecimiento entre las dos tiras o discos.
Resultado: Se observa crecimiento solo alrededor del factor V.
8. PRUEBA DE SNTESIS DE PORFIRINAS:

8.1. Fundamentos de la prueba:
8.2. Procedimiento:
8.2.1 Resuspenda una asada del microorganismo en 0.5 mL del substrato enzimtico. Espere 10
minutos.
8.2.2 Incube la mezcla a 35 oC y lea a las 18 horas.
8.2.3 Adicione dos gotas de reactivo de Kovac, agite la mezcla enrgicamente.
8.2.4 Examine el tubo con la lmpara de Wood y observe si hay presencia de fluorescencia roja.

8.4.1 Sntesis de Porfirina: Haemophilus influenzae no posee las enzimas que intervienen en la sntesis
de las protoporfirinas a partir del cido delta-minolevulnico, en consecuencia no habr
deteccin de porfirinas.
8.4. Resultado:
Tras agregar el reactivo de Kovac, la aparicin de un color rojo indica la presencia de porfobilingeno.
En el caso de H. influenzae no se observa ningn viraje de color. Al utilizar la lmpara de Wood, no
se observa fluorescencia rojo naranja.

8.5. Control de Calidad para la Prueba de Porfirinas:

Resultado: Requiere factores X y V no hay viraje de color. No hay fluorescencia rojo naranja al observar
con la lmpara de Wood.
Resultado: No requiere factor X de forma exgena. Hay fluorescencia rojo naranja al observar con la
lmpara de Wood.
TABLA No. 1
DIFERENCIACIN BIOQUMICA Y BIOTIPIFICACION DE
Haemophilus influenzae
Biotipo Indol Urea Ornitina Porfirinas Glucosa Sacarosa Lactosa Xilosa

I + + + + +
II + + + +
III + + +*
IV + + + +
V + + + +
VI + + +
VII + + +
VIII + +
Haemophilus parainfluenzae
I + + + +
II + + + + +
III + + + +
IV + + + + + +
V No es claro si este biotipo existe.
Aislamientos negativos para indol, urea y ornitina pueden ser H. segnis
VI + + + + +
VII + + + + +
VIII + + + +
*H. aegyptius es similar a H. influenzae Biotipo III pero no fermenta la xilosa.
Se pueden diferenciar por el estudio de las protenas de la membrana externa.
9. SEROTIPIFICACION :
La presencia de antgenos especficos en la cpsula o pared celular es utilizada como base para la
caracterizacin serolgica de algunos gneros y especies bacterianas. En algunos casos el antgeno est
ubicado en el LPS de la pared y estn conformados por carbohidratos. Pequeas variaciones de los
azcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. En algunos casos el antgeno
est ubicado en la cpsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antgeno es altamente especfica,
es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos o tipos.

9.2. Fundamentos antignicos de la bacteria:

La cpsula de Haemophilus influenzae juega un papel importante en la virulencia. De acuerdo a los
antgenos que la constituyen existen 6 grupos o serotipos, denominndolos con las letras a, b, c, d, e
y f. Estos antgenos son de naturaleza polisacrida y son serolgicamente especficos. El serotipo mas
comnmente aislado en casos de enfermedad invasiva es el b. Algunos aislamientos no poseen cpsulas,
por lo que no pueden serotipificarse y se les denomina no tipificables (NT). Estos ltimos suelen
pertenecer a la microbiota normal.
9.3. Procedimiento:
9.3.1 Con la bacteria a identificar haga una suspensin densa (tubo No. 3 de la escala de McFarland)
en solucin salina al 0.85%.
9.3.2 Coloque una gota sobre una lmina de aglutinacin o un portaobjetos y agregue una gota de
antisuero polivalente de H. influenzae.
9.3.3 Agite con un palillo de madera y observe la formacin de grumos bacterianos en un lapso de
1 minuto.
9.3.4 Simultneamente, se debe trabajar con un control positivo y uno negativo.
9.3.5 Si la reaccin con el polivalente es positiva, contine con el monovalente anti-b y despus con
los otros antisueros (anti a,c,d,e,f).
NOTA: Recuerde que si se demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos positivos.
Un exceso en uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) puede dar un resultado falso
negativo.
9.4. Resultado:
Serologa positiva: se observa una reaccin fuerte en la cual todas las clulas estn aglutinadas.
Serologa negativa: no se observa reaccin, las clulas no estn aglutinadas.

Resultado: Se observa una reaccin fuerte en la cual todas las clulas estn aglutinadas.
Resultado: No se observa reaccin, las clulas no estn aglutinadas.
10.PRUEBA DE -HEMOLISIS EN AGAR SANGRE DE CONEJO O CABALLO AL 3%:

La produccin de la beta hemlisis se observa fcilmente en agar sangre de caballo o de conejo al 3%.
Los eritrocitos de conejo y de caballo no liberan la enzima DNAasa dentro del medio, como lo hacen los
eritrocitos de carnero y debido a esto permiten el crecimiento de la mayora de las especies de
Haemophilus.

10.2.1 Siembre por agotamiento, sobre el agar sangre de caballo al 3% el microorganismo que va a
estudiar, de tal manera que queden colonias aisladas.
10.2.2 Incube durante 18-24 horas a 35 oC en una atmsfera con CO 2 al 5%.

H. influenzae no produce hemolisinas. Para otras especies ver tabla No.2.
10.4. Resultado:
hemolisis negativa: no se observa zonas de beta-hemlisis alrededor de la colonia.
10.5. Control de Calidad para la Prueba de Hemlisis en Agar Sangre de Conejo o

de Caballo al 3%.
Resultado: No se observa zonas de hemlisis alrededor de la colonia.
10.5.2 Haemophilus haemolyticus INS 001
Resultado: Se observa zonas de hemlisis alrededor de la colonia.
11.PRUEBA DE FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS: GLUCOSA, SACAROSA,

LACTOSA, XILOSA, RIBOSA Y MANOSA:
Haemophilus influenzae tiene la capacidad de fermentar la glucosa y la ribosa. La xilosa es fermentada
solamente por el biotipo IV. La sacarosa, lactosa y manosa no son fermentados por ningn biotipo. Un
color amarillo indica una reaccin positiva.
11.4. Resultado
Prueba de carbohidratos positiva: se observa viraje de color del violeta al amarillo.
Prueba de carbohidratos negativa: no se observa viraje de color. El medio conserva su color violeta.

Resultado: Fermenta la glucosa y ribosa: vira de color del violeta al amarillo.
No fermenta la xilosa, sacarosa, lactosa ni manosa: no hay viraje de color. El caldo se observa de color
violeta.
11.5.2 Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901
Resultado: Fermenta la glucosa, sacarosa y manosa: vira de color del violeta al amarillo.

No fermenta la lactosa, xilosa y ribosa: el medio no vira de color. El caldo se observa de color violeta.
12.PRUEBA DE ONPG:

Haemophilus influenzae no posee la enzima -galactosidasa. Por lo tanto la prueba es negativa, no
habiendo viraje de color.
12.4. Resultado:
Prueba de ONPG negativa: no hay viraje de color. Se observa transparente.

Resultado: No hay viraje del color se observa transparente.
12.5.2 Haemophilus aphrophilus INS 002
Resultado: Se observa viraje al color amarillo.
13.PRUEBA DE PRODUCCIN DE H2S:

Los radicales sulfuros contenidos en algunos aminocidos producidos por la protelisis de las protenas
pueden ser rotos por las enzimas de ciertas especies de microorganismos, dando como resultado la
produccin de H2S que al reaccionar con el acetato de plomo produce sulfito de acetato, un precipitado
negro que puede ser detectado por el desarrollo de un color caf oscuro sobre la tira reactiva. El
propsito de esta prueba es diferenciar H. influenzae de otras especies. Ver tabla No. 2.
13.2.1 De un cultivo de 24 horas inocule un plato de agar chocolate y distribuya el microorganismo en
tres direcciones, por toda la superficie del medio.
13.2.2 Coloque la tira reactiva, que contiene el acetato de plomo, sobre el inculo.
13.2.3 Incube a 35 oC por 24-48 horas.

Haemophilus influenzae no produce radicales sulfuro por lo tanto, no produce un precipitado negro (H2S)
al tener contacto con el acetato de plomo.
Nota: Ocasionalmente algunas cepas producen radicales sulfuro. Ver tabla No. 2.

13.4. Resultado:
13.4.1 Produccin de H2S positiva: se observa un oscurecimiento de la tira reactiva.
13.4.2 Produccin de H2S negativa: no se observa cambio de color en la tira reactiva.

Resultado: no se observa oscurecimiento en la tira reactiva.
13.5.2 Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901
Resultado: Se observa un oscurecimiento de la tira reactiva.
14.PRUEBA DE DEPENDENCIA DE CO2 :

Algunas especies bacterianas no pueden crecer en ausencia de bajas concentraciones (5-10%) de CO2.
Esta caracterstica se utiliza para su identificacin y diferenciacin entre especies del mismo gnero.
14.2.1. Prepare una suspensin del microorganismo en solucin salina al 0.85% con una turbidez
similar al tubo 0.5 de la escala de McFarland.
14.2.1. Inocule dos platos de Agar Chocolate con 1L de la suspensin.
14.2.1. Incube una en una atmsfera con CO 2 al 5% y la otra en aerobiosis, las dos con ambiente
hmedo.

Haemophilus ifluenzae no es dependiente de CO 2 pero su crecimiento es realzado por ste. Algunas
especies del gnero son dependientes (ver tabla No. 2) lo cual permite diferenciarlas. Debido a que la
humedad juega un papel importante es necesario que los platos con el agar sean incubadas en presencia
de sta.
14.4. Resultado:
Dependencia de CO 2 negativa: H. influenzae crece tanto en el plato de Agar
Chocolate incubado con ambiente de CO 2 al 5% como sin l.
NOTA: Esta lectura debe confirmarse por coloracin de Gram de la colonia, donde los microorganismos
cultivados en aerobiosis aparecern atpicos comparados con los del cultivo en atmsfera de 5% de CO2.

Resultado: Crece con y sin 5% de CO 2
Resultado: Se observa crecimiento solamente con CO 2

Tabla 2. Especies de Haemophilus dependientes de NAD y/o hemina
Especies de Haemophilus
PRUEBA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
NAD Dependiente + + + + + + +
Porfirinas + + + + W +
Indol V V V
Urea V + + V +
Ornitina V V V
Hemlisis + (v) +
CAMP
Glucosa cido + (+) + (v) + + W + + +
Glucosa gas V - (v) (v) + + V
Sacarosa + + W + +
Lactosa + +
Xilosa +* V V
Ribosa + (+) + + + /
Manosa + + + /
ONPG V * V + +
Oxidasa +** + + + + + + V
Catalasa + + + V +* V +
H2S ** + + + + +
CO2 dependientes + + +
V = variable ** = ocasionalmente W = reaccin dbil

* = Biotipo IV ( ) = reaccin tarda / = No hay datos
1. Haemophilus influenzae 6. Haemophilus parahemolyticus

(ver cuadro 2 biotipos) 7. Haemophilus segnis
2. Haemophilus aegyptius 8. Haemophilus paraphrophilus
3. Haemophilus haemolyticus 9. Haemophilus aphrophilus
4. Haemophilus ducreyi 10. Actinobacillus (Haemophilus)
5. Haemophilus parainfluenzae actynomycetemcomitans
INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES:

Positivo: Se aisl Haemophilus influenzae serotipo__.
Negativo: No se aisl Haemophilus influenzae.

DIAGRAMA DE FLUJO PARA LA IDENTIFICACIN DE

Haemophilus influenzae
Agar chocolate:
Colonias convexas redondas pequeas con iridiscencia
Gram: cocobacilo gramnegativo
Oxidasa: Positiva
Catalasa: Positiva
Requerimiento de factores
Porfirinas
X y V: (+)
Serologa Biotipo
Cloranfenicol Betalactamasa
acetil-transferasa
Susceptibilidad
Antimicrobiana

IV. BIBLIOGRAFA:
1. Manual de Haemophilus influenzae, Grupo de Microbiologa, Instituto Nacional de Salud, Colombia,
Organizacin Panamericana de la Salud OPS. Taller Sobre la Identificacin Bioqumica y Serolgica
de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, Managua, Nicaragua, marzo 2 al 6 de
1998.
2. Haemophilus, Bordetella y Brucella en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George
F. Brooks editor, Cap. 19, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), 1998, Editorial El Manual
Moderno S.A. de C.V. Mxico D.F.
3. Haemophilus en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 7, 5 edicin, 1996,
Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
4. Campos JM. Haemophilus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray ed in chief, chap 39,
ASM Press, 7th ed, Washington D.C., 1999.
5. Lpez Cruz SR. Normas Tcnicas para el Diagnstico de Meningitis Bacteriana en Normas Tcnicas
de Bacteriologa, captulo XIII. Sergio R. Lpez, Justo Reyes Cerros, Alcides Gonzlez Mairena, Rosibel
Centeno, 3 edicin, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia
CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua,
Nicaragua.
6. Lpez Cruz SR. En cooperacin con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedimientos
para el Diagnstico de Meningitis Bacteriana. Organizacin Panamericana de la Salud,
Organizacin Mundial de la Salud, Asociacin de Laboratorios de Salud Pblica, PHAO/WHO/
APHL, 2002.

de Streptococcus pneumoniae
I. ALCANCE:
Laboratorios de la red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a la identificacin.
CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.6 con respecto a la identificacin.

Streptococcus pneumoniae pertenece al gnero Streptococcus de la familia Streptococcaceae. El gnero
Streptococcus est conformado por cocos grampositivos, aneaerobios facultativos, catalasa negativa y
citocromo-oxidasa negativa. Los neumococos son bacterias grampositivas, encapsuladas, con morfologa
de diplococos lanceolados, con 0.5 a 1.25 m de dimetro, agrupados en pares o en cadenas cortas
(divisin en un plano), inmviles, no formadores de esporas; tpicamente crecen de modo difuso en caldo
con suero y requieren medios complejos para su desarrollo.
El cultivo en agar sangre bovina presenta colonias lisas, pequeas, brillantes circundadas por halo verde
de alfahemlisis. Son anaerobios facultativos y algunos aislamientos clnicos son exigentes en CO2. El
neumococo pierde su viabilidad a 60oC por 30 minutos, se lisa fcilmente, es soluble en bilis y sensible
a la optoquina. Las colonias de S. pneumoniae en medio de cultivo slido, exhiben una zona de
depresin central causada por una autolisis parcial. Con el envejecimiento del cultivo, ocurre una rpida
perdida de viabilidad de estas bacterias cuando crecen en ausencia de catalasa y peroxidasa, debido
a la acumulacin de perxido de hidrgeno.
La pared celular consiste de un esqueleto de pptido-glucano, tpico de las bacterias grampositivas. En
este esqueleto se anclan el polisacrido capsular, el polisacrido C de la pared celular y las protenas.
Polisacrido capsular:
El polisacrido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el
sistema de la clasificacin en serotipos se basa en su diversidad antignetica. Es el responsable de la
diferenciacin de sta nica especie en 90 serotipos.
El PS fue descrito como el primer antgeno, no proteico, inductor de anticuerpos en humanos. La cpsula
se sintetiza rpida y extensivamente durante la fase logartmica del crecimiento bacteriano. En casos de
enfermedad neumoccica, el antgeno PS puede ser detectado en el suero y orina de los pacientes
afectados.
La cpsula consiste en polmeros de alto peso molecular conformados por unidades repetitivas de
oligosacridos, ligados por enlaces covalentes a la pared celular. El polisacrido se denomina substancia

soluble especfica (soluble specific substance, SSS). La cpsula es considerada el principal factor de
virulencia de esta bacteria, debido a su resistencia a la fagocitosis.
Polisacrido de la Pared Celular:

El polisacrido de la pared bacteriana, denominado tambin polisacrido C (C'PS) es un complejo de
cido teicoico, principal componente de la pared celular del neumococo. Est ligado covalentemente al
pptidoglucano a travs de residuos de cido murmico. La cantidad de ste antgeno vara de cepa a
cepa, pero es igual en casi todos los tipos de neumococo (antgeno comn).
Antgeno De Forssman:
Est formado de cido lipoteicico y cido teicico, similar al polisacrido C de la pared celular y est
ligado covalentemente a lpidos. El antgeno de Forssman (F) se encuentra uniformemente distribuido en
la membrana plasmtica y tambin est localizado en las molculas de LPS expuestas en la superficie. Las
partes lipdicas de este antgeno estn ancladas en la doble capa de lpidos de la membrana plasmtica
del neumococo.
La presencia de este antgeno inhibe fuertemente a la autolisina neumoccica y tambin regula la
actividad de la enzima murena hidrolasa, que tiene actividad en la lisis bacteriana. Todos los
neumococos son susceptibles a la lsis, durante la fase estacionaria del crecimiento y es durante esta fase
que el antgeno regulador resulta en la degradacin de la pared celular bacteriana. Los estudios de
inmunizacin de ratones con el antgeno de Forssman no han demostrado proteccin contra la infeccin
neumoccica.
La principal enzima autoltica es la N-acetil-murmico-alanina-amidasa (autolisina), la cual rompe la
unin entre el cido murmico y la alanina del mucopptido de la pared celular, durante la fase
estacionaria del crecimiento de la bacteria. La lsis del neumococo por sales biliares ocurre a travs de
la activacin de sta enzima.
III. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.4 Reloj de mesa

1.2.1 Guantes descartables no estriles
1.2.2 Hisopos estriles
1.2.4 Asas bacteriolgicas con punta redonda y recta
1.2.5 Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales no reusables

1.2.6 Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2)
1.2.8 Tubos 12 x 75
1.2.10 Lugol
1.2.11 Alcohol al 70 o o alcohol acetona (1:1)
1.2.12 Fucsina acuosa o safranina.
1.2.13 Solucin salina 0.85%
1.2.14 Discos de otoquina (hidrocloruro de etilhidrocuprena)
1.2.15 Desoxicolato de sodio al 10%.
1.2.16 Sueros para tipificar.
1.2.17 Azul de metileno acuoso al 1%
1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR.

1.4.1 Observar alfa hemolisis y morfologa macroscpica.
1.4.2 Gram
1.4.3 Catalasa
1.4.4 Susceptibilidad a la optoquina.
1.4.5 Solubilidad en bilis.
1.4.6 Serotipificacin.


1.6. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: ver captulo 16.

Antimicrobianos en polvo (de preferencia altamente purificados):
1.7.1. Penicilina
1.7.2. Ceftriaxona
2. CARACTERSTICAS DE LAS UFCS EN ASC:

El cultivo en agar sangre de carnero presenta colonias lisas, pequeas, redondas, brillantes, al prin-
cipio cupuliformes, que desarrollan ms tarde una meseta central con bordes elevados, circundadas
por un halo verde de alfahemlisis.

3. COLORACIN DE GRAM DE UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS A

PARTIR DEL AGAR SANGRE.
Permite observar la tincin, agrupacin y morfologa, microscpica caracterstica.

3.2. Procedimiento para la tincin de Gram: ver captulo 3.
3.3. Resultado:
Diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas.
3.4. Control de Calidad para la prueba de Gram

Resultado: Se observa diplococos lanceolados grampositivos formando cadenas cortas.
Resultado: Se observa bacilos cortos gramnegativos.
Streptococcus pneumoniae no posee la enzima catalasa, por lo tanto la prueba es negativa y no se
formarn burbujas.
4.4. Resultado:
Catalasa negativa: no se observa produccin de burbujas.

4.5.1. Staphylococcus aureus. ATCC 25923
5. PRUEBA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA:



Streptococcus pneumoniae es susceptible a optoquina en bajas concentraciones.
5.4. Resultado:
Optoquina positiva: zonas de inhibicin mayores o iguales a 14mm son interpretadas como susceptibles.
Optoquina negativa: zonas de inhibicin menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.

Resultado: Zonas de inhibicin mayores o iguales a 14 mm son interpretadas como susceptibles.
Resultado: Zonas de inhibicin menores de 14mm son interpretados como no susceptibles.

Streptococcu pneumoniae produce enzimas autolticas que son las responsables de la caracterstica
umbilicada de la colonia en cultivos viejos. La principal enzima autoltica es la N-acetil-murmico-
alanina amidasa (autolisina), la cual rompe la unin entre el cido murmico y la alanina del
mucopptido de la pared celular, durante la fase estacionaria del crecimiento. La lisis del neumococo por
sales biliares ocurre a travs de la activacin de sta enzima. La adicin de la solucin de sales de bilis
a la suspensin de Streptococcus pneumoniae, acelera el proceso de lisis, proceso asociado con la
disminucin de la tensin superficial entre el medio y la membrana celular bacteriana.
6.4. Resultado:
Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo. Compare con el control
positivo. El control negativo deber permanecer turbio.
6.5. Control de calidad para la prueba de solubilidad en Bilis:

Resultado: Solubilidad en bilis positiva: se observa claridad o transparencia en el tubo.
Resultado: Solubilidad en bilis negativa: se observa turbidez en el tubo

7. SEROLOGA:
azcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. En algunos casos el antgeno
7.2. Procedimiento:
7.2.1. Rotule un tubo de 12 x 75 mm con el nmero del aislamiento y coloque 0.5 mL de solucin
salina estril.
7.2.2. Con un hisopo estril, tome de 3 a 5 colonias aisladas y realice una emulsin en el tubo con
solucin salina. La suspensin debe tener una apariencia ligeramente turbia, es decir, debe ser
menor que el estndar 0.5 de la escala de MacFarland .
7.2.3. Marque una lmina portaobjetos con el nmero del aislamiento.
7.2.4. Tome el hisopo hmedo y frtelo firmemente contra la lmina portaobjetos.
7.2.5. Realice dos extendidos de forma circular a cada extremo de la lmina (el dimetro del extendido
debe ser de aproximadamente 1 cm).
7.2.6. Deje secar los extendidos al aire. No los fije.
7.2.7. Con un asa pequea estril remueva y tome una asada del antisuero, colquela sobre el
extendido y mezcle bien.
7.2.8. Con una asa pequea estril tome una gota de solucin acuosa de azul de metileno al 1%, y
colquela sobre el antisuero en la lmina portaobjetos.
7.2.9. Coloque un cubreobjetos y presione suavemente para permitir que el colorante se extienda.
7.2.10. Coloque una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos.
7.2.11. Examine con el objetivo de 100x .
NOTA: El orden en el cual los antisueros son probados se basa en la frecuencia con que aparecen los
diferentes serotipos de Streptococcus pneumoniae.

La pared celular consiste de un esqueleto de pptido-glucano, tpico de las bacterias grampositivas. En
este esqueleto se anclan el polisacrido capsular, el polisacrido C de la pared celular y las protenas.
El polisacrido capsular (PS) es un determinante esencial para la antigenicidad del neumococo y todo el
sistema de la clasificacin en serotipos se basa en su diversidad antignica. Es la responsable de la
diferenciacin de sta nica especie en 90 serotipos.
La determinacin del serotipo es fundamental para estudios epidemiolgicos que permiten contribuir a los
esfuerzos por lograr una vacuna polivalente nica que cubra el continente americano.

7.4. Resultado:
Positiva: se observa hinchazn de la cpsula (reaccin de qellung) y aglutinacin de las clulas.
Negativa: no se observa hinchazn de la cpsula, ni aglutinacin de las clulas.
7.5. Control de calidad de la prueba de Serologa:

Resultado: Se observa hinchazn de la cpsula y aglutinacin de las clulas.
Resultado: No se observa hinchazn de la cpsula, ni aglutinacin de las clulas.

Positivo: Se aisl Streptococcus pneumoniae.
Negativo: No se aisl Streptococcus pneumoniae.
Nota: Todos los neumococos aislados de casos invasivos (LCR, hemocultivo, derrame pleural) deben
ser enviados al CNDR para confirmacin bioqumica, pruebas especiales de sensibilidad y determi-
nacin del serotipo.

Streptococcus pneumoniae
Agar Sangre de Carnero:

Colonias pequeas grisceas, mucoides, alfa hemolticas
Frotis: diplococos lanceolaos

grampositivos
Catalasa: Negativa Optoquina: Positiva
Solubilidad en Bilis: Positiva Serologa
Susceptibilidad antimicrobiana

IV. BIBLIOGRAFA:
1. Manual de Streptococcus pneumoniae, Grupo de Microbiologa, Instituto Nacional de Salud,
Colombia, Organizacin Panamericana de la Salud, OPS. Taller Sobre la Identificacin Bioqumica
y Serolgica de Haemophilus influenzae y Streptococcus pneumoniae, Managua, Nicaragua,
marzo 2 al 6 de 1998.
2. Estreptococos en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor,

cap. 15, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), 1998, editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico D.F.
3. Los Cocos Grampositivos en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, Cap.12,

5 edicin, 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
de Bacteriologa, captulo XIII. Sergio R. Lpez, Justo Reyes Cerros, Alcides Gonzlez Mairena,
Rosibel Centeno, 3 edicin, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y
Referencia CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur,
Managua, Nicaragua.
5. Lpez Cruz SR. En cooperacin con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedi-
mientos para el Diagnstico de Meningitis Bacteriana. Organizacin Panamericana de la Salud,
Organizacin Mundial de la Salud, Asociacin de Laboratorios de Salud Pblica, PHAO/WHO/
APHL, 2002.

de Neisseria meningitidis
I. ALCANCE:
Laboratorios de la red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.4 con respecto a la identificacin.

Neisseria meningitidis son diplococos gramnegativos cuya apariencia es similar a riones o granos de
caf, con los lados adyacentes planos o cncavos. Miden de 0,6 a 1,5 m, en dependiencia del medio
de cultivo y el tiempo de incubacin. Son inmviles, no esporulados, aerobios y se desarrollan
ptimamente a temperaturas entre 35 a 37 oC. Su crecimiento se realza cuando se incuba bajo una
atmsfera con CO 2 y humedad. N. meningitidis es oxidasa y catalasa positiva.
Suelen producir cido de algunos carbohidratos por la va de oxidacin, no por va de la fermentacin.
III. IDENTIFICACIN:

1.1. Equipos:
1.1.1. Incubadora de CO2
1.1.2. Microscopio con objetivo de 1000 y ocular de 10x

1.2.4. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales pequeos
1.2.5. Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2)
1.2.6. Marcadores indelebles.
1.2.7. Cristal violeta
1.2.8. Lugol
1.2.9. Alcohol al 70% o alcohol acetona

1.2.10. Fucsina acuosa o safranina

1.2.11. Solucin salina 0,85%
1.2.13. Perxido de Hidrgeno al 30%
1.2.14. Base para los azcares: Cistena Triptona Agar CTA
1.2.15. Glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa
1.2.16. Suero para aglutinacion grupos A, B, C, D, W135, X, Y, Z y Z1 .
1.3 Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en procesamiento del LCR.
1.4. Pruebas para la Identificacin:

1.4.1. Observar morfologa macroscpica y condiciones de cultivo.
1.4.2. Gram
1.4.3. Oxidasa
1.4.4. Catalasa
1.4.5. Produccin de cidos a partir de glucosa, maltosa, sacarosa y sactosa.
1.4.6. Serotipoficacin.

1.5.5 Neisseria meningitidis ATCC 13102

1.6 Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ninguna.

Antimicrobianos en polvo altamente purificados:
1.7.1 Penicilina.
1.8. Pruebas Especiales:

1.8.1. Betalactamasa
2. CARACTERSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs) EN

AGAR CHOCOLATE O AGAR SANGRE:
Son ligeramente caf grisseas, convexas, traslcidas, elevadas, lisas y mucoides, miden de 1-3 mm de
dimetro.


DEL AGAR CHOCOLATE O AGAR SANGRE:
Permite observar tincin, agrupacin y morfolologa microscpica.

3.2. Procedimiento para la tincin del frotis: ver captulo 3.
3.3. Resultado:
Diplococos arrionados Gram negativos.

Resultado: Bacilos gramnegativos cortos
Resultado: Cocos grampositivos en racimos
Nesseria meningitidis posee la enzima citocromo oxidasa la cual se detecta al colocar un inculo en una
tira que contenga el reactivo para-dimetilendiamina o tetra-para-difenilendiamina, que se caracteriza por
la aparicin de un color prpura en la tira reactiva.
4.4. Resultado:

4.5.1. Pseudomonasa aeruginosa ATCC 27853
Resultado: Presencia de la enzima citocromooxidasa: se observa un color prpura en la tira reactiva.
Resultado: Ausencia de la enzima citocromooxidasa: se observa un color amarillo palido en la tira
reactiva.


Neisseria meningitidis posee la enzima catalasa, por lo tanto da reaccin positiva cuando se mezcla
con perxido de hidrgeno, la cual se caracteriza por la formacin inmediata y moderada de burbujas.
5.4. Resultado:
Catalasa positiva: produccin inmediata y moderada de brbujas.

5.5.1. Staphylococcus aureus. ATCC 25923
6. PRODUCCIN DE CIDOS A PARTIR DE GLUCOSA, MALTOSA, SACAROSA,

Y LACTOSA:
Tradicionalmente la produccin de cido de carbohidratos ha sido determinada usando la basede Cistina
Tripticasa Agar (CTA) con los carbohidratos en un porcentaje al 1%.
El azcar por esta va es convertido en productos intermedios como el cido pirvico. Al carecer de las
enzimas deshidrogenasas, las bacterias con enzimas oxidativas transfieren iones de hidrgenos
disponibles, del acido pirvico al ciclo de Krebs, los que se unen con oxgeno para formar agua.
El acido pirvico es transformado en cido lctico y otros cidos mixtos. Estos cidos que se producen
por va oxidativa en los tubos de CTA son extremadamente dbiles, por lo tanto, deben utilizarse sistemas
de pruebas con detectores ms sensibles. Por el momento las pruebas de deteccin de cidos con sistemas
ms sensibles, aunque existen, no estn extendidos comercialmente, por lo cual, se tendr que seguir
empleando el CTA.
6.2. Procedimiento:
6.2.1. Marque 4 tubos de CTA con las iniciales G (glucosa), M (maltosa), S (sacarosa) y L (lactosa).
6.2.2. De un cultivo de 24 horas y empleando un asa redonda, tome varias UFC, de tal manera que
quede bien cargada.
6.2.3. Introduzca varias veces el asa en el tubo de CTA, de tal manera que el inculo quede esparcido
ampliamente.
6.2.4. Repita el procedimiento anterior en los restantes 3 tubos de CTA.
6.2.5. Introduzca un disco de glucosa en el primer tubo y repita el procedimiento en los restantes 3 tubos
con discos de maltosa, sacarosa y lactosa.
6.2.6. Cierre hermticamente con tapones de rosca e incube entre 35 o-37 oC en aerobiosis, durante
18-24 horas.


Las pruebas confirmativas son necesarias para distinguir entre varias especies del gnero Neisseria.
Las especies de Neisseria se pueden diferenciar entre s por los patrones de acidificacin de 4 azcares:
Glucosa
Maltosa
Lactosa
Sacarosa
Neisseria meningitidis oxida la glucosa y maltosa pero no la lactosa ni la sacarosa. La oxidacin se
detecta en el tubo de CTA por un cambio de color hacia el amarillo en la parte ms superficial del tubo.
Los tubos, previos a su inoculacin, son de color rosado intenso a rojo.
6.4. Resultado:
Produccin de cidos a partir de glucosa y maltosa positiva: hay viraje en el color del rosado al
amarillo.
Produccin de cidos a partir de sacarosa y lactosa negativa: no hay viraje en el color, se observa de
color rosado.
6.5 Control de calidad:

6.5.1. Nesisseria meningitidis ATCC 13102
Resultado: Oxidacin de la glucosa y maltosa positiva: viraje de color del rosado al amarillo, en el tercio
superior del tubo.
Oxidacin de la sacarosa y lactosa negativa: no hay viraje de color.
7. SEROTIPIFICACIN:
azcarres dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. En algunos casos el antgeno
es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos o serotipos.
7.2. Procedimiento:
7.2.1. Tome una de las dos partes de un plato Petri descartable (100 mm). Utilizando un marcador fino
indeleble dibuje varios cuadrantes, de tal manera que obtenga rectngulos de aproximada-
mente 2.5 x 1cm.
7.2.2. En la cara interna del plato que dibuj y guindose por los rectngulos dibujados, coloque una
gota del suero A, B, o C. Se sugiere empezar con el suero que ms comunmente da reacciones
positivas en su laboratorio. En Nicaragua, el serogrupo circulante interepidmico es el B.

7.2.3. Utilizando un palillo de madera, tome un inculo del plato de ACh (una UFC suele ser suficiente)
y frtela gentilmente frente a la gota del suero, a manera de descargar el inculo en la superficie
de un rea muy pequea (no mayor que la gota).
7.2.4. Utilizando el mismo palillo mezcle la gota de suero y el inculo con movimientos hacia delante
y hacia atrs, siguiendo el sentido del rectngulo.
7.2.5. Descarte el palillo en un contenedor conteniendo cloro al 0.5%.
7.2.6. Mueva el plato con movimientos que sigan el sentido del rectngulo al mismo tiempo que observa
con una luz indirecta durante un mximo de un minuto.
7.2.7. Observe si hay aglutinacin. Si no hay, repita el procedimiento anterior con cada uno de los
sueros hasta encontrar el serogrupo correspondiente.
NOTA: La aglutinacin fuerte y rpida suele presentarse antes de transcurrido un minuto. Recuerde que
si demora mucho la lectura, la placa puede secarse y dar falsos positivos. Un exceso de uno de los
componentes (antgeno o anticuerpo) puede dar un resultado falso negativo.
Tome en cuenta que la identificacin serolgica de Neisseria meningitidis es una prueba presuntiva y es
insuficiente sin las pruebas confirmativas. Otras especies de Neisseria pueden dar reacciones cruzadas
con N. meningitidis. Los serogrupos A y C pueden dar reacciones cruzadas debido a la presencia de
polisacridos capsulares comunes. Por esta razn, las pruebas confirmativas deben preceder a la
serotipificacin.

Existen 13 serogrupos de N. meningitidis, clasificados en base a los polisacridos de la cpsula o a los
antgenos de la membrana externa. Estos serogrupos se denominan con las letras mayscualas del
alfabeto y nmeros arbigos en algunos de ellos: A, B, C, D, 29E, H, I, J, K, L, W135, X, Y y Z. Los
serogrupos ms frecuentes implicados en brotes o epidemias son el A, B, C, Y y W135. Los serogrupos
A y C estn asociados a enfermedad meningocccica de tipo epidmico, en tanto que el B se asocia ms
a casos de enfermedad infecciosa espordica interepidmica, ocasionalmente en brotes muy localizados.
7.4. Resultado:
Serologa positiva: se observa aglutinacin rpida y completa.
Serologa negativa: no se observa aglutinacin.

7.5.1. Nesisseria meningitidis ATCC 13102
Resultado: Aglutinacin positiva con suero C.
Resultado: No se observa aglutinacin con suero C

Positivo: Se aisl Neisseria meningitidis C.
Negativo: No se aisl Neisseria meningitis C.


Neisseria meningitidis
Agar Chocolate:
Colonias mucoides, traslcidas, no pigmentadas, no hemolticas
Frotis: Diplococos Gram negativos arrionados
Oxidasa: positiva Catalasa: positiva
Cistina Tripticasa Susceptibilidad por

Betalactamasa Serologa
Agar MIC
Produccin de cidos
Glucosa Maltosa Lactosa Sacarosa
Rosado Rosado
Amarillo Amarillo
intenso intenso

IV. BIBLIOGRAFA:
de Bacteriologa, captulo XIII. Sergio R. Lpez, Justo Reyes Cerros, Alcides Gonzlez Mairena, Rosibel
Centeno, 3 edicin, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia
CNDR, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua,
Nicaragua.
2. Especies de Neisseria y Moraxella catarrahalis en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman
editor Cap. 10, 5 a edicin, 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
3. Neisserias en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George F. Brooks editor,
Cap. 21, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico D.F.
4. Haemophilus en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 7, 5 edicin, 1996,
Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
5. Knapp JS, Koumans EH. Neisseria and Branhamella in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R.
Murray ed in chief, chap 38, ASM Press, 7th ed, Washington D.C., 1999.
6. Lpez Cruz SR. En cooperacin con Eyda de Campollo (LNS Guatemala). Manual de Procedimientos
para el Diagnstico de Meningitis Bacteriana. Organizacin Panamericana de la Salud, Orga-
nizacin Mundial de la Salud, Asociacin de Laboratorios de Salud Pblica, PHAO/WHO/APHL,
2002.

7.4 Procedimienos para la identificacin
de Listeria monocytogenes
I. TOMA DE MUESTRA
Ver toma de muestra del LCR
II. TRANSPORTE
Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, almacenar o transportar la muestra a 4oC, por un
perodo de 24 a 48 horas.
III. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA

Ver inicio del captulo 7.
IV. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS

Ver inicio de captulo 7.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Del. 1.4.15 con respecto a las pruebas de identificacin.
CNDR: Del 1.4.15 con respecto a las pruebas de identificacin.
VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

El gnero Listeria comprende un grupo de pequeos bacilos o coco bacilos grampositivos no espo-
rulados, mviles por flagelos pertricos cuando es cultivada entre 20 y 25oC. Debido a su forma variable,
los miembros de este genero se confunden usualmente con Corynebacterium, Lactobacillus, Streptocuccus
y Enterococcus. Listeria se puede diferenciar de los ltimos tres gneros por su produccin de catalasa
y su movilidad lo diferencia de Corynebacterium.
El gnero Listeria comprende las siguientes especies: L. monocytogenes, L. grayi, L. innocua, L. ivanovii,
L. seeligeri, y L. welshimeri, de las cuales, solamente Listeria monocytogenes es patgena para los hu-
manos. Esta especie ha sido aislada se una gran variedad de fuentes del ambiente y animales. En la
cadena de transmisin los productos alimenticios provenientes de animales ingresan al tracto digestivo
y posteriormente invade a tejidos como el sistema nervioso central.
Listeria monocytogenes un bacilo grampositivo no esporulado, corto, cuyas clulas miden entre 0.4 a
0.5mm x 1.0 a 2.0mm. Es un poco ms pequeo que otras especies de bacilos grampositivos aerobios.

Son cocobacilos y ocasionalmente pueden verse como diplobacilos, cadenas cortas y en ocaciones
formando empalizadas similares a difteroides.
Cuando se examinan frotis de lquido cefalorraqudeo es importante tomar en cuenta a L. monocytogenes,
importante agente causal de meningitis bacteriana aunque menos frecuente que N. meningitidis,
Streptococcus hemolticos del grupo B y H. influenzae.
En placas de Agar Sangre de Carnero, incubadas a 35oC durante 24 horas en ambiente de CO2 al 5%
se observan colonias pequeas, translcidas y grises. La mayora de las cepas producen un estrecho halo
de beta hemlisis que habitualmente no se extiende ms all del borde de la colonia. La hemolisina es
el principal factor de virulencia de Listeria monocytogenes.
VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.2. Incubadora
1.1.3. Microscopio con objetivo de inmersin 100x y ocular de 10x

1.2.1. Asas bacteriolgicas con punta recta y redonda
1.2.2. Gradilla
1.2.5. Jarra de vidrio y velas de cera blanca (si no se cuenta con incubadora de CO 2)
1.2.6. Colorantes de Gram
1.2.7. Aceite de inmersin
1.2.8. Peroxido de hidrgeno al 30%
1.2.9. Azcares: lactosa, ramnosa, xilosa, manitol
1.2.10. TSI
1.2.11. Esculina
1.2.12. Caldo Vogues-Proskauer (VP)
1.2.13. Caldo de nitratos NO3NO2
1.2.14. Reactivo A (-Naftilamina, cido actico 5N)
1.2.15. Reactivo B (cido sulfanlico, cido actico 5N)
1.2.16. Oxidasa
1.2.17. Urea
1.2.18. Mio
1.2.19. Citrato


1.3.1. Caldo tripticasa soya o caldo triptosa
1.3.2. Agar Sangre de Carnero
1.4 Pruebas para identificacin:

1.4.1. Desarrollo a 4oC
1.4.2. Morfologa de las colonias
1.4.3. Gram
1.4.4. Catalasa
1.4.5. CAMP Test
1.4.6. Fermentacin de glucosa y lactosa en TSI
1.4.7. Produccin de H2S en TSI
1.4.8. Fermentacin de ramnosa, xilosa y manitol:

1.4.9. Hidrlisis de Esculina
1.4.10. Vogues-Proskauer (VP)
1.4.11. Reduccin de nitratos
1.4.12. Oxidasa
1.4.13. Ureasa
1.4.14. Produccin de indol
1.4.15. Crecimiento en citrato

1.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999

1.6 Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer:
Ninguno. La sensibilidad debe realizarse por el mtodo de Concentracin Inhibitoria Mnima.
2. DESARROLLO A 4oC:
Fundamento: Debido a que L. monocytogenes puede ser difcil de aislar a 35oC desde hace mucho tiempo
se recomienda utilizar la capacidad de Listeria de desarrollarse a 4oC para su aislamiento cuando, por
ejemplo, las muestras del LCR han resultado negativas para las bacterias mas comunes y las pruebas
presuntivas soportan la posibilidad de meningitis bacteriana.
2.1. Procedimiento:
2.1.1. Mezclar una parte de la muestra con nueve partes de caldo tripticasa soya (o caldo triptosa en
su defecto).

2.1.2. Mantener la mezcla muestra-caldo a 4 oC durante varios das a dos meses.

2.1.3. Subcultivar la mezcla en agar sangre de carnero semanalmente, hasta lograr la recuperacin del
microorganismo.
2.1.4. Fundamentos fisiolgicos de la bacteria: Listeria monocytogenes tiene la capacidad de de-
sarrollarse a 4oC.
2.3. Resultado:
Crecimiento y recuperacin del microorganismo a partir del caldo incubado a 4 oC.
3. CARACTERSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC):

Colonias pequeas, translcidas y grises. En Agar Sangre de Carnero se observan con un halo de b
hemlisis que habitualmente no se extiende mas all del borde de la colonia. Listeria monocytogenes no
forma colonias blancas como lo hacen otros bacilos grampositivos.
4. GRAM:
4.1. Fundamento: ver captulo 3.

4.3. Fundamentos estructurales de la bacteria:
La tincin de Gram permite observar las caractersticas tintoriales de Listeria monocytogenes as
como su agrupacin y morfologa microscpica.
4.4. Resultado:
Bacilos o cocobacilos cortos grampositivos dispuestos en empalizadas, diplobacilos o cadenas cortas.

Listeria monocytogenes B-1-1999
Resultado: Cocobacilos grampositivos agrupados en empalizadas, diplobacilos y cadenas cortas.
5. CATALASA:
5.5.1. Listeria monocytogenes posee la enzima catalasa, por lo tanto descompone el perxido de
hidrgeno en agua y oxgeno.
5.4. Resultado:
Catalasa positiva: produccin rpida y moderada de burbujas.


5.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999.
Resultado: Catalasa positiva: produccin moderada de burbujas.
6. CAMP Test (Christie, Atkins, Munch-Peterson):

6.1. Principio de la prueba: ver captulo 17.
La actividad hemoltica de Listeria monocytogenes es potenciada por la lisina del Staphylococcus
aureus y por lo tanto produce una reaccin positiva para la prueba de CAMP segn como se aprecia
en al figura No. 1.
zona de
betahemlisiss
L. monocytogenes
L. ivanovii
S. aureus
6.1. Resultado:
Formacin de un halo rectangular de hemlisis acentuada en la parte cercana al inculo de
Staphylococcus aureus

Resultado: Prueba de CAMP positiva.
7. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS EN TSI:



Listeria monocytogenes posee las enzimas galactosidasa y galactsido permeasa que fermentan la
lactosa, la enzima invertasa que fermenta la sacarosa y la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa que
fermenta la glucosa. No produce gas porque carece de la enzima deshidrogenasa frmica. Tambin
carece de las enzimas tiosulfato reductasa y cistena disulfurasa por lo tanto no produce sulfuro de
hidrgeno.
7.4. Resultados:
7.4.1. Fermentacin de lactosa y glucosa: A/A (amarillo / amarillo sin gas y sin H2S).

7.5.1.Listeria monocytogenes B-1-1999
Resultado: Fermentacin de lactosa y glucosa: A/A.
3. FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS: MANITOL, RAMNOSA Y XILOSA:

Listeria monocytogenes fermenta la ramnosa pero no la xilosa ni el manitol.
8.4. Resultados:
8.4.1. Fermentacin de la ramnosa positiva: viraje de color del caldo, del violeta al amarillo.
8.4.2. Fermentacin de la xilosa y el manitol negativos: no hay viraje de color del caldo. Queda de color
violeta.

Listeria monocytogenes B-1-1999
Resultado: Fermentacin de ramnosa positiva: viraje de color de violeta a amarillo.
Fermentacin de la xilosa y manitol negativa: no hay viraje de color. El caldo queda de color violeta
9. HIDRLISIS DE LA ESCULINA:

Listeria monocytogenes hidrolisa la esculina en glucosa y esculetina.

9.4. Resultados:
Hidrlisis de la esculina positiva: el medio inicialmente de color ligeramente mbar se torna de color
negro.

Resultado: Hidrlisis de la esculina positiva: viraje de color del mbar al negro.
10.VOGUES-PROSKAUER (VP):

Listeria monocytogenes produce acetilmetilcarbinol como producto metablico final de la glucosa y forma
cantidades pequeas de cidos mixtos.
10.4. Resultados:
Produccin de acetilmetilcarbinol positiva: formacin de un anillo de color zapote en la superficie del
caldo al agregar el hidrxido de potasio y alfanaftol.
10.5. Control de calidad de la prueba:

Resultado: Produccin de acetilmetilcarbinol positiva: aparece un anillo color zapote al agregar el
reactivo.
11.REDUCCIN DE NITRATOS:

Listeria monocytogenes no tiene la capacidad de obtener energa de las molculas de nitratos, por lo
tanto, no los reduce a nitritos.
11.4. Resultados:
Reduccin de nitratos negativa: el caldo no vira de color al agregar los reactivos A y B en los primeros
30 segundos.

Resultado: No hay produccin de nitritos: el caldo no vara de color al agregarle los reactivos.

12.OXIDASA:

Listeria monocytogenes no posee la enzima citocromo oxidasa, por lo tanto da reaccin negativa, que
se caracteriza por la ausencia de viraje de color en la tira reactiva.
12.4. Resultado:
Oxidasa negativa: no hay viraje de color en la tira reactiva

Resultado: Oxidasa negativa: no hay viraje de color en la tira reactiva.
13. UREASA:
Listeria monocytogenes carece de la enzima ureasa por lo tanto, no hidrolizan la urea.
13.4. Resultado:
Hidrlisis de la urea negativa: no hay viraje del color. El medio conserva su color original.

13.5.1. Listeria monocytogenes B-1-1999.
Resultado: Hidrlisis de la urea negativa: no hay viraje de color.
14.INDOL:

Listeria monocytogenes carece de la enzima triptofanasa, por lo tanto no produce indol.

14.4. Resultado:
Produccin de indol negativo: ausencia de anillo rojo en la superficie del medio (MIO) al adicionar el
reactivo de Kovacs.

Resultado: Produccin de indol negativa: no hay viraje de color al agregar el reactivo.
15.CITRATO:

Listeria monocytogenes no utilizan el citrato como nica fuente de carbono.
15.4. Resultados:
Utilizacin del citrato negativa: no hay viraje de color, ni crecimiento en el medio.

Resultado: Utilizacin del citrato negativa: no hay viraje de color ni crecimiento en el medio.
TABLA DE DIFERENCIACIN DE ESPECIES DE LISTERIA

CAMP Reduccin
Fermentacin
Especie de nitratos
Hemlisis Test
Manitol Ramnosa Xilosa
L. monocytogenes + + +
L. grayi + V V
L. innocua V
L. ivanovii ++ +
L. seeligeri + + + ND
L. welshimeri V + ND
V: variable ND: no determinado
VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Bille J, Rocourt J and Swaminathan B. Listeria, Erysipelothrix, and Kurthia in Manual of Clinical
Microbiology. Patrick R. Murray ed in chief, chap 22, 7th ed, 1999, ASM Press, Washington,
D.C.

CAPTULO 8.
Procedimientos para bacterias
aisladas en hemocultivos
1. INDICACIONES:
Se realiza hemocultivos en caso que se sospeche de:
1.1. Fiebre Tifoidea y Paratifoidea y sospecha de salmonelosis
1.2. Meningococcemia.
1.3. Infeccin del torrente sanguneo por anaerobios.
1.4. Infeccin del torrente sanguneo por gramnegativos y/o grampositivos.
1.5. Endocarditis bacteriana.
1.6. Leptospirosis
2. OBTENCIN DE LA MUESTRA:
2.1 La sangre para hemocultivos se obtiene de los pacientes durante el perodo febril y antes de
iniciar el tratamiento con antimicrobianos. En casos de fracaso teraputico en los cuales an no
se ha corroborado el diagnstico microbiolgico, el tratamiento con antimicrobianos debe
suspenderse durante 72 horas bajo supervisin mdica. En estos casos se requiere una estrecha
colaboracin entre el laboratorista y el mdico quien es el que debe evaluar los riesgos /
beneficios de suspender la terapia para el aislamiento bacteriano en casos de fracaso de la
terapia antibacteriana. El nmero de muestras a tomar y el momento de hacerlo depende de la
naturaleza de la patologa. En casos de fiebre tifoidea o de salmonelosis invasivas, los ndices de
aislamiento son ptimos en la primera y segunda semanas. Si se trata de endocarditis bacteriana,
la toma de tres muestras separadas el primer da de ingreso, detecta el 90% de los agentes
infecciosos. Existen otras variaciones y el criterio del cardilogo debe ser tomado en cuenta
para determinar la frecuencia y el momento de la toma.
2.2. Lavarse las manos y usar guantes estriles. Para extraer la muestra realizar limpieza y antisepsia
de la piel primero con alcohol iodado al 2% y seguidamente con alcohol al 70%.
2.3. Extraer la sangre con jeringa estril de manera que obtengamos una relacin 1/10 entre la san-
gre y el medio de cultivo. En adultos 4-5-7 mL de sangre en frascos de 40-50-70mL
respectivamente. En nios 2-2.5mL de sangre en frascos de 20-25mL respectivamente. Para
neonatos existe una presentacin de caldo con 9mL al cual se adiciona 1 mL de sangre. Antes
de emplear un frasco para hemocultivo debe verificarse cuidadosamente si el volumen del caldo
es para adulto o nios. En algunos de estos medios no se requiere la utilizacin de jeringa y la
Captulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos 133

toma de muestra se realiza colocando directamente el frasco a travs de un sistema vacum (al
vaco). La prdida de relacin entre el volumen de sangre y el caldo de cultivo puede hacer que,
en caso que la cantidad de sangre sea mayor, la muestra se coagule y en caso que sea menor,
que el SPS y factores lticos de la misma sangre destruyan a las bacterias.
2.4. Si la muestra es extrada con jeringa, inocularla inmediatamente en el frasco de hemocultivo,
limpiando previamente la tapa de goma con alcohol iodado al 2% y luego mezclndola sua-
vemente.
3. REQUERIMIENTOS QUE DEBE LLENAR UN MEDIO DE CULTIVO PARA SER

CONSIDERADO COMO MEDIO DE HEMOCULTIVO:
3.1. Debe ser un caldo constituido por tripticasa soya o infusin de cerebro corazn de buey (BHI),
contener el anticoagulante SPS del 0,025 al 0,05% (polianetol sulfonato de sodio polianinico)
y contener un 5% de CO2. Su interior debe estar al vaco para facilitar la entrada de la sangre.
Su diseo, preferiblemente debe facilitar la toma de la muestra directamente a travs de un
dispositivo de vacum (vaco). Los frascos con caldos de BHI o tripticasa soya que se elaboran en
los laboratorios y que no contienen los dems factores no deben ser considerados como medios
de hemocultivo. En estos casos usualmente crecen bacilos gramnegativos pero no los mi-
croorganismos nutricionalmente exigentes como Streptococcus pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
3.2. Para aislamiento de Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Enterobacterias, bacilos
gramnegativos no fermentadores, Streptococcus spp y Staphylococcus spp, el frasco de hemo-
cultivo debe contener:
3.2.1. Caldo BHI o TSA
3.2.2 CO2
3.2.3. Anticoagulante SPS (polianetol sulfonato de sodio polianionico) al 0.025%- 0.05%.
3.3. Para el aislamiento de Neisseria meningitidis, el frasco de hemocultivo debe contener:
3.3.1. Caldo BHI o TSA
3.3.1. CO2
Figura 1. Frascos de Hemocultivos
134 Captulo 8: Procedimientos para bacterias aisladas en hemocultivos


1. La sangre debe transportase en frascos de hemocultivos a temperatura ambiente procurando que
no pase de 2 horas.

1. Incubar el frasco inoculado a una temperatura de 35-37 oC por 7 das.
2. Los subcultivos se realizan en ASC o Agar Chocolate (ACh) la sospecha de diagnstico clnico,
con la siguiente frecuencia: I) a las18-24horas II) a las 48horas y III) a los 7 das de incubacin.
El procedimiento es el siguiente:
2.1. 2.1 Con guantes descartables, limpiar la tapa de goma del frasco de hemocultivo con alcohol
iodado al 2%, extraer aproximadamente 1 mL y depositar entre 6 a 8 gotas en el medio de cultivo
(Ver Figura 2).
Figura 2: Inoculacin del medio Agar Sangre de

Carnero del frasco de hemocultivo.
2.1. Dejar secar la muestra durante 10 minutos e incubar de 35 a 37 oC en atmsfera de CO 2.

2.2. Revisar el cultivo a las 24 y 48 horas. Si no hay crecimiento descartar el plato. Si hay crecimiento
realizar un Gram y reaislarlo en el medio de cultivo apropiado segn la morfologa del Gram.
NOTA: Observar diariamente el frasco. Cuando hay turbidez y no se ha indicado el subcultivo (segn
el numeral 2), primero debe obtenerse una muestra por puncin del frasco, realizarle un Gram y
subcultivar slo en caso que se observaran bacterias. El medio de cultivo a utilizar en el subcultivo
depende de la tincin y morfologa observada en el Gram.

1. TOMA DE MUESTRA:
1.1. Jeringa estril
1.2. Alcohol Iodado al 2%
1.3. Alcohol al 70%
1.4. Torniquete
1.5. Frasco para hemocultivo
1.6. Guantes estriles

2. TRANSPORTE DE LA MUESTRA:
2.1. Contenedor de plstico para transportar la muestra
Nota: El contenedor debe ser resistente a lcalis, cidos y debe ser reesterilizable por medio de
autoclave.
3. PROCESAMIENTO:
3.1. Equipos:
3.1.2. Incubadora con CO2
3.1.3. Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora con CO 2).
3.1.7. Microscopio con objetivos de 40X y 100X
3.2. Materiales:
3.2.1. Jeringa estriles
3.2.6. Gradillas
3.2.7. Lminas de vidrio
3.2.8. Contenedores con cloro al 10% para desechar material contaminante
3.3. Reactivos:
Colorantes y reactivos para la tincin de Gram.

3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC)
3.4.2. Agar Chocolate (ACh)
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Haemophilus influenzae: Ver captulo 7.
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Streptococcus pneumoniae: Ver captulo 7.
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE Neisseria meningitidis: Ver captulo 7.
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: Ver captulo 4.
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACION DE BACILOS GRAMNEGATIVOS NO

FERMENTADORES: Ver captulo 3 .

8.1. Procedimientos para la identificacin
de los Streptococcus grupo viridans
Ver toma de muestra en hemocultivo.

Ver Transporte de la muestra en hemocultivo.

Ver procedimiento en hemocultivo.

Ver equipos, materiales y reactivos en hemocultivo.
V. ALCANCE:
CNDR: numerales del 1.4.1 al 1.4.8 con respecto a pruebas de identificacin.

Los estreptococos son microorganismos esfricos u ovoides, con una disposicin caracterstica en forma
de cadenas. La mayora de los estreptococos crecen en medios slidos formando colonias discoidales
generalmente de 1 a 2 mm de dimetro. Las variantes de una misma cepa de estreptococo pueden dar
lugar a colonias con diferencias morfolgicas. Son anaerobios facultativos.
Streptococcus grupo viridans, incluyen a varias especies de estreptococos alfa hemolticos y no he-
molticos que por su relacin filogentica han sido organizados en 5 grupos:
Grupo I o mitis: Son alfahemolticos e incluye las especies mitis, sanguis, parasanguis, gordanii, crista,
ovalis y pneumoniae. De este grupo, los Streptocococcus mitis, sanguis, gordanii y oralis se han aislado
en pacientes con endocarditis bacteriana subaguda. La especie oralis tambin se ha aislado en pacientes
con neutropenia.
Grupo II o Anginosus: Son beta, alfa o no presentan hemlisis (gama hemlisis) e incluye a las es-
pecies anginosus, constellatus e intermedius. Las tres especies se han aislado de pacientes con infec-
ciones en genitales y abscesos en boca.

Grupo III o mutans: Son beta, alfa o gama hemolticos e incluyen a las especies mutans, sobrinus,
cricetus, rattus, downei y macacae. Las especies mutans y sobrinus estn asociados a caries dental y las
especies downei y macacae se han aislado en monos.
Grupo IV o salivarius: Son alfa o no hemolticus e incluye a las especies salivarius, vestibularis y
thermophilus. La especie salivarius es parte de la microbiota de la boca y se ha aislado en infecciones
del torrente sanguneo de pacientes neutropnicos.
Grupo V o bovis: Son alfa o gama hemolticos e incluye las especies bovis, alactolyticus y equinus.
La especies bovis se ha aislado en pacientes con endocarditis y cncer del clon.
La identificacin de las especies del grupo viridans debe ser realizada nicamente cuando los
aislamientos provienen de infecciones serias: endocarditis, abscesos, pacientes con cncer o con
procesos neutropnicos.
No son solubles en bilis y su desarrollo no es inhibido por los discos de optoquina. Son las especies que
ms prevalecen como parte de la microbiota normal del sistema respiratorio superior, boca y sistema
urogenital. En casos de traumatismos pueden llegar a la sangre. Del 30 al 40% de las endocarditis
bacterianas estn asociadas a Streptococcus grupo viridans en pacientes con lesiones valvulares o
prtesis cardacas.
Los Streptococcus grupo viridans tambin se pueden aislar en raras ocasiones de otras infecciones
graves, como meningitis y neumonas, en particular en husped comprometidos.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
Ver equipos en heridas y abscesos.

1.2.2. Gradillas
1.2.3. Contenedores con cloro del 5 al 10% para desechar material contaminante
1.2.7. Tubos para coagulasa de 45 x 75
1.2.8. Pinzas estriles
1.2.11. Colorantes y reactivos para la tincin de Gram
1.2.12. Peroxido de hidrgeno (H2O2) al 30%

1.2.13. Discos de optoquina de 6mm

1.2.14. Desoxicolato de sodio al 10%
1.2.15. Discos de bilis esculina de 6mm
1.2.16. Dispositivos para prueba de PYR.
1.2.17. Caldo nutritivo al 6.5% de NaCl
1.2.18. Arabinosa
1.2.19. Sorbitol

1.3.1. Agar Sangre de Carnero (ASC).

1.4.1. Coloracin de Gram de las colonias
1.4.3. Pruebas para diferenciar Streptococcus pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus
grupo viridans:
1.4.3.1. Prueba de optoquina
1.4.3.2. Prueba de solubilidad en bilis
1.4.4. Pruebas para diferenciar Enterococcus spp de Streptococcus grupo viridans

1.4.4.1. Prueba de bilis esculina.
1.4.4.2. Prueba de PYR.
1.4.4.3. Prueba de crecimiento en caldo nutritivo al 6,5%.

1.5.3. Streptococcus bovis OPS 29
1.5.4. Streptococcus viridans INS 003

1.7. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Concentracin Inhibitoria Minima

(CIM/MIC):
1.7.1. Penicilina.
1.8. Pruebas especiales de sensibilidad antimicrobiana: Ninguna.


2.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria ante el medio:
Algunas cepas del grupo viridans producen una alfa hemlisis, (lisis parcial de los eritrocitos de carne-
ro). Otras cepas del mismo grupo carecen de hemolisina S (producen una gamma hemlisis) por lo tanto
no producen hemlisis en el medio.
2.4. Resultado:
2.4.1. Morfologa de las colonias: Las colonias del grupo de Streptococcus grupo viridans tienen
diferente morfologa dependiendo de las especies a que pertenecen.
2.4.2. Hemlisis:
2.4.2.1. Alfa hemlisis: Positiva. Se observa hemlisis parcial. Zona de color verde musgo
alrededor de las UFCs.
2.4.2.2. Gama hemlisis: Positiva. No se observa zona de hemlisis alrededor de las UFCs.

Resultado: Hemlisis alfa positiva. Se observa halo de color verde musgo alrededor de las UFCs.
3. COLORACIN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCs):
3.1. Fundamento de la tincin: ver captulo 3.

Los Streptococcus grupo viridans son cocos grampositivos que retienen el colorante de violeta de
genciana, por lo que se observan de color violeta oscuro. Dependiendo de la especie se observarn
cadenas cortas o largas con cocos en sueltos o pares, esfricos y ovoides.
3.4. Resultado:
Se observa cocos grampositivos esfricos u ovoides dispuestos en cadenas.

Resultado: Se observan cocos grampositivos (violeta oscuro) esfricos u ovoides dispuestos en cadenas.

Los Streptococcus grupo viridans carecen de la enzima catalasa, por lo tanto no catalizan el H2O2 en
oxgeno y agua.
4.4. Resultado:

Resultado: Negativo. No hay produccin de burbujas.
PRUEBAS PARA DIFERENCIAR: Streprtococcus pneumoniae de Enterococcus spp

y Streptococcus grupo viridans:
5. PRUEBA DE OPTOQUINA:
La sensibilidad a la optoquina (clorhidrato de etil hidrocuprena) se utiliza para diferenciar Streptococcus
pneumoniae de Enterococcus spp y Streptococcus grupo viridans.
Los Streptococcus del grupo viridans son resistentes a la optoquina. Cuando se colocan discos de
optoquina de 6mm, el dimetro del halo de inhibicin del crecimiento es menor de 14 mm.
5.4. Resultado:
Negativo: El halo de inhibicin con discos de 6mm es menor de 14mm.

Resultado: Negativo. El halo de inhibicin con discos de 6mm es menor de 14mm.
5.5.2. Streptococcus pneumoniae ATCC 49619.
5.5.3. Resultado: Positivo. El halo de inhibicin con discos de 6mm es mayor de 14 mm


Los Streptococcus del grupo viridans carecen de las enzimas autolticas (autolisinas) que son las que
actan con el reactivo para acelerar la reaccin ltica natural. Por lo tanto, al agregarle el reactivo
desoxicololato de sodio al 0.5% no se activa autlisis.
6.4. Resultado:
Negativo: Se observa turbidez en el tubo.

Resultado: Negativo. Se observa turbidez en el tubo.
Resultado: Positivo. El tubo se observa transparente.
PRUEBAS PARA DIFERENCIAR: Enterococcus spp de Streptococcus grupo

viridans (Ver diagrama de flujo despus de la prueba de PYR).
7.1. Fundamento de la Prueba:

Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias, en particular los Estreptococosdel grupo D y
especies de Enterococcus spp, de tolerar grandes concentraciones de bilis (40%). Para detectar esta alta
tolerancia se agrega esculina, la cual es hidrolizada si la bacteria se desarrolla. La hidrlisis de la
esculina, da como resultado la formacin de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su
vez reacciona con los iones frricos para formar un complejo negro.
7.2. Procedimiento:
7.2.1. Rotular un tubo para coagulasa
7.2.2. Agregar 100mL de agua destilada estril.
7.2.3. Tomar 2 3 colonias de un cultivo fresco y hacer una suspensin homognea.
7.2.4. Con una pinza estril colocar el disco de bilis esculina dentro del tubo que contiene la suspensin.
7.2.5. Incubar a una temperatura de 35-37 oC durante 4 horas.
7.2.6. Realizar la lectura.


Algunos Streptococcus del grupo viridans solo aproximadamente el 3% tienen la capacidad de hidrolizar
la esculina en presencia de bilis.
7.4. Resultado:
Hidrlisis de la esculina
Negativa: Se observa color amarillo (color del disco)

7.5.2. Streptococcus grupo viridans NS 003
Resultado: Negativa: Se observa color amarillo el disco.
8. PRUEBA DE TOLERANCIA AL CLORURO DE SODIO 6,5%:

La prueba de tolerancia a la sal en concentraciones de 6.5% de NaCl diferencia las especies de los
Streptococcus del grupo viridans (principalmente del grupo V bovis en el que se incluye a Streptococcus
bovis ) de Enterococcus spp.

Se basa en la capacidad de algunas bacterias de desarrollarse en presencia de cantidades variadas de
cloruro de sodio (NaCl). Es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varios gneros y
especies bacterianas, incluyendo los Streptococcus del grupo viridans. En este caso se utiliza la
concentracin de cloruro de sodio al 6,5%.
8.2 Procedimiento:
8.2.1. Rotular el tubo que contiene caldo nutritivo con 6.5% de cloruro de sodio.
8.2.2. Tomar 2 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de incubacin. Hacer una suspensin
homognea. Si el caldo se inocula con cantidad excesiva de bacterias, l inoculo puede ser
reportado como si desarrollara crecimiento, lo cual sera un resultado falso positivo.

Los Streptococcus grupo viridans no son halo tolerantes por lo que carecen de la capacidad de
desarrollarse en concentraciones de 6.5% de cloruro de sodio.
8.4. Resultado:
No hay turbidez en el caldo.


Resultado: Positivo.Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.
Resultado: Negativo.No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.
9. PRUEBA DE PYR (DETERMINACIN DE LA ENZIMA PIRROLIDONIL

ARILAMIDASA):
La prueba de PYR se utiliza como prueba rpida para la diferenciacin presuntiva de los Streptococcus
grupo viridans (Streptococcus bovis) de los Enterococcus spp.
El sustrato utilizado es la L-pirrolidonilo-b-naftilamida (PYR por sus siglas en ingls). Este compuesto es
hidrolizado por la enzima pirrolidonilopeptidasa. La hidrlisis del sustrato por esta enzima libera b-
naftilamida libre, que se detecta al agregar el reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido. Si la
hidrlisis se llev a cabo, se forma un compuesto de color rojo cereza oscuro.
9.2. Procedimiento:
9.2.1. Con un palillo descartable tomar 2 3 colonias del cultivo puro de 24 horas de incubacin y
realizar un frotis en la superficie del cuadrante de la lmina que ha elegido para el caso. La
lmina contiene cuatro cuadrantes para trabajar.
9.2.2. Agregar una gota del reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido .
9.2.3. Realizar la lectura inmediatamente. Si no hay desarrollo de color realizar la segunda lectura al
minuto de haber agregado el reactivo.

Los Streptococcus grupo viridans carecen de la enzima pirrolidonilopeptidasa, por lo tanto no hidroliza
el sustrato.
9.4. Resultado:
Positivo: Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

Resultado: Positivo. Desarrollo de un color rojo cereza oscuro
Resultado: Negativo. Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).

10.FERMENTACIN DE MANITOL:
Ninguna de las especies de importancia clnica tienen enzimas para fermentar el manitol. La especie
mutans es capaz de hacerlo pero est fuera del alcance de este manual abarcar el tema de la caries
dental. Sin embargo, entre la especie bovis es utilizada para diferenciar los tipos I del II.
10.4. Resultado:
Positiva: Tipo I. Fermenta el manitol. Viraje del color del medio de violeta a amarillo, por fermentacin
del carbohidrato.
Negativa: Tipo II. No fermenta el manitol. No hay viraje de color. El caldo se observa de color violeta.

10.5.1. Streptococcus bovis OPS 29
Resultado: Positiva. Viraje del color del medio de violeta a amarillo
10.6. Informe de resultado:

Negativo: No hubo crecimiento bacteriano.
Positivo: Posibilidad 1: Streptococcus grupo viridans con su respectivo antibiograma.
Posibilidad 2: Streptococcus bovis con su respectivo antibiograma.

FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIN DE

STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS
ASC
Alfa hemolticas
Gram: Cocos Gram + en cadenas
Catalasa: negativa
OPTOQUINA
Discos 6 mm: 14mm
Discos 10 mm: 16mm
POSITIVO RESULTADO
DUDOSO
S. pneumoniae SOLUBILIDAD EN BILIS

(Desoxicolato de Na al 10%)
NEGATIVA POSITIVA
BILIS ESCULINA BILIS ESCULINA +

CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl PYR: S. pneumoniae
PYR CALDO NUTRITIVO 6,5% NaCl:
POSITIVO NEGATIVO Streptococcus bovis
Streptococcus grupo MANITOL

Enterococcus spp
viridans
POSITIVO NEGATIVO
Tipo I Tipo II
VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Rouff KL, Whiley RA and Beighton D. Streptococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R.
Murray editor in chief. Chap 17, 7th edition, ASM, Washington, 1999.
2. Reyes Cerros J. y Gonzlez Mairena A., Normas Tcnicas para Hemocultivo en: Normas Tcnicas de
Bacteriologa, Cap. XI. Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR.
3 ed., 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur,
Managua, Nicaragua.
3. Meja Sandino MJ. Exudado Faringeo II en Manual de Bacteriologa Mdica 3 ed. 2001, Ministerio
Laboratorios Post Huracn MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR. Managua, Nicaragua.
4. Los cocos grampositivos Parte II: Estreptococos, Enterococos y Bacterias Similares a Estreptococos
en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, captulo 12, 5 edicin, 1996. Editorial
Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
5. Estreptococos spp en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks editor,
Cap. 14, 16 ed. (21 edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V. Mxico D.F.

CAPTULO 9.
Procedimientos para bacterias aisladas en
exudado tico
Para tomar una muestra de exudado tico se recomienda no haber recibido tratamiento local ni sistmico
con antimicrobianos 3 das antes de la toma de la muestra.
1. OTITIS EXTERNA:
Hacer una ligera traccin hacia arriba y atrs del pabelln de la oreja e introducir un hisopo de algodn
estril rotndolo suavemente. Tome dos muestras. Una muestra servir para realizar un frotis y posterior
tincin de Gram y la otra para el cultivo. En caso no de sembrar la muestra inmediatamente introduzca
el hisopo en un medio de transporte de Stuart y transprtela a temperatura ambiente.
Tome una nueva muestra con otro hisopo y realice un frotis en una lmina portaobjetos.
2. OTITIS MEDIA:
El odo medio es estril. Cuando ocurre una infeccin a este nivel, la muestra debe ser tomada por el
mdico, pues requiere de la puncin del tmpano (miringostoma). Cualquier germen aislado de esta
muestra debe ser completamente identificado y reportado. El tipo de microorganismo vara con la edad,
pero usualmente se encuentran los siguientes.
3.1. Streptococcus pneumoniae:

Causa el 50% de todas las infecciones a cualquier edad.
3.2. Haemophilus influenzae:

Es el microorganismo ms frecuentemente aislado en nios: 30% de todas las causas.
3.3. Streptococcus pyogenes:

10-15% de todas las causas.
3.4. Enterobacterias y Staphylococcus:

Principales causas en recin nacidos.
Captulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado tico 147


1. En caso de otitis externa, el hisopo debe introducirse en el medio de transporte de Stuart, teniendo
cuidado que todo el hisopo quede en contacto con el agar.
2. En caso de muestras de odo medio, la siguiente informacin debe ser anotada en la jeringa:
cdigo de la muestra, fecha y hora en que fue tomada.
3. Todas las muestras deben acompaarse con una hoja que contenga como mnimo la siguiente
informacin:
3.1. Institucin
3.2. Sala
3.3. Nmero de expediente
3.4. Nombre del paciente
3.5. Edad
3.6. Sexo
3.7. Resmen de historia clnica. Si existe un Comit de Infecciones Intrahospitalarias (CIIH)
que requiera informacin adicional sobre los casos de infeccin, debe elaborarse una
hoja con los datos que el CIIH determine.
4. Transportar la muestra contenida en el medio de transporte a temperatura ambiente.
5. Si la muestra obtenida est contenida en una jeringa, debe transportarse a temperatura ambiente.
1. OTITIS EXTERNA:
1.1. Con uno de los dos hisopos con los cuales tom la muestra, realice un frotis de 1.5 x 2 cm
en una lmina portaobjetos nueva, con un grosor tal que sea posible leer a travs de l.
Coloree el frotis con tincin de Gram.
1.2. Con el otro hisopo, ya sea que provenga de un medio de transporte o sea directamente
del paciente, siembre la muestra en los medios de Agar Sangre de Carnero y Agar Mac
Conkey.
2. OTITIS MEDIA:
2.1. Del contenido de la jeringa, ponga una pequea cantidad (menos de una gota) en el
centro de una lmina portaobjetos y realice un frotis como se indica en el numeral 1 de
otitis externa.
2.2. Con el contenido de la jeringa realice un inculo cerca de la orilla de los platos de Agar
Sangre de Carnero y Agar Mac Conkey. Estre en la forma convencional.
148 Captulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado tico

1.1. Otitis media:

1.1.1. Jeringa estril descartable de 3mL
1.2. Otitis externa:

2. TRANSPORTE:
2.1. Medio de transporte de Stuart
3. PROCESAMIENTO:
3.1. Equipos:
3.1.1. Incubadora de CO 2 (o jarra con vela en caso de carecer de incubadora de CO 2 )
3.1.2. Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x

3.2.3. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales descartables
3.2.5. Solucin salina estril al 0.85%
3.2.6. Colorantes para tincin de Gram: Cristal violeta, lugol, alcohol 70 o o alcohol-acetona (1:1),
fucsina acuosa o safranina.

3.3.1. Agar Sangre
3.3.2. Agar Mac Conkey
3.3.3. Agar Chocolate (*)
3.3.4. Agar Sabouraud con Cloranfenicol (**)
(*) Slo en caso de cultivo de odo medio.
(**) Slo si observa levaduras sin seudohifas en el frotis.
V. IDENTIFICACIN:
NOTA: Los equipos, materiales, pruebas bioqumicas y reactivos a utilizar para la identificacin
bacteriana estn descritos en el captulo correspondiente a cada bacteria.
Captulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado tico 149

Haemophilus influenzae: ver captulo 7.

Streptococcus pyogenes: ver captulo 10.
Staphylococcus spp: ver captulo 6.
Enterobacterias: ver captulo 4.
Bacilos No Fermentadores: ver captulo 6.
Candida spp: ver captulo 14 seccin de Exudado Vaginal.
1. INFORME FINAL DE LOS RESULTADOS:

Positivo: Nombre del microorganismo.
Negativo: Microbiota Normal.
VI. BIBLIOGRAFA:
1. Reyes Cerros J. Normas Tcnicas para Exudado tico en Normas Tcnicas de Bacteriologa,
captulo VIII. Sergio R. Lpez, Justo Reyes Cerros, Alcides Gonzlez Mairena, Rosibel Centeno,
3 edicin, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR, Agencia
Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua.
150 Captulo 9: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado tico

CAPTULO 10.
en exudado farngeo

No haber recibido tratamiento antimicrobiano sistmico 3 das antes de la toma de muestra.
2. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE EXUDADO FARNGEO:

2.1. Incline ligeramente la cabeza del paciente hacia atrs e ilumine bien la garganta.
2.2. Presione la lengua hacia abajo con depresor de madera de modo que pueda observarse la parte
posterior de la garganta.
2.3. Luego frote el hisopo de algodn estril de arriba abajo contra ambas amgdalas, contra la parte
posterior de la faringe y contra cualquier mancha blanca que se encuentre alrededor de las
amgdalas.
2.4. Introduzca el hisopo en el medio de transporte de Stuart.

El medio de transporte conteniendo la muestra debe ser trasladado al laboratorio a temperatura ambiente
(sin refrigerantes).

Se recomienda la Sangre de Carnero como sangre de eleccin para detectar Streptococcus -hemolticos.
No debe utilizarse sangre humana porque sta puede contener anticuerpos especficos antiestrep-
tococo, antimicrobianos. Por otro lado, contiene un factor antiestreptolisina S que puede inhibir la
hemlisis. Este factor no tiene relacin con el contacto previo a Streptococcus.
Las bolsas colectoras de sangre humana contienen citrato como anticoagulante, el cual inhibe el
crecimiento bacteriano.
1. Rotular el plato de Agar Sangre de Carnero (ASC).
2. Tomar el hisopo que contiene la muestra e inocular cerca de una sexta parte del plato de forma
redonda. Se hace girar el hisopo sobre la superficie del agar de modo que toda la superficie del
hisopo entre en contacto con el agar.
3. Deje secar el inculo durante 5 minutos.
Captulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado farngeo 151

4. Estre los medios de la forma convencional. Ver captulo 17.

5. Utilizando un asa redonda realizar de 3 a 4 estras a profundidad para observar la beta hemlisis
con mayor facilidad, para ello se introduce el asa hasta el fondo del plato en forma perpendicular
a la superficie.
6. Incubar de 35-37 oC durante 18 a 24 horas en ambiente 5% de CO 2 utilizando el mtodo de la
jarra con una vela de parafina blanca o incubadora con CO 2.

1. TOMA DE MUESTRA:
1.1. Hisopos estriles.
1.2. Depresor de madera.
1.3. Lmpara de bateras o de cuello de ganso.
2.1. Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart
3. PROCESAMIENTO:
3.1. Equipos:
3.1.2. Incubadora con CO2
3.1.3. Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora CO 2).
3.1.7. Microscopio con objetivo de 40X y 100X
3.1.8. Rotador
3.2. Materiales:
3.2.4. Guantes descartables y mascarillas
3.2.5. Gradillas
3.2.6. Lminas de vidrio
3.2.7. Pinzas
3.2.8. Contenedores con cloro al 5% para desechar material contaminante.
3.3. Reactivos: Ninguno.

3.4.1. Agar Sangre de Carnero al 5% (ASC).
152 Captulo 10: Procedimientos para bacterias aisladas en exudado farngeo

10.1. Procedimiento para la identificacin
de Streptococcus pyogenes (Grupo A) y
otros -Hemolticos
Ver toma de muestra.

Ver Transporte en exudado.

Ver Procesamiento.

Ver en exudado farngeo.
V. ALCANCE:
CNDR: numerales del 1.3.1 al 1.3.5 con respecto a pruebas de identificacin.

Los Streptococcus pertenecen a la familia Streptococcaceae. Estos microorganismos son cocos
grampositivos, catalasa negativa, que tienden a desarrollarse en pares y cadenas. Los Streptococcus son
anaerobios facultativos. Los Streptococcus de importancia mdica son homo fermentadores, lo que
significa que el nico producto de fermentacin de la glucosa es el cido lctico, son oxidasa negativa.
Producen gran variedad de substancias y enzimas extracelulares. Su capacidad para efectuar diferentes
grados de hemlisis constituye una base importante para su clasificacin.
La clasificacin de los Streptococcus se fundamenta en la presencia de caractersticas fisiolgicas e
inmunolgicas en base a un esquema desarrollado por Rebecca Lancefield. En este esquema, los
Streptococcus han sido diferenciados en dos grandes grupos y 20 especies (A-H y K-V). La base de la
clasificacin la constituyen los polisacridos de la pared celular en la que un carbohidrato especfico
designa a un grupo. La excepcin la constituye el grupo D, cuyo antgeno est conformado por un cido
glicerolteicico. Estos carbohidratos mas el cido glicerolteicico tienen propiedades antignicas
capaces de estimular la formacin de anticuerpos que tienen utilidad diagnstica.

Los antgenos pueden ser extrados por mtodos qumicos (cido clorhdrico o ntrico, formaldehdo) o
por mtodos fsicos (calor y presin altas), los cuales son puestos en evidencia por medio de anticuerpos
precipitantes o aglutinantes. Los sistemas de diagnstico comercial se basan principalmente en la
utilizacin de anticuerpos aglutinantes ligados a partculas de ltex.
Entre las enzimas ms importantes que elaboran los Streptococcus -hemolticos estn:
Desoxirribonucleasa (DNasa). La producen los grupos A, B, C y G. El grupo A produce ms de 4
tipos de esta enzima (tambin conocidas con las siglas A, B, C y D, de las cuales la B es la ms comn).
Durante infecciones de piel y faringe se desarrollan anticuerpos antiDNasa B. La glomerulonefritis que
se desarrolla despus de imptigo por Streptococcus pyogenes se acompaa de elevacin de estos
anticuerpos.
Exotoxinas. El grupo A producen al menos 3 exotoxinas con actividad eritrognica (tambin conocidas
por las siglas A, B, C). La A est conformada por un complejo de protena con cido hialurnico. Antes
del advenimiento de los antimicrobianos era comn observar la fiebre escarlata, cuyo rash se deba a
estas toxinas. Tambin estn asociadas a la virulencia y participan en la gnesis de la fiebre, dao al
tejido cardaco, bloqueo temprano de la respuesta inmune secundaria y realzan la susceptibilidad al
choque por endotoxina.
Hemolisinas. La estreptolisina O induce la respuesta de anticuerpos conocidos como antiestreptolisinas
O (ASO), los cuales se utilizan, entre otros, para determinar procesos recientes o antiguos de infeccin
a Streptococcus pyogenes. La estreptolosina S produce la hemlisis en los medios de cultivo que brinda
las bases para la clasificacin de los Streptococcus como alfa o beta hemolticos. La hemlisis que se
observa realzada en las estras profundas es producida tanto por las estreptolisinas O (que actan en
ausencia de oxgeno) como de las estreptolisinas S (que actan mejor en presencia de oxgeno).
Hialuronidasa. Producida por los Streptococcus -hemolticos.Su virulencia est estrechamente
asociada a esta enzima, la cual ayuda a la rpida expansin de los Streptococcus en los tejidos con
presencia de cido hialurnico. Despus de infecciones de piel, faringe y desarrollo de fiebre reumtica
se detectan anticuerpos antihialuronidasa.
Estreptoquinasa. Producida por los grupos A, C y G. Existen varios tipos de la cual la 5K-A es la ms
comn. Estas enzimas han sido utilizadas con fines teraputicos por sus acciones fibrionolticas sobre
adhesiones pleurales y oclusiones arteriales.
La relacin entre los grupos de Streptococcus y diferentes patologas es una informacin vital para
determinar qu especie o qu grupo puede esperarse que se desarrolle en un cultivo segn el tejido,
rgano o sistema de donde proviene la muestra. Esta relacin es la siguiente:
Streptococcus beta hemoltico del grupo A (Streptococcus pyogenes).
Est asociada a faringoamigdalitis. El propsito de realizar el cultivo de exudado farngeo es la bsque-
da de esta bacteria en vista que dependiendo de cada pas, entre un 7-10% est asociada a fiebre
reumtica y glomerulonefritis. Este grupo tambin est asociado a abscesos amigdalinos, angina de
Ludwing y en los portadores de toxinas eritrognicas, a escarlatina.
Streptococcus beta hemoltico grupos B (Streptococcus agalactiae)
Contiene antgeno del grupo B (compuesto por un polmero de ramnosa-glucosamina).

Los Streptococcus -hemolticos del grupo B son parte de la microbiota normal de la faringe y vagina.
Muy raramente estn asociados a faringitis de importancia clnica, por lo que no debe reportarse a
menos que existan brotes epidmicos. Cuando se aisla de la vagina en mujeres embarazadas y en el
ltimo trimestre, debe reportarse. En recin nacidos prematuros, en nios a trmino con historia de
sufrimiento fetal y en inmunocomprometidos, suelen desarrollarse infecciones pulmonares, cardacas,
sepsis y meningitis por Streptococcus beta hemoltico grupos B adquiridos en la vagina durante el parto.
Streptococcus -hemoltico grupos C y D: Streptococcus grupo C (Streptococcus equisimilis,

Streptococcus zooepidemicus y Streptococcus equi ) y Streptococcus grupo G (Streptococcus bovis
y Streptococcus equinus).
Los grupo C y G son comensales de la nasofaringe, pero ambos pueden producir faringitis epidmicas.
Ambos grupos elevan las ASLO. No deben reportarse de rutina sino cuando se asocian a brotes
epidmicos.
Streptococcus grupo F (Streptococcus milleri) :

Puede ser causa de: infecciones supurativas graves, como celulitis, absceso de tejido profundo,
bacteremia, osteomielitis y endocarditis.
VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipo: Ver equipos en exudado farngeo.

1.2.2. Gradillas
1.2.3. Contenedores con cloro para desechar material contaminante
1.2.7. Tubos para coagulasa
1.2.8. Pinza estril.
1.2.10. Colorantes para tincin de gram
1.2.11. Peroxido de Hidrgeno (H2O2)al 30%.
1.2.12. Paquete comercial conteniendo frascos con anticuerpos para la deteccin de antgenos de
grupo, segn la clasificacin de Lancefield.
1.2.13. Discos de bacitracina de 0.04U
1.2.14. Pipeta semiautomtica 200-1000 L
1.2.15. Puntas estriles para las pipeta de 200-1000 L
1.2.16. Viales estriles de 1mL

1.3. Prueba para identificacin:

1.3.1. Coloracin de gram de las colonias
1.3.3. Prueba de Sensibilidad a bacitracina
1.3.4. Prueba de CAMP
1.3.5. Prueba confirmativa: Serologa

1.4.3. Streptococcus agalactia ATCC 1073
1.6. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Concentracin Mnima Inhibitoria:

Ninguno.
1.7. Pruebas especiales de sensibilidad antimicrobiana: Ninguna.

NOTA: La sensibilidad antimicrobiana para Streptococcus del grupo A se hace por razones de
vigilancia epidemiolgica. Hasta el momento no se han reportado cepas resistentes a la penicilina en
ninguna parte del mundo y este hecho debe ser conocido por el mdico tratante. El reporte de otros
antimicrobianos se justifica en caso de alergia a la penicilina.

2.3. Fundamento fisiolgico de la bacteria ante el medio de cultivo:

Los Streptococcus -hemolticos producen estreptolosina S, la cual es responsable de la intensa reaccin
hemoltica que se observa principalmente en los grupos A y B. La hemlisis que se observa realzada en
las estras profundas es producida tanto por las estreptolisinas O (que actan en ausencia de oxgeno)
como de las estreptolisinas S (que actan mejor en presencia de oxgeno). Suelen observarse UFCs
de 1mm o menos, mates y grisceas. Las del grupo A tienen las caractersticas de ser quebradizas, lo
que dificulta tomarlas con un asa recta.

2.4. Resultado:
El grupo A suele tener > 0,5mm de dimetro, redondas, bordes bien definidos y aspecto opaco. Al
manipularla la colonia es quebradiza. La beta hemlisis se observa como un halo transparente alrededor
de la colonia. En el rea donde se realiza la estra por puncin, la hemlisis se observa ms intensa en
la profundidad del agar. La morfologa e intensidad de hemlisis vara con los grupos C y G. Con el grupo
C las UFCs suelen ser ms pequeas y la zona de beta hemlisis es de menor intensidad.
2.5. Control de calidad de la hemlisis:

Resultado: Hemlisis positiva. Se observa un halo transparente alrededor de las UFCs.
Resultado: Hemlisis Negativa. No hay halo transparente alrededor de la colonia.
3. COLORACIN DE GRAM DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFCS):

3.1. Fundamento de la tincin: ver captulo 3.
Los Streptococcus se agrupan predominantemente en cadenas cortas y largas. Suelen observarse cocos
sueltos o en pares, esfricos.
3.4. Resultado:
Se observa cocos grampositivos agrupados predominantemente en cadenas.

Resultado: Se observa cocos grampositivos dispuestos en cadenas.
Los Estreptococcus -hemolticos de los grupos A, B, C, D, F y G carecen de la enzima catalasa, por
lo tanto no catalizan el H2O2 en oxgeno y agua.
4.4. Resultado:


Resultado:Negativo: No hay produccin de burbujas.
Resultado: Positivo. Se producen abundantes burbujas y de forma inmediata.
PRUEBA PRESUNTIVA PARA Streptococcus -hemolticos del grupo A :
5. PRUEBA DE BACITRACINA:
Los Streptococcus beta-hemolticos del grupo A son susceptibles a bajas concentraciones del antibitico
polipeptdico bacitracina. Proporciona un mtodo sencillo y econmico para la identificacin presuntiva
de este grupo de estreptococo.
5.2. Procedimiento:
5.2.1. Con una asa recta tomar de 1 UFC del plato de ASC.
5.2.2. Descargar el inculo en el centro de un plato de ASC.
5.2.3. Con una asa redonda estriar el inculo sobre un rea circular que abarque 2/3 del plato.
Estriar en tres direcciones.
5.2.4. Con una pinza previamente flameada, colocar un disco de bacitracina de 0,04 unidades
(Taxo A 0,04 U). Asegurar que el disco est adherido a la superficie del agar presionando
suavemente sobre el mismo.
5.2.5. Incubar de 35-37 oC durante 18-24 horas.

Los Streptococcus -hemolticos del grupo A son susceptibles a bajas concentraciones de bacitracina.
5.4. Resultado:
Cualquier halo de inhibicin, sin importar su dimetro, indica sensibilidad a la bacitracina.

Resultado: Sensible (S): Se observa un halo de inhibicin.
5.5.2. Streptococcus agalactiae ATCC 1073
Resultado: Resistente (R): No hay halo de inhibicin. Se observa crecimiento hasta los bordes del disco.

Figura 1. Prueba de Bacitracina.
Limitaciones de la prueba: Esta prueba solo debe realizarse a Streptococcus -hemolticos, ya que
muchos Streptococcus alfa hemolticos (incluyendo neumococos) son susceptibles a bajas
concentraciones de bacitracina.
NOTA: Cuando la prueba de bacitracina es sensible se informa:
Streptococcus -hemoltico presuntivamente del grupo A. Requiere confirmacin. Si el informe se escribe
haciendo uso del programa WHONET, escribir una nota (en observaciones) que indique: Diagnstico
presuntivo.
PRUEBA PRESUNTIVA PARA Estreptococcus -hemolticos del grupo B:
1. PRUEBA DE CAMP:
La actividad hemoltica de la -hemolisina producida por la mayora de las cepas de Staphylococcus
aureus es intensificada por una protena extracelular producida por los Streptococcus del grupo B. La
interaccin entre la -hemlisis del Staphylococcus aureus y el Streptococcus agalactiae (grupo B) es
sinrgica y el resultado se manifiesta como una zona de hemlisis en forma de punta de flecha (ver
figura.2) . La prueba de CAMP no es confirmativa debido a que con otras bacterias se ha observado el
mismo fenmeno (por ejemplo: Listeria monocytogenes, Listeria seeligeri, Corynebacterium afermentans,
Corynebacterium auris, Corynebacterium coyleae, Corynebacterium falsenii, Corynebacterium imitans,
Corynebacterium striatum, Turicella otitidis, Arcanobacterium haemolyticum son CAMP positivas).
6.2. Procedimiento:
6.2.1. Con una cepa fresca de Staphylococcus aureus ATCC 25923 haga una estra recta en un
plato de ASC, de manera que abarque de un lado al opuesto, pasando por el centro (imagi-
nando un reloj, sera como trazar una lnea entre las 12 y las 6 pasando por el centro).

6.2.2. Con la cepa sospechosa de ser Streptococcus grupo B realizar una estra en lnea recta de tal
manera que forme un ngulo recto con respecto a la estra del Staphylococcus aureus. (en el
reloj, sera como trazar una lnea de las 9 al centro).
6.2.3. Repetir el mismo procedimiento del lado opuesto, utilizando 2 cepas. Un control positivo con un
Streptococcus -hemoltico del grupo B (Streptococcus agalactiae) previamente identificado y que
debe ser mantenido como una cepa control. La otra cepa debe ser un control negativo, realizada
con un Streptococcus -hemoltico del grupo A (Streptococcus pyogenes).
6.2.4. Incubar a 35-37 oC durante 18-24 horas.
6.2.5. Lectura: el control con Streptococcus agalactiae da una imagen similar a una flecha. La punta de
la flecha es una zona de hemlisis intensa. El control negativo no da la imagen de flecha,
solamente se observa hemlisis alrededor de la estra del inculo realizado. Si la cepa en estudio
da una imagen similar al control positivo (Streptococcus agalactiae) se considera CAMP positiva
y por lo tanto, presuntivamente como Streptococcus - hemoltico del grupo B.

Las hemolisinas S de los Streptococcus del grupo B actan sinrgicamente con las hemolisinas del
Staphylococcus aureus, lo cual da como resultado una intensificacin de la zona de hemlisis. La
forma en punta de flecha se logra por la disposicin espacial de ambas estras.
6.4. Resultado:
Positivo: Se observa beta hemlisis en forma de punta de flecha

Resultado: Negativo: No se observa beta hemlisis en forma de punta de flecha.
6.5.2. Streptococcus agalactiae ATCC 1073
Resultado: Positivo: Se observa beta hemlisis en forma de punta de flecha.
Figura 2. Prueba de CAMP Test

Limitaciones de la prueba:
Esta prueba no debe de incubarse en atmsfera con CO 2 ya que algunos Streptococcus del grupo A
pueden resultar positivos.
NOTA: Cuando la prueba de CAMP es positiva se informa :
Streptococcus -hemoltico presuntivamente del grupo B. Requiere confirmacin. Si el informe se escribe
haciendo uso del programa WHONET, escribir una nota (en observaciones) que indique: Diagnstico
presuntivo.
1. PRUEBA DE CONFIRMACIN POR MEDIO DE LA DETECCIN DEL ANTGENO DE

LA PARED CELULAR:
7.1. Fundamento de la Prueba: ver captulo 17.

7.2. Fundamento inmunolgico de la bacteria:
La clasificacin de los Streptococcus se fundamenta en la presencia de caractersticas fisiolgicas e
inmunolgicas en base a un esquema desarrollado por Rebecca Lancefield. En este esquema, los
Streptococcus han sido diferenciados en dos grandes grupos y 20 especies (A-H y K-V). La base de
la clasificacin la constituyen los polisacridos de la pared celular en la que un carbohidrato especfico
designa a un grupo. La excepcin la constituye el grupo D, cuyo antgeno est conformado por un cido
glicerolteicico. Estos carbohidratos ms el cido glicerolteicico tienen propiedades antignicas ca-
paces de estimular la formacin de anticuerpos que tienen utilidad diagnstica.
7.3. Procedimiento:
7.3.1. Procedimiento de la extraccin del antgeno por medio de calor y presin utilizando
el autoclave.
7.3.1.1. Sembrar el cultivo puro del estreptococo en estudio en 10 ml de BHI (Infusin Cerebro
Corazn).
7.3.1.2. Incubar a 35-37 oC durante 18-24 horas.
7.3.1.3. Verificar la pureza del cultivo con frotis y coloracin de Gram.
7.3.1.4. Centrifugar el cultivo del caldo a 3,500 rpm durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante
en un contenedor con cloro al 10%.
7.3.1.5. Agregar 0,5mL de solucin salina (0,85%) al sedimento.
7.3.1.6. Agitar vigorosamente y llevar al autoclave a 1,08 kg/cm 2 BAR de presin (15 lb/pg2 PSI),
121 oC durante 10 minutos.
7.3.1.7. Centrifugar a 3,500 rpm durante 10 minutos.
7.3.1.8. Extraer el sobrenadante con una pipeta semiautomtica de 200-1000 L y ponerlo en un vial
estril de 1mL.
NOTA: Los kits comerciales traen enzimas de extraccin del antgeno, el procedimiento de la extrac-
cin depende de la casa comercial. En el prospecto describe la forma de realizar el procedimiento. En
caso que este reactivo se termine se realiza el mtodo de autoclave antes descrito.

7.3.2. Aglutinacin con ltex: La prueba de aglutinacin con ltex se basa en el empleo de an-
ticuerpos altamente especficos contra el conjunto de antgenos de grupo segn la clasificacin
de Lancefield. Estos anticuerpos estn adsorbidos a partculas de poliestireno (ltex) con el
propsito que la reaccin sea claramente visible.
7.3.2.1. Dejar los reactivos a temperatura ambiente.
7.3.2.2. Mezclar vigorosamente para conseguir una suspensin homognea.
7.3.2.3. Depositar 1 gota del antgeno que sirve como control positivo en el rea indicada en la tarjeta
disponible para realizar la reaccin. Repetir el procedimiento con el control negativo.
7.3.2.4. Aadir 1 gota del ltex con el anticuerpo a cada uno de los controles.
7.3.2.5. Mezclar empleando el palillo que usualmente traen los paquetes comerciales. Descartar el
palillo en el contenedor con cloro al 5%.
7.3.2.6. Rotar la muestra manualmente o con un rotador de 300rpm, durante 1 minuto.
7.3.2.7. Leer los resultados. Se debe observar una franca y rpida aglutinacin en el crculo del control
positivo y una suspensin lechosa homognea en el crculo del control negativo.
7.3.2.8. Poner una gota del antgeno de la muestra en estudio en uno de los crculos disponibles en
la tarjeta.
Agregar una gota del anticuerpo antigrupo, segn los resultados obtenidos con la prueba positiva: Si la
prueba de bacitracina fue positiva utilice el antisuero del grupo A, si la prueba de CAMP fue positiva
emplee el antisuero del grupo B. Si ninguna de las dos pruebas fuera positiva contine con los antisueros
de los grupos C y G o segn el origen de la muestra y la frecuencia de los grupos aislados en su
laboratorio. Si bioqumicamente se trata de un Streptococcus bovis emplee el antisuero del grupo D. En
todos los casos proceda como se indica en los numerales del 7.3.2.5 al 7.3.2.7. Una lectura positiva
evidencia aglutinacin similar al control positivo o en caso contrario, la reaccin es similar al control
negativo.
Nota: cuando la reaccin de aglutinacin es dbil y de lenta aparicin debe continuarse con los
antisueros de los otros grupos hasta identificar la reaccin ms intensa y rpida.
Descartar la tarjeta en el contenedor con cloro al 5%.
7.4. Resultados:
Positiva: Hay aglutinacin homognea, clara y rpida con el antisuero especfico de grupo. Se infor-
ma segn el grupo identificado, por ejemplo: Streptococcus pyogenes (si el suero con el que aglutin
fue el del grupo A) o Streptococcus -hemoltico del Grupo A.
Negativa: No hay aglutinacin o es muy dbil y de aparicin lenta. Se informa como microbiota
normal.
Sensibilidad a los antimicrobianos: No debe reportarse la sensibilidad al Streptococcus pyogenes (grupo
A). La sensibilidad se realiza con fines de vigilancia epidemiolgica. Hasta el ao 2002 no se han
reportado Streptococcus pyogenes resistentes a la penicilina. Sin embargo los resultados deben
informarse al mdico a solicitud de ste cuando la razn est justificada como en el caso de pacientes
alrgicos a la penicilina que requieren otros antimicrobianos como segunda eleccin.

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Ayoub EM, Ferreri P. Group A Streptococal Diseases in Infectious Diseases, chap. 30. Paul D.
Hoeprich editor, 5 th ed, JB Lippincott Co. Philadelphia, 1994.
2. Rouff KL, Whiley RA and Beighton D. Streptococcus in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R.
Murray editor in Chief. Chap 17, 7th edition 1999, ASM, Washington.
3. Lpez Cruz SR, Centeno R y Reyes Cerros J.: Normas Tcnicas para Exudados Farngeos en: Normas
Tcnicas de Bacteriologa, Cap. XII. Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnstico y
Referencia CNDR. 3 ed., 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Edito-
rial Imprimatur, Managua, Nicaragua.
4. Meja Sandino MJ. Exudado Farngeo II en Manual de Bacteriologa Mdica 3 ed., 2001, Ministerio
Laboratorios Post Huracn MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR. Managua, Nicaragua.
5. Los cocos Grampositivos Parte II en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, Cap. 12,
5 ed., 1996. Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
6. Streptococcus spp en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelgerg. Geo F. Brooks, editor,
Cap. 15, 16 ed. (de la 21 edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico D.F.
7. Facklam RR. Streptococcus en Manual de Procedimiento para el Aislamiento e Identificacin de
Streptococcus, Cap. II, Reimpreso de Prevencin y Control de la Fiebre Reumtica en la Comunidad.
Organizacin Panamericana de la Salud OPS, Publicacin Cientfica No. 399, 1980.

CAPTULO 11.
Procedimientos para la identificacin de
Bordetella pertussis
La muestra para aislar Bordetella pertussis es el exudado paranasal y se recomienda no administrar
tratamiento sistmico 3 das antes a la toma de muestra.
Bordetella pertussis se adhiere a las clulas cilndricas del tejido nasal, por lo que preferentemente crece
y reside en la nasofaringe. Por otro lado, la microbiota de la faringe es mayor y variada que la de las
narinas, por lo que las muestras tomadas en ese sitio dificultan mas su aislamiento.
Bordetella pertussis es sensible a los cidos grasos contenidos en hisopos de algodn, de tal manera que
deben emplearse los de alginato de calcio o dacrn. Los hisopos deben estar envueltos en un palillo
flexible ( no utilizar aplicadores de madera, ante el peligro que se rompan con los movimientos defensivos
del paciente).
1. Inclinar la cabeza del paciente hacia atrs.
2. Introducir un hisopo aproximadamente 2-3 cms en la narina correspondiente.
3. Presionar y rotar en la parte anterior de la nasofaringe durante un perodo no mayor de 30
segundos. Utilizar un segundo hisopo para la otra narina.
4. Introducir los hisopos en el medio de transporte de Charcoal.

Cuando el tiempo de transporte es entre dos a 24 horas, las muestras deben ser transportadas en el
medio de Charcoal a temperatura ambiente. Las muestras no deben refrigerarse.
III. PROCESAMIENTO DEL EXUDADO PARANASAL:

1. Con un marcador indeleble trazar una lnea a la parte posterior del plato de agar Charcoal Sangre
de Caballo (CSC) de tal forma que lo divida en dos partes iguales. Sembrar la muestra de cada
hisopo en el extremo de cada seccin dividida y luego estriarla en la forma habitual.
2. Incubarla a 35-37oC por 7 das en cmara hmeda ( colocar un recipiente grande lleno de agua
dentro de la incubadora, de lo contrario puede presentar problemas en el crecimiento o introduzca
los platos en una jarra con un recipiente pequeo conteniendo agua). El crecimiento se puede
observar despus de las primeras cuarenta y ocho horas de incubacin pero puede tardar 7 dias.
Captulo 11: Procedimientos para la identificacin de Bordetella pertussis 165

1.1. Hisopos de alginato de calcio.
2. TRANSPORTE:
2.1. Un contenedor irrompible para el traslado de las muestras.
3. PROCESAMIENTO:
No hay procesamiento previo a la siembra.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: el aislamiento de Bordetella pertussis es un procedimiento del Centro de
Referencia.

El gnero Bordetella abarca seis especies: B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, B. avium,
B. hinzii y B holmesii, (anteriormente grupo CDC NO-2). Son cocobacilos gramnegativos pequeos
en los aislamientos primarios. En los subcultivos las bacterias por lo general son ms pleomrficas.
Bordetella pertussis es un cocobacilo pequeo de tincin plida, catalasa y oxidasa positiva, aerobia
estricto, que se desarrolla ptimamente a 35-37 oC, entre 3 y 4 das de incubacin, no utiliza
carbohidratos y es inactiva en la mayora de las pruebas bioqumicas.
Su aislamiento requiere el empleo de medios enriquecidos como Charcoal Sangre de Caballo (CSC). En
este medio las colonias pueden ser ligeramente -hemolticas, sobre todo en las reas ms confluyentes
de desarrollo, despus de una incubacin prolongada. En los aislamientos frescos desarrollan colonias
lisas y brillantes con un perfil alto y en forma de cpula, similares a pequeas gotas de mercurio que
miden de 1-2 mm de dimetro.
El resto de las especie del gnero Bordetella son menos exigentes y se desarrollan en los medios de rutina,
como Agar Sangre de Carnero y Agar McConkey.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.1. Incubadora
1.1.2. Microscopio con objetivo de 100x y ocular de 10x
166 Captulo 11: Procedimientos para la identificacin de Bordetella pertussis


1.2.4. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de materiales descartables
1.2.5. Jarra de vidrio
1.2.7. Solucin salina estril al 0.85%
1.2.8. Cristal violeta
1.2.9. Lugol
1.2.10. Alcohol 70 o o alcohol acetona (1:1)
1.2.11. Fucsina acuosa o safranina.
1.2.12. Dihidrocloruro de tetrametil-para-fenilendiamina
1.2.13. MIO
1.2.14. Urea
1.2.15. Caldo para NO3NO2
1.2.16. Reactivo A (a-Naftilamina, cido actico 5N)
1.2.17. Reactivo B (cido sulfanlico, cido actico 5N)

1.3.1. Agar Mac Conkey (como prueba de crecimiento)
1.3.2. Agar Sangre de Carnero (como prueba de crecimiento)

1.4.1. Morfologa macroscpica
1.4.2. Coloracin de Gram de la colonia
1.4.3. Prueba de la oxidasa
1.4.4. Movilidad a 37oC (MIO)
1.4.5. Hidrlisis de la Urea
1.4.6. Reduccin de Nitratos
1.4.7. Crecimiento en Agar Mac Conkey
1.4.8. Crecimiento en Agar Sangre

1.5.1 Bordetella pertussis ATCC 10536
1.5.4 Bordetella parapertussis ATCC 15311

1.6 Sensibilidad a los antimicrobianos:

No hay puntos de corte para difusin en agar por lo que debe realizarse por CIM.
2. CARACTERSTICAS DE LAS UFCs EN AGAR CHARCOAL SANGRE DE CABALLO

(CSC):
Colonias lisas y brillantes con un perfil alto y en forma de cpula, similares a pequeas gotas de mer-
curio que miden de 1-2 mm de dimetro.

DEL AGAR CHARCOAL SANGRE DE CABALLO (CSC):
3.1 Procedimiento para la preparacin del frotis:

3.1.1. Utilizando un asa recta, tome del Agar Charcoal una UFC y emulsinela en una pe-
quea gota de solucin salina estril sobre un portaobjetos limpio. Disprsela en un rea de
1 cm por lado. El grosor de la muestra debe ser tal que se debe leer a travs de ella.
3.1.2. Djela secar a temperatura ambiente y luego fjela pasndola rpidamente sobre el mechero.
3.2. Procedimiento para la tincin de Gram: ver captulo 3.
3.3. Resultado:
Se observan cocobacilos gramnegativos cuya caracterstica ms notable es que se tien dbilmente.
No hay una agrupacin caracterstica.

3.4.1. Bordetella pertussis ATCC 10536
Resultado: Se observan cocobacilos gramnegativos, dbilmente teidos.
Resultado: Se observa cocos grampositivos en racimos.
4.1. Fundamento de la prueba: Ver captulo 17.

4.2. Procedimiento: Ver captulo 17.
Bordetella pertussis posee la enzima citocromooxidasa. Por lo tanto da reaccin positiva, que se
caracteriza por la aparicin de un color prpura en la tira reactiva.

4.4. Resultado:

4.5.1. Bordetella pertussis ATCC 10536
Resultado: Se observa un color prpura en la tira reactiva.
4.5.2. Bordetella parapertussis ATCC 15311
Resultado: No se observa viraje de color en la tira reactiva.
5. PRUEBA DE MOVILIDAD A 37oC:

5.1. Fundamento de la Prueba: ver captulo de 17.
5.2. Procedimiento: ver captulo de 17.
Bordetella pertussis no posee flagelos, por lo tanto es inmvil.
5.4. Resultado:
Movilidad negativa: se observa crecimiento solamente a lo largo de la puncin del inculo.

5.5.1. Bordetella pertussis ATCC 10536.
Resultado: Se observa crecimiento solamente a lo largo de la puncin del inculo.
Resultado: Se observa crecimiento difuso en todo el medio.
6. PRUEBA DE UREA:

Bordetella pertussis carece de la enzima ureasa por lo tanto no hidroliza la urea.
6.4. Resultado:
Hidrlisis de urea negativa, no hay viraje en el color, el medio se observa ligeramente amarillo.

6.5.1. Bortedella pertussis ATCC 10536

Resultado: No hay viraje de color. El medio conserva su color original.

6.5.2. Bordetella parapertussis ATCC 15311
Resultado: Hay viraje de color del amarillo al rosado prpura.
7. PRUEBA DE REDUCCIN DE NITRATOS A NITRITOS:

Bordetella pertussis no tiene la capacidad de reducir los nitratos a nitritos y a otros productos de
reduccin, por lo tanto la prueba es negativa.
7.4. Resultado:
Reduccin de nitratos negativa: no hay viraje de color al agregar los reactivos A y B

7.5.1. Bortedella pertussis ATCC 10536 .
Resultado: No hay reduccin de nitratos a nitritos: no hay viraje de color. El medio conserva su
color original despus de agregar los reactivos.
Resultado: Hay reduccin de nitratos a nitritos: hay viraje de color del amarillo al rosado prpura
despus de agregar los reactivos.
8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY:

Bordetella pertussis no tiene la capacidad para desarrollarse en Agar Mac Conkey, por lo tanto
la prueba es negativa.
8.4. Resultado:
Crecimiento en Agar Mac Conkey negativo.

8.5.1 Bordetella pertussis ATCC 10536.
Resultado: No hay crecimiento bacteriano.

8.5.1 Escherichia coli ATCC 25922.

Resultado: Crecimiento de UFCs rosadas caractersticas.
9. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN AGAR SANGRE:
9.1. Fundamento del medio: Ver captulo 17.

Bordetella pertussis no tiene la capacidad para desarrollarse en Agar Sangre, por lo tanto la prueba
es negativa.
9.4. Resultado:
Crecimiento en Agar Sangre de Carnero negativa: no se observa crecimiento bacteriano.
9.4.1 Bordetella pertussis ATCC 10536
Resultado: No hay crecimiento bacteriano.
9.4.1 Bordetella parapertussis ATCC 15311
Resultado: Se observa crecimiento bacteriano.
Tabla No. 1
CARACTERSTICAS DIFERENCIALES DE LAS ESPECIES
DEL GNERO BORDETELLA
PRUEBA Bordetella Bordetella Bordetella

pertussis parapertussis bronchiseptica
Oxidasa + +
Movilidad 37oC +
Hidrlisis de Urea + (24h) + (4h)
Reduccin de Nitratos +
Desarrollo en Mac Conkey V +
Desarrollo en Sangre + +
V: Variable.
V. INFORME DE LOS RESULTADOS FINALES:

Positivo: Se aisl Bordetella pertussis.
Negativo: No se aisl Bordetella pertussis.


Bordetella pertussis
Agar Charcoal Sangre de Caballo (CSC):

Colonias lisas y brillantes similares a pequeas gotas de mercurio.
Frotis: cocobacilos gramnegativos dbilmente teidos
Oxidasa: positiva Movilidad 37C:

negativa
Reduccin de Nitratos: Hidrlisis de Urea:

negativa negativa
Desarrollo en Agar Mac Desarrollo en Agar

Conkey: negativo Sangre: negativo
VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Lpez Cruz SR. Normas Tcnicas para el diagnstico de Bordetella pertussis en Normas Tcnicas de
Bacteriologa CaptuloXIII. Sergio R. Lpez, Justo Reyes Cerros, Alcides Gonzlez Mairena, Rosibel
Centeno, 3 edicin, 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR,
Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua,
Nicaragua.
2. Bacilos Gramnegativos Exigentes en Diagnstico Microbiolgico, Elmer W. Koneman editor, Cap. 8,
5 edicin, 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
3. Haemophilus, Bordetella, y Brucella en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. George
F. Brooks editor, Cap. 19, 16 edicin (de la 21 edicin en ingls), 1998, Editorial El Manual
Moderno, S.A. de C.V. Mxico, D.F.
4. Hoppe JE. Bordetella in Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray ed in chief, chap 40,
7th ed, 1999, ASM Press, Washington, D.C.
186
CAPTULO 12.
Procedimientos para las bacterias
aisladas en el coprocultivo
1.1. Recolectar la muestra en un frasco limpio de boca ancha en cantidad aproximada

de 5g.
1.2. Cerrar hermticamente el frasco.
1.3. No haber ingerido tratamiento antimicrobiano 3 das antes.
2. TIPO DE MUESTRA:
2.1. Heces fecales recin evacuadas:

Para la obtencin de las heces debe utilizarse un frasco estril boca ancha con tapa de rosca, y reco-
ger una cantidad aproximada de 5g, luego se lleva la muestra al laboratorio lo mas pronto posible.
La muestra recogida debe ser procesada lo antes posible y no dejar transcurrir ms de dos horas despus
de haber sido obtenida.
Si transcurren ms de dos horas para la siembra, se almacena la muestra a temperatura de 4 oC.
2.2. Hisopado rectal:

El Hisopado rectal tiene dos indicaciones: 1) Procesamiento inmediato de una muestra sin la posibili-
dad de obtener heces frescas en ese momento, 2) estudios en pacientes portadores.
Tomar la muestra con el hisopo estril, humedecer un extremo del hisopo con un lquido estril,
no bacteriosttico o introducirse ligeramente en el medio de transporte, si es que ste va ha utilizar-
se (no deben usarse lubricantes) y una vez insertado en el esfnter rectal, se har girar antes de reti-
rarlo. El nmero de hisopo depender del tipo de investigacin que se vaya a realizar.

La muestra recolectada en un frasco estril, debe transportarse al laboratorio de ser posible, en un
ambiente fro.
Si la muestra demora ms de 2 horas en llegar al laboratorio, debe transferirse a un medio como el
Stuart o Cary Blair y transportarla a temperatura ambiente. Cuando la muestra es transportada en los
medios de Stuart o Cary Blair se deben introducir 2 hisopos en el medio, uno para procesamiento de
Captulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo 173

clera si se realizara en el laboratorio y el otro para bsqueda de Salmonellas spp , Shigellas spp y
Escherichia coli 0157 : H7.
En caso de hisopado rectal el hisopo se colocar en un tubo vaco estril con tapa si se va a procesar
en trmino de 2 horas, de lo contrario se introduce el hisopo en el medio de transporte.
1. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DE HECES FRESCAS:
1.1. Tomar un hisopo e introducirlo en la muestra teniendo cuidado de mezclarla homo-

gneamente, luego sembrarla directamente en el medio de Agar MacConkey (MacC),
Agar Salmonella Shigella (SS) y Caldo Selenito (CS), tomando en cuenta que debe:
1.1.1. Inocular la muestra con un lado del hisopo en MacC.
1.1.2. Inocular el lado opuesto del hisopo en Agar SS.
1.1.3. Introducir y dejar el hisopo en el Caldo Selenito.
La razn de sembrar la muestra primero en Agar MacConkey, se debe a que este medio tiene menos
inhibidores que el Agar SS.
1.2. Dejar secar el inculo en los medios mencionados aproximadamente 5 minutos y estriar el medio
en la forma usual. (Ver procedimiento en captulo 17).
1.3. Incubar los medios a temperatura de 35-37oC durante 18 a 24 horas, excepto el Caldo Selenito
cuyo tiempo de incubacin debe ser de 6 a 12 horas.
1.4. Realizar un subcultivo de caldo Selenito a Agar SS e incubar de 35 a 37oC durante 18 a 24 horas.
2. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DEL MEDIO DE TRANSPORTE:

Debe contener dos hisopos. Utilice un hisopo para clera y el segundo hisopo utilcelo para bsqueda
de Salmonella spp, Shigella spp y Escherichia coli o 157:H7. Realizar el procedimiento antes descrito.
3. SI LA MUESTRA ES DE UN HISOPADO RECTAL:

Inocularla en los medios antes mencionados y realizar el mismo procedimiento anterior.
1. TOMA DE MUESTRA:
1.1. Frasco estril, de boca ancha y tapa de rosca.
1.2. Hisopos estriles.
1.3. Guantes.
174 Captulo 12: Procedimientos para bacterias aisladas en el coprocultivo

2.1. Tubos conteniendo medio de transporte de Stuart o Cary Blair .
2.2. Termo con refrigerante.
3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
3.1. Equipos:
3.1.1. Incubadora a 35-37 o C
3.1.2. Refrigeradora a 6-8 o C
3.1.3. Bao de Mara
3.1.6. Guantes
3.2. Materiales:
3.2.3 Asas bacteriolgicas rectas y redondas
3.2.4 Contenedores con cloro al 0.5% para desechar material contaminante.

3.3.1. Agar Salmonella Shigella (ASS)
3.3.2. Agar MacConkey (MacC)
3.3.3. Caldo Selenito (CS)

de Shigella spp
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 y 1.4.10 con respecto a pruebas de
identificacin.

El gnero Shigella pertenece a la Tribu Escherichiae de la Familia Enterobacteriaceae y como tales son
bacilos gram negativos que fermentan la glucosa, no fermentan la lactosa excepto Shigella sonnei que
lo hace lentamente; son anaerobios facultativos no esporulados, no presentan cpsula y son inmviles ya
que no poseen flagelos. Son bacterias de crecimiento rpido en medios de baja selectividad como Agar
MacConkey y en medios altamente selectivos como Agar Salmonella Shigella excepto algunas cepas de
Shigella dysenteriae serotipo 1 que pueden ser inhibidas en su crecimiento. Proliferan bien en medios de
enriquecimiento altamente inhibidores como selenito.
El gnero Shigella est constituido por cuatro especies dysenteriae (serogrupo A), flexneri (sero-
grupo B), boydii (serogrupo C) y sonnei (serogrupo D).
Dentro de la especie dysenteriae, se agrupan 13 serotipos del 1 al 13, con mayor importancia clnica
el serotipo 1 causante de disentera bacilar. Esta especie tiene la particularidad de no fermentar el manitol
y adems:
1. Ausencia de catalasa, contraria a las dems Enterobacterias.
2. Posee una enzima -galactosidasa muy activa (prueba de ONPG rpidamente positiva, en menos
de una hora).
Shigella dysenteriae 6 a diferencia de S. dysenteriae 1 es ONPG lenta (18 horas).

Dentro de la especie flexneri se agrupan 6 serotipos del 1 al 6. Asimismo dentro de los serotipos 2 y
3 se agrupan subtipos a y b que son variaciones menores ligadas a conversin bacteriofgica (se refiere
a fagos, cierto tipo de virus que infectan bacterias y que son tiles para clasificarlas) realizada slo en
laboratorios especializados.
El serotipo de Shigella flexneri 6 posee variedades bioqumicas que producen poco gas a partir de la
glucosa en el sitio de inoculacin del agar inclinado Triple Sugar Agar o Kligler Iron Agar. Estas
variedades son: Boyd 88, Manchester y Newcastle.

Dentro de la especie boydii, se agrupan 18 serotipos del 1 al 18. El serotipo de Shigella boydii 14 tiene
la particularidad de producir poco gas en el sitio de inoculacin. El serotipo 9 es ONPG positiva.
Algunas cepas del serotipo 10 poseen un antgeno de superficie que enmascara al antgeno O, el cual
debe ser eliminado calentando el cultivo a 100 oC segn se describe ms adelante.
Dentro de la especie sonnei existen dos tipos de cepas con caractersticas geno y fenotpicas que sirven
como orientacin diagnstica:
1. Colonias de fase I son lisas, de contorno circular y convexo. Los antgenos de fase I son aglutinables
por antisueros para antgeno de fase I.
2. Colonias de fase II son rugosas, de contornos irregulares. Los antgenos de fase II son aglutinables
por antisueros para antgeno de fase II.
Esta disociacin ha permitido descubrir la funcin de un plsmido, en el poder invasivo o patgeno de
las shigellas:
1. Las colonias fase I poseen un plsmido que confiere caractersticas invasivas o virulentas.
2. Las colonias fase II han perdido ese plsmido, no son invasivas o avirulentas.
La prdida del plsmido no slo significa un cambio en el aspecto de la colonia, tambin en la
especificidad antignica y en el potencial patgeno.
La shigellosis es endmica en los climas tropicales y templados y es ms frecuente en verano. En
Nicaragua, se han aislado con mayor frecuencia las especies de S. flexneri y S. sonnei en segundo lugar.
S. boydii se aisla con muy poca frecuencia.
El modo de transmisin es fecal-oral, de forma directa o de forma indirecta, al contaminar los alimentos.
El perodo de incubacin es de 12-96 horas 1-3 das e incluso de una semana en el caso de S.
dysenteriae 1.
La gravedad y letalidad de la infeccin y desarrollo de la enfermedad dependen de la edad del enfermo,
el estado nutricional, la magnitud de la dosis infectante (de 10 a 100 clulas bacterianas), la especie y
el serotipo de la especie.
Entre las exotoxinas que produce Shigella estn las citotoxinas que ejercen un efecto nocivo especfico
sobre la clula intestinal, produciendo una diarrea profusa no sanguinolenta en etapa temprana y la
invasin del intestino delgado que da por resultado aparicin posterior de sangre con pus en las
deposiciones.
S. dysenteriae 1 posee, adems de las enzimas y exotoxinas que le confieren las caractersticas des-
critas anteriormente, neurotoxinas que se asocian a una alta mortalidad tal y como ocurri en la
epidemia de shigellosis por este serotipo en donde durante los primeros 4 aos fueron afectadas ms de
medio milln y murieron 20,000 personas en toda Centroamrica. Esta neurotoxina acta blo-
queando las terminales nerviosas del SNC y produce hemorragias en la mdula espinal que llevan a
edema y compresin en los nervios y por ltimo, parlisis y la muerte.
Las mejores oportunidades de aislar a las shigellas por medio del coprocultivo se dan en la etapa inicial
o fase aguda de la enfermedad cuando este patgeno est en mayor nmero en las heces y antes de
administrar cualquier antibitico. Deben ser heces recin evacuadas o que tengan moco.

VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipo:
1.1.2. Microscopio con objetivos de 40x
1.1.5. Bao Mara a 100 oC

Materiales:
1.2.4. Contenedores con cloro al 0.5% para descarte de material no reusable
1.2.7. Pipetas automticas de 40-200 L y de 200-1000 L
1.2.8. Lmpara fluorescente blanca para lectura de serologa
Reactivos:
1.2.9. Reactivo de Kovac o Erlich
1.2.12. Solucin Salina estril al 2 %
1.2.13. Antisueros para serogrupo A de Shigella dysenteriae
1.2.14. Antisueros para serogrupo B de Shigella flexneri
1.2.15. Antisueros para serogrupo C de Shigella boydii
1.2.16. Antisueros para serogrupo D de Shigella sonnei
1.2.17. Antisueros para serotipos del 1 al 13 de Shigella dysenteriae
1.2.18. Antisueros para serotipos del 1 al 6 de Shigella flexneri
1.2.19. Antisueros para serotipos del 1 al 18 de Shigella boydii
1.2.20. Antisueros para antgenos de fase I y II de Shigella sonnei

1.3.1. Agar Salmonella Shigella
1.3.2. Agar MacConkey
1.3.3. Caldo Selenito


1.4.1. Triple Sugar Iron
1.4.2. Lisine Iron Agar
1.4.3. Movilidad Indol Ornitina
1.4.4. Utilizacin de Citrato de Simmons
1.4.5. Hidrlisis de Urea
1.4.6. Prueba de ONPG
1.4.7. Descarboxilacin de Ornitina en caldo
1.4.8. Utilizacin de Acetato de sodio
1.4.9. Fermentacin de Mucato
1.4.10. Determinacin de especie por seroaglutinacin con sueros de grupo
1.4.11. Determinacin de serotipo y subtipo por seroaglutinacin
1.5. Cepas para control de calidad

1.5.1. Shigella flexneri OPS 45
1.5.3. Escherichia coli CNDR RV 1
1.5.4. Proteus miriabilis ATCC 7002
2. CRECIMIENTO EN AGAR SALMONELLA SHIGELLA (AGAR SS):

Las shigellas carecen de las enzimas galactsidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto no tienen la
capacidad de fermentan la lactosa y aparecen como colonias transparentes en el medio, convexas y de
2 a 4 mm de dimetro luego de 24 horas de incubacin.
Es recomendable usar este medio en conjunto con otro medio menos inhibidor como Agar MacConkey
debido a que Salmonella Shigella Agar inhibe el crecimiento de algunas cepas de Shigella dysenteriae
serotipo 1.
2.4. Resultado:
Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de dimetro.


2.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45
Resultado: Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de dimetro.
3. CRECIMIENTO EN AGAR MacCONKEY:

Las shigellas carecen de las enzimas galactsidopermeasa y galactosidasa, por lo que no tienen la
capacidad de fermentan la lactosa y las colonias aparecen incoloras o transparentes, convexas
y pequeas de 2 a 4 mm de dimetro despus de 24 horas de incubacin.
3.4. Resultado:
Crecimiento de colonias incoloras, transparentes, convexas y de 2-4 mm de dimetro.

Resultado: UFCs lactosa negativas: crecimiento de colonias transparentes, convexas y de 2-4 mm.
Resultado: UFCs lactosa positivas: crecimiento de colonias rosadas, convexas y de 2-4 mm.
4. CRECIMIENTO EN CALDO SELENITO:

El selenito es un medio enriquecedor que acta inhibiendo el crecimiento de la mayora de gram-
negativos, con lo cual favorece el crecimiento de otras bacterias, pero principalmente, shigellas y
salmonellas.
Las especies de Shigella de pacientes con infecciones leves donde el nmero de microorganismos puede
estar por debajo de 200 por gramo de heces, se pueden recuperar del caldo selenito si se subcultivan
dentro de 6 a 12 horas de incubacin.
4.4. Resultado:
Turbidez del caldo a las 8 a 12 horas de incubacin.


Resultado: Turbidez del caldo. Buen crecimiento y recuperacin.

Resultado: Poca turbidez del caldo. Sin incremento o en muy pequea cantidad
5. PRUEBA EN TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO O TRIPLE SUGAR IRON POR SUS
SIGLAS EN INGLS):
Todas las shigellas poseen la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo que fermentan la glu-
cosa. No poseen la enzima invertasa, por lo tanto no pueden fermentar la sacarosa. Algunas varie-
dades de Shigella flexneri 6 y Shigella boydii 14 que poseen la enzima deshidrogenasa frmica pro-
ducen muy poca cantidad de gas a partir de la glucosa, en el punto de inoculacin.
Shigella sonnei posee la enzima galactosidasa y por lo tanto es la nica especie del gnero Shigella
que puede fermentar lentamente la lactosa en 2 a 3 das.
5.4. Resultado:
5.4.1. Shigella spp: K/A (rojo / amarillo)

Resultado: K/A (rojo / amarillo)
Resultado: A/Ag (amarillo / amarillo, gas)
6. PRUEBA EN LIA (LISINA HIERRO AGAR O LISINE IRON AGAR POR SUS SIGLAS
EN INGLS):

6.3. Fundamentos bioqumico de la bacteria:
Las shigellas no poseen la enzima lisina descarboxilasa, por lo tanto no descarboxilan la lisina. Tam-
poco poseen la enzima lisina desaminasa por lo que no desaminan la lisina. Algunas variedades
de Shigella flexneri 6 y Shigella boydii 14 que poseen la enzima deshidrogenasa frmica y producen
muy poca cantidad de gas a partir de la glucosa, en el punto de inoculacin.

6.4. Resultado:
6.4.1. Shigella spp: K/A (violeta / amarillo)

Resultado: K/A (violeta / amarillo)
Resultado: K/K (violeta / violeta )
7. PRUEBA DE MIO (MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA):
7.1. Prueba de Movilidad:

7.1.1. Fundamento de la prueba: ver captulo 17.
7.1.2. Procedimiento: ver captulo 17.
7.1.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria:
Las shigellas carecen de flagelos, por lo tanto son inmviles.
7.1.4. Resultado:
Movilidad negativa: crecimiento exclusivamente a lo largo de la puncin.
7.1.5. Control de calidad:
7.1.5.1. Shigella flexneri 2b OPS 45
Resultado: Movilidad negativa: crecimiento a lo largo de la puncin.
7.1.5.2. Escherichia coli ATCC 25922
Resultado: Movilidad positiva: turbidez difusa en el medio.
7.2. Prueba de produccin de Indol:


Las shigellas carecen de la enzima triptofanasa, por lo tanto, no producen indol como producto terminal.
Algunas cepas de las especies dysenteriae, flexneri y boydii poseen la enzima, por lo que pueden
producirlo.
7.2.4. Resultado:
7.2.4.1. Shigella spp. Produccin de indol variable: ausencia o presencia de anillo rojo al agregar el
reactivo de Kovac.
7.2.4.2. Shigella sonneii. Produccin de indol negativo: ausencia de anillo rojo con reactivo de
Kovac.


Resultado: Produccin de indol negativa: ausencia del anillo rosado. Se forma un anillo transparente
o ligeramente amarillento.
Resultado: Produccin de indol positiva: presencia de anillo de color rosado intenso.
7.3. Prueba de descarboxilacion de ornitina:

A excepcin de Shigella sonnei que posee la enzima descarboxilasa y por lo tanto descarboxila la
ornitina, las especies de Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii, no poseen esta enzima, por lo
que no descarboxilan la ornitina.
7.3.4. Resultado:
7.3.4.1. Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Descarboxilacin de la ornitina negativa: Hay
viraje de color del violeta al amarillo. La reaccin es mas intensa en el fondo del tubo.
7.3.4.2. Shigella sonnei. Descarboxilacin de la ornitina positiva: No hay viraje de color y se observa
violeta en todo el medio.
Resultado: Descarboxilacin de la ornitina negativa: se observa amarillo en el fondo del medio.
Resultado: Descarboxilacin de la ornitina positiva: se observa violeta en el fondo del medio.
8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN CITRATO DE SIMMONS:

Las shigellas no utilizan el citrato como nica fuente de carbono.
8.4. Resultado:
Utilizacin del citrato: Negativa. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del medio en 4
das. El medio se observa de color verde.


Resultado: Crecimiento en citrato negativo. No hay viraje de color ni crecimiento en la superficie del
medio en 4 das. El medio se observa de color verde.
Resultado: Crecimiento en citrato positivo: viraje de color del verde al azul.
9. PRUEBA DE HIDRLISIS A LA UREA:

Todas las shigellas carecen de la enzima ureasa por lo tanto no hidrolizan la urea.
9.4. Resultado:
Hidrlisis de la urea negativa: no hay viraje de color del medio. Se observa amarillo plido.

Resultado: Hidrlisis de la urea negativa: se observa amarillo en el fondo del medio.
9.5.2. Proteus mirabilis ATCC 7002
Resultado: Hidrlisis de la urea positiva: viraje de color a rosado intenso.
10.PRUEBA DE ONPG (ORTO-NITROFENIL --D-GALACTOPIRANSIDO):

A excepcin de S. sonnei, nica especie que posee la enzima -galactosidasa y que por lo tanto es
ONPG-positiva y fermentadora lenta de la lactosa, las dems especies de Shigella no poseen la enzima
-galactosidasa, por lo que son ONPG negativas.
10.4. Resultado:
10.4.1. S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. ONPG negativa: No hay viraje de color en la suspensin.
10.4.2. Shigella sonnei. ONPG positiva: Hay viraje de color al amarillo en la suspensin.


Resultado: ONPG negativa: no hay viraje de color en la suspensin.
Resultado: ONPG positiva: hay viraje de color a amarillo de la suspensin.
11.PRUEBA DE DESCARBOXILACIN DE ORNITINA EN CALDO:

A excepcin de Shigella sonnei que posee la enzima descarboxilasa y por lo tanto descarboxila la
ornitina, las especies de Shigella dysenteriae, S. flexneri y S. boydii, no poseen esta enzima por lo que
no descarboxilan la ornitina.
11.4. Resultado:
11.4.1. S. dysenteriae, S. flexneri y S. boydii. Descarboxilacin de la ornitina negativa: hay viraje de
color del violeta al amarillo en el fondo del medio.
11.4.2. Shigella sonnei. Descarboxilacin de la ornitina positiva: no hay viraje de color y el caldo se
observa violeta.

Resultado: Descarboxilacin de la ornitina negativa: no hay viraje de color. El caldo se observa violeta.
Resultado: Descarboxilacin de la ornitina positiva: se observa violeta en el fondo del medio.
12.PRUEBA DE CRECIMIENTO EN ACETATO DE SODIO:

12.2. 12.2 Procedimiento: ver captulo 17.
12.3. Fundamentos bioquimcos de la bacteria:
Las shigellas no utilizan el acetato como nica fuente de carbono.
12.4. Resultado:
12.4.1. Shigella spp. Utilizacin del acetato negativa: no hay viraje de color ni crecimiento en la
superficie del medio en 7 das. El medio se observa de color verde.


Resultado: Utilizacin del acetato como nica fuente de carbono negativa: no hay crecimiento ni hay
viraje del color. El medio se observa de color verde.
Resultado: Utilizacin del acetato como nica fuente de carbono positiva: hay crecimiento y viraje de
color del verde al azul.
13.PRUEBA DE FERMENTACIN DE MUCATO:

Las shigellas no utilizan el mucato. Esta prueba bioqumica es til para diferenciar el gnero Shigella de
Escherichia coli inactiva.
13.4. Resultado:
13.4.1. Shigella spp: Utilizacin del mucato negativa: no hay viraje de color del medio en 2 das. El
caldo se observa de color azul.

Resultado: Utilizacin del mucato negativa: en dos das no hay viraje de color. El medio se observa
de color azul.
Resultado: Utilizacin del mucato positiva: en dos das el medio vira de color del azul al verde.
14.SEROTIPIFICACIN:
La presencia de antigenos especficos en la cpsula o pared celular es utilizada como base para la
caracterizacin serolgica de algunos gneros y especies bacterianas. En algunos casos el antgeno esta
azucares dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. En algunos casos el antgeno
esta ubicado en la cpsula. En ambos casos y cuando la naturaleza del antgeno es altamente especifica,
14.2. Procedimiento: Ver numeral 18.4 en adelante.


El antgeno somtico O constituye la parte ms externa de los lipopolisacridos de la pared celular de
las shigellas. Diferentes subunidades de polisacridos repetidas le confieren especificidad de grupo que
son la base para la determinacin de la especie: A (dysenteriae ), B (flexneri ), C (boydii ), D (sonnei ).
14.4. Caracterizacin de los antgenos somticos O:

Los aislamientos con caractersticas bioqumicas tpicas de Shigella deben someterse a identificacin
serolgica del antgeno somtico O por aglutinacin en lmina con antisueros para cada especie o
grupo. Para ello debe contarse con un cultivo puro de 24 horas de incubacin de la cepa en estu-
dio y es necesario verificar que se encuentre en forma lisa, siguiendo los siguientes pasos:
14.4.1. Procedimiento de la verificacin de colonias lisas o rugosas:
Se debe verificar si la cepa se encuentra en forma lisa, es decir que es aglutinable. Para ello se pro-
cede de la siguiente forma:
a. Sobre una lmina de vidrio limpia, colocar una gota de solucin salina al 2%.
b. Con un palillo de madera estril tomar un inculo de la cepa, de manera que estn en igual cantidad
al mezclarse, el inculo con la solucin salina.
c. Mezclar de forma homognea.
d. Rotar manualmente la lmina en forma circular y despacio por un tiempo mximo de un minuto.
e. Observar si se producen o no grumos (fuerte aglutinacin)
14.4.2. Resultados:
Si no se producen grumos (cepa lisa o aglutinable), puede proceder a la aglutinacin con los anti-
sueros somticos.
Si se producen fuertes grumos con la solucin salina al 2% indica que se trata de una cepa rugosa,
por lo tanto debe seguir los siguientes pasos para eliminar el antgeno de cubierta que est en-
mascarando al antgeno O e inhibiendo la aglutinacin.
14.4.3. Procedimiento para la eliminacin del antgeno de cubierta:
a. Hacer una suspensin de la bacteria en solucin salina 0.85%. La suspensin debe ser bastante
densa y homognea, sin partculas flotantes.
b. Calentar en bao Mara a 100 oC de 15 a 30 minutos.
c. Dejar enfriar la suspensin
d. Reintentar la aglutinacin.
14.4.4. Resultados:
Si no se producen grumos (cepa lisa o aglutinable), puede proceder a la aglutinacin con los antisueros
somticos.
Si an despus de este tratamiento, persiste la aglutinacin con solucin salina al 2%, debe enviar la
cepa al laboratorio de referencia CNDR para su debida confirmacin y serotipificacin.

14.5. Procedimiento para la serotipificacin polivalente somtica (aglutinacin de cepas

de Shigella en forma lisa):
Si la prueba con solucin salina al 2% no aglutin (cepa lisa), debe realizar la serotipificacin usando
los antisueros somticos para cada especie, en el siguiente orden:
Antisuero para serogrupo B de Shigella flexneri
Antisuero para serogrupo D de Shigella sonnei
Antisuero para serogrupo C de Shigella boydii
Antisuero para serogrupo A de Shigella dysenteriae
a. Sobre una lmina de vidrio limpia, colocar una gota de antisuero para serogrupo B de Shigella
flexneri.
b. Con un palillo de madera estril, tomar un inculo de la cepa pura, de manera que estn en igual
cantidad al mezclarse, el inculo con el antisuero.
c. Mezclar de forma homognea.
d. Rotar manualmente la lmina en forma circular y despacio por un tiempo mximo de un minuto para
favorecer la reaccin antgeno-anticuerpo.
e. Observar si se producen o no grumos (fuerte aglutinacin).
f. Si hay aglutinacin, anote los resultados de la especie. Si no hay aglutinacin proceda a realizar
el mismo procedimiento (incisos 1 al 5) con el antisuero D. Proceda con el resto de los antisueros
de la misma manera en caso de que las aglutinaciones con los antisueros D y C sean negativas.
Ver figura No. 2.
14.5.1. Resultados e Informe:
Si aglutina con B informe: Shigella flexneri
Si aglutina con D informe: Shigella sonnei
Si aglutina con C informe: Shigella boydii
Si aglutina con A informe: Shigella dysenteriae
Nota: La identificacin completa del serotipo se hace con fines epidemiolgicos, por lo que corresponde
al CNDR hacer estos procedimientos y por lo tanto, todas las cepas aisladas deben ser enviadas a este
Centro para su debida confirmacin y serotipificacin.

Flujograma de Serotipificacin para Shigella spp
Cepacon caractersticas bioqumicas

de Shigella
Estra en TSA u otro medio sin

inhibidores
Aglutinacin con solucin salina

al 2%
Negativo Positivo
Aglutinar con Calentar suspensin densa en 1mL

antisuero para de solucin salina al 0.85% a 100oC
serogrupo B 15-30 minutos
Negativo Positiva
S . flexneri Reintentar aglutinacin con solucin
salina al 2%
Aglutinar con antisuero Negativo

para serogrupo D aglutinar con Positivo, enviar
antisueros al CNDR
Positivo
Negativo
S. sonnei
Aglutinar con antisuero para serogrupo C
Negativo Positiva
S. boydii
Aglutinar con antisuero para

serogrupo A
Positivo
Negativo
S. dysenteriae

Figura No. 1
Reacciones caractersticas de Shigella en agar TSI-LIA
Figura No. 2
Reacciones de aglutinacin para determinacin de especie en shigellas

Tabla No. 1
TAXONOMIA DEL GENERO Shigella spp
Gnero Especies Serotipos Subtipo Fases Ejemplo
(serogrupo)
Shigella dysenteriae (A) 1,2,3,4,5,6,7,8, S. dysenteriae 1
9,10,11,12,13
Shigella flexneri ( B ) 1,2,3,4,5,6 a, b S. flexneri 2a
Shigella boydii (C) 1,2,3,4,5,6,7,8,
9,10,11,12,13,
14,15,16,17,18 S. boydii 14
Shigella sonnei (D) Un slo serotipo Fase I lisa S. sonnei fase I
virulenta
Fase II
rugosa
avirulenta
Tabla No. 2
CARACTERSTICAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES ENTRE ESPECIES DE
Shigella spp
Especie ONPG Ornitina
descarboxilasa
S. dysenteriae Negativa Negativa
S. flexneri Negativa Negativa
S. boydii Negativa Negativa
S. sonnei Positiva Positiva
Tabla No. 3
CARACTERSTICAS BIOQUIMICAS DIFERENCIALES ENTRE
Shigella y Escherichia coli inactiva
Prueba bioqumica Shigella Escherichia coli inactiva

Actato de sodio Negativa Positiva
Citrato de sodio Negativa Positiva
Mucato Negativa Positiva

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Guidelines for the Control of Epidemics due to Shigella dysenteriae 1. Program for Control of
Diarrhoeal Diseases. World Health Organization WHO/CDD/SER/88.12.
2. Tribu Escherichiae y Gnero Shigella en Diagnstico microbiolgico. Elmer W. Koneman, editor,
captulo 4, Pg.196-201, 5 edicin 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires,
Argentina.
3. Le Minor L, Richard C. Shigella en Mthodes de Laboratoire pour lidentification des En-
terobactries, Cap. 4, pg. 72-78, Institut Pasteur, 1 ed.1993, Paris, France.
4. Gnero II. Shigella en Manual Enterobacterias: Actualizacin Diagnstica. Servicio de
Enterobacterias, Departamento de Bacteriologa, Instituto Nacional de Enfermedades Infec-
ciosas (INEI), 2000, Buenos Aires, Argentina.
5. Shigellosis en Manual para el Control de las Enfermedades Transmisibles, Abram S. Benenson editor,
pg. 412-416 OPS/ OMS, 16 ed. 1997, Washington, D.C.
6. Shigellas en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, captulo
16, 16 edicin (de la 21 a edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de C.V.
Mxico, D.F.
7. Bennington J. Endotoxinas, Exotoxinas, Neurotoxina en Diccionario Enciclopdico del Labora-
torio Clnico, pgs. 463, 540-543, 999, Editorial Mdica Panamericana, 1 ed.1991, Buenos Aires,
Argentina.

de Salmonella spp
Ver toma de muestra de coprocultivo

Ver transporte en coprocultivo.
III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA:

No hay procedimientos previos.

Ver equipo, materiales y reactivos en coprocultivo.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: numeral VII - del 1.4.1 al 1.4. 6 y 1.4.14 con respecto a pruebas de
identificacin.
CNDR: numeral VII - del 1.4.1 al 1.4.15 con respecto a pruebas de identificacin.

El gnero Salmonella spp pertenece a las enterobacterias y como tales son bacilos gramnegativos que
fermentan la glucosa, no fermentan la lactosa ni la sacarosa, son anaerobias facultativas, la mayora
mviles con flagelos pertricos, no producen indol y suelen producir sulfuro de hidrgeno. Son bacterias
de crecimiento rpido, crecen en medios diferenciales como MacConkey y en los altamente selectivos
como Agar Salmonella Shigella, as como en medios altamente inhibidores como Selenito.
Los miembros del gnero Salmonella poseen tanto propiedades invasivas como exotxicas y endotxicas.
La principal forma de transmisin es a travs de los alimentos. De las formas clnicas, las ms comunes
son la fiebre tifoidea y paratifoidea producidas por Salmonella Typhi y Paratyphy A. De las asociadas
a infeccin del torrente sanguneo, uno de los serotipos ms comunes es Salmonella Choleraesuis. Sin
embargo, la forma clnica ms frecuente es la diarrea asociada a ms de 1,500 serotipos. Estos procesos
requieren manejo teraputico distinto por tener morbi mortalidad distinta.

La gravedad de la enfermedad depende de varios factores, tales como magnitud de la dosis infectante,
el estado nutricional y edad del paciente.
Con respecto a su nomenclatura y taxonoma, este gnero ha sido objeto de sucesivas modificaciones
a travs de los aos y aunque todava se siguen usando muchos de los mtodos descritos por Edwards
y Ewing, los ltimos estudios del DNA mediante tcnicas de hibridacin, demostraron que el gnero
Salmonella est constituido por dos especies entrica y bongori (que en la clasificacin anterior era
conocida como subespecie V de la especie entrica). A su vez, la especie entrica est subdividida en
seis subespecies: entrica ( o subespecie I), salamae (o subespecie II), arizonae (o subespecie IIIa),
diarizonae (o subespecie IIIb), houtenae (o subespecie IV) e indica (o subespecie VI).
Dentro de la subespecie entrica y la especie bongori se agrupan ms de 2,400 serovariedades que

estn definidas en funcin de sus diferentes asociaciones de antgenos: 1. Somticos (O) los cuales son
de naturaleza lipopolisacrida, estables al calor, 2. Antgenos flagelares (H) de naturaleza protica,
lbiles al calor y 3. De envoltura (Vi) de naturaleza polisacrida, lbiles al calor. Estas serovariedades
se encuentran descritas en el esquema de Kauffmann y White, publicado por el Centro de Referencia e
Investigacin del Instituto Pasteur de Paris, el cual funciona como Centro de Referencia de OMS. Estas
serovariedades por lo general llevan el nombre relacionado con el lugar geogrfico donde se aislaron por
primera vez o relacionado con un sndrome y dado que las serovaridades no tienen nivel taxonmico
de especie, sus nombres se escapan al dominio del Cdigo Internacional de Nomenclatura Bacteriana y
por lo tanto deben escribirse en letra tipo romano como se describe en el siguiente ejemplo: Salmonella
enterica subespecie enterica serovar Typhimurium. En la prctica de rutina, Salmonella Typhimurium.
Kaufman y White hicieron esta clasificacin serolgica en base a la ltima clasificacin bioqumica que
divide a las salmonellas en dos especies: entrica y bongori. La especie aislada ms frecuentemente es
Salmonella entrica en la que se encuentran la mayora de las serovariedades aisladas en humanos. Este
procedimiento de identificacin es el que se describe en este manual.
La identificacin completa del serotipo se hace con fines epidemiolgicos, por lo que corresponde al
CNDR realizar. Todas las Salmonella spp aisladas de los laboratorios de la Red deben ser enviados al
CNDR para la caracterizacin de la serovariedad.
VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipo: Ver Equipos en coprocultivo.

1.2.1. Antisueros somticos antisalmonella
1.2.2. Antisueros flagelares antisalmonella

Ver medios de cultivo en coprocultivo.

1.4. Pruebas para Identificacin

1.4.1. TSI
1.4.2. LIA
1.4.3. MIO
1.4.4. Citrato
1.4.5. Urea
1.4.6. Malonato
1.4.7. ONPG
1.4.8. Dulcitol
1.4.9. Gelatina
1.4.10. Sorbitol
1.4.11. Mucato
1.4.12. Salicina
1.4.13. Lactosa
1.4.14. Suero polivalente O
1.4.15. Seroaglutinacin con sueros monovalentes anti O, H y Vi para determinar serovariedad.

1.5.3. Proteus miriabilis ATCC 7002

1.7. Pruebas especiales:

1.7.1. Determinacin de BLEE por medio de triple disco con CRO, CAZ y AMC
2. CRECIMIENTO EN AGAR Salmonella Shigella (SS AGAR):

2.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria ante el medio de cultivo:
Las Salmonella spp carecen de las enzimas galactsidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto no
fermentan la lactosa.

2.4. Resultado:
En este medio las colonias se observan transparentes, convexas, de 2-4 mm, con un punto negro,
debido a la produccin de H2S por la presencia de las enzimas tisulfato reductasa y cistena di-
sulfurasa.

Resultado: Crecen UFCs que miden de 2-4 mm con el centro negro y el borde transparente.
Resultado: Crecen UFCs convexas de 2-4mm, color rosado plido.
3. CRECIMIENTO EN AGAR Mac CONKEY

3.2. Procedimiento para la siembra: ver captulo 17.
Las Salmonella spp carecen de las enzimas, galactosidopermeasa y galactosidasa, por lo tanto las
colonias en este medio se comportan como lactosa negativas.
3.4. Resultado:
Las UFCs se observan incoloras, transparentes y convexas, de 2-4mm.

Resultado: Crecen UFCs que miden de 2-4 mm lactosa negativas (incoloras)
Resultado: Crecen UFCs convexas de 2-4mm, color rosado intenso, con depresin umbilical en el
centro.
4. CRECIMIENTO EN CALDO SELENITO:

El selenito es un medio enriquecedor que acta inhibiendo el crecimiento de la mayora de gram
negativos, con lo cual favorece el crecimiento de otras bacterias, pero principalmente E. coli, shigellas
y salmonellas.

4.4. Resultado:
Las Salmonella spp crecen en un tiempo de 6 a 12 horas de incubacin.

Resultado: Turbidez del caldo. Buen crecimiento y recuperacin.
Resultado: Ausencia o muy poca turbidez a las 6 a 12 horas de incubacin.
5. PRUEBA EN TSI (TRIPLE AZCAR HIERRO O TRIPLE SUGAR IRON POR SUS
SIGLAS EN INGLS):

Las Salmonella spp poseen la enzima glucosa 6 fosfato deshidrogenasa, por lo tanto fermentan la
glucosa, no poseen las enzimas galactosidasa ni galactsidopermeasa por lo tanto no fermentan la
lactosa, producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa frmica y H2S (sulfuro de
hidrgeno), por la presencia de las enzimas tiosulfatoreductasa y cisteinadisulfurasa.
Salmonella Typhi se diferencia de las dems por producir poca cantidad de H2S usualmente concen-
trado en el tercio superior y centro del medio a las 24 hrs. y ms intenso a las 48 hrs. de incubacin.
5.4. Resultado:
5.4.1. Salmonella spp: K/Ag + ( rojo/ amarillo, poco gas y abundante cantidad de H2S).
5.4.2. Salmonella Typhi : K/Ag + ( rojo/ amarillo, poco gas y poca cantidad de H2S).

Resultado: K/Ag+ (rojo/amarillo, poco gas y abundante H2S).
Resultado: A/AG (amarillo/amarillo, abundante gas).
6. PRUEBA EN LIA (LISINA HIERRO AGAR O LISINE IRON AGAR POR SUS SIGLAS
EN INGLS):


El gnero Salmonella spp posee la enzima lisinadescarboxilasa, por lo tanto, descarboxilan la lisi-
na excepto la Salmonella Paratyphi A que no posee la enzima. Producen gas debido a la presencia de
la enzima hidrogenasa frmica, producen H2S (Precipitado negro) debido ala presencia de las enzi-
mas tiosulfatoreductasa y cisteinadisulfurasa.
6.4 Resultado:
6.4.1. Salmonella spp: K/Kg+ (violeta/violeta, poco gas y abundante cantidad de H2S).
6.4.2. Salmonella Paratyphi A: K/Ag+ (violeta/amarillo, poco gas, y abundante cantidad de H2S).
6.5 Control de calidad:

Resultado: R/Ag+ (rojo/amarillo, poco gas y abundante produccin de H2S)
Resultado: K/Kg (violeta/violeta, con poco gas)
7.1. Prueba de movilidad:

7.1.1. Fundamento de las pruebas: ver captulo 17.
7.1.3. Fundamentos de la bacteria:
Las Salmonella spp tienen flagelos pertricos excepto, Gallinarum y Pullorum
7.1.4. Resultado:
7.1.4.1. Movilidad positiva: turbidez difusa en el medio.
7.1.4.2. Movilidad negativa: crecimiento alrededor de la lnea de inoculacin. No hay turbidez.
Resultado: La movilidad es positiva:turbidez difusa en el medio
7.1.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
Resultado: La movilidad es negativa: crecimiento alrededor del inculo, no hay turbidez.
7.2. Prueba de indol:

7.2.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria: Las Salmonella spp carecen de la enzima
triptofanasa, por lo tanto no producen indol.

7.2.4. Resultado:
Produccin de indol negativa: Ausencia del anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo
de Kovacss.
Nota: Esta prueba hace la diferencia de Salmonella spp con Edwarsiella tarda que es indol positivo.
Ver tabla No. 1.
Resultado: La produccin de indol es positiva: presencia de un anillo rojo en la superficie del medio
al adicionar el reactivo de Kovac.
7.2.5.2. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Resultado: La produccin de indol es negativa: ausencia del anillo rojo en la superficie del medio al
adicionar el reactivo de Kovac.
7.3. Prueba de ornitina:

7.3.3. Fundamentos bioqumicos de la bacteria: Con excepcin de Salmonella Typhi, todas
las Salmonellas poseen la enzima ornitina descarboxilasa.
7.3.4. Resultado:
7.3.4.1. Salmonella spp:
Descarboxilacin de la ornitina positiva: viraje de color a un violeta ligeramente ms intenso en todo el
tubo.
7.3.4.2. Salmonella Typhi:
Descarboxilacin de la ornitina negativa: viraje de color violeta a amarillo en el fondo del tubo
7.3.5.1. Escherichia coli ATCC 25922.
Resultado: La descarboxilacin de la ornitina es positiva: viraje de color a un violeta ligeramente ms
intenso en todo el tubo.
Resultado: La descarboxilacin de la ornitina es negativa: viraje de color del violeta al amarillo en el
fondo del tubo.
8. CRECIMIENTO EN CITRATO DE SIMMONS:



Excepto Salmonella Typhi y Paratyphi A, las salmonellas utilizan el citrato como nica fuente de car-
bono. Salmonella Choleraesuis puede o no utilizarlo.
Nota: Esta prueba sirve para diferenciar Salmonella spp de Edwarsiella tarda y Citrobacter freundii.
Ver tabla No. 1.
8.4. Resultados:
8.4.1. Salmonella spp:
Utilizacin del citrato positiva: crecimiento y viraje de color del verde al azul en la superficie del medio.
8.4.2. Salmonellas Typhi y Paratyphi A:
Utilizacin del citrato negativa: no hay crecimiento ni viraje del color. El medio se observa de color
verde.

Resultado: La utilizacin del citrato es positiva: crecimiento y viraje de color del verde al azul en la
superficie del medio.
Resultado: La utilizacin del citrato es negativa: no hay crecimiento ni viraje de color, se observa verde.
9. PRUEBA DE HIDRLISIS DE LA UREA:

9.1. Fundamento de las prueba: ver captulo 17.
Las Salmonella spp carecen de la enzima ureasa, por lo tanto no hidrolizan la urea.
9.4. Resultado:
Hidrlisis de la urea negativa: no hay viraje del color, el medio se observa de color amarillo plido.

Resultado: La hidrlisis de la urea es positiva: viraje de color del amarillo tenue al rosado intenso
Resultado: La hidrlisis de la urea es negativa: no hay viraje del color, se observa amarillo tenue.

TABLA No. 1. DIFERENCIACIN BIOQUMICA ENTRE

SALMONELLA, EDWARSIELLA Y CTROBACTER
BACTERIA TSI LIA UREA CITRATO MOVILIDAD INDOL ORNITINA
Salmonella spp K/Ag+ K/Kg+ Negativa Positivo Positiva Negativo Positiva

Salmonella K/Ag + K/Kg+ Negativa Negativo Positiva Negativo Negativa
Typhi
Salmonella K/Ag+ K/Kg+ Negativa Variable Positiva Negativo Positiva
Choleraesuis
Salmonella K/Ag+ K/Ag+ Negativa Negativo Positiva Negativo Positiva
Paratyphi A
Edwarsiella K/Ag+ K/Kg+ Negativa Negativo Positiva Positivo Positiva
tarda
Citrobacter K/Ag+ K/Ag+ Negativa Positivo Positiva Variable Negativa
freundii
Nota: Las pruebas siguientes se utilizan para diferenciacin de especies segn Kauffmann y White,
despus de las cuales se realiza la serotipificacin.
10.PRUEBA DEL DULCITOL:

10.1. Fundamento de las prueba: ver captulo 17.
Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba. Las salmonellas de las subespecies
entrica, salamae y la especie bongori, fermentan el dulcitol. Las subespecies arizonae, diarizinae y
houtenae, no lo fermentan. La subespecie indica, puede o no fermentarlo.
10.4. Resultados:
10.4.1. Subespecies entrica, salamae y especie bongori:
Fermentacin del dulcitol positiva: viraje de color del violeta al amarillo.
10.4.2. Subespecies arizonae, diarizona y houtenae:
Fermentacin del dulcitol negativa: no hay viraje del color, se observa violeta.
10.4.3. Subespecie indica:
Fermentacin del dulcitol: Positiva o negativa. Puede o no puede haber viraje del color.


10.5.1. Klebsiella pneumoniae bATCC 700603
Resultado: La fermentacin del dulcitol es positiva. viraje de color del violeta al amarillo.
Resultado: La fermentacin del dulcitol es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.
11.PRUEBA DE ONPG (ORTO-NITROFENIL B-D-GALACTOPIRANSIDO):

11.1. F undament o de las pr ueba: ver captulo 17.
11.2. Pr ocedimient o: ver captulo 17.
Las Salmonella spp tienen diferentes recciones con esta prueba:
Las subespecies arizonae, diarizonae y la especie bongori, poseen la enzima beta- galactosidasa.
Las subespecies entrica, salamae y houtenae, no poseen la enzima.
La subespecie indica puede tener o carecer de la enzima, por lo que da reacciones variadas.
11.4. Resultados:
Subespecies arizonae, diarizonae y especie bongori :
ONPG positiva: viraje de color a amarillo
Subespecies entrica, salamae y houtenae :
ONPG negativa: no hay viraje del color. Se observa transparente.
Subespecie indica:
ONPG variable: puede o no puede haber viraje del color.

Resultado: ONPG positiva: viraje del color a amarillo.
Resultado: ONGP negativa: no hay viraje del color, se observa transparente.
8. PRUEBA DE CRECIMIENTO EN MALONATO:

Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba.

Las sub especies salamae, arizonae y diarizonae, utilizan el malonato como nica fuente de carbono. Las
sub especies entrica, houtenae, indica y especie bongori, no lo utilizan.
12.4. Resultados:
Salmonella subespecies salamae, arizonae y diarizonae:
Utilizacin del malonato positiva: viraje de color del verde al azul oscuro.
Salmonella subespecies entrica, houtenae, indica y especie bongori :
Utilizacin del malonato negativa: no hay viraje del color. El caldo se observa de color verde.

Resultado: La utilizacin del malonato es positiva: viraje de color del verde al azul.
Resultado: La utilizacin del malonato es negativa: no hay viraje de color, se observa verde.
9. PRUEBA DE HIDRLISIS DE LA GELATINA:

Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba.
Las subespecies salamae, arizonae, diarizonae, houtenae e indica hidrolizan la urea.
La subespecie enterica y especie bongori no hidrolizan la urea.
13.4. Resultados:
Hidrlisis de la gelatina positiva: halo opaco alrededor del inculo (contrario al halo sensible de un
antibiograma en el que se ve un halo claro).
13.4.2. Las salmonellas subespecies entrica y especie bangori:
Hidrlisis de la gelatina negativa: ausencia del halo.

Resultado: La hidrlisis de la gelatina es positiva: halo opaco alrededor del inculo.
Resultado: La hidrlisis de la gelatina es negativa: ausencia del halo.

14.PRUEBA DEL FERMENTACIN DEL SORBITOL:

Todas las subespecies de la especie enterica y la especie bongori de Salmonella spp fermentan el sorbitol
excepto subespecie indica.
14.4. Resultados:
Fermentacin del sorbitol positiva: viraje del color de violeta a amarillo
14.4.2. Salmonella sub especie indica:
Fermentacin del sorbitol negativa: no hay viraje del color, se observa violeta.

Resultado: la fermentacin del sorbitol es positiva: viraje de color del violeta al amarillo.
Proteus mirabilis ATCC 7002
Resultado: la fermentacin del sorbitol es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.
15.PRUEBA DEL MUCATO:

Las Salmonella spp tienen diferentes reacciones con esta prueba. Las Salmonellas de las subespecies
entrica, salamae, arizonae e indica y la especie bongori, utilizan el mucato de sodio. La subespecie
houtenae no lo utiliza y la subespecie diarizonae, puede o no utilizarlo.
15.4. Resultados:
Fermentacin del mucato positiva: viraje de color del azul al amarillo.
15.4.2. Salmonella subespecie houtenae:
Utilizacin del mucato negativa: no hay viraje de color, se observa azul.
15.4.3. Salmonella subespecie diarizonae:
Utilizacin del mucato positiva Negativa: puede o no puede haber viraje del color.


Resultado: La utilizacin del mucato es positiva: viraje del color de azul a amarillo.
Resultado: La utilizacin del mucato es negativa. No hay viraje de color, se observa azul.
16.PRUEBA DE LA SALICINA:
16.1. F undament o de las pr uebas: ver captulo 17.

Las Salmonella spp no fermentan la salicina, excepto la subespecie houtenae.
16.4. Resultados:
Fermentacin de la salicina negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.
16.4.2. Salmonella subespecie houtenae:
Fermentacin de la salicina positiva: viraje de color del violeta al amarillo.

Resultado: La fermentacin de la salicina es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.
Resultado: La fermentacin de la salicina es positiva: viraje de color del violeta al amarillo.
17. PRUEBA DE FERMENTACIN DE LA LACTOSA EN CALDO:

Las Salmonella spp no poseen las enzimas galactosidasa ni galactosido permeasa, por lo tanto no
fermentan la lactosa, excepto las sub especies arizonae, diarizonae, e indica que pueden o no
fermentarla.
17.4. Resultados:
Fermentacin de la lactosa negativa: no hay viraje de color, se observa violeta

17.4.2. Salmonella subespecies arizonae, diarizonae e indica:

Fermentacin de la lactosa variable: puede o no puede haber viraje del color del violeta al amarillo.

Resultado: La fermentacin de la lactosa es negativa: no hay viraje de color, se observa violeta.
Resultado: La fermentacin de la lactosa es positiva: viraje de color del violeta al amarillo.
18. SEROTIPIFICACIN:
La presencia de antgenos especficos en la cpsula, flagelos o pared celular es utilizada como base para
la caracterizacin serolgica de algunos gneros y especies bacterianas. En algunos casos el antgeno
est ubicado en el LPS de la pared y estn conformados por carbohidratos. Pequeas variaciones de los
azcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. Tambin existen antgenos
ubicados en los flagelos de la clula bacteriana y en algunos casos el antgeno est ubicado en la
cpsula. En cualquier caso y cuando la naturaleza del antgeno es altamente especfica, se utiliza para
clasificar a la bacteria en serotipos o serovariedades.
18.2. Pr ocedimient o: Ver numeral 18.4 en adelante.

18.3. Fundamentos inmunolgicos de la bacteria:
Las salmonellas tienen una estructura antignica compleja. El antgeno somtico, (O) constituye la parte
ms externa de los lipopolisacridos de la pared celular, y consisten en unidades repetidas del
polisacridos, resistentes al calor, alcohol y a cidos diluidos que suelen identificarse mediante
aglutinacin bacteriana. El antgeno flagelar (H) est localizado en los flagelos y est constituido de
aminocidos y protenas lbiles al calor. El alcohol los desnaturaliza o elimina y suelen identificarse
mediante pruebas de floculacin. El antgeno capsular (Vi) es de naturaleza polisacrida, es termolbil
y se identifica por aglutinacin bacteriana.
Las serovariedades de Salmonella spp surgen como consecuencia de una asociacin particular de
factores antignicos somticos y flagelares y en algunos casos (S. Typhi, S. Paratyphi C y algunas cepas
de S. Dublin) capsulares.

Esta Reaccin antgeno anticuerpo, para caracterizar el serogrupo O (somtico) de Salmonella spp, se
realiza en lmina a partir de un cultivo puro de 24 hrs. Es importante verificar que la bacteria se
encuentre en forma lisa, lo cual se comprueba haciendo aglutinacin con solucin salina al 2%. A
continuacin se describe la tcnica.
18.4.1. Verificacin de las caractersticas lisas de las UFCs:
18.4.1.1. Sobre una lmina poner una gota de solucin salina al 2%.

18.4.1.2. Con un palillo, Tomar un pequeo inculo de la cepa fresca y pura. Mezclar homogenizando
bien y cuidadosamente.
18.4.1.3. Mover o rotar la lmina manualmente y en forma circular por un tiempo mximo de 1 minuto.
18.4.1.4. Observar la presencia o ausencia de grumos.
18.4.2. Resultados:
Si no hay presencia de grumos se realiza la aglutinacin con antisueros polivalentes.
Si hay formacin de grumos, se debe verificar la bioqumica de la cepa y enviarla al CNDR para su
debida confirmacin y serotipificacin.
18.4.3. Procedimiento para la serotipificacin polivalente somtica:

18.4.3.1. Sobre una lmina poner una gota del antisuero polivalente para Salmonellas
18.4.3.2. Con un palillo, tomar un pequeo inculo de la cepa fresca y pura y mezclar homogeni-
zando bien y cuidadosamente.
18.4.3.3. Mover o rotar la lmina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de
1 minuto, para favorecer la reaccin antgeno anticuerpo.
18.4.4. Resultados: Si hay aglutinacin debe considerarse como Salmonella spp y enviar la cepa
al CNDR para su debida confirmacin y serotipificacin completa.
Nota: aglutinaciones dbiles o tardas no deben considerarse como positivas.
Grfico No. 1.
18.4.5. Caracterizacin de los antgenos flagelares H:

La caracterizacin antignica flagelar es un procedimiento complejo y que requiere de materiales con
los que no cuentan los laboratorios perifricos, por lo que le corresponde al CNDR como centro de
referencia. Por lo tanto toda cepa aislada, debe ser identificada bioqumicamente y serotipificada
somticamente en el laboratorio perifrico y enviada al CNDR para la realizarle la serotipificacin
flagelar.

CARACTERSTICAS DIFERENCIALES ENTRE LAS ESPECIES Y

SUB-ESPECIES DE SALMONELLA
Especies S. enterica S. bongori

Sub-especies enterica salamae arizonae diarizonae houtenae indica
Caractersticas
Dulcitol + + d +
ONPG (2h) + + d +
Malonato + + +
Gelatinasa + + + + +
Sorbitol + + + + + +
Cultivo con KCN + +
L (+)-tartrato (a) +
Galacturonato + + + + +
-glutamyltransferasa +(*) + + + + +
-glucuronidasa d d + d
Mucato + + + (70%) + +
Salicina +
Lactosa (75%) +(75%) d
Lisis para fago O1 + + + + d
(a) = d-tartrato
(*) = Typhimurium d. Dublin
+ = 90 % o ms de las reacciones positivas.
= 90% o ms de las reacciones negativas.
d = Diferentes reacciones para las diferentes serovariedades.

FLUJOGRAMA PARA LA IDENTIFICACIN DE SALMONELLA SPP
MUESTRA
Agar SS, agar McCONKEY Caldo Selenito. Agar S S

Incubar 18-24hrs Incubar 12-18 hrs Incubar 18-24 hrs
Colonias sospechosas: Lactosa

negativa, con H2S
en SS y con o sin H2S en
Mc Conkey
IDENTIFICACIN DE GNERO
TSI LIA
Incubar 18-24 hrs
MIO CITRATO UREA

Incubar 18-24 hrs
Dulcitol ONPG Malonato Gelatina Sorbitol Mucato Salicina

Lactosa
Incubar 12- 18 hrs
SEROLOGA SOMTICA SEROLOGA FLAGELAR

Polivalentes Polivalentes
Monovalentes Monovalentes
Factores Factores
(SEROVARIEDAD)
FRMULA ANTIGNICA

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Enterobacterias en Diagnstico Microbiolgico. Texto Atlas a color, Elmer W. Koneman editor,
captulo 4, 5 ed, 1999, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
2. Popoff MY, Le Minor L. Antigenic Formulas of the Salmonellas Serovar Kaufman White Scheme WHO
Colaborating Center for Reference and Research on Salmonellas, Instituto Pasteur, Pars, 1997.
3. Tribu Salmonellae en Enterobacterias Actualizacin Diagnstica, pginas 1730. Instituto Na-
cional de Enfermedades Infecciosas (INEI) Dr. Carlos G. Malbrn, Buenos Aires, Argentina, ao
2000.
4. Bacilos Entricos Gramnegativos (Enterobacteriaceae) En Microbiologa Mdica de Jawets, Melnick
y Adelberg Geo. F. Brooks editor. Captulo 16. Editorial El Manual Moderno, 16 edicin (traduccin
de la 21 edicin en ingls). Mxico D. F. 1998.

de Escherichia coli O157:H7
Ver toma de muestra en coprocultivo.

Ver transporte en coprocultivo.

Ver procesamiento en coprocultivo.

Ver en coprocultivo.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: numerales del 1.4.1 al 1.4.8 con respecto a las pruebas de identificacin.
CNDR: numerales del 1.1.4 al 1.4.9.2 con respecto a las pruebas de identificacin.

Escherichia coli forma parte de la familia Enterobacteriaceae a la cual pertenecen otros patge-
nos importantes como las Shigellas y Salmonellas. Son bacilos gramnegativos, no esporulados, la
mayora mviles aunque tambin pueden haber variantes no mviles. Crecen en medios de cultivos
simples de peptona o extracto de carne sin ningn suplemento, o medios selectivos como el Agar
McConkey. Son anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con produccin de cido o cido y
gas, son catalasa positivo y oxidasa negativo y reducen los nitratos a nitritos.
Forman parte de la microbiota intestinal normal de humanos, animales y se aslan del medio am-
biente. Algunas cepas de Escherichia coli son patgenas para el hombre y los animales.
La patogenicidad depende si las bacterias poseen o no elementos genticos que codifican para dife-
rentes factores de virulencia. Si no lo poseen, permanecen como comensales benignos, pero si adquie-
ren esos factores por algn mecanismo de transferencia de material gentico, producen los distintos
tipos de diarrea.
Para las distintas variedades de Escherichia coli existe un esquema de clasificacin basado en la
presencia de factores de virulencia. Las caractersticas que forman la base de este esquema incluyen :
adhesin de las bacterias en las clulas huspedes , produccin de toxinas y/o invasividad.

Clasificacin de las diferentes variedades Escherichia coli asociadas a diarrea infecciosa:

1. EPEC Escherichia coli Enteropatgena
2. ETEC Escherichia coli Enterotoxignico
3. EaggEC Escherichia coli Enteroagregativa
4. DAEC Escherichia coli de Adherencia Difusa
5. EIEC Escherichia coli Enteroinvasiva
6. EHEC Escherichia coli Enterohemorrgica
Actualmente en el CNDR no se realiza el diagnstico confirmativo para las primeras cinco variedades
debido a que se utilizan tcnicas moleculares cuya utilidad fundamental es para la investigacin o vi-
gilancia epidemiolgica. Los costos de dichos procedimientos hacen inaccesible que por el momento se
utilicen en el diagnstico de rutina.
La variedad de Escherichia coli entero hemorrgica (conocida anteriormente como verotoxignica) se
transmite a travs de carne de res contaminada con heces fecales provenientes del ganado vacuno.
Existen ms de 150 serotipos asociados a esta causa de diarrea, aunque el prototipo es el serotipo
O157:H7. En varios de estos pases ha pasado a ser una causa de diarrea ms frecuente que la
shigelosis y salmonelosis. Para su deteccin se utilizan medios de cultivo, bioqumicos y antisueros que
estn disponibles comercialmente, aunque su confirmacin requiere procedimientos de biologa mole-
cular como el PCR o hibridacin con sondas genticas.
La diarrea por Escherichia coli enterohemorrgica serotipo O157:H7 es resultado de la accin de la
toxina Shiga (Stx por su homologa con la toxina producida por Shigella dysenteriae 1), la cual tiene
propiedades de entero toxina, citotoxina y neurotoxina. Se han identificado dos tipos de Stx (Stx1 y Stx2
con dos subtipos Stx2c y Stx2e), de las cuales se han identificado en diarrea asociada a humanos la
Stx1, Stx2, Stx1/Stx2 y Stx2/Stx2c.
Ambas toxinas penetran en el enterocito e inhiben la sntesis proteica por inactivacin del ribosoma 60S,
lo cual lleva a la formacin de lceras hemorrgicas. La alta mortalidad que se asocia a esta variedad
patognica de Escherichia coli se debe a la accin de las toxinas sobre el sistema sanguneo y riones
que dan origen al Sndrome Ureico hemoltico (SUH) o a prpura trombocitopenica trombtica (PTT). El
primer brote de diarrea se report en 1982 en personas que ingirieron hamburguesas conteniendo carne
de res cocinada insuficientemente. Se ha reportado en varios pases de Europa, Norteamrica, Canad,
Mxico y varios pases de Suramrica.
Escherichia coli O157:H7 es el prototipo de un grupo de ms de 150 serotipos de Escherichia coli
entre los que estn: O26:H11, O26:H32, O103:H2, O111NM, O113: H21, O145: NM y otros, sin
embargo el 80% del SUH est asociado a O157:H7. Los otros serotipos se asocian a diarrea mucosa
con o sin sangre.
Los mtodos para su caracterizacin son:
a) Pruebas bioqumicas y serotipificacin.
b) Hibridacin con sondas gentica para los genes sxt1, sxt2, eaeA.
c) PCR para sxt1, sxt2, eaeA, O157 y E-Hly.
d) Ensayos de toxicidad especifica en clulas vero para sxt1 y sxt2.

Las pruebas bioqumicas y serotipificacin son mtodo presuntivo. Las tcnicas moleculares son mtodos
confirmativos.
Escherichia coli fermenta el sorbitol en menos de 24 horas a excepcin del serotipo O157:H7 que lo hace
en ms de 24 horas de incubacin, lo cual se utiliza como la caracterstica ms notable para su
aislamiento rpido.
VII. IDENTIFICACIN:

1.1. Equipos: Ver equipos en coprocultivo:

1.2.2. Gradillas
1.2.4. Contenedores con cloro al 10% para desechar material contaminante
1.2.5. Asas rectas y redondas
1.2.6. Lminas portaobjeto
1.2.8. Reactivo de Kovac
1.2.9. Solucin de KOH al 40%
1.2.10. Antisuero somtico para Escherichia coli O157
1.2.11. Antisuero flagelar para Escherichia coli H7
1.3. Medios de cultivo: Ver medios de cultivo en coprocultivo:
1.4. Pruebas de identificacion:

1.4.1. TSI
1.4.2. LIA
1.4.3. TSA
1.4.4. MIO
1.4.5. Urea
1.4.6. Citrato
1.4.7. Malonato
1.4.8. Sorbitol
1.4.9. Serologa:
1.4.9.1. Antisuero O157
1.4.9.2. Antisuero H7


1.5.3. Escherichia coli CNDR-SV 1
1.6. Sensibilidad a los Antimicrobianos:

1.6.1. Antimicobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ninguno.
1.6.2. Antimicobianos a utilizar por el mtodo de Concentracin Inhibitoria Minima (CIM/
MIC): Ninguno.
1.7. Pr uebas especiales de sensibilidad ant imicr obiana: Ninguna.
2. CRECIMIENTO EN AGAR MacConkey (MacC):
2.1. F undament o del medio de cult ivo: ver captulo 17.

Las colonias de Escherichia coli poseen enzima glucsidopermeasa, y -galactosidasa. Estas en-
zimas fermentan la lactosa (sustrato), produciendo grandes cantidades de cidos mixtos y precipi-
tacin de las sales biliares. Por lo tanto se observar las colonias color rosado intenso rodeadas de
un halo de color rosado menos intenso formado por la precipitacin de las sales biliares.
2.4. Resultado:
Las colonias caractersticas de Escherichia coli son lactosa positiva color rosado intenso, miden de 2
a 4 mm, convexas, con bordes regulares y una depresin umbilical en el centro de la colonia.

Resultado: Colonias lactosa positiva (color rosado intenso).
Resultado: Colonias lactosa negativa (incoloras, transparentes).
3. PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZCAR Y HIERRO):

3.1. F undament o de la pr ueba: ver captulo 17.
Escherichia coli posee las enzimas glucsidopermeasa, y -galactosidasa que fermentan la lac-
tosa, tambin poseen glucosa 6-fosfato deshidrogenasa que fermenta la glucosa y la invertasa
que fermenta la sacarosa, producen gas debido a la presencia de la enzima hidrogenasa frmica.

3.4. Resultado:
3.4.1. Escherichia coli : A/AG ( amarillo/amarillo, con abundante gas).

Resultado: A/AG ( amarillo/amarillo, con abundante gas).
4. PRUEBA DE LIA (LISINA HIERRO AGAR):

Escherichia coli posee la enzima lisinadescarboxilasa, por lo tanto descarboxila la lisina (sustrato),
tambin poseen la enzima glucosa 6-fosfato deshidrogenasa que fermenta la glucosa. Producen gas
debido a la presencia de la enzima hidrogenasa frmica.
4.4. Resultado:
4.4.1. Escherichia coli : K/Kg (violeta /violeta , poco gas).

Resultado: K/Kg (violeta / violeta, poco gas).
5. CRECIMIENTO EN AGAR NUTRITIVO (AN) o TRIPTICASA SOYA (TSA):

Se realiza un estriado en forma de S de las colonias sospechosas en un plato de AN o TSA con
el objetivo de multiplicar la cepa para obtener una poblacin gentica homogneamente similar,
libre de inhibidores qumicos, que sirva para realizar las pruebas bioqumicas y serolgicas.
5.4. Resultado:
5.4.1. Escherichia coli crecer confluentemente siguiendo la forma de la estra.

Resultado: Crecimiento confluente en forma de S.

6.1. Prueba de movilidad:

6.1.3. Fundamentos fisiolgicos de la bacteria:
6.1.5.1. Todas las Escherichia coli O157:H7 poseen flagelos pertricos, por lo tanto son mviles.
6.1.4. Resultado:
Movilidad: Positiva. Turbidez difusa en el medio.
Resultado: Movilidad: Positiva. Turbidez difusa en el medio.
6.2. Prueba de indol:

6.2.3.1. Todas las Escherichia coli O157: H7 poseen de la enzima triptofanasa, por lo tanto producen
indol.
6.2.4. Resultado:
Produccin de Indol: Positivo. Se observa anillo rojo en la superficie del medio al adicionar el reactivo
de Kovacs.
Resultado: Produccin de indol: Positivo. Se observa anillo rojo en la superficie del medio al adicionar
el reactivo de Kovacs.
6.3. Prueba de ornitina:

El 65% de las Escherichia coli poseen la enzima ornitinadescarboxilasa, por lo tanto descarboxilan la
ornitina. El 35% que no poseen la enzima, no descarboxilan la ornitina. Por lo tanto pueden observarse
reacciones positivas o negativas

6.3.4. Resultado:
6.3.4.1. Descarboxilacin de la ornitina: Positiva: Intensificacin del color violeta en todo el tubo.
6.3.4.2. Descarboxilacin de la ornitina: Negativa: Vira de color violeta a amarillo en el fondo del tubo.
Resultado: Descarboxilacin de la ornitina: Positiva: Intensificacin del color violeta en todo el tubo.
7. PRUEBA DE UREA:
7.3.1. Escherichia coli carece de la enzima ureasa, por lo tanto, no hidrolizan la urea.
7.4. Resultado:
7.4.1. Hidrlisis de la Urea: Negativa. No hay viraje de color, el medio se observa amarillo plido.

Resultado: Hidrlisis de la Urea : Negativa: No hay viraje de color, el medio se observa amarillo plido.
8. PRUEBA DE CITRATO:
8.3.1. Escherichia coli: No utiliza el citrato como nica fuente de carbono, por lo tanto no hay
crecimiento en la superficie inoculada ni cambio de color.
8.4. Resultado:
8.4.1. Utilizacin del citrato: Negativo. No hay crecimiento ni viraje de color. El medio se observa de
color verde.

Resultado: Utilizacin del citrato: Negativo. No hay crecimiento ni viraje de color. El medio se observa
de color verde.

9. PRUEBA DE MALONATO:
Escherichia coli no utiliza el malonato como nica fuente de carbono, por lo tanto no hay crecimiento
en el medio ni cambio de color.
9.4. Resultado:
Utilizacin del malonato: Negativo. No hay viraje del color. El caldo se observa de color verde.

Resultado: Utilizacin del malonato: Negativo. No hay viraje del color. El caldo se observa de color
verde.
10.PRUEBA DE SORBITOL (incubacin a 37oC por 24 horas):

El diagnstico presuntivo de Escherichia coli O157:H7 debe realizarse por aglutinacin con los
antisueros O157 y H7, a partir de colonias no fermentadoras de sorbitol.

10.3.1. Escherichia coli O157: H7 se diferencia de los otros serotipos de Escherichia coli ente-
rohemorrgicas porque no fermenta el sorbitol en las primeras 24 horas de incubacin. Esta
caracterstica es importante confirmarla antes de la caracterizacin serolgica.
Nota : Todas las cepas que no fermenten el sorbitol en las primeras 24 horas deben remitirse al CNDR
para su respectiva confirmacin.
Resultado: Fermentacin del sorbitol: Negativo. No hay viraje del color, el caldo se observa de color
violeta.

Resultado: Positivo. Viraje del color del medio de violeta a amarillo.
11.SEROTIPIFICACIN:

ubicado en el LPS (lipopolisacrido) de la pared y estn conformados por carbohidratos. Pequeas

variaciones de los azcares dan como resultado variaciones en la especificidad del antgeno. En algunos
casos el antgeno est ubicado en la cpsula o en los flagelos. En todos los casos y cuando la naturaleza
del antgeno es altamente especfica, es utilizada para clasificar a la bacteria en serogrupos, serotipos
o tipos.
11.2. Procedimiento: Ver numeral 11.4.1 en adelante.

11.3. Fundamento inmunolgico de la bacteria:
Las enterobacterias tienen una estructura antignica compleja. El antgeno somtico (O) constituye la
parte ms externa de los lipopolisacridos de la pared celular, y consisten en unidades repetidas de
polisacridos resistentes al calor y al alcohol. El antgeno flagelar (H) est localizado en los flagelos, y
son lbiles al calor y alcohol. La caracterizacin de Escherichia coli O157:H7 se basa en la
comprobacin del antgeno de la pared O157 y el antgeno flagelar H7.
11.4. Caracterizacin de los antgenos somticos O (Ag O):

La caracterizacin del antgeno somtico O se realiza por aglutinacin en lminas de vidrio a partir
de cultivos puros de 24 horas en AN o TSA .
11.4.1.2. Con un palillo de madera, tomar un pequeo inculo de la cepa fresca. Mezclar vigorosa pero
gentilmente hasta obtener una buena homogenizacin.
11.4.1.3. Mover o rotar la lmina manualmente y en forma circular por un tiempo mximo de 1
minuto.
11.4.2. Resultados:
Presencia de grumos: indica que la cepa es autoaglutinable y posiblemente es una cepa rugosa no apta
para la caracterizacin serolgica.
Si no hay presencia de grumos: se realiza la aglutinacin con antisuero O157 .
11.4.3. Procedimiento para la serotipificacin polivalente somtica:
11.4.3.1. Sobre una lmina poner una gota del antisuero O157.
11.4.3.2. Con un palillo de madera, tomar un pequeo inculo de la cepa fresca. Mezclar vigorosa pero
gentilmente hasta obtener una buena homogenizacin.
11.4.3.3. Mover o rotar la lmina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de 1 mi-
nuto para favorecer la reaccin antgeno anticuerpo.
11.4.4. Resultados:
Aglutinacin: En menos de 1 minuto se forman grumos homogneos. Su presencia debe considerarse
como una prueba presuntiva de Escherichia coli O157.

No hay aglutinacin: Se observa una suspensin homognea de aspecto lechoso. Si no hay aglutinacin
se considera negativa para Escherichia coli O157.
Nota: aglutinaciones dbiles o tardas no deben considerarse como positivas.
11.4.5. Control de calidad de los antisueros:
11.4.5.1. Cepa Escherichia coli O157:H7 CNDR-RV 1
Resultado:
Positivo: Solucin Salina : negativo. No se observa aglutinacin.
Antisuero O157: positivo. Se observa aglutinacin.
11.5. Caracterizacin del antgeno flagelar H:

La deteccin del antgeno flagelar H7 requiere de una estimulacin previa de la movilidad (varios pasos)
en el medio de Craigy, que se prepara como se describe a continuacin:
11.5.1. Preparacin del Medio Craigy:
11.5.1.1. Pesar:
11.5.1.1.1. Caldo nutritivo 8 gr
11.5.1.1.2. Extracto de levadura 2 gr
11.5.1.1.3. Cloruro de sodio 5 gr
11.5.1.1.4. Nitrato de potasio 1 gr
11.5.1.1.5. Agar 5 gr
11.5.1.1.6. Agua destilada c.s.p. 100 ml
11.5.1.1.7. pH: 7.6
11.5.1.2. En tubos de 10x160mm con tapa de rosca se introduce una varilla hueca de 8cm de
longitud y 3 4 mm de ancho.
11.5.1.3. Se agregan 5mL del medio de cultivo (el cual contiene agar al 0.5%) en cada tubo.
11.5.1.4. Se esteriliza durante15 minutos a 121 oC y 15 lb. de presin (o 1.07 kg/cm 2).
11.5.1.5. El medio se deja gelificar colocando el tubo en posicin vertical. El interior de la varilla
debe haber quedado lleno del medio de cultivo y los bordes del mismo sobresalir entre
1-3 mm sobre la superficie del medio.
11.5.2. Procedimiento para la serotipificacin flagelar:
11.5.2.1. Con un asa recta sembrar un inculo en el centro del medio de cultivo contenido en el inte-
rior de la varilla y a una profundidad no mayor de 5 mm. Las bacterias mviles ms
competentes se desplazarn al fondo del medio contenido en la varilla y luego a la superficie
del medio de cultivo externo.
11.5.2.2. Tomar una porcin del crecimiento del tubo exterior con un asa redonda.
11.5.2.3. Realizar la aglutinacin en lamina con el antisuero H7 como se describe para la sero-
loga somtica (numeral 11.4.4).

11.5.3. Resultados:
Positivo: Solucin Salina : Negativo: no se observa aglutinacin.
Antisuero H7: Positivo: se observa aglutinacin con grumos finos.
11.5.4. Control de Calidad de los antisueros:
11.5.4.1. Escherichia coli O157:H7 CNDR-RV 1
Resultado: Positivo: Solucin Salina : Negativo: no se observa aglutinacin
Antisuero H7 : Positivo: se observa aglutinacin
11.6. Informe de resultado del coprocultivo:

Negativo: No se aisl Escherichia coli O157 H7.
Positivo: Se aisl Escherichia coli O157 : H7. No se requiere susceptibilidad antimicrobiana.
VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Lpez Cruz SR. Normas Tcnicas para Coprocultivo en Normas Tcnicas de Bacteriologia, Cap.V.,
3 ed., 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR, Agencia
Danesa para el Desarrollo Internacional DANIDA, Editorial Imprimatur, Managua, Nicaragua.
2. Manual de Procedimientos. Parte I: Escherichia coli diarrico. Taller Terico Prctico. Diagnstico
molecular de las enfermedades diarricas agudas causadas por Vibrio cholerae y Escherichia coli,
1998, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Carlos G. Malbran, Buenos Aires,
Argentina; Siena, Italia.
3. Lpez Cruz SR. Coprocultivo I en Manual de Bacteriologa Mdica., 3 ed., 2001, Ministerio de
Salud. Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR, Proyecto de Fortalecimiento de los
Laboratorios de Salud Pblica Post Huracn MITCH, AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua.
4. Tribu Escherichiae en Manual de Enterobacterias: Actualizacin Diagnstica. Cap. I, Servicio de
Enterobacterias. Departamento de Bacteriologa, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas,
INEI Dr. Carlos G. Malbrn, 2000, Buenos Aires, Argentina.
5. Levine MM. Escherichia coli that Cause Diarrea: Enterotoxigenic, Enteropathogenic, Enteroin-
vasive, Enterohemorrhagic, and Enteroadherent. Journal Infectious Diseases, 1987; 155 (3):377-89.
6. Rivas M, Binsztein N, Basanta G et al. Antibody Responses against Excherichia coli Heat-Labile
toxin and Colonization Factor Antigens I and II in Argentinian Children. Journal Infectious Diseases,
1996; 171: 1045-49.
7. Rivas M, Voyer L, Tous M. Hemolytic uremic syndrome: co.infection with two different serotypes
of shigalike toxin producing Escherichia coli. Medicina (Buenos Aires), 1993; 53:487-90.

CAPTULO 13.
Procedimientos para la identificacin
de Vibrio cholerae
1. TIPO DE MUESTRA:
1.1. Heces fecales recin evacuadas
1.2. Vmitos
1.3. Hisopado rectal

3.1. Recolectar la muestra en un frasco limpio de boca ancha en cantidad aproximada de 5g.
3.2. Cerrar hermticamente el frasco.
3.3. No haber ingerido tratamiento antimicrobiano 3 das antes.
3. 0BTENCIN DE LA MUESTRA EN CASO DE PACIENTES SOSPECHOSOS DE

CLERA:
3.1. Colecte la muestra de heces o vmitos del paciente en un frasco de vidrio o plstico de boca
ancha, limpio y seco. Basta colectar el equivalente a 1/4 de taza de las deposiciones. Es
importante tomar las muestras antes de iniciar tratamiento con antibiticos.
3.2. Introduzca dos hisopos en el frasco que contiene la muestra, luego introdzcalo en el tubo que
contiene el medio Cary Blair hasta el fondo del frasco, quebrando la parte superior del hiso-
po. Deje adentro los hisopos y cierre el tubo. El medio puede obtenerlo en el CNDR. Debe
enviarlo a temperatura ambiente.
3.3. Introduzca un tercer hisopo en el frasco que contiene la muestra de heces o vomito y simbrelo
en medios de agar SS, Mac onkey y caldo selenito, con el objetivo de buscar otros patge-
nos como Salmonella, Shigella y E. coli. La identificacin de estos enteropatgenos debe
ser realizada en su laboratorio. En caso que el laboratorio de su unidad no tenga la posibili-
dad de hacerlo, no es necesario realizar el numeral 3.3. El CNDR utilizar uno de los dos hisopos
(punto 3.2) para el aislamiento de shigellas, salmonellas y E. coli enterohemorrgico O157.
3.4. Si en un momento determinado hay un caso sospechoso y no tiene medio de Cary Blair, co-
lecte la muestra como se menciona en el numeral 1, y gurdela en refrigeracin (NO LA
CONGELE) LLAME INMEDIATAMENTE AL CNDR. para recibir instrucciones adicionales.
Captulo 13: Procedimientos para la identificacin de Vibrio cholerae 225

Si no es posible comunicarse, enve la muestra inmediatamente al CNDR. Transprtela en un

termo con refrigerante.
3.5. En pacientes fallecidos en los que fue posible colectar una muestra, el mdico o patlogo debe
tomar una muestra de 2 cm del ileon terminal. Esta debe depositarse en un tubo contenien-
do caldo nutritivo o un sustituto (BHI, Tipticasa Soya, Mueller Hinton. El caldo debe contener
1% de NaCl).

1. En caso de heces frescas, transportar en un frasco estril y de ser posible en un ambiente fro.
2. Si la muestra demora ms de 2 horas en llegar al laboratorio, debe transferirse a un medio
de transporte de Cary Blair y transportarla a temperatura ambiente.
2.1. Si la muestra es transportada en medio de transporte Cary Blair introducir 2 hisopos en el medio,
uno para procesamiento de clera y el otro para bsqueda de Salmonella spp, Shigella spp y
E. coli 0157 en su laboratorio.
3. En el caso de hisopados rectales, cuando la muestra se procesa en no ms de dos horas desde
el momento de la toma hasta su llegada al laboratorio, el hisopo se introduce en un tubo vaco
estril con tapa de rosca. Si el transporte durara ms de 2 horas, el hisopo se introduce en un
tubo con medio de transporte de Cary Blair. En esta ltima forma, el V. cholerae permanece
viable hasta 30 das a temperatura ambiente.
III. PROCESAMIENTO PREVIO DE LA MUESTRA:
1. SI SE TRABAJA LA MUESTRA A PARTIR DE HECES FRESCAS:

1.1. Tomar un hisopo con punta de algodn.
1.2. Introducir el hisopo en la muestra teniendo el cuidado de mezclarla homogneamente
1.3. Sembrar la muestra con el hisopo directamente en el tubo de agua peptonada (APA).
Con otro hisopo se toma una nueva muestra y se siembra en los medios de Agar MacConkey, Agar
SS y caldo Selenito, para bsqueda de Salmonella, Shigella y E. coli O157 (Ver captulo de
Coprocultivo.)
2. SI LA MUESTRA ES DE UN HISOPADO RECTAL O PROVENIENTE DEL MEDIO DE

TRANSPORTE CARY Y BLAIR:
2.1. Un hisopo sembrarlo en APA y con el otro realizar un inculo en MacConkey, otro en SS
agar y por ltimo sembrar el hisopo en caldo selenito.
A continuacin proceder de la forma siguiente:
2.2. Incubar el APA de 6 a 8 horas a una temperatura de 35 a 37 oC.
2.3. Subcultivar de la superficie del agua peptonada a agar TCBS ( tiosulfato, citrato, sales biliares,
sacarosa). Poniendo una a dos asadas en un extremo del plato, dejar que el exceso de lquido
se absorba por unos 5 minutos y estriar el inculo en la forma convencional.
2.4. Incubar de 18 a 24 horas a 35 - 37 oC.
226 Captulo 13: Procedimientos para la identificacin de Vibrio cholerae

2.5. Picar 2 UFC sospechosos del TCBS subcultivado del APA, y sembrarlo en un plato de TSA
con NaCl 1%. El plato de TSA debe ser previamente dividido en su parte posterior en 8
reas iguales con un marcador indeleble. Cada UFC debe ser sembrada en el rea respectiva
en forma serpentiforme. Cada una de los 8 UFC sembrados en el TSA deben sembrarse
simultneamente en TSI y LIA e incubarse durante 18-24 horas a 35-37 oC.
1. EQUIPOS:
1.1. Incubadora a 35 - 37 oC
1.2. Refrigeradora a 6 - 8 oC
1.3. Mechero tipo Bunsen
1.4. Reloj de mesa
1.5. Lmpara para lectura de serologa
2. MATERIALES Y REACTIVOS:
2.1. Guantes descartables no estriles
2.2. Frasco estril, boca ancha con tapa de rosca.
2.3. Hisopos estriles con punta de algodn
2.4. Tubos vacos para el caso de hisopados rectales
2.5. Marcadores indelebles
2.6. Asas rectas y redondas
2.7. Contenedores con cloro al 0.5 % para descarte de materiales no reusables
2.8. Platos petri plsticos lminas porta objetos para realizar las aglutinaciones
2.9. Palillos de madera
2.10. Tiras de oxidasa reactivo dihidrocloruro de tetrametil para fenilendiamina
2.11. Desoxicolato de sodio al 0.5%
2.12. Solucin salina 2%
2.13. Suero Polivalente de V. cholerae O1.
2.14. Antisuero Ogawa
2.15. Antisuero Inaba
2.16. Antisuero monovalente de V. cholerae O139
2.17. Aceite mineral
2.18. Alfa Naftol
2.19. KOH 40%
3.1. APA (Agua Peptonada Alcalina)
3.2. TCBS (Tio Sulfato Citrato Bilis Sacarosa)
3.3. TSA con 1% NaCl ( Agar Tripticasa Soya)

V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: numerales del 1.4 al 1.4.8 con respecto a pruebas de identificacin.
CNDR: numerales del 1.4 al 1.4.16 con respecto a pruebas de identificacin.

La familia vibrionaceae agrupa a bacterias acuticas, tanto de agua salada como de agua dulce; varias
son patgenas a diversos animales acuticos. Se reconocen once especies del gnero Vibrio como
causantes de infecciones intestinales y extraintestinales en humanos. Son microorganismos halfilos
(requieren sodio para su crecimiento), a excepcin de dos especies, llamadas por esta razn vibrios no
halfilos: V. cholerae y V. mimicus. De las especies de vibrio, se considera que las asociadas con
diarrea son: V. cholerae, seroptipo O1 y O139 ,V. cholerae no O1, V. parahemolyticus, V. fluvialis,
V. mimicus. V. hollisae, y V. furnisii. V. cholerae O1 y O139, productor de enterotoxina es el agente
causal de el clera.
Est constituido por bacilos gramnegativos anaerobios facultativos. Son pequeos (0.5 x 1.5-3 m) con
morfologa de bacilos rectos y semicurvos. Al efectuar varios subcultivos, desaparecen las formas curvas
y slo se observan bacilos rectos. Poseen un solo flagelo polar, cubierto de una envoltura. Son sensibles
a pH cido. El pH de 5 o menos les es letal.
Se trata de bacterias de fcil crecimiento, mesfilos y aerobios. Crecen bien en algunos medios de cultivo
comunes, especialmente en agar sangre de carnero al 5%. Sin embargo, el uso del medio selectivo y
diferencial llamado TCBS (Tiosulfato, Citrato, sales Biliares, Sucrosa) ayuda considerablemente en el
aislamiento primario. En este medio las bacterias presentan colonias grandes, aplanadas en los bordes
y amarillas.
La clasificacin serolgica de V. cholerae se basa en las caractersticas del antgeno somtico O el
cual est constituido por una protena termolbil y otra termoestable, y varios polisacridos. Esta especie
se divide en 6 serogrupos (1 al 6). Al serogrupo 1 pertenecen los vibriones colricos epidmicos que
causan el clera ( Vibrio cholerae O1 y O139).
Segn la protena somtica termoestable, el antgeno O se diferencia en 13 tipos (A-L). Vibrio cholerae
O1 presenta combinaciones de tres tipos de antgeno somtico: A, B y C. En base a las combinaciones
de estos antgenos, se diferencian tres subtipos serolgicos o serotipos: Ogawa (A + B), Inaba (A + C)
e Hikojima (A + B + C). Independiente de la clasificacin serolgica, V. cholerae O1 se diferencia, segn
sus caractersticas bioqumicas y epidemiolgicas en dos biotipos: El Tor y Clsico. El biotipo El Tor se
caracteriza por causar epidemias con pocos casos graves (aproximadamente 2%) y muchos casos leves
o asintomticos. Tambin sobrevive ms tiempo en el medio ambiente, y es ms resistente a los agentes
qumicos.
Esta infeccin es de transmisin fecal-oral. Se adquiere por la ingestin de Vibrio cholerae O1 de agua
contaminada y mariscos principalmente bivalvos (conchas), y de otros alimentos contaminados. El
perodo de incubacin es corto, de uno a cinco das. Cuando la infeccin se ha establecido en la
poblacin, las aguas negras desempean un importante papel en la cadena de la infeccin.
Vibrio cholerae O1 produce una potente enterotoxina extracelular. Se trata de una protena cuyo peso
molecular aproximado es 84,000 dalton. La enterotoxina activa el sistema adenilato ciclasa de las
clulas de la mucosa del intestino humano. Como consecuencia, intracelularmente se acumula adenosin

monofosfato cclico (AMP-C) que altera el transporte activo de iones a nivel de la membrana celular.
Ocurre secrecin activa de lquido y electrolitos hacia el lumen del intestino con disminucin de la
absorcin. En los casos graves, el paciente presenta diarrea abundante y acuosa (como agua de arroz)
y vmitos, lo que causa deshidratacin severa y acidosis metablica. En casos graves sin tratamiento,
la muerte puede ocurrir apenas 12 horas despus del aparecimiento de los sntomas. Algunos pacientes
con clera severo pueden excretar un volumen de fluido equivalente al peso de su cuerpo en 4 das. Las
infecciones moderadas y leves son las ms comunes.
El objetivo principal del tratamiento es para evitar la muerte por deshidratacin a travs del pronto
reemplazo de agua y electrolitos por la va oral o parenteral, segn el grado de deshidratacin. El
tratamiento con antimicrobianos acorta el perodo de la diarrea y disminuye el requerimiento de lquidos,
pero no es indispensable para la recuperacin del paciente. Adems, no eliminan el estado de portador
y su uso irracional se convierte en una fuerte presin selectiva para el aparecimiento de cepas
multirresistentes.
VII. IDENTIFICACIN:
1. EQUIPO, MATERIALES Y REACTIVOS PARA LA IDENTIFICACIN:

1.1. Equipo: (Ver numerales IV- 1).
1.2. Materiales y Reactivos: (Ver numerales IV-2).
1.3. Medios de cultivo: (Ver numerales IV-3).
1.4. Pruebas para la Identificacin
1.4.1. TSI (Agar Hierro Tres Azcares)
1.4.2. LIA (Agar Lisina Hierro)
1.4.3. Tiras de oxidasa reactivo dihidrocloruro de tetrametil para fenilendiamina
1.4.4. Desoxicolato de sodio al 0.5%
1.4.5. Solucin salina 2%
1.4.6. Antisuero Polivalente de V. cholerae O1
1.4.7. Antisuero Ogawa y Antisuero Inaba
1.4.8. Antisuero Monovalente O139
1.4.9. Caldo de Ornitina con NaCl al 1%
1.4.10. Caldo de Lisina con NaCl al 1%
1.4.11. Caldo de Arginina con NaCl al 1%
1.4.12. Caldo de Sacarosa con NaCl al 1%
1.4.13. Caldo nutritivo con NaCl al 1% y Caldo nutritivo sin NaCl
Biotipos: (Clsico y el Tor)

1.4.14. Caldo Vogues Proskauer
1.4.15. Hemlisis en Agar Sangre de Carnero al 5%
1.4.16. Sensibilidad a la Polimixina B 50 U


1.5.3 Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1 (no portador de enterotoxina)

1.7. Antimicrobianos a utilizar par la Concentracin Minima Inhibitoria: Ninguno.
1.8. Pruebas Especiales: Ninguna.
2. CRECIMIENTO EN CALDO DE ENRIQUECIMIENTO AGUA PEPTONADA ALCALINA

(APA):
El pH alcalino del APA inhibe y retrasa el crecimiento de otras bacterias pero no de Vibrio cholerae,
por lo que crece sin dificultad en un tiempo de 6-8 horas a una temperatura de 35 a 37oC de incubacin.
2.4. Resultado:
Se observa turbidez y la formacin de una pelcula blanca de crecimiento en la superficie del caldo.

2.5.1. Vibrio choerae O1 CNDR AT-1
Resultado: turbidez del medio y formacin de una pelcula blanquecina en la superficie del caldo.
Nota: El V. cholerae O1 CNDR AT-1 fue aislado en aguas del balneario de Tipitapa y
se comprob que careca de los genes que regulan la produccin de la toxina y uno de
los factores de adherencia. La comprobacin fue hecha con mtodos moleculares en el
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Carlos G. Malbran de Argentina, por
lo cual no existe riesgo en su uso en el laboratorio para fines de control de calidad. Sin
embargo, deben tomarse las precauciones universales para su manipulacin,
almacenamiento y eliminacin.
3. CRECIMIENTO EN AGAR TIO SULFATO CITRATO BILIS SACAROSA (TCBS):


3.3. Fundamento bioqumicos de la bacteria:

Vibrio cholerae posee la enzima invertasa por lo tanto fermenta la sacarosa y como resultado las
UFCs se observan de color amarillo, de 2-3 mm, chiclosas, redondas, lisas, brillantes y ligeramen-
te aplanadas las ms grandes o francamente convexas las pequeas.
3.4. Resultado:
UFCs de 2-3mm, planas o convexas, amarillas y brillantes.

3.5.1. Vibrio cholerae O1 CNDR AT-1
Resultado: Crecimiento de UFCs de 2-3mm, planas o convexas, amarillas y brillantes.
4. AGAR TSA CON NACL AL 1%:

El NaCl al 1% confiere un crecimiento ms vigoroso a las cepas de V. cholerae. El propsito de la siem-
bra en este medio es obtener un crecimiento masivo para realizar las pruebas presuntivas y confirmativas.
4.4. Resultado:
V. cholerae crece confluentemente siguiendo la forma serpentiforme de las estras.

Resultado: Crecimiento confluente
5. PRUEBA DE TSI (TRIPLE AZUCAR Y HIERRO):

Vibrio cholerae posee las enzimas galactosidasa y galactsidopermeasa, (fermenta la lactosa) posee
la enzima invertasa (fermenta la sacarosa) y tambin posee la enzima glucosa 6 fosfato deshidroge-
nasa (fermenta la glucosa). No produce gas porque carece de la enzima deshidrogenasa frmica y
de las enzimas tiosulfatoreductasa y cistenadisulfurasa por lo tanto, no produce sulfuro de hidrgeno.

5.4. Resultado:
Vibrio cholerae : A/A (amarillo / amarillo sin gas y sin H2S).

5.5.2. Resultado: A /A (amarillo / amarillo)
6. PRUEBA DE LIA ( LISINA HIERRO AGAR):

Vibrio cholerae posee la enzima lisina descaborxilasa por lo tanto, descarboxila la lisina.
6.4. Resultado:
Vibrio cholerae: K/K (violeta /violeta sin gas y sin H2S)

Resultado: Descarboxilacin de la lisina: K/K (violeta/violeta)
PRUEBAS PRESUNTIVAS PARA Vibrio cholerae O1
7.2. Procedimiento:
Se realiza con colonias aisladas recientemente de agar TSA con NaCl al 1%.
7.2.1. Se toma una cinta de oxidasa. Con un palillo se toma un inculo del agar TSA y se coloca en
el centro de la parte de la tira con el reactivo. Una alternativa en vez de la tira comercial
es impregnar un pedazo de papel absorbente con una a tres gotas del reactivo tetrametil
para fenilendiamina al 1%. El papel debe colocarse previamente en un plato petri.
7.2.2. El inculo se extiende, ya sea en la parte correspondiente de la tira o del papel impregnado con
el reactivo.
7.2.3. La lectura debe realizarse en los primeros 10 segundos. El cambio de color a un prpura intenso
indica la presencia de la enzima citocromo oxidasa.

7.3.1. Vibrio cholerae posee la enzima citocromo oxidasa, por lo tanto da reaccin positiva que
se caracteriza por la aparicin de un color prpura en la tira reactiva.

7.4. Resultado:
Oxidasa positiva: se observa un color a prpura en la tira reactiva. Ver figura No 1.

Resultado: Se observa un rpido aparecimiento de un color prpura en la tira reactiva.
Resultado: No hay aparecimiento del color prpura en menos de 10 segundos.
Figura No. 1
8. PRUEBA DEL CORDN:

Las clulas bacterianas se lisan por efecto del desoxicolato, por esta razn la suspensin perder turbidez
y el DNA liberado de las clulas lisadas ocasionara que la mezcla se haga viscosa.
8.2. Procedimiento:
Sobre un plato petri de plstico en una lmina poner una gota de solucin acuosa de desoxicolato de
sodio al 0.5%.
8.2.1. Con un aplicador de madera palillo de dientes estril, tomar un pequeo inoculo de la cepa
fresca y pura del agar TSA.
8.2.2. Mezclar homogenizando de modo circular. Debe leerse en los primeros 30 segundos.

V. cholerae se alisa por efecto del desoxicolato, por esta razn la mezcla se torna viscosa y se forma
un hilo mucoide al suspender o levantar el palillo o asa.

8.4. Resultado:
Prueba del cordn positiva: formacin de hilo mucoide. Ver figura No. 2.

Resultado: formacin de hilo mucoide.
Figura No. 2
9. SEROLOGA DEL ANTISUERO POLIVALENTE O1 Y DEL ANTISUERO

MONOVALENTE O139:

La tipificacin serolgica de los aislamientos de Vibrio cholerae se basa en la deteccin de los ant-
genos somticos O termoestables y de naturaleza lipopolisacarida. Basndose en los antgenos O se
han identificado ms de 130 serogrupos en esta especie, pero solamente los que poseen los antgenos
O del grupo 1 (serogrupos O1 y O 139) producen la toxina asociada a clera epidmica. Los antgenos
flagelares (H) se comparten ampliamente entre los serogrupos O y no han resultado tiles para
identificacin.
9.2. Pr ocedimient o: Ver numerales 9.4 en adelante.

Vibrio cholerae O1 y O139 poseen los antgenos somticosO que aglutinan con suero polivalente
O1 y monovalente O139. La aglutinacin se puede observar a simple vista por la rpida conformacin
de grumos. Fig. No. 3.
La identificacin del serotipo con antisueros monoespecficos (absorbidos) O139 sigue siendo la
prueba serolgica confirmatoria para los aislamientos de V. cholerae que no aglutinan con el anti-
suero polivalente O1.

Se realiza en lmina a partir de un cultivo puro de 24 horas. Es importante verificar que la bacteria se
encuentre en forma lisa, lo cual se comprueba haciendo mezclando un inculo con solucin salina al 2%.
A continuacin se describe la tcnica.


9.4.1.2. Con un palillo, tomar un pequeo inculo de la cepa fresca y pura. Mezclar homogenizan-
do bien y cuidadosamente.
9.4.1.3. Mover o rotar la lmina manualmente y en forma circular por un tiempo mximo de 1 minuto.
9.4.2. Resultados:
Si no hay presencia de grumos se realiza la aglutinacin con antisuero polivalente O1.
La presencia de grumos (autoaglutinacin) indica la presencia de una cepa rugosa o de un V. cholerae
atpico. La obtencin de cepas lisas se logra con varias resiembras en ASC. Luego se repite el
procedimiento anterior.
9.4.3. Procedimiento para la serotipificacin polivalente O1:
9.4.3.1. Sobre un plato petri de plstico o en una lmina portaobjetos poner una gota del antisuero
polivalente O1.
9.4.3.2. Con un palillo, tomar un pequeo inculo del agar TSA y mezclar homogenizando bien y
cuidadosamente.
9.4.3.3. Mover o rotar manualmente en forma circular el plato o la lmina, por un tiempo no mayor a
un 1 minuto.
9.4.3.4. Si la prueba es negativa con el Polivalente O1 realizar el mismo procedimiento con suero
monovalente O139. Ver numerales 9.4.3.1-9.4.3.3.
9.4.4. Resultados:
Aglutinacin con el polivalente O1: debe considerarse como V. cholerae O1.
Aglutinacin con el monovalente O139: debe considerarse como V. cholerae O139.
En cualquier caso, enviar la cepa al CNDR para su debida confirmacin.
Nota: aglutinaciones dbiles o tardas no deben considerarse como positivas. Ver figura No. 3.
Figura No. 3
1) Aglutinacin Positiva 2) Aglutinacin Negativa.

10.SEROLOGA CON LOS ANTISUEROS, OGAWA E INABA:

Segn la protena somtica termoestable, el antgeno O se diferencia en 13 tipos (A-L); Vibrio cholerae
O1 presenta combinaciones de tres tipos de antgeno somtico: A, B y C. En base a las combinaciones
de estos antgenos, se diferencian tres subtipos serolgicos o serotipos: Ogawa (A + B), Inaba (A + C),
e Hikojima (A + B + C). Este litmo es muy raro y generalmente inestable. Su identificacin se atribuye,
con frecuencia, a reacciones en que los antisueros de prueba se absorbieron de manera inadecuada.
10.2.1. Sobre un plato petri de plstico o en una lmina portaobjeto poner una gota de cada uno
de los antisueros Ogawa e Inaba.
10.2.2. Con un palillo, tomar un pequeo inculo de la cepa fresca y pura del agar TSA. Mezclar
homogenizando bien y cuidadosamente.
10.2.3. Mover o rotar el plato o la lmina manualmente en forma circular, por un tiempo no mayor de
1 minuto, para favorecer la reaccin antgeno anticuerpo.

Los V. cholerae que tienen los antgenos proticos A y B se designan como serotipo Owaga. Los que
tienen los antgneos proticos A y C se designan como serotipo Inaba.
A diferencia de la aglutinacin con el suero polivalente O1, la reaccin en el caso de Ogawa es ms
tardada pero los grumos son claramente visibles. En el caso de Inaba los grupos tardan en aparecer y
son muy finos. Fig. No. 3.
10.4. Resultado:
Aglutinacin positiva con suero Ogawa: se corresponde con V. cholerae O1 serotipo Ogawa.
Aglutinacin positiva con suero Inaba: se corresponde con V. cholerae O1 serotipo Inaba.
Nota: En caso de aglutinacin con ambos sueros enviar al CNDR para su confirmacin. Ver resumen
de las pruebas presuntivas en tabla No. 1.
PRUEBAS CONFIRMATIVAS PARA Vibrio cholerae O1:
11.PRUEBA DE ORNITINA EN CALDO CON NaCl AL 1%:

Vibrio cholerae, posee la enzima ornitina descarboxilasa, por lo tanto, descarboxila la ornitina dan-
do como producto terminal la putrescina que alcaliniza el medio.

11.4. Resultado:
Descarboxilacion de la ornitina positiva: viraje de color que acenta el color violeta. El crecimiento de
la bacteria hace que el caldo se observe turbio. Ver figura No. 4.

Resultado: Decarboxilacin de la ornitina positiva: viraje de color que acenta el color violeta. El
crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio.
12.PRUEBA DE LISINA EN CALDO CON NaCl AL 1%:

Vibrio cholerae, posee la enzima lisina descarboxilasa, por lo tanto descarboxila la lisina, dando como
producto terminal la cadaverina que alcaliniza el medio.
12.4. Resultado:
Descarboxilacion de la lisina positiva: hay un ligero viraje de color que acenta el color violeta. El
crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio. Ver figura No. 4.
Resultado: Descarboxilacion de la lisina positiva: hay un ligero viraje de color que acenta el color
violeta. El crecimiento de la bacteria hace que el caldo se observe turbio.
13.PRUEBA DE ARGININA EN CALDO AL CON NACL AL 1%:

Vibrio cholerae carece de la enzima argininadihidrolasa, por lo tanto no se forma del producto final
citrulina.
13.4. Resultado:
Dihidrlisis de la arginina negativo: viraje de color del medio de violeta a amarillo por fermentacin de
la glucosa. Ver figura No 4.


Resultado: Dihidrolisis de la arginina negativo: viraje de color del medio de violeta a amarillo.
14.PRUEBA DE SACAROSA EN CALDO CON DE NaCl AL 1%:

14.3. Fundamento bioqumicos de la bacteria: Vibrio cholerae posee la enzima invertasa,
por lo tanto hay fermentacin de la sacarosa.
14.4. Resultado: Fermentacin de la sacarosa positivo: viraje de color del medio de violeta a amarillo.
Ver figura No 4.

Resultado: Fermentacin de la sacarosa positiva: viraje de color del violeta al amarillo.
15.PRUEBA DE CRECIMIENTO EN CALDO NUTRITIVO CON NaCl AL 1% Y CALDO

NUTRITIVO SIN NaCl:

La mayor parte de las especies de Vibrio diferentes de Vibrio cholerae son halfilas, por lo que requie-
ren de una cantidad mnima de sal en los medios de cultivo para su crecimiento. La capacidad de
V. cholerae para crecer en medios de cultivo con o sin sal es una caracterstica selectiva til.
Los caldos se inoculan con un inculo muy pequeo tomado del agar TSA recin obtenido. El inculo
debe de ser tan pequeo que no cause turbidez antes de incubar los caldos. Luego se incuban a

una temperatura de 35 a 37 oC y se leen entre las 18 a 24 horas. Si no hay crecimiento en 24

horas, se incuban hasta 7 das.

Vibrio cholerae y el Vibrio mimicus no son halfilos pero s halotolerantes, por lo que crecen bien
tanto en el caldo nutritivo con el NaCl al 1% y en el caldo sin NaCl, debido a que el caldo simple
contiene trazas de sal suficientes para el crecimiento.
15.4. Resultado:
Crecimiento en ambos tubos. Se observa mayor turbidez en el tubo que contiene NaCl al 1%.

Resultado: Crecimiento en ambos tubos con mayor turbidez en el que contiene NaCl.
DETERMINACIN DE LOS BIOTIPOS EL TOR Y CLSICO:

16.PRUEBA VOGUES PROSKAUER CON NaCl AL 1%:
V. cholerae produce acetilmetilcarbinol como producto metablico final del metabolismo de la
glucosa. En presencia de oxgeno atmosfrico e hidrxido de potasio al 40%, el acetilmetilcarbinol
se convierte a diacetilo. Al agregar el naftol, el cual sirve de catalizador se forma un complejo en la
superficie del tubo, por lo que aparenta un anillo de color zapote.
Nota: en el caso de V. cholerae la incubacin del caldo con VP se requieren 48 horas antes de
realizar la prueba.
16.4. Resultado:
16.4.1. Vogues Proskauer positivo: se forma un anillo de color zapote en la superficie del caldo.
16.4.2. Vogues Proskauer negativo: se forma un anillo de color caf claro u oscuro que se corres-
ponde con el color del naftol.

Resultado: Vogues Proskauer positivo: se forma un anillo de color zapote en la superficie del caldo.
Resultado: Se forma un anillo color caf claro u oscuro (color del naftol )

17.PRUEBA DE HEMLISIS EN ASC AL 5%

17.1. F undament o de la pr ueba: Ver captulo de Streptococcus.
17.2. Pr ocedimient o: Ver captulo de Streptococcus.
Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor produce hemolisinas, observndose desde una leve a una marcada
beta hemlisis. El biotipo Clsico no es hemoltico.
17.4. Resultado:
17.4.1. Produccin de hemolisinas: Beta hemlisis alrededor de las colonias, biotipo El Tor.
17.4.2. Sin produccin de hemolisinas: Ausencia de beta hemlisis alrededor de las colonias, biotipo
Clsico.

Resultado: Beta hemlisis alrededor de las colonias
18.PRUEBA DE SENSIBILIDAD A LA POLIMIXINA B 50 U:

El disco de polimixina B 50 U es un antimicrobiano polipptido catinico, bactericida para nume-
rosos bacilos aerobios gramnegativos que acta a nivel de las membranas celulares ricas en fos-
fatidiletanolamina y cuyo resultado es la alteracin del transporte activo y la permeabilidad selectiva.
18.2.1. Proceda a la preparacin de un inculo y su siembra en el medio de Mueller Hinton segn se
describen en el captulo de sensibilidad a los antimicrobianos por el mtodo de Kirby y Bauer.
18.2.2. Coloque un disco de polimixina B de 50 unidades en el centro del agar inoculado con el
V. cholerae.
18.2.3. Incube de 18 a 24 horas y a una temperatura de 35 a 37 oC.

V. cholerae O1 es sensible o resistente a la accin bactericida de la polimixina B, segn el biotipo.
El Tor es resistente y el biotipo Clsico es sensible.
18.4. Resultado:
Halo de inhibicin (no importa el dimetro): biotipo Clsico.
Ningn halo de inhibicin: biotipo El Tor. (ver figura No. 5).


Resultado: Halo de inhibicin negativo: El crecimiento del V. cholerae llega hasta la orilla del disco.
Biotipo El Tor.
Figura No. 5
Biotipo El Tor Biotipo Clsico
Nota: Ver resumen de las pruebas confirmativas en tabla No. 2.

Diagrama de flujo para el aislamiento e identificacin de V. cholerae
Muestras: Heces, hisopado rectal vmitos
Medio de trasporte Cary-Blair
Enriquecimiento en agua peptonada alcalina (APA)

Incubacin 6 a 8 horas a 35-37C
Subcultivo de la superficie del caldo (APA) en agar TCBS

Incubar 18 a 24 horas a 35-37C
UFCs sospechosas amarillas 2-3mm de dimetro aplanadas
Sembrar en agar TSA con NaCl al 1%
Pruebas presuntivas TSI y LIA

A/A y K/K
Oxidasa ( )
Oxidasa (+)
Se descarta de
V. cholerae
Cordn ( )
Cordn (+) Se descarta
Solucin Salina (+)

Solucin Salina ( )
Polivalente O1 ( ) Polivalente O1 (+)
Serotipo Factores Ogawa Inaba

Ogawa A, B +
Monovalente O139 Inaba A, C +
Hikojima A, B, C + +
O139 ( ) 0139 (+)

se reporta V. cholerae O139
Se descarta V. cholerae

TABLAS DE DIFERENCIACIN BIOQUMICA

TABLA No. 1
PRUEBAS PRESUNTIVAS DE V. cholerae 01
OXIDASA CORDON S S 01 0139 Inaba Ogawa
01 POS POS NEG POS NEG POS NEG
01 POS POS NEG POS NEG NEG POS
0139 POS POS NEG NEG POS
SS: solucin salina - Pos: positivo - Neg: negativo
TABLA No. 2
PRUEBAS CONFIRMATIVAS DE V. cholerae 01
O L A S NaCl 1% Caldo sin NaCl VP Hemlisis Polimixina
01 El Tor POS POS NEG POS POS POS POS POS R
01 Clsico POS POS NEG POS POS POS NEG NEG S
0139 POS POS NEG POS POS POS POS POS
18.6. Informe:
18.6.1. Positivo
Vibrio cholerae O1, Ogawa, El Tor.
Vibrio cholerae O1, Inaba, El Tor.
Vibrio cholerae O139.
18.6.2. Negativo para Vibrio cholerae O1 y O139
VIII. BIGLIOGRAFA:
1. Trrez MF, Cano F., Gonzlez Camargo CL, Aguilar de Miranda T., Paniagua F. Etiologa y
Diagnstico de Laboratorio de el Clera. Organizacin Panamericana de la Salud. Publicacin
Tcnica No.1, 1991, Guatemala.
2. Mtodos de laboratorio para el diagnstico de Vibrio cholerae. Centro para el Control y Prevencin
de Enfermedades CDC y Organizacin Panamericana de la Salud, OPS, Programa Especial de
Publicaciones, OPS, 1994, Washington, D.C.
3. Lpez Cruz SR. Vibrio cholerae: Manual de Bacteriologa Mdica 3 ed., Ministerio de Salud. Cen-
tro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR. Proyecto de Fortalecimiento de laboratorios
Post Huracn MITCH. AID/CDC/APHL/CNDR, Managua, Nicaragua.
4. Gonzlez Mairena A, Lpez Cruz SR. Diagnstico de Clera por Laboratorio en Normas tcnicas de
Bacteriologa, Cap. IV. Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR,
3 edicin, 1996, Agencia Danesa para el Desarrollo Internacional, DANIDA, Editorial Impri-
matur, Managua, Nicaragua.
5. Quimioterapia Antimicrobiana en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F.
Brooks, editor, captulo 10, 16 edicin (de la 21a edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual
Moderno S.A. de C.V. Mxico, D.F.

CAPTULO 14.
de microorganismos aislados en
exudado vaginal
1. RECOMENDACIONES AL PACIENTE:
1.1. No debe haber recibido ningn tratamiento local o sistmico con antimicrobianos, tres das antes
de la toma de la muestra.
1.2. Abstinencia sexual el da anterior a la toma de la muestra.
1.3. Debe presentarse sin haberse realizado ducha vaginal. Las nias no debern haberse baado
o limpiado los genitales.
1.4. Este examen no debe realizarse durante el perodo menstrual.
2. TIPO DE MUESTRA:
2.1. Exudado vaginal y endocervical:

2.1.1. Acostar al paciente en posicin ginecolgica e introducir el espculo estril sin aplicar ningn
tipo de lubricante.
2.1.2. Con un hisopo estril, tomar la muestra del exudado de las paredes y el fondo del saco de
Douglas.
2.1.3. Hacer un frotis en el extremo de una lmina portaobjetos.
2.1.4. El frotis debe quedar transparente y sin residuos que impidan una buena lectura despus de la
tensin.
2.1.5. Introducir el hisopo en un tubo de ensayo con 1mL de solucin salina al 0.85% para examen
al fresco.
2.1.6. Localizar el endocrvix e introducir un hisopo estril en el mismo.
2.1.7. Rotar el hisopo sobre si mismo con el objetivo de eliminar el moco cervical.
2.1.8. Introducir un segundo hisopo estril y seco, a una profundidad de 1-1.5cm dentro del canal
endocervical y rotarlo gentilmente.
2.1.9. Hacer un frotis de forma redonda a la par del frotis del exudado del fondo de saco de Douglas.
El frotis debe tener un espesor tal que permita leer letras pequeas a travs de l y un di-
metro no mayor de 2 cm.
Captulo 14: Procedimientos para la identificacin de Thrichomonas vaginalis, 245

2.1.10. Utilizando otro hisopo estril, repita el procedimiento descrito en 2.1.7.

2.1.11. Inocule el hisopo en un plato de agar Thayer Martin. Estrelo en la forma convencional e
introdzcalo inmediatamente en una jarra de vidrio y genere CO 2 con el mtodo de la
vela. Utilice slo velas de parafina blanca.
2.2. Toma de muestra de exudado vulvar:

2.2.1. Cuando se trate de nias es conveniente que siempre est presente un familiar o un testigo
de la institucin. Debe explicarse claramente a la madre o pariente que el hisopo no ser
introducido en la vagina. En los casos de tipo mdico legal, la muestra debe ser to-
mada exclusivamente por un gineclogo.
2.2.2. Acostar al paciente en posicin ginecolgica. Separar los labios mayores.
2.2.3. Con un hisopo estril, tomar por frotacin una muestra del introito vaginal y uretral. Hacer
un frotis en una lmina portaobjetos con las mismas caractersticas descritas en el aparta-
do 2.1.8 de exudado vaginal y endocervical.
2.2.4. Con la misma tcnica y utilizando un segundo hisopo estril repita el procedimiento de to-
mar la muestra segn se describe en 2.2.2. En caso de enrojecimiento en los labios ma-
yores, frote la cara contralateral del hisopo en las zonas eritematosas.
2.2.5. Inocular el hisopo en el plato con agar Thayer Martin. Estriarlo en la forma convencional e
introducirlo inmediatamente en una jarra de vidrio. Generar ambiente de CO 2 por el m-
todo de la vela.
2.2.6. Introducir el hisopo en un tubo de ensayo con 1mL de solucin salina al 0.85% para
examen al fresco.
2.3. Exudado uretral en mujeres:

2.3.1. Ponerse guantes descartables estriles.
2.3.2. Acostar al paciente en posicin ginecolgica. Separar los labios mayores.
2.3.3. Presionar el orificio uretral y tomar la muestra con un hisopo estril.
2.3.4. Inocular la muestra en el medio Thayer Martin.
2.3.5. Con la misma tcnica y utilizando otro hisopo estril, hacer un frotis en una lamina por-
taobjetos.

Trasportar el exudado vaginal para examen al fresco en un tubo de ensayo con solucin salina 0.85%.

No hay procedimientos previos.
246 Captulo 14: Procedimientos para la identificacin de Thrichomonas vaginalis,

IV. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS:

1.1. Equipos:
1.1.1. Camilla
1.1.2. Espculo estril
1.1.3. Lmpara cuello de ganso

1.2.1. Guantes
1.2.2. Hisopos de algodn estriles
1.2.3. Lminas porta objetos
1.2.4. Marcador indeleble
1.2.5. Solucin de cloro al 0.5%.
1.2.6. Tubos de ensayo con 1mL de solucin salina al 0.85%

1.3.1. Agar Thayer Martin
2.1. Materiales:
2.1.1. Gradilla
2.1.2. Tubos de ensayo con 1mL de solucin salina al 0.85%
V. ALCANCE:
Ver alcance en procedimientos para la identificacin de cada microorganismo.
VI. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS DEL EXUDADO VAGINAL:

Las infecciones del aparato genital femenino son causadas por una amplia variedad de microorganismos
que incluyen bacterias, hongos y virus. Algunos sntomas son ocasionados por organismos exgenos
mientras que otros son causados por miembros de la microbiota local de la paciente. El tipo de infeccin
y el agente causal es influenciado por un sinnmero de factores que incluyen: Actividad sexual, uso de
dispositivos intrauterinos, instrumentacin del aparato genital, administracin de antimicrobianos y
enfermedades sistmicas.
Los microorganismos que causan este tipo de infecciones se pueden clasificar en tres grupos
Grupo 1: microorganismos que no son parte de la microbiota local. Si se aslan se reportan siempre:
a.) Neisseria gonorrhoeae
b.) Trichomonas vaginalis
c.) Chlamidia trachomatis*
*No se incluye en el presente Manual.

Grupo 2: Son parte de la microbiota local, pero en condiciones especiales, en asociacin con
anaerobios son causa de leucorrea. Se identifican y se reportan si rene un conjunto de criterios
diagnsticos.
a.) Gardnerella vaginalis
b.) Candida albicans
c.) Mobiluncus spp
d.) Ureaplasma urealyticum*
e.) Micoplasma hominis*
* No se incluyen en el presente Manual.
Grupo 3: Son parte de la microbiota local y estn asociados a leucorrea si hay cambios en el pH, dao
local (partos, legrados, maniobras quirrgicas), o enfermedad sistmica. No se aslan de rutina sino
cuando el mdico lo solicita y la solicitud debe acompaarse de una breve historia clnica acerca del
problema. Una excepcin es el Streptococcus hemoltico del grupo B (Streptococcus agalactiae), que
siendo miembro de la microbiota local, debe aislarse y reportarse en mujeres embarazadas, cuando el
cultivo se realiza en los ltimos das previo a la fecha probable del parto. En nios recin nacidos
prematuros o recin nacidos a trmino pero con historia de sufrimiento fetal o en nios inmuno-
comprometidos, suelen desarrollarse infecciones pulmonares, cardacas, infeccin del torrente sanguneo
(spsis) o meningitis por Streptococcus hemoltico del grupo B adquirido en la vagina durante el
transcurso del parto. Por esta razn, a este grupo de mujeres se le administra tratamiento profilctico
antes del parto.

de Trichomonas vaginalis
Ver toma de la muestra al inicio de este captulo.

Ver transporte de la muestra al inicio de este captulo.

Ver procesamiento de la muestra al inicio de este captulo.

Ver equipo, materiales y reactivos muestra al inicio de este captulo.
V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red y Centro de Referencia aplican todos los incisos con respecto a las pruebas de
identificacin.

La trichomoniasis es una enfermedad de transmisin sexual causada por Trichomonas vaginalis, un
protozoario flagelado. Morfolgicamente tiene forma de pera, con una membrana ondulante que se
extiende desde la parte media a la posterior. Adems, en la parte anterior posee cuatro flagelos con los
cuales se desplaza con movimientos rotatorios y vacilantes. Dado a su tamao (longitud de 15-20 m)
es fcilmente visible con un objetivo de 40X. De las tres especies de tricomonas que infectan al hombre,
solamente Trichomonas vaginalis es patgeno.
Trichomonas vaginalis puede causar inflamacin moderada, sobre todo cuando la invasin a la mucosa
es intensa. El pH, el estado fisiolgico de las superficies vaginales y la microbiota bacteriana
acompaante son los principales factores que afectan la patogenicidad.
En la mujer, la infeccin est limitada a la vulva, vagina y crvix. Rara vez se extiende al interior del
tero. En el hombre es poco comn, pero se pueden infectar las vesculas seminales, prstata y uretra.
Los signos y sntomas en las mujeres son: leucorrea, sensibilidad local, prurito vulvar y sensacin de
quemadura. Alrededor del 10% de los hombres infectados tienen un exudado uretral blanquecino.

VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.1. Centrfuga
1.1.2. Microscopio

1.2.2. Lminas cubreobjetos
1.2.3. Pipetas Pasteur
1.3. Pruebas para identificacin:

1.3.1. Examen al fresco.
2. EXAMEN AL FRESCO:
2.1. Fundamento:
El examen al fresco consiste en determinar visualmente la presencia Trichomonas vaginalis.
2.2. Procedimiento:
2.2.1. Centrifugar la muestra entre 3,000 a 5,000 rpm durante tres minutos.
2.2.2. Eliminar el sobrenadante.
2.2.3. Con una pipeta de Pasteur, tomar una gota del sedimento y colocarla en una lmina por-
taobjetos. Colocar encima un cubreobjetos.
2.2.4. Observar al microscpico con objetivo de 40X.

Trichomonas vaginalis es un protozoario flagelado en forma de pera, que se evidencia principalmente
por su movimiento rotatorio y ondulatorio.
2.4. Resultado:
Presencia de Trichomonas vaginalis en el examen al fresco.
2.5. Informe:
Positivo: Se observaron Trichomonas vaginalis.
Negativo: No se observaron Trichomonas vaginalis.

de Gardnerella vaginalis



V. ALCANCE:
identificacin.

Gardnerella vaginalis es un bacilo aerobio Gram variable, con similitud a la pared de los grampositivos
a excepcin que es mas delgada, es inmvil, y forma parte de la microbiota normal de la vagina y el
ano de adultos de ambos sexos. Tambin se encuentra en el ano de los nios. En ciertas circunstancias
se torna virulento y causa una vaginitis no especfica (vaginosis). Los frotis hmedos de vaginitis
inespecfica dan lugar a las clulas pista, las cuales son clulas epiteliales de la vagina recubiertas con
muchos bacilos gramnegativos muy pequeos, principalmente en la periferia de estas clulas. La
leucorrea suele tener un olor caracterstico a pescado que se acenta o se hace evidente al agregar una
una gota de hidrxido de potasio. En casos de vaginosis por G. vaginalis el pH vaginal se incrementa
a 4.5-5.5 (normal: 3.5-4.5). La referencia (regla de oro) para la identificacin de Gardnerella vaginalis
no es el cultivo sino su identificacin directa. Para su diagnstico se valoran estos tres aspectos: olor
caracterstico a pescado (prueba de aminas), presencia de clulas pista y pH de la vagina.

VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.1. Microscopio

1.2.1. Lminas porta objetos
1.2.2. KOH al 10%
1.2.5. Pipetas Pasteur

1.3.1. Prueba de aminas
1.3.2. Gram
1.3.3. pH vaginal*
* El pH vaginal debe ser tomado con cintas especiales que puedan detectar cambios de pH entre
2 y 5. Estas cintas no estn disponibles para el laboratorio por lo que nicamente se har el diagnstico
basado en la prueba de aminas y Gram.
2. PRUEBA DE AMINAS:
2.1. Fundamento:
Al poner en contacto una gota de la muestra de exudado vaginal o vulvar con una gota de KOH al 10%,
se desprende un olor a pescado caracterstico que indica la presencia de aminas.
2.2. Procedimiento:
2.2.1. Colocar una gota de la muestra en un portaobjeto y agregar a sta, una gota de KOH al 10%.
2.2.2. Olfatear la muestra para determinar si ocurre desprendimiento de un olor a pescado
caracterstico que indica la presencia de aminas.

Gardnerella vaginalis al ponerse en contacto con KOH al 10% libera un olor a pescado caracterstico
que indica la presencia de aminas.

2.4. Resultado:
Desprendimiento de un olor a pescado caracterstico que indica la presencia de aminas al mezclar la
muestra con el KOH.
2.5. Informe:
2.5.1. Positivo: Prueba de aminas positiva
2.5.2. Negativo: Prueba de aminas negativa
3. GRAM:
3.1. Fundamento:
El anlisis de la tincin de Gram consiste en observar la presencia o ausencia de clulas pista, que en
caso de estar presentes evidencian de la presencia de Gardnerella vaginalis.
3.2. Procedimiento:
3.2.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin el Gram del frotis directo de exudado vaginal.

La infeccin causada por Gardnerella vaginalis se caracteriza por la presencia de clulas pista las cuales
son clulas epiteliales de la vagina recubiertas con coco bacilos gramnegativos y o positivos.
3.4. Resultado:
Presencia de clulas epiteliales de la vagina recubiertas con coco bacilos gramnegativos y o
grampositivos.
3.5. Informe:
Positivo: Se observaron clulas pista
Negativo: No se observaron clulas pista

de Mobiluncus spp



V. ALCANCE:
identificacin.

Es un bacilo gramnegativo anaerobio estricto y de difcil crecimiento en medios de cultivo. El diagnstico
se realiza por medio del Gram. En el frotis se observan predominantemente bacilos grampositivos cortos
y curvos en la superficie de las clulas epiteliales o fuera de ellas. Es frecuente el pleomorfismo. El papel
de Mobiluncus en la vaginosis no es bien claro aunque se le puede identificar en asociacin con
Gardnerella y otros anaerobios. Su potencial papel patgeno se conoce porque ha sido aislado de
abscesos de senos, exudados umbilicales y del torrente sanguneo, as como de aspirados de mujeres con
infeccin plvica. No est indicado su cultivo de rutina, pues su identificacin es relativamente fcil, la
cual se realiza por medio del Gram.

VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.1. Microscopio


1.3.1. Gram
2. GRAM:
2.1. Fundamento:
El anlisis de la tincin de Gram consiste en observar la presencia o ausencia predominante de bacilos
grampositivs semicurvos y pleomrficos que sugieren la presencia de Mobiluncus.
2.2. Procedimiento:
Observar al microscopio con objetivo de inmersin el Gram del frotis directo de exudado vaginal o
vulvar.

La infeccin causada por Mobiluncus se caracteriza por la presencia de bacilos grampositivos
cortos y curvos en la superficie de las clulas epiteliales o fuera de estas.
2.4. Resultado:
Presencia de bacilos grampositivos cortos y curvos en la superficie de las clulas epiteliales o fuera de
stas.
Presencia de leucocitos polimorfonucleares abundantes por campo.
2.5. Informe:
Positivo: Bacilos grampositivos semicurvos abundantes. Leucocitos polimorfonucleares abundantes.
Sugiere Mobiluncus.
Negativo: No se observ Mobiluncus.

de Candida albicans



V. ALCANCE:
identificacin.

Es una levadura oval gemante que produce seudihifas en cultivo, tejidos y exudados. El gnero Candida
es miembro de la microbiota local de las mucosas del aparato respiratorio, digestivo y genital femenino
encontrndose en este ltimo caso en aproximadamente el 20% de las mujeres sanas. El 85-90% de
stas son Candida albicans, por lo tanto, lo que interesa demostrar es si es la causa de la infeccin.
Para ello es bsico conocer que el criterio de virulencia aceptado es la produccin de seudohifas.
En los frotis de exudados, Candida spp aparece como una levadura grampositiva, con gemaciones que
miden 2-3 x 5-6 m y en las cuales se observan prolongaciones ramificantes denominadas seudohifas.
Cuando stas ltimas se observan, es una evidencia particular de virulencia y de la presencia de Candida
albicans, por lo que no se requiere alguna prueba adicional para la caracterizacin de la especie.

VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.1. Microscopio


1.3.1. Gram
2. GRAM:
2.1. Fundamento:
El anlisis de la tincin de Gram consiste en observar la presencia o ausencia de levaduras y si stas
manifiestan la presencia de gemaciones y seudohifas. Tambin permite determinar la presencia de
leucocitos polimorfonucleares.
2.2. Procedimiento:
2.2.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersin (100X).

En casos de vaginitis, Candida albicans suele observarse con gran cantidad como levaduras gemantes
y varias de ellas con seudohifas. En casos de otras especies, lo comn es la abundante cantidad de
clulas gemantes sin seudohifas. Las seudohifas forman ramificaciones de diverso tamao.
2.4. Resultado:
Presencia de levaduras grampositivas con y sin seudohifas
2.5. Informe:
Positivo: Se observaron levaduras con y sin seudohifas.
Negativo: No se observaron levaduras.

de otras levaduras



V. ALCANCE:
identificacin.

Las especies no dimrficas (no producen seudohifas en los tejidos) eventualmente logran causar
enfermedad. Cuando en el Gram se observan abundantes levaduras sin seudohifas pueden deberse a
especies de Candida.
VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Agar Sabouraud.
1.2. CMA (Corn Meal Agar o Agar de Harina de Maz con Teewen 80).
2. PRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIN:

2.1. Gram.
2.2. Morfologa y agrupacin de las levaduras en CMA.

3. PRODUCCIN DE SEUDOHIFAS EN CMA:

3.1. Fundamento:
El agar de harina de maz facilita la formacin de seudohifas y blastoconidias en Candida albicans
o la formacin de tubos germinales y agrupacin de las levaduras en racimos caractersticos en otras
especies. El tipo de estructura morfolgica y su agrupacin se emplean para la determinacin de la
especie.
3.2. Procedimiento:
Cuando en las muestras teidas con Gram se observen abundantes levaduras sin seudohifas, se procede
de la siguiente manera:
3.2.1. Con un asa redonda sembrar en forma serpentiforme en el medio de Sabouraud e incubar de 24
a 48 horas a 35 oC.
3.2.2. Tomar una asada de la cepa sembrada en Sabouraud y realizar un Gram para verificar la
presencia de levaduras y pureza del cultivo. Si se confirman las dos variables anteriores, sem-
brar una asada en el centro de un plato de CMA, dispersndola en un rea aproximada de
2 cm por lado.
3.2.3. Con una pinza sin dientes, tomar un cubreobjetos y flamearlo en el mechero y luego dejarlo
enfriar.
3.2.4. Colocar el cubreobjeto sobre el estriado del centro del plato de CMA, de tal manera que los
lados del mismo coincidan con los del estriado.
3.2.5. Incubar el CMA durante 4 horas.
3.2.6. Terminado el perodo de incubacin, quite la tapa del plato de Petri y observe al microscopio
utilizando un objetivo de 40 X.
3.3. Resultados:
La identificacin de la especie de Candida se realiza comparando la morfologa de las sudohifas
y blastoconidias de la muestra con la morfologa de diferentes especies de Candida presentadas en
las fotos siguientes:

a: Candida kruzei b: Candida tropicalis

c: Candida guilliermondii d: Candida lusitaniae
e: Candida albicans f: Candida parapsilosis
Informe:
Reportar el gnero y la especie identificada. Si no es posible la identificacin de la levadura, reportar
Candida spp.

VIII. BIBLIOGRAFA:
1. Lpez SR. Reyes J. Normas Tcnicas para el Estudio de Exudado Vaginal en Normas Tcnicas de
Bacteriologa, 3 ed. 1996, Ministerio de Salud, Centro Nacional de Diagnstico y Referencia,
Managua, Nicaragua. Imprimatur.
2. Rodloff AC, Hillier SL and Moncla BJ. Peptostreptococcus, Propionibacterium, Lactobacillus,
Actinomyces, and Other Non-Spore-Forming Anaerobic Gram-Positive Bacteria in Manual of Clinical
Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 47, 7th edition, ASM, Washington, 1999.
3. Funke G, Bernard K. Coryneform Gram-Positive Rods in Manual of Clinical Microbiology, Patrick R.
Murray editor in chief. Chap 21, 7th edition, ASM, Washington 1999.
4. Warren NG, Hazen KC. Candida, Crytococcus, and Other Yeasts of Medical Importance in
Manual of Clinical Microbiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 95, 7th edition, ASM,
Washington, 1999.
5. Visvesvara GS. Pathogenic and Opportunistic Free-Living Amebae in Manual of Clinical Mi-
crobiology, Patrick R. Murray editor in chief. Chap 108, 7th edition, ASM, Washington, 1999.

CAPTULO 15.
de Neisseria gonorrhoeae
1. RECOMENDACIONES AL PACIENTE:
1.1. No debe haber recibido ningn tratamiento local o sistmico con antimicrobianos, tres das antes
de la toma de la muestra.
2. TIPO DE MUESTRA:
2.1. Exudado uretral en hombres:
2.1.1. Ponerse guantes descartables estriles.
2.1.2. Indicar al paciente que se retracte el prepucio y presione suavemente el canal uretral, de
atrs hacia delante, con el fin de extraer la muestra hacia el meato urinario.
2.1.3. Introducir con gentileza, en el orificio uretral, un tercio de la torunga de un hisopo estril.
2.1.4. Inocular en agar Thayer Martin.
2.1.5. Hacer un frotis en una lmina portaobjetos.
2.2. Exudado rectal:

2.2.1. Indicar al paciente de presentarse habiendo defecado previamente.
2.2.2. Introducir el hisopo estril 2.5 cm dentro del ano y grelo sobre s mismo tratando de tocar las
paredes. Si el hisopo contiene material fecal, repita el procedimiento las veces que sea nece-
sario utilizando en cada ocasin un hisopo diferente.
2.2.3. Despus de unos segundos, retirar el hisopo e inocular el agar Thayer Martin.
2.3. Exudado endocervical: ver captulo 14.

2.4. Exudado vulvar: ver captulo 14.
2.5. Exudado uretral en mujeres: ver captulo 14.

1. De no ser incubado inmediatamente en el laboratorio de la institucin, el Thayer Martin debe ser
transportado en atmsfera de CO 2 utilizando una jarra con vela de parafina blanca.
Captulo 15: Procedimientos para la identificacin de Neisseria gonorrhoeae 263


Estriar el inculo sembrado en Thayer Martin de manera convencional e incubarlo inmediatamente en
ambiente con CO2. Si no se tiene una incubadora con CO2 , se debe utilizar una jarra con una vela de
parafina blanca.

1. TOMA DE MUESTRA:
1.1. Equipos:
1.1.1. Camilla
1.1.2. Espculo estril
1.1.3. Lmpara cuello de ganso

1.2.1. Guantes
1.2.2. Hisopos de algodn estriles
1.2.3. Lminas portaobjeto
1.2.4. Lpiz graso o marcador
1.2.5. Solucin de cloro al 0.5% para descarte de material contaminado

1.3.1. Agar Thayer Martin
2.1. Materiales:
2.1.1. Jarra con vela de parafina blanca.
3. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:
3.1. Equipos:
3.2. Materiales:
3.2.1. Jarra con vela de parafina blanca (si no cuenta con incubadora de CO 2).
3.3. Reactivos: Ninguno
3.4. Medios de Cultivo: Ninguno.
264 Captulo 15: Procedimientos para la identificacin de Neisseria gonorrhoeae

V. ALCANCE:
Laboratorios de la Red: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a las pruebas de identificacin.
CNDR: Numerales del 1.4.1 al 1.4.5 con respecto a las pruebas de identificacin.

En el siglo II, Galeno denomin a esta enfermedad con las palabras griegas gonor semilla y
rhoia flujo, lo que sugiere que Galeno consideraba que estaba relacionada con el flujo de semen.
En el siglo XII la gonorrea fue reconocida como enfermedad de transmisin sexual. En el siglo XIX
la gonorrea fue diferenciada de la sfilis.
En 1879, Neisser observ por primera vez gonococos en exudados purulentos uretrales y conjun-
tivales y en 1885 Bumm la aisl, y luego la recuper despus de inocularla a voluntarios, probando
con ello la relacin causal entre el microorganismo y la enfermedad.
Los miembros del gnero Neisseria, son microorganismos gramnegativos cocoides, que suelen estar
agrupados predominantemente en pares, aunque pueden observarse cadenas cortas. Los diplococos
tienen sus caras adyacentes aplanadas, lo que le confiere el aspecto de granos de caf. Son inmviles,
no forman esporas y crecen en forma ptima entre 35 oC y 37 oC con atmsfera de CO 2 al 5%.
N. gonorrhoeae posee proyecciones de polmeros protenicos, llamados pili, que funcionan como
factor de adherencia a las mucosas. Los pili tambin pueden interferir en la ingestin y destruccin
del gonococo por parte de los neutrfilos.
Tambin se ha demostrado que el gonococo produce una proteasa contra la inmunoglobulina A se-
cretora (IgA1) que degrada y consecuentemente neutraliza.
En relacin al cultivo, el frotis de exudado uretral de hombres tiene una sensibilidad de 90% y
una especificidad de 99%. En contraste, en mujeres los frotis de exudados endocervicales tiene una
sensibilidad cercana a 50% y una especificidad aproximada de 95%, siempre y cuando sean ana-
lizados por un microscopista experimentado.
En medios enriquecidos como el Thayer Martin, a las 24-48 horas de incubacin los gonococos forman
colonias mucoides, convexas, resplandecientes, elevadas, transparentes u opacas, no pigmentadas y
con un dimetro de 1 a 5 mm.
N. gonorrhoeae es oxidasa y catalasa positivas. Esta ltima caracterstica se utiliza como un mtodo
rpido y eficaz para la identificacin presuntiva.
Las especies del gnero Neisseria producen cidos por la oxidacin de algunos carbohidratos.
Neisseria gonorrhoeae produce cido a partir de glucosa, pero no de maltosa, sacarosa ni lactosa.
VII. IDENTIFICACIN:
1.1. Equipos:
1.1.2. Incubadora
1.1.3. Microscopio con objetivo de inmersin y ocular de 10X


1.2.1. Asas bacteriolgicas con punta recta y redonda
1.2.2. Gradilla
1.2.4. Laminas portaobjetos
1.2.8. Peroxido de hidrgeno al 3%
1.2.10. Base para los azcares: Cistena Triptona Agar (CTA).
1.2.11. Discos con glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.

1.3.1. Agar Chocolate.
1.4. Pruebas para identificacin:

1.4.1. Observacin macroscpica de la morfologa de las colonias.
1.4.2. Gram.
1.4.3. Oxidasa.
1.4.4. Catalasa.
1.4.5. Produccin de cidos a partir de glucosa, maltosa, sacarosa, lactosa.

1.5.1. Sensibilidad a los antimicrobianos
1.5.1.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923
1.5.1.3. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
1.5.1.4. Enterococcus faecalis ATCC 29212
1.5.1.5. Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
1.5.2. Antimicrobianos a utilizar por el mtodo de Kirby y Bauer: Ver captulo 16.
1.5.2.1. Pruebas especiales: Betalactamasa por el mtodo de nitrocefina.
2. CARACTERSTICAS DE LAS UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) EN

EL AGAR THAYER MARTIN:
Colonias mucoides, convexas, resplandecientes y elevadas, transparentes u opacas, no pigmentadas, con
un dimetro de 1 a 5 mm.

3. GRAM:
3.3. Fundamentos morfolgicos de la bacteria:
Neisseria gonorrhoeae se observa como un diplococo gramnegativo intra y extracelular. En los casos
de uretritis crnica es comn observar las formas extracelulares.
3.4. Resultado:
3.4.1. Frotis directo: Diplococos gramnegativos arrionados intra o extracelulares en polimorfonucleares.
3.4.2. Frotis del Agar Thayer Martin: Diplococos gramnegativos arrionados. Cocos sueltos y cadenas
cortas.
3.5. Control de calidad para la tincin de Gram:

Resultado: Bacilos gramnegativos: se observan de color rojo o rosado intenso.
Resultado: Cocos grampositivos: se observan de color azul a prpura.
4. OXIDASA:
N. gonorrhoeae posee la enzima citocromo oxidasa. Lo cual se manifiesta por el aparecimiento de un
color prpura en la tira reactiva.
4.4. Resultado:
Oxidasa positiva: Hay viraje de color al prpura en el inculo puesto en la tira reactiva. El viraje
aparece en los primeros 30 segundos.
4.5. Control de calidad para la prueba de oxidasa:

Resultado: Oxidasa positiva. Se observa un viraje de color al prpura intenso en el inculo puesto en
la tira reactiva.
Resultado: Oxidasa negativa. No hay viraje de color. Se observa un color amarillo plido en el inculo
puesto en la tira reactiva.

5. CATALASA:
5.3. Fundamentos de la bacteria:
Neisseria gonorrhoeae posee la enzima catalasa, por lo tanto descompone el perxido de hidr-
geno (H2O2) en oxgeno y agua. La liberacin del oxgeno se puede observar a simple vista por la
formacin rpida e intensa de burbujas.
5.4. Resultado:
Catalasa positiva: produccin vigorosa e inmediata de burbujas.

Resultado: Presencia de la enzima catalasa. Produccin inmediata e intensa de burbujas.
Resultado: Ausencia de la enzima catalasa. No hay produccin de burbujas.
6. PRODUCCIN DE CIDOS A PARTIR DE GLUCOSA, MALTOSA, SACAROSA Y

LACTOSA:
6.1. Fundamentos de las pruebas:

Tradicionalmente la produccin de cido de carbohidratos ha sido determinada usando la base de
Cistina Tripticasa Agar (CTA) con los carbohidratos en una proporcin al 1%. Esta base sirve ms para
detectar cambios de acidez producida por microorganismos fermentativos y es relativamente insensible
para detectar cidos producidos por las especies oxidativas de Neisseria.
El azcar por esta va es convertido en productos intermedios como el cido pirvico. Al carecer de las
enzimas deshidrogenasas, las bacterias oxidativas transfieren iones de hidrgenos disponibles del cido
pirvico al ciclo de Krebs, los que se unen con el oxgeno para formar agua. El cido pirvico es
transformado en cido lctico y otros cidos mixtos. Estos cidos que se producen en esta va son
extremadamente dbiles, por lo que la visualizacin de la conversin del pH en el medio es igualmente
dbil.
Con la base CTA se requiere un fuerte inculo y un tiempo de incubacin de 48 horas para observar
los cambios oxidativos de los carbohidratos.
6.2. Procedimiento:
6.2.1. Marce 4 tubos de CTA con las iniciales G (glucosa), M (maltosa), S (sacarosa) y L (lactosa).
6.2.2. De un cultivo de 24 horas y empleando un asa redonda, tome varias UFC, de tal manera que
quede bien cargada.

6.2.3. Introduzca varias veces el asa en el tubo de CTA, de tal manera que el inculo quede esparcido
ampliamente.
6.2.4. Repita el procedimiento anterior en los restantes 3 tubos de CTA.
6.2.5. Introduzca un disco de glucosa en el primer tubo y repita el procedimiento en los restantes 3 tubos
con discos de maltosa, sacarosa y lactosa.
6.2.6. Cierre hermticamente con tapones de rosca e incube entre 35 o - 37oC en aerobiosis durante
18-24 horas.

Las pruebas de oxidacin de azcares son pruebas confirmativas y son necesarias para distinguir entre
varias especies del gnero Neisseria. Las especies de Neisseria se pueden diferenciar entre si por los
patrones de acidificacin de 4 azcares: Glucosa, maltosa, lactosa, sacarosa.
Neisseria gonorrhoeae oxida la glucosa pero no la maltosa, lactosa ni sacarosa. La oxidacin se detecta
en el tubo de CTA por un viraje de color del rosado al amarillo, visible en la parte ms superficial del
tubo.
6.4. Resultados:
Oxidacin de la glucosa positiva: Viraje de color del rosado al amarillo en el sitio de insercin del
disco.
Oxidacin de la maltosa, sacarosa y lactosa negativa: No hay viraje de color en los tubos
conteniendo los discos de esos azcares. El medio queda de color rosado plido.

6.2.1. Neisseria gonorrhoeae ATCC 49226
Resultado: Oxidacin de la glucosa positiva. Viraje de color del rosado al amarillo en el tubo que
contiene el disco de glucosa. No hay viraje de color en los tubos conteniendo los discos de maltosa,
sacarosa y lactosa.

ESQUEMA DE IDENTIFICACIN
MUESTRA
FROTIS CULTIVO
GRAM GRAM
DIPLOCOCOS
DIPLOCOCOS
GRAMNEGATIVOS REAISLAMIENTO EN OXIDASA
GRAMNEGATIVOS
ARRIONADOS INTRA O AGAR CHOCOLATE POSITIVA
ARRIONADOS
EXTRACELULARES
OXIDACIN DE ANTIBIOGRAMA
BETALACTAMASA
AZUCARES EN CTA
GLUCOSA MALTOSA SACAROSA LACTOSA
AMARILLO ROSADO ROSADO ROSADO

INTENSO INTENSO INTENSO
Neisseria gonorrhoeae
VII. INFORME DE RESULTADOS:
1. Frotis directo:
Positivo: Se observaron diplococos gramnegativos extra celulares.
Se observaron diplococos gramnegativos intra y extra celulares.
Negativo: No se observan diplococos gramnegativos.
2. Cultivo:
Positivo: Se aisl Neisseria gonorrhoeae
Negativo: No se aisl Neisseria gonorrhoeae.
3. Sensibilidad:
Reportar la interpretacin de los halos de inhibicin con sus dimetros en milmetros.
4. Betalactamasa:
Betalactamasa positiva.
Betalactamasa negativa.

VIII. BIBLIOGRAFIA:
1. Especies de Neisseria y Moraxella catarrhalis en Diagnstico microbiolgico. Elmer W. Koneman,
editor, captulo 10, 5 edicin 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
2. Lpez SR, Reyes CJ, Gonzlez MA, Centeno R: Normas Tcnicas para el Neisseria gonorrhoeae
en Normas Tcnicas de Bacteriologa, captulo VII, 3 ed. 1996, DANIDA/MINSA, Editorial Im-
primatur, Managua, Nicaragua.
3. Neisserias en Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. Geo F. Brooks, editor, cap-
tulo 21, 16 edicin (de la 21 a edicin en ingls) 1998, Editorial El Manual Moderno S.A. de
C.V. Mxico D.F.

CAPTULO 16.
Susceptibilidad antimicrobiana:
Procedimientos para la sensibilidad por el
mtodo de difusin en Agar
I. ALCANCE:
Todos los laboratorios de la Red.

Hacia 1950, se empleaba una amplia variedad de mtodos que diferan de laboratorio a laboratorio,
ya que no exista un procedimiento estndar aceptable. Por tal razn, la OMS form un comit
para investigar el problema, el cual proporcion las bases que condujeron al desarrollo de m-
todos estandarizados. En los Estados Unidos el mtodo estndar usado se basa en los estudios de
Kirby y Bauer, mtodo que despus sera el ms usado en el mundo por ser barato, fcil de realizar y
dar la posibilidad de evaluar varios antimicrobianos al mismo tiempo.
La prueba de sensibilidad por difusin con discos o mtodo de Kirby-Bauer consiste en colocar
discos de papel impregnados de antibiticos en la superficie de un agar previamente inoculado con
una suspensin bacteriana de concentracin conocida.
La concentracin del antibitico disminuye a medida que se incrementa la distancia desde el disco.
Se produce simultneamente la difusin de antibitico y el crecimiento bacteriano en la superficie
del agar. Cuando se alcanza la masa celular crtica de bacterias, despus de 4 10 horas, aparece
el crecimiento bacteriano. En el rea donde la concentracin de antibitico es suficiente para evitar
el crecimiento bacteriano se observa un halo de inhibicin con borde definido claramente y con el
disco ubicado en el centro del crculo. En el borde de este halo la concentracin del antibitico, conocida
tambin como concentracin crtica, se aproxima a la CIM (Concentracin Inhibitoria Mnima o MIC
por sus siglas en ingls) obtenida en las pruebas de dilucin.
1. INDICACIONES:
1.1. Bacterias no fastidiosas de rpido desarrollo de 16-18 horas de incubacin.
1.2. Bacterias no fastidiosas si:
1.2.1. Se usa el medio de cultivo adecuado y adems se suplementa segn las exigencias del
microorganismo.
1.2.2. Se modifican los tiempos y la atmsfera de incubacin segn las exigencias del microorganismo.
1.2.3. Se cuenta con los medios de interpretacin adecuados.
Captulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana 273

2. LIMITACIONES DE LA PRUEBA:
2.1. La prueba slo deber aplicarse a especies bacterianas cuidadosamente evaluadas.
2.2. No realizar la prueba a aquellas bacterias que crecen con lentitud.
2.3. No realizar la prueba a aquellas bacterias que necesitan condiciones anaerobias para su
desarrollo.
La lista de bacterias a las cuales se les puede realizar la sensibilidad por difusin en agar, segn NCCLS
2004 son:
2.3.1. Todos los gneros y especies de las enterobacterias.
2.3.2. Bacilos gramnegativos no fermentadores: Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter spp,
Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia cepacia.
2.3.3. Haemophilus spp
2.3.4. Streptococcus pneumoniae (excepto penicilina)
2.3.5. Staphylococcus spp
2.3.6. Streptococcus spp
2.3.7. Enterococcus spp
2.3.8. Neisseria gonorrhoeae
2.3.9. Vibrio cholerae
La sensibilidad antimicrobiana de cualquier otra bacteria aerobia o anaerobia facultativa que no sea de
la lista anterior debe realizarse por CIM o Epsilon Test (E Test).
Para la realizacin de esta prueba se deben tomar en cuenta algunas caractersticas del medio de cultivo
que pueden alterar la susceptibilidad, como el grosor de la placa de agar, el pH, la concentracin de
cationes bivalentes (Ca y Mg ) y las concentraciones de Timina y Timidina.
Existen otros factores a tomar en cuenta como la temperatura, tiempo de incubacin, la atmsfera y la
adicin al agar de nutrientes especiales, sin embargo, estos factores dependen del microorganismo a
evaluar.
III. EQUIPOS, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
1. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO:
1.1. Equipos:
1.1.1. Espectrofotmetro.
1.1.2. Incubadora calibrada a 35oC.

1.2.1. Tubos de ensayo del mismo dimetro que el que contiene el estndar de McFarland.
1.2.2. Estndar 0.5 de McFarland.
1.2.3. Asas bacteriolgicas con punta recta.
1.2.4. Mechero tipo Bunsen.
274 Captulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

1.2.5. Gradilla
1.2.6. Hisopos
1.2.7. Pinza recta sin dientes
1.2.8. Solucin salina al 0.85% estril.
1.2.9. Aislamiento bacteriano en fase logartmica (crecimiento de 24 horas).
1.2.10. Discos de antimicrobianos.
1.2.11. Alcohol de 70 o para esterilizacin de pinzas.
1.2.12. Cepas de referencia para control de calidad
1.2.13. Regla milimetrada o calper-vernier para la medicin de los dimetros de los halos de inhibicin.
1.2.14. Normas NCCLS actualizadas* para interpretacin de resultados.
*Solicitar versin actualizada al Departamento de Bacteriologa del CNDR.

1.3.1. Agar Mueller Hinton: Enterobacterias, Staphylococcus spp , Bacilos no fermentadores, Vibrio
cholerae y Enterococcus spp.
1.3.2. Agar Mueller Hinton ms 5% de sangre de carnero: Streptococcus spp excepto Streptococcus
viridans.
1.3.3. Agar HTM (Haemophilus Test Medium): Haemophilus influenzae.
1.3.4. Agar Chocolate: Neisseria gonorrhoeae.

IV. FACTORES QUE AFECTAN EL DIMETRO DEL HALO DE INHIBICIN:
2. PROFUNDIDAD DEL AGAR:

2.1. Principios y fundamentos:
La medicin de la profundidad del agar debe realizarse con cada nueva preparacin de Mueller
Hinton y debe ser de 4mm. Este grosor se logra agregando 25 mL de agar por cada plato de
100mm de dimetro. Cuando se tengan lotes de platos de petri mayores de este dimetro se debe
agregar mayor cantidad de agar de tal manera que la profundidad del agar sea siempre de 4mm.
Para medir la profundidad del agar utilice un calper (pie de rey, denominacin con las que
se obtiene en las ferreteras de Nicaragua).
Otro factor que puede alterar la profundidad del agar es la superficie de la mesa de trabajo. Si sta
tiene alguna inclinacin, los platos con el agar tendrn profundidades distintas en el centro y en
los bordes. Para verificar esta variable utilice un nivel (de los utilizados en albailera). Por otro
lado, algunas marcas de platos petri de vidrio no tienen una base plana. Tenga el cuidado de no
utilizar este tipo de plato para el agar de Mueller Hinton, ya que usualmente la profundidad en el
centro es menor que en las orillas.

2.2. Procedimiento:
Hay varias formas de medir la profundidad del agar. La ms exacta y fcil es introducir la parte saliente
de un calper en el centro del plato:
2.2.1. Coloque el medidor de mm en la cuarta raya, la cual se corresponde con 4mm. En este momento,
en el extremo contrario sale una parte del medidor que se corresponde con un largo de 4mm.
2.2.2. Introduzca la parte saliente del medidor en el centro del plato con el agar.
2.2.3. Cuando la profundidad del agar es de 4mm, la base del calper toca paralelamente toda la
superficie. Si dicha base se hunde en el agar, significa que la profundidad es mayor de 4mm.
Por el contrario, si hay espacio entre la base del calper y la superficie del agar, indica que la
profundidad es menor de 4mm.
Cuando no se cuente con un calper puede medirse cortando en el centro un cuadro de agar de un
centmetro por lado aproximadamente. Luego se extrae dicha parte y se mide el grosor con una regla
milimetrada. Otra opcin es introducir la punta de una pipeta de Pasteur en el centro del medio y luego
retirarla, procurando que en la punta de la pipeta se haya extrado una porcin del agar, luego, medir
el trozo de agar que ha quedado en el interior.
3. pH DEL AGAR:
El pH del medio de cultivo para realizar el antibiograma debe de estar entre 7.2 y 7.4. El dimetro de
los halos de inhibicin se ve afectado por el pH segn la naturaleza de los distintos antimicrobianos:
pH mayor de 7,4 (alcalino) suelen dar halos mayores (falsa sensibilidad) para: macrlidos (ERY),
aminoglucsidos (GEN, AMK) y quinolonas (CIP, OFX, NOR). Con pH cido: pasa lo contrario.
pH menor de 7, (cido) suelen dar halos mayores (falsa sensibilidad) para: tetraciclinas (TCY),
betalactmicos (AMP, AMX) y nitrofuranos (NIT). Con pH alcalino: pasa lo contrario.
3.2. Procedimiento:
3.2.1. Medir el pH del medio despus de haber sido esterilizado y antes de ser vaciado en los platos.
Ajustar la temperatura del medio, segn la que tenga el Bao de Mara donde previamente
mantuvo el medio. Para ajustar el pH del medio, usar NaOH al 0.1N y HCl al 0.1N.
3.2.2. Realice la medicin del pH del agar en cada nueva preparacin de Mueller Hinton.
4. CONCENTRACIN DE CATIONES BIVALENTES (Ca Y Mg ):

Las concentraciones de estos cationes en el agar Mueller Hinton deben ser: para Ca de 20 a 25 mg/
L y para Mg de 10 a 12.5 mg /L. Esta concentracin de cationes en el medio se evala utilizando la
cepa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

La concentracin de cationes es crucial para el tamao de los halos de inhibicin antimicrobiana.

Concentraciones mayores a las descritas de los cationes Ca y Mg suelen dar halos menores para
tetraciclinas y aminoglucsidos, por lo que los resultados pueden asociarse a falsa resistencia.
Concentraciones menores a las descritas, suelen dar halos mayores para tetraciclinas y aminoglucsidos,
por lo que los resultados pueden asociarse a falsa sensibilidad.
La determinacin de cationes se debe hacer nicamente al abrir un nuevo frasco de Mueller Hinton. Si
la prueba indica que los niveles de cationes son mayores o menores a lo esperado, el frasco debe
eliminarse y abrir otro. Cuando tenga duda de los resultados, solicite al CNDR que los confirme.
4.2. Procedimiento:
4.2.1. Utilice la cepa ATCC 27853. Prepare su siembra, incubacin y lectura segn se describe en el
apartado V (procedimiento).
4.2.2. Colocar en el centro del plato un disco de gentamicina de 10 g.
4.3. Interpretacin:
4.3.1. El halo de inhibicin debe medir entre 16 y 21 mm de dimetro.
5. CONCENTRACIN DE TIMINA Y TIMIDINA:

En algunos lotes de medio se encuentran grandes cantidades de estas sustancias y algunos
microorganismos pueden utilizarlas para evitar el mecanismo de accin del trimetoprim y desarrollarse,
aun cuando sean intrnsicamente sensibles. Este mecanismo afecta especialmente a los enterococos. Es
por eso que para evaluar la concentracin de timina y timidina en el Mueller Hinton se utiliza la cepa
de Enterococcus faecalis ATCC 29212. Las concentraciones de timina y timidina afectan
especficamente los halos de inhibicin del trimetoprim-sulfametoxazol, por lo que la prueba se limita a
la evaluacin de este antimicrobiano.
Los halos menores de 20 mm representan una alta concentracin de timina y timidina lo que implica
una falsa resistencia al SXT.
Realice la medicin de la concentracin de timina y timidina a cada lote nuevo de agar Mueller Hinton.
5.2. Procedimiento:
5.2.1. Utilice la cepa ATCC 29212. Prepare su siembra, incubacin y lectura segn se describe en el
apartado V (procedimiento).
5.2.2. Colocar en el centro del plato un disco de sulfametoxazol/trimetoprim de 23.75/1.25g
5.3. Interpretacin:
5.3.1. El halo de inhibicin debe medir ms de 20 mm de dimetro.

V. PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACIN DEL INCULO:
1.1. Con un asa recta tomar una UFC del TSA.
1.2. Hacer una suspensin homognea en un tubo de ensayo conteniendo 3 mL de solucin salina
estril al 0.85%. (Utilizar un agitador de tubos si lo considera necesario).
1.3. Ajustar la turbidez del inculo a la del estndar 0.5 de McFarland comparndolo visualmente.
Para ello, se debe colocar la cepa problema en una gradilla y a la par el estndar de McFarland.
Esta gradilla debe tener en la parte posterior una tira de papel blanco con una o dos lneas
negras de 0.5 a 1 cm de ancho, la cual acta como contraste para comparar la turbidez de los
tubos. Si la turbidez del inculo es menor, se agrega ms inculo. Si la turbidez es mayor, se debe
diluir con solucin salina.
Para el inculo tome en cuenta lo siguiente:

l Los tubos para preparar el inculo deben ser del mismo dimetro que el que contiene el patrn de
McFarland.
l El patrn de turbidez deber mantenerse sellado a temperatura ambiente y en la oscuridad.
2. INOCULACIN EN EL MUELLER HINTON Y COLOCACIN DE DISCOS DE

ANTIMICROBIANOS:
2.1. Introducir un hisopo estril en la suspensin, luego presionarlo contra las paredes del tubo, con
el fin de escurrir el exceso de inculo.
2.2. Estriar en tres direcciones, de tal manera que se cubra de manera uniforme toda la superficie del
medio.
2.3. Dejar secar la placa por un perodo de 3 a 5 minutos. Nunca dejar secar la placa por ms de
15 minutos antes de aplicar los discos de sensibilidad.
2.4. Colocar los discos utilizando una pinza sin dientes. Inmediatamente ejerza una ligera presin
sobre el centro del disco. Tambin se pueden utilizar aplicadores de multidiscos.
Para el medio de cultivo tome en cuenta lo siguiente:

l El medio de cultivo que emplear para realizar el antibiograma debe conservarse en refrigeracin
de 4-8oC. Para realizar el antibiograma debe emplearse a temperatura ambiente.
l A la hora de ser inoculada, la superficie del agar debe tener la humedad adecuada, sin gotas de
condensacin, ya que estas absorberan parte del antimicrobiano inmediatamente que los discos
sean colocados.
Para la colocacin de los discos tome en cuenta lo siguiente:

l El retardo en la colocacin de los discos (ms de 15 minutos) induce halos ms pequeos.
l No se deben mover los discos una vez que han hecho contacto con el agar. Los antimicrobianos se
difunden inmediatamente.

Para los discos de sensibilidad tome en cuenta lo siguiente:

l Los discos que contienen drogas de la familia de los betalactmicos deben mantenerse en freezer
a temperaturas menores a 20 oC.
l Los de uso diario deben mantenerse a temperaturas entre 4o - 8oC.
l Deben estar envueltos en paquetes hermticos, con desecante, para protegerlos de la humedad.
l Verificar la fecha de vencimiento antes de utilizarlos.
l Se deben sacar del refrigerador una 1 a 2 horas antes de su empleo, para que estn a temperatura
ambiente al momento de usarlos.
3. CONDICIONES DE INCUBACIN:
3.1. Incubar las placas en forma invertida dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicacin de los
discos.
3.2. Las condiciones y tiempos de incubacin estn en dependencia del microorganismo evaluado.
Para la incubacin tome en cuenta lo siguiente:

l Atender las temperaturas recomendadas en NCCLS. Menor temperatura: Pobre crecimiento de la
bacteria (halos ms grandes).
Mayor temperatura: dependiendo de sta podemos ocasionar la muerte de la bacteria o inhibir su
crecimiento (halos ms grandes). Tiempo de incubacin mayor o menor que el recomendado por
la tcnica. A menor tiempo de incubacin, menor desarrollo bacteriano (halos ms grandes). Mayores
tiempos de incubacin: halos ms pequeos.
Temperatura, tiempo de incubacin y atmsfera requerida para realizar la

sensibilidad por el mtodo de difusin en agar:
Microorganismo Temperatura de Tiempos de Atmsfera
incubacin incubacin
Enterobacterias 350C 16-18 horas Aire ambiental
Bacilos no fermentadores 350C 16-18 horas Aire ambiental
Streptococcus spp 350C 20-24 horas 5% CO2
Enterococcus spp 350C 16-18 horas Aire ambiental
(a)
Streptococcus pneumoniae 350C 20-24 horas 5% CO2
Staphylococcus spp 350C 16-18 horas Aire ambiental
(a)
Haemophilus influenzae 350C 16-18 horas 5% CO2
Neisseria gonorrhoeae 350C 20-24 horas 5% CO2
Vibrio cholerae 350C 16-18 horas Aire ambiental
Stenotrophomonas maltophilia 350C 20-24 horas Aire ambiental
Burdcolderia cepacia 350C 20-24 horas Aire ambiental

4. LECTURA DEL HALO DE INHIBICIN:

Previo a la medicin tome en cuenta que:
l Utilizar un fondo antirreflejo y oscuro
l La luz debe incidir de forma directa desde arriba
l Posicin del plato de Mueller Hinton: Invertido.
l Posicin del plato con suplemento con sangre: Sin la tapa, directamente de la superficie del agar.
Discriminar bien la zona de hemlisis.
Medicin:
l Medir con regla milimetrada o con un calper. Al medir el halo tome en cuenta que ya sea con regla
o con calper, el dimetro tomado debe pasar por el centro del disco.
l Puede haber superposicin de la zona de inhibicin (ZI) por halos grandes cuando se colocan ms
discos de los recomendados (5 a 7 discos por placas de 100 mm).
l En caso de bacterias fastidiosas es recomendable poner menos discos que en el antibiograma estndar.
l Con los discos de sulfametoxazol-trimetoprim (SXT) tome en cuenta que las bacterias sensibles
pueden crecer en la ZI. Debido a su accin bacteriosttica, el SXT requiere varias generaciones
para inhibir completamente a las bacterias. Accin: medir el halo ms evidente a simple vista.
l Staphylococcus y Enterococcus con oxacilina (OXA) y vancomicina (VAN):
l l No se deben de leer antes de 24 horas.
l l Utilice luz transmitida (luz lateral)
l l Cualquier UFC intra ZI indica resistencia!
l En caso de Proteus puede haber crecimiento de velo en la ZI. Accin: ignorar la invasin. Medir
el halo evidente a simple vista.
Cuando se logra ver ms de un halo, cul es el borde que se mide?:

l el punto final deber tener en cuenta el rea que no tiene desarrollo evidente (obvio) a simple vista.
l Los tamaos de las zonas de inhibicin sern interpretadas con las tablas de las normas NCCLS.
VI. INFORME:
Reportar los resultados utilizando el programa WHONET. El resultado debe contener:
1. Nombres y apellido del paciente.
2. Edad
3. Sexo
4. Sala del paciente o en su defecto la procedencia de la muestra (reportar si es un paciente
ambulatorio o hospitalizado).
5. Nmero de la muestra.

6. Fecha de recepcin de la muestra.

7. Tipo de muestra.
8. Gnero y especie de la bacteria aislada (Reportar solamente el gnero en caso de no tener
la posibilidad de identificar la especie).
9. Pruebas especiales de sensibilidad:
9.1. Betalactamasa para microorganismos fastidiosos.
9.2. CAT (Cloralfenicol Acetil Transferasa) para Haemophilus spp.
9.3. Betalactamasas de Espectro Extendido (BLEE): reportar BLEE si fue confirmada con
doble o triple disco (ver captulo de betalactamasas).
10. Resultados de la sensibilidad antimicrobiana (reportar la interpretacin de los resultados en Sen-
sible, Intermedio o Resistente de cada antimicrobiano y la medida en milmetros de los halos
de inhibicin).
11. Comentarios y datos adicionales.
11.1. Resultado de la tincin de Gram.
11.2. En caso de urocultivo reportar el recuento de colonias.
12. Cualquier otra variable que, en conjunto con el Comit de Infecciones Intrahospitalarias o el
epidemilogo del hospital se determine que es importante para la vigilancia.
13. Firma del tcnico que realiz el anlisis.
14. Sello de la institucin.
VII. CONTROL DE CALIDAD DE LA PRUEBA DE SENSIBILIDAD POR DIFUSIN

CON DISCOS O MTODO DE KIRBY-BAUER:
1. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS:
Para este propsito se deben utilizar las cepas de referencia: Escherichia coli ATCC 25922,
Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 y Staphylococcus aureus ATCC 25923.
Los objetivos de este control de calidad son, mantener la vigilancia de la precisin y exactitud de los
procedimientos para la evaluacin del antibiograma, controlar el comportamiento y la calidad de los
reactivos usados y evaluar el desempeo tcnico de quienes realizan las pruebas y leen los resultados.
El control de calidad con las cepas de referencia se debe realizar semanalmente en el CNDR y cada
dos semanas en los laboratorios de hospitales, laboratorios regionales, y cada vez que se vaya a
utilizar un lote nuevo de Mueller Hinton o de discos de sensibilidad.
2. PROCEDIMIENTO:
2.1. Al inicio de la semana, incluir las cepas ATCC como una muestra ms de la rutina. Utilizar
los medios de cultivo y bioqumica que se emplean para los aislamientos de rutina as como el
resto de pruebas diagnsticas.

2.2. Realice la prueba de sensibilidad por difusin con discos o mtodo de Kirby-Bauer a las
cepas ATCC utilizando los mismos discos de sensibilidad que se emplean en la rutina y que
hayan sido elegidos previamente segn las normas NCCLS.
2.2.1. Escherichia coli ATCC 25922: AMP, AMC, SXT, CHL, AMK, CEC, CRO, CTX, CIP, NIT.
2.2.2. Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853: GEN, CAZ, FEP, IPM, MEM, PIP, TZP.
2.2.3. Staphylococcus aureus ATCC 25923: PEN, OXA, VAN, ERY, CLI.
2.2.4 Escherichia coli ATCC 35218*: AMC, SAM, TZP.
* Para control de los inhibidores de betalactamasas.
2.3. Se espera que la medicin de los halos en mm para estas cepas, estn dentro de los puntos
de corte que se indican en las normas NCCLS.
2.4. Todos los laboratorios de la Red deben tener las tablas y grficos que se han elaborado para
anotar los resultados obtenidos de los controles. Los resultados que hay que anotar son los
resultados de la medicin de los halos de inhibicin para cada antimicrobiano y cada cepa
realizados quincenalmente, as como los datos colectados sobre las variables a controlar del
Mueller Hinton (si este fuera el medio a utilizar) y los discos de sensibilidad. Los datos anotados
con respecto a los halos de inhibicin generan automticamente las grficas que facilitan la
visin de los resultados obtenidos en el tiempo.
3. TOMAR MEDIDAS CORRECTIVAS EN LOS SIGUIENTES CASOS:

3.1. Cuando se detecten resultados fuera de rango causado por errores obvios como el uso de cepa
ATCC equivocada, contaminacin de la cepa o el medio, condiciones de incubacin incorrecta:
3.1.1. Documentar la razn y evaluar nuevamente la cepa el mismo da que se encontr el error.
3.2. Cuando se detecten resultados fuera de los rangos aceptables no causados por error obvio:
3.2.1. Repetir el procedimiento por cinco das consecutivos desde el da que se detecta el error.
3.2.2. Si las cinco medidas estn dentro de los rangos normales no se necesita ninguna accin
correctiva. Si alguna permanece fuera de rangos normales, se requiere una accin correctiva
adicional.
3.2.3. Revisar la fecha de caducidad y condiciones de almacenamiento de los medios de cultivo, discos
de sensibilidad y escala de McFarland utilizadas en la realizacin del antibiograma.
3.2.4. Evaluar si los pasos para la realizacin del antibiograma fueron correctamente realizados.
3.2.5. Revisar la calibracin de la temperatura y atmsfera de incubadoras utilizadas para incubar los
antibiogramas.
3.2.6. Revisar la calibracin de refrigeradoras utilizadas para el almacenamiento de los discos.
3.2.7. Realizar control a la cepa de referencia para evaluar si est contaminada o ha cambiado.

16.1. Deteccin de betalactamasas en
Haemophilus influenzae, Neisseria
gonorrhoeae, Staphylococcus spp y
Enterococcus spp. Mtodo cromognico
I. ALCANCE:
Todos los Laboratorios de la Red y CNDR: aplican todos los incisos.
Los antibiticos betalactmicos actan sobre la pared celular bacteriana bloqueando su sntesis por lo
que se obtiene un efecto bacteriosttico y luego bactericida. Su excelente efecto antimicrobiano se ve
limitado por la existencia de betalactamasas producidas por una gran variedad de microorganismos.
Estas enzimas rompen eficientemente el anillo beta lactmico con la produccin de cido penicilinico.
La resistencia a los beta lactmicos puede estar codificada genticamente en el cromosoma bacteriano
o bien por plsmidos. En este caso, ocurre la transferencia de la resistencia entre bacterias de la misma
especie y an entre bacterias de diferentes gneros y especies.
Una determinacin positiva de betalactamasas predice:
a. Resistencia a penicilina; ampicilina y amoxicilina para Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, M.
catarrhalis.
b. Resistencia a penicilina, acilamino, carboxi y ureidopenicilinas para Staphylococcus spp. y Enterococcus
spp.
Hay varias pruebas para demostrar la produccin de betalactamasas, la mayora se basan en la

determinacin de la produccin de cido penicilinico:
a. Mtodo acidomtrico: denota un cambio de pH que se visualiza por un cambio de color del
indicador rojo de fenol.
b. Mtodo iodomtrico: se basa en que el cido penicilinico producido por la accin de la enzima
betalactamasa sobre el anillo beta lactmico de la penicilina reduce el yodo a yoduro, decolorando
la mezcla del almidn-yodo empleada para visualizar la reaccin.
c. Mtodo cromognico: se basa en el cambio de color amarillo a rosado de una cefalosporina
cromognica (nitrocefina), cuando la fraccin amida del compuesto unida al anillo betalactmico
es hidrolizada por la betalactamasa.
Una determinacin negativa de betalactamasas no descarta resistencia debido a que existen otros
mecanismos. No corresponde realizar la determinacin de betalactamasas en Enterobacteriaceae,

Pseudomonas spp. y otros bacilos gramnegativos aerbicos por los mtodos descritos anteriormente
debido a que estos resultados no pueden predecir la susceptibilidad a los diferentes betalactmicos.
1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
1.1. Equipos:

1.2.1. Contenedores con cloro al 0.5%.
1.2.2. Palillos de madera estriles.
1.2.3. Slide (portaobjetos desechable) comercial impregnado con nitrocefina.
1.2.4. Agua destilada.

2. PROCEDIMIENTO:
2.1. Abra la bolsa que contiene las lminas con nitrocefina, stas generalmente estn compuestas de
cuatro cuadrantes.
2.2. Rotule 3 de los cuadrantes de la siguiente manera: P (paciente), C+ (control positivo), C - (control
negativo).
2.3. Humedezca uno de los cuadrantes con una gota de agua destilada. Utilice los otros cuadrantes
para los controles positivo y negativo.
2.4. Con un palillo de madera estril seleccione varias UFCs aisladas o una banda de crecimiento
confluente del cultivo puro de la cepa en estudio.
2.5. Extienda la muestra sobre la zona de reaccin humedecida de la lmina. Deseche el palillo de
madera en el contenedor con cloro al 5%.
2.6. Proceda de igual manera con las cepas control en los otros cuadrantes.
2.7. Examine la zona de reaccin para detectar un cambio de color.
3. RESULTADOS:
3.1. Betalactamasa positiva: En 5 a 60 segundos, el inculo de la cepa en estudio vira al color
rosado.
3.2. Betalactamasa negativa: No se observa cambio de color en la zona del inculo de la cepa en
estudio.

4.1. Klebsiella pneumoniae ATCC 700603
Resultado: Betalactamasa positiva. Se observa viraje a color rosado en los primeros 60 segundos.
4.2. Staphylococcus aureus ATCC 25923
Resultado: Betalactamasa negativa. No hay viraje de color en los primeros 60 segundos.
5. INFORME:
El programa WHONET incluye la posibilidad de informar la presencia de betalactamasas.
5.1. Beta lactamasa positiva
5.2. Beta lactamasa negativa

16.2. Mtodos para la deteccin de
betalactamasas de espectro extendido
(BLEE) en bacilos gramnegativos
I. ALCANCE:
Todos los Laboratorios de la Red y CNDR: aplican todos los incisos.
Las infecciones intrahospitalarias asociadas a bacilos gramnegativos productores de lactamasas de
Espectro Extendido (BLEE) constituyen un serio problema en el manejo teraputico de los afectados por
su elevada mortalidad y altos costos. La deteccin de brotes asociados a bacilos gramnegativos
productores de BLEE se reportan cada vez con mayor frecuencia, variando entre pases o reas
geogrficas el tipo de enzimas segn el gnero y especie de microorganismos causales. El problema es
mayor debido a que los megaplsmidos que contienen los genes que codifican estas enzimas suelen
acompaarse de otros que codifican resistencia a otros antimicrobianos no -lactmicos como
aminoglucsidos y quinolonas. Hasta hace poco, los -lactmicos resistentes a la hidrlisis de BLEE tales
como los carbapenems eran una alternativa para el tratamiento, sin embargo, el aparecimiento de
enzimas que los hidrolizan dejan muy pocas alternativas para el tratamiento de los afectados. Por esta
razn su deteccin en el laboratorio de bacteriologa debe ser un procedimiento de rutina, sobre todo
en aquellos gneros bacterianos que son causa frecuente de infecciones nosocomiales.
1. FUNDAMENTOS FISIOLGICOS DE LAS BACTERIAS:

Las BLEE son enzimas que son sintetizadas por los bacilos gramnegativos (enterobacterias y no fer-
mentadores) e hidrolizan los antimicrobianos betalactmicos y por lo tanto, confieren resistencia a
penicilinas, cefalosporinas (de primera, segunda, tercera y cuarta generacin) y monobactames. Dada su
particular estructura qumica, algunos de estos betalactmicos son resistentes a la hidrlisis: cefamicinas
(cefoxitina, cefotetan y otros) y carbapenems (imipenem, meropenem y otros).
Las BLEE se han derivado de las Betalactamasas de Expectro Ampliado (BLEA). Unas pocas mutaciones
en el gen que codifica a una de estas enzimas convierten una BLEA en BLEE con lo cual amplan su
expectro hidroltico a cefalosporinas y monobactames que las BLEA no poseen. Sin embargo, esta
caracterstica suele acompaarse de una prdida de la eficiencia hidroltica y como resultado, en la
mayora de los casos, los niveles de resistencia son muy bajos, lo que complica su deteccin. El
significado clnico de esto es que las cepas que se informan sensibles con el mtodo de difusin en agar

(Kirby y Bauer) pueden ser portadoras de una BLEE y por lo tanto, ser resistentes a varios antimicrobianos
betalactmicos lo que si no se toma en cuenta, implica fallas en el tratamiento con antimicrobianos
betalactmicos. Por esta razn, hoy se acepta que la presencia de una BLEE en cualquier microorganismo
debe informarse como resistente a penicilinas, monobactames y todas las cefalosporinas de tercera y
cuarta generacin independientemente de su sensibilidad in vitro. Para mejorar la deteccin de BLEE las
normas NCCLS han modificado los puntos de corte de algunas cefalosporinas de tercera generacin en
el caso de Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca y Escherichia coli, cuando el mtodo empleado es
el de difusin en agar. Sin embargo, estos puntos de corte no incluyen a otras enterobacterias ni bacilos
no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter spp que tambin pueden elaborar
BLEE, lo que los convierte en un serio problema en los casos de infeccin nosocomial.
Las BLEE son codificadas en genes presentes en megaplsmidos transferibles entre bacilos gramnegativos
por el mecanismo de conjugacin. Estas enzimas reciben distintos nombres. En EEUU y Europa
predominan las BLEE derivadas de las BLEA TEM-1, TEM-2 y SHV-1. En Argentina y pases del cono sur
de suramrica se ha detectado CTX-M-2 (grupo 2be de la clasificacin de Karen Bush) con muy poca
actividad hidroltica sobre ceftacidima (CAZ) y aztreonam (AZT) y adems, inhibida por cido
clavulnico, sulbactam y tazobactam. Igualmente se ha detectado PER-2 que se diferencia de la anterior
en que tiene una fuerte actividad ceftacidimasa, SHV-2 y SHV-5. PER-1 se ha descrito en Turqua.
En un pas determinado pueden estar circulando diferentes tipos de enzimas BLEE y por lo tanto, el efecto
hidroltico en las cefalosporinas de tercera generacin es tan variado como el tipo de enzima se detecte
en cada caso particular. El nivel de dificultad para detectar este mecanismo de resistencia depende
especialmente del tipo de betalactamasa que se trate. La deteccin de las tipo TEM o SHV son
particularmente difciles debido a la baja actividad hidroltica sobre las cefalosporinas de tercera y cuarta
generacin.
Existen diferentes mtodos para detectar las BLEE. El mas sencillo es la resistencia obvia que se detecta
con los puntos de corte usuales segn las normas NCCLS. Pero esto no siempre es posible debido a la
existencia de BLEE con pobre actividad hidroltica y cuyos dimetros de inhibicin son grandes para una
o varias cefalosporinas de tercera generacin y monobactames con lo cual se interpretaran como
sensible si se utilizan los puntos de corte usuales de las normas NCCLS. De esta manera, en los casos
de Klebsiella spp y Escherichia coli estas normas recomiendan puntos de corte diferentes para ciertas
cefalosporinas de tercera generacin y monobactames. Utilizando estos puntos de corte, los mejores
discos para detectar BLEE en bacilos gramnegativos son ceftriaxona, cefotaxima, cefpodoxima,
cefatacidima y aztreonam.
2. DETECCIN DE CEPAS SOSPECHOSAS DE BLEE POR EL MTODO DE LOS PUNTOS

DE CORTE:
Segn estos puntos de corte, se debe sospechar e informar la presencia de BLEE en Klebsiella spp y
E. coli cuando los halos de inhibicin son los siguientes:

Tabla No. 1.
Puntos de corte para Klebsiella spp y Escherichia coli a partir de los cuales se
debe sospechar la presencia de BLEE.
Antibitico E. coli y Klebsiella spp Para confirmacin utilizar:

sospechosas de BLEE
Ceftacidima 22 mm Ceftacidima con
Ceftriaxona 25 mm ceftacidima/ cido clavulnico 30/10 g ma
Cefotaxima 27 mm mas
Cefpodoxima 17 mm Cefotaxima con cefotaxima/ cido clavulnico
Aztreonam 27 mm cido clavulnico 30/10 g
El mtodo anterior es presuntivo, por lo que inmediatamente hay que confirmarlo. Para ello se utilizan
varios mtodos. El siguiente es el recomendado por NCCLS:
2.1 CONFIRMACIN DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAO DE LOS

HALOS ENTRE DOS DISCOS:
Cuando la diferencia entre ceftacidima (o cefotaxima) y ceftacidima/cido clavulnico (o cefotaxima/
cido clavulnico) es >5mm se confirma la presencia de BLEE. Es necesario realizar las dos pruebas para
determinar si la las BLEE son ceftacidimazas, cefotaximasas o ambas.
2.2 MTODO DEL HUEVO (DEFORMACIN) CON TRIPLE DISCO:

2.2.1. Discos a utilizar:
2.2.1.1 Ceftacidima (CAZ) 30 g
2.2.1.2 Ceftriaxona (CRO)* 30 g o cefotaxima (CTX) 30 g
2.2.1.3. Amoxicilina con cido clavulnico (AMC) 20/10 g
2.2.2. Fundamentos fisiolgicos del mtodo:
Para realizar el antibiograma se colocan en fila los tres discos anteriores teniendo cuidado de colocar
el de amoxicilina/clavulnico en el centro de la fila. La distancia recomendada debe ser entre 2 a 3 cm
entre el centro de la cefalosporina y el centro del disco de AMC. Un dimetro menor de 2 cm mejora la
visualizacin del efecto huevo en cepas con dimetros de inhibicin muy pequeos (ver la tabla anterior)
pero en estos aislamientos no sera necesario detectar la BLEE porque las cepas ya son claramente
resistentes a las cefalosporinas de tercera generacin. Con distancias mayores de 3 cm puede no
producirse el efecto huevo debido a las bajas concentraciones del inhibidor (cido clavulnico).
Cuando las bacterias producen BLEE se observa una deformacin del halo producido por la cefalosporina
de tercera generacin (o una o ambas), fenmeno conocido como efecto huevo (ver figura 1). Este
* Cefepima (FEP) en caso de Pseudomonas aeruginosa.

fenmeno toma distintas formas dependiendo del dimetro de inhibicin de las cefalosporinas utilizadas,
la capacidad inhibitoria del inhibidor de las BLEE (en este caso el cido clavulnico) y de la distancia
a la que son colocados los discos.
El efecto huevo se debe a que el inhibidor se difunde radialmente con gradientes de concentracin
decrecientes alrededor del disco de AMC. Las bacterias que se encuentran en la zona alrededor de este
disco tendrn la BLEE inhibida hasta una distancia tal que el cido clavulnico haya disminuido lo
suficiente como para no seguir inhibiendo a la enzima. Es decir, a mayor distancia del disco de AMC,
menor concentracin de clavulnico, menor inhibicin de la BLEE. Por otro lado, el mismo fenmeno de
gradientes de concentracin ocurre en los discos de las cefalosporinas puestos a los lados del disco de
AMC: a mayor distancia del disco, menor concentracin de la cefalosporina de tercera generacin. La
interaccin de estos dos gradientes es la que determina la deformacin del halo de inhibicin (ver figura
1). Cualquier aislamiento que presente este efecto en el antibiograma debe ser considerado como una
prueba confirmativa de la produccin de BLEE y debe informarse resistente a todas las penicilinas,
cefalosporinas (excepto las de cuarta generacin como cefepime) y monobactames, independientemente
del halo de inhibicin, en caso que previamente se haya hecho un antibiograma de la forma usual.
En el caso de Enterobacter spp, Serratia spp, M. morganii y Providencia spp el mecanismo de resis-
tencia mas comn es la produccin de betalactamas cromosmica tipo AMP-C inducible por derrepresin
de la enzima que se produce de manera natural. Sin embargo, la presencia de BLEE plasmdicas en estos
dos gneros
bacterianos es cada vez mayor. La deteccin de BLEE en estos gneros tiene un impacto vital en los
pacientes ya que invalida la utilizacin de cefalosporinas de tercera y cuarta generacin. El mtodo para
detectar BLEE en ellos es similar a los descritos para Klebsiella spp y Escherichia coli, con la diferencia
que los puntos de corte para las cefalosporinas de tercera generacin son los recomendados para
enterobacterias por lo que no se deben aplicar los puntos de corte designados para la deteccin
sospechosa de BLEE en Klebsiella spp y Escherichia coli (ver tabla 2). Esto significa que para la deteccin
de BLEE en estos gneros slo pueden usarse mtodos confirmativos como el del doble o triple disco.
El cido clavulnico adems de inhibir la BLEE induce la produccin de la betalactamasa tipo AMP-C
y no posee accin inhibitoria sobre esta enzima. Esto significa que tiene efectos contrapuestos con
respecto a estos dos tipos de enzimas y por lo tanto, cuando se realiza la prueba del doble o triple disco,
estos efectos competirn: por un lado, inhibir la BLEE y se producir el efecto huevo, por otro lado
inducir la produccin de la enzima AMP-C propia de estos gneros, la cual hidroliza a las
cefalosporinas de tercera generacin, y se observar el achatamiento caracterstico. Sin embargo el
efecto que predomina, a pesar que son contrapuestos, es el efecto huevo sobre el achatamiento. El efecto
de achatamiento se puede observar colocando un disco de cefoxitina (FOX) frente a una cefalosporina
de tercera generacin (ver figura 2). En conclusin, el mtodo de doble o triple disco utilizando AMC
+ CRO o AMC + CRO + CAZ tiene buenas sensibilidad y especificidad para detectar BLEE en
enterobacterias que adems producen betalactamasas inducibles tipo AMP-C.

Tabla No.2
Puntos de corte para indicar sensibilidad a cefalosporinas en el caso de
enterobacterias productoras de betalactamasas AMP-C inducible.
Enterobacter spp, C. freundii, Serratia spp, M. morganii y

Antibitico Providencia spp
sensibles
Ceftacidima 18 mm
Ceftriaxona 21 mm
Cefotaxima 23 mm
Cefpodoxima 21 mm
Aztreonam 22 mm
3. CONTROL DE CALIDAD DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAO DE LOS

HALOS:
Escherichia coli ATCC 25922:
<2mm de incremento en la zona de inhibicin.
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:

>5mm de incremento en el halo entre ceftacidima y ceftacidima/cido clavulnico.
>3mm de incremento en el halo entre cefotaxima y cefotaxima/cido clavulnico.

Figura 1.
Deteccin de BLEE con el mtodo del doble o triple disco
Figura 2.
Imagen de achatamiento que se observa cuando la cefoxitina
induce la produccin de betalactamasa AMP-C frente a una cefalosporina
de tercera generacin

16.3 Determinacin de cloranfenicol
acetil transferasa (CAT)
I. ALCANCE:
Laboratorios de Bacteriologa hospitalarios, de SILAIS y laboratorios de Referencia (CNDR) aplican todos
los incisos.

El cloranfenicol es un agente bacteriosttico que inhibe la sntesis de protenas. Contiene en su estructura
qumica un anillo nitrobenceno.
La mayora de los aislamientos de H. influenzae resistentes al cloranfenicol producen la enzima
cloranfenicol acetil-transferasa (CAT) que tiene la capacidad de inactivar el cloranfenicol. Su sntesis est
mediada por plsmidos.
En casos excepcionales, los aislamientos de H. influenzae pueden adquirir la resistencia al cloranfenicol
a travs de mecanismos no enzimticos. Esta resistencia puede ser detectada por la prueba de difusin
de disco (Kirby - Bauer).
La tcnica para la deteccin de la enzima cloranfenicol acetiltrasferasa se basa en visualizar la inhibicin
del crecimiento de una cepa de Escherichia coli (Escherichia coli ATCC 25922), sensible al cloranfenicol.
1. EQUIPO, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:
1.1. Equipo:
1.1.1. Incubadora calibrada a 37oC.

1.2.2. Pinzas estriles para sensidiscos
1.2.3. Contenedor con cloro al 0.5% para descarte de materiales
1.2.4. Discos de papel de filtro de 8.5mm de dimetro estriles
1.2.5. Hisopo estril
1.2.6. Sensidiscos de Cloranfenicol con carga de 30g
1.2.7. Escala McFarland No. 3
1.2.8. Solucin Salina al 0.85%


1.3.1. Agar tripticasa soya

1.4.2. Haemophilus influenzae CNDR 24
2. PROCEDIMIENTO:
2.1. En 2mL de solucin salina al 0.85% prepare una suspensin de Escherichia coli ATCC 25922
con crecimiento de 18-24 horas, hasta lograr una turbidez igual al tubo de McFarland No. 3.
2.2. Introduzca un hisopo estril dentro de la suspensin. Elimine el exceso de inculo rotando el
hisopo en la pared del tubo. Luego inocule en la superficie de un plato de agar tripticasa soya.
Difunda en tres direcciones, horizontal, vertical y transversal.
2.3. Luego coloque 4 discos de papel filtro estril, separados aproximadamente 2 cm entre s y del
borde de la placa.
2.4. Rotule 3 de los discos de papel de filtro de la siguiente manera: P (paciente), C+ (control positivo),
C-(control negativo). El cuarto disco djelo sin rotular como control de esterilidad del papel filtro.
2.5. Sobre el disco de papel filtro rotulado como P (cepa proveniente del paciente), extienda con un
asa bacteriolgica un inculo suficiente de tal manera que cubra toda la superficie del disco.
2.6. Realice el mismo procedimiento con las cepas control en los otros dos discos de papel filtro.
2.7. Coloque sobre cada uno de los discos inoculados un disco de cloranfenicol de 30g.
2.8. Incube la placa a 37oC en atmsfera aerbica con la tapa de la placa hacia arriba y observe a
partir de las 16 horas de incubacin.
3. RESULTADOS:
3.1. CAT Positiva: No se observa inhibicin de crecimiento de E. coli. Esto significa que el
aislamiento en estudio produce la enzima cloranfenicol acetil- transferasa, es decir el cloranfenicol
fue inactivado por lo tanto no puede actuar sobre la E. coli.
3.2. CAT Negativa: Se observa un halo de inhibicin de crecimiento de E. coli. Esto significa que
la cepa en estudio no produce la enzima cloranfenicol acetil-transferasa, es decir, el cloranfenicol
no fue inactivado, por lo tanto actua sobre la E. coli.
4.1. Haemophilus influenzae CNDR-24
Resultado: CAT positivo. No hay inhibicin de Escherichia coli, la cual crece hasta los bordes del disco
de papel absorbente donde fue inoculada la cepa CNDR-.
4.2. Haemophilus influenzae ATCC 49247
Resultado: CAT negativo. Hay inhibicin del Escherichia coli. Se presenta un halo de inhibicin
alrededor del disco donde fue inoculada la cepa ATCC 49247.

5. INFORME:
5.1. Cloranfenicol Acetil- Transferasa positiva.
5.2. Cloranfenicol Acetil-Transferasa negativa.

16.4 Lista Oficial de discos de
susceptibilidad y tablas de discos con
antimicrobianos que deben emplearse
segn bacterias
I. AL CANCE: Todos los laboratorios de la Red.
II. PRINCIPIOS Y FUNDAMENTOS

1. La seleccin de los antibiticos se hace en base a:
1.1. Una lista bsica de antimicrobianos de uso clnico, a la cul se ajusta el laboratorio. Esta lista
la determina un Comit formado por personal mdico representante de la unidad de salud
respectiva.
1.2. Se toma en cuenta la prioridad del antimicrobiano de acuerdo al grupo al que pertenece
(ver tabla No. 1).
1.3. Se toma en cuenta el valor predictivo que tienen algunos antimicrobianos respecto a otros del
mismo grupo (ver tabla No. 1).
2. A continuacin se presenta el listado de los antimicrobianos a utilizar a partir del 2005 en los
laboratorios de la Red Nacional, para las pruebas de susceptibilidad.
2.1. 1. Penicilina (PEN) 2. Oxacilina (OXA) 3. Ampicilina (AMP) 4. Cefalotina (CEP) 5. Cefaclor
(CEC) 6. Ceftriaxona (CRO) 7. Ceftacidima (CAZ) 8. Cefotaxima (CTX) 9. Cefepima (FEP)
10. Cefoxitina (FOX) 11. Cefuroxima (CXM) 12. Piperacilina (PIP) 13. Imipenem (IPM)
14. Meropenem (MEM) 15. Aztreonam (ATM) 16. Amoxicilina/cido clavulnico + (AMC)
17. Ampicilina/Sulbactam (SAM) 18. Piperacilina/Tazobactam (TZP) 19. Eritromicina (ERY)
20. Azitromicina++ (AZM) 21. Amicacina ( AMK), 22. Gentamicina (GEN) 23. Gentamicina de
alta carga (GEH) 24. Estreptomicina de alta carga (STH) 25. Levofloxacina (LVX),
2 6 . Ciprofloxacina (CIP) 2 7 . cido nalidixico + + + (NAL) 2 8 . Vancomicina (VAN),
29. Nitrofurantona (NIT), 30. Cloranfenicol (CHL), 31. Tetraciclina (TCY) 32. Minociclina
(MNO) 33. Clindamicina (CLI) 34. Rifampicina (RIF) 35. Sulfametoxazol/Trimetoprim (SXT).
36. Colistin (COL).
+
Slo para la deteccin de BLEE.
++
Slo para el centro de referencia.
+++
Slo para detectar sensibilidad desminuida a quinolonas fluoradas en salmonellas extra intestinales
y otras enterobacterias.

III. DISCOS DE SENSIBILIDAD QUE SE DEBEN EMPLEAR SEGN LOS

DIFERENTES GRUPOS BACTERIANOS
1. CEPAS DE LA COMUNIDAD:
1.1. Salmonella spp: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CHL (30 g), NAL (30 g), CIP (5 g),
CRO (30 g)*, AMC (20/10 g)*, CAZ (30 g)* .
1.2. Shigella spp: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CTX (30 g), CHL (30 g), NAL (30 g),
CIP (5 g), NIT (300 g).
1.3. Escherichia coli **: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CIP (5 g), NIT (300 g), CEP
(30 g), SAM (10/10 g), GEN (10 g), CRO (30 g)*, AMC (20/10 g)*, CAZ (30 g,)*.
1.4. Haemophilus influenzae: AMP (10 g), SAM (10/10 g), CRO (30 g), CHL (30 g), CEC
(30 g), CXM (30 g), LVX (5 g), AZM (15 g), SXT (1.25/23.75 g).
1.5. Streptococcus pneumoniae: OXA (1 g), PEN***, CTX***, IPM***, CXM***, ERY (15 g),
SXT (1.25/23.75 g), CHL (30 g), VAN (30 g), TCY (30 g), LVX (5 g), RIF (5 g).
1.6. Neisseria meningitidis: PEN***, CTX***, CHL***, RIF***, CIP***, SXT***, TCY***.
1.7. Neisseria gonorrhoeae: PEN (10 g), CTX o CRO (30 g), TCY (30 g), CIP (5 g).
1.8. Vibrio cholerae: AMP (10 g), CHL (30 g), TCY (30 g), SXT (1.25/23.75 g).
2. CEPAS DE ORIGEN HOSPITALARIO

Escherichia coli : AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CIP (5 g), CEP (30 g), GEN (10 g),
AMK (30 g), IPM (10 g), CHL (30 g), CRO (30 g)*, AMC (20/10 g)*,
CAZ (30 g)*.
Klebsiella spp: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CIP (5 g), NIT (300 g)**, CEP (30 g),
SAM (10/10 g), GEN (10 g), AMK (30 g), TZP (100/10 g), IPM (10 g), MEM (10 g),
CHL (30 g), CRO (30 g)*, AMC (20/10 g)*, CAZ (30 g)*, COL (10 g)****, FOX (30 g)****.
Enterobacter spp: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CRO (30 g), CIP (5 g), GEN
(10 g), AMK (30 g), TZP (100/10 g), IPM (10 g), FEP (30 g), CRO (30 g)*, AMC
(20/10 g)*, CAZ (30 g)*, COL (10 g)****, FOX (30 g)****.
Otras enterobacterias: AMP (10 g), SXT (1.25/23.75 g), CIP (5 g), CEP (30 g), GEN
(10 g), AMK (30 g), TZP (100/10 g), IPM (10 g), CHL (30 g), MEM (10 g), NIT (300 g),
CRO (30 g)*, AMC (20/10 g)*, CAZ (30 g)*.
Pseudomonas aeruginosa: GEN (10 g), AMK (30 g), CIP (5 g), IPM (10 g),
PIP (100 g), MEM (10 g), TZP (100/10 g), FEP (30 g), ATM (30 g), CFP (30 g), FEP
(30 g)*, AMC (20/10 g)*, CAZ (30 g,)*.
Acinetobacter spp: GEN (10 g), AMK (30 g), CIP (5 g), IPM (10 g), PIP (100 g), MEM
(10 g), CHL (30 g), SAM (10/10 g), TZP (100/10 g), SXT (25 g), FEP (30 g)*, AMC (20/
10 g)*, CAZ (30 g)*.
Stenotrophomonas maltophilia: LVX (5 g), SXT (1.25/23.75), MNO (30 g).
Burkholderia cepacia: CAZ (30 g), MEM (10 g) MNO (30 g).

Staphylococcus aureus y Staphylococcus spp: PEN (10 UI), OXA (1 g), VAN (30 g),
FOX (30 g), ERY (15 g), CLI (2 g), GEN (10 g), RIF (5 g), SXT (1.25/23.75 g), CIP (5 g),
CHL (30 g), TCY (30 g), NIT (300 g)**.
Streptococcus spp beta hemolticos: PEN (10 UI), LVX (5 g), ERY (15 g), CHL (30 g),
AMP (10 g).
Streptococcus viridans: CRO (30 g), CHL (30 g), ERY 15 g), VAN (30 g), LVX (5 g).
Enterococcus spp: VAN (30 g), AMP (10 g) PEN (10 g), GEH (120 g), STH(300 g),
NIT (300 g)**.
* Para deteccin de BLEE por el mtodo del triple disco.

** Asociada a infecciones urinarias bajas no complicadas.
*** Las pruebas de sensibilidad se realizan por CIM.
**** Prueba para diferenciacin de gnero en el grupo KES ( Klebsiella, Enterobacter,
Serratia ).
Nota para Enterococcus spp: La prueba de sinergia entre betalactmicos (AMP, PEN) o glicopptidos (VAN) y
aminoglucsidos (GEH y STH) es fundamental en pacientes con enterococos aislados de sitios estriles, especialmente en
endocarditis bacteriana. Detecta bajos o altos niveles de resistencia a aminoglucsidos: halos 10mm en los discos de alta carga
indican sinergia, entre 7-9mm debe hacerse CIM y halos 6mm indican resistencia y por lo tanto falta de sinergia. La prueba
se realiza colocando un disco de AMP frente a GEH y STH. Si el enterococo es resistente a AMP (16mm), la prueba de sinergia
debe repetirse con VAN. Cuando es resistente a AMP y VAN (v.g. Enterococcus faecium), lo ms probable es que no haya sinergia.
En tal caso enviar la cepa al CNDR para probar la sensibilidad a linezolid y quinupristina-dalfopristina.
Los enterococos pueden tener resistencia de alto y bajo nivel a AMP. La resistencia de bajo nivel puede detectarse con la prueba
de sinergia, realizada con aminoglucsidos de alta carga tal y como se ha descrito en el prrafo anterior. De forma rutinaria
debe realizarse y reportarse la prueba de sinergia para los enterococos aislados de sitios estriles.
TABLA No. 1.
TABLA DE CLASIFICACION DE ANTIBITICOS Y SU VALOR PREDICTIVO
ANTIBIOTICO VALOR PREDICTIVO PARA
Ampicilina (AMP) Amoxicilina.

Amoxicilina/cido clavulnico, ampicilina/sulbactam, piperacilina y
piperacilina/tazobactam.
Cefalotina (CEP) Cefapirina, cefradina, cefalexina, cefaclor y cefadroxil.
Ceftriaxona (CRO) Cefotaxima.
Tetraciclina (TCY) Todas las tetraciclinas (doxiciclina y minociclina).
Eritromicina (ERY) Azitromicina, claritromicina y diritromicina.
Nitrofurantona (NIT) Furazolidona.
Oxacilina (OXA) Todos los betalactmicos, penicilinas betalactamasa lbiles (ampicilina,
amoxicilina, azlocilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y
ticarcilina), penicilinas betalactamasa estables (cloxa y dicloxacilina),
combinaciones de inhibidores betalctmicos (clavulanato y sulbactam),
cefems relevantes y carbapenems.
Penicilina (PEN) Betalactmicos y combinaciones de betalactmicos - inhibidores de
betalactamasas.

TABLA No 2. ANTIMICROBIANOS A USAR CON EL METODO DE KIRBY Y BAUER PARA
300
ENTEROBACTRIAS Y OTROS GRAMNEGATIVOS BASNDOSE EN LISTA BASICA y NCCLS
ESPECIE A A C C C C T G N P C S M I P T S N A C F A C A L C M C C F
M M E R A H C E I E I X E P I Z A A M T E T X Z V E N F O O
P K P OA ZA LB Y N TC N P T M M P P MD LE CA X P M M M X C O P L X
Enterobacterias S S S S S S N S S N S S SF S N SG S S S SH SI N N N N N N N SL SL
MANUAL
Psedomonas N S N S S N N S N N S N S S S S N N S N S S N N N N N S N N
DE
aeruginosa spp
Acinetobacter spp N S N S S S N S N N S S S S S S S N S N S N N N N N N N N N
Neisseria N N N SJ N N S N N S S N N N N N N N N Sj N N N N N N N N N N
gonorrhoeae
H a e m o p h i l u s spp K S N N S N S N N N N N S N N N N S N N N N N S S S S N N N N
Vibrio cholerae S N N N N S S N N N N S N N N N N N N N N N N N N N N N N N
PROCEDIMIENTOS
Captulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

Stenotrophomonas N N N N N N N N N N N S N N N N N N N N N N N N S N S N N N
DE
maltophilia
Burkholderia N N N N S N N N N N N N S N N N N N N N N N N N N N S N N N
cepacia
N: no
S: si
NOTAS:
A. Se utilizan para la deteccin de BLEE por el mtodo de triple disco.
B. No debe reportarse en urocultivos.
C . Se utiliza para bacterias aisladas de orina y determinar el valor predictivo de furazolidona en shigellas.
D . Se utiliza para la deteccin de BLEE y BLEA.
E. Se utiliza para detectar sensibilidad reducida a quinolonas fluoradas
F. Slo para Klebsiellas spp de origen hospitalario.
G. Para E. coli de origen hospitalario.
H . Slo para Shigella spp
I . Slo para Enterobacter spp, Klebsiella spp y E. coli.

J. Se puede usar indistintamente CRO o CTX.
K . Para aislamientos provenientes de LCR o SANGRE de pacientes en riesgo de muerte (meningitis, epiglotitis, bacteremia, celulitis facial) slo deber informarse
sensibilidad a ampicilina, una cefalosporina de tercera generacin y cloranfenicol. Los resultados obtenidos con agentes administrados por va oral slo
debern informarse en aquellos aislamientos provenientes de infecciones no complicadas (otitis media, sinusitis e infecciones broncopulmonares).
L . Para diferenciar grupo KES. Klebsiella spp: FOX: S, COL: S, Enterobacter spp: FOX: R, COL: S, Serratia spp: FOX: S o R, COL: R.
TABLA No 3. ANTIMICROBIANOS A USAR CON EL METODO DE KIRBY Y BAUER PARA
MICROORGANISMOS GRAMPOSITIVOS BASNDOSE EN LISTA BASICA y NCCLS
GNERO Y ESPECIE CHL A TCY ERYA GEN OXA PEN CIP SXT VAN LVX IPM FOX CLI RIF M N O STH AMP NIT GEH CRO
Streptococcus
viridans S N S N N NB N N S S N N N N N N N N N S
Streptococcus
pneumoniae S S S N SC N N SD SE S N N N S N N N N N N
Streptococcus spp
hemolticos S N S N N SF N N N S N N N N N N Sf N N N
MANUAL
Staphylococcus spp S N S S SG SG S S SH N N SI SJ S S N N S N N
DE
Enterococcus sppK N N N N N SL N N Sm N N N N N N Sn S S Sn N
N: no S: si
NOTAS:
A. No deben reportarse en urocultivos.
PROCEDIMIENTOS
B. No se hace la sensibilidad por difusin en agar con discos, se hace por CIM (concentracin inhibitoria mnima).
C . Se usa en lugar de penicilina por el mtodo de Kirby y Bauer. Si se obtienen valores de 19 mm debe realizarse CIM a penicilina, cefotaxima e imipenem
DE
y reportar segn el resultado obtenido.

D . Streptococcus pneumoniae aislados de vas respiratorias bajas.
E. Halos menores de 17 mm o crecimiento de colonias intrahalos, enviar la cepa al CNDR.
F. En primer instancia usar PEN, si no hay, usar AMP, si no hay, usar CTX. Halos menores de 24 mm, enviar la cepa al CNDR.
G. La actividad de los antibiticos betalactmicos para Staphylococcus puede deducirse con slo el uso de estos dos antibiticos.
Penicilina sensible: predice resultados de penicilinas y combinaciones con inhibidores betalactmicos, cefems y carbapenems. Penicilina resistente y
oxacilina sensible: predice resistencia a penicilinas betalactmicas lbiles a betalactamasas estafilocccicas (ampicilina, amoxicilina, carbenicilina,
mezlocilina, piperacilina y ticarcilina) pero predice sensibilidad a penicilinas betalactamasa estables (cloxacilina y dicloxacilina) y a combinaciones de
inhibidores betalactmicos (clavulanato y sulbactam), cefems relevantes y carbapenems.
H . Halos menores de 14mm o crecimiento de colonias intrahalos, enviar la cepa al CNDR.
I . La resistencia de Staphylococcus aureus mediada por el gen mecA puede ser detectada con cefoxitina (FOX). Cuando el dimetro del halo es 19mm debe
ser reportado como oxacilina resistente. Cuando el dimetro del halo es 20mm debe ser reportado como oxacilina sensible
J. La resistencia de Staphylococcus spp a macrlidos puede presentarse sola (por eflujo codificada por el gen msrA) y se observa en el antibiograma como
ERY (R) y CLI (S) sin atachamiento o presentarse con resistencia metilasa constitutiva ERY (R) y CLI (R), metilasa inducible ERY (R) y CLI (S) con
atachamiento. Esta ltima ocurre por metilacin del rRNA 23S codificada por el gen erm y se presenta como resistencia a macrlidos, clindamicina y
estreptograminas. Estos mecanismos pueden ser detectados poniendo un disco de clindamincina de 2 g a unos 15-26 mm de otro de eritromicina de
15 g como parte del antibiograma de rutina.
K . Hacer determinacin de betalactamasa con Nitrocefina.
L . En Enteococcus no productores de betalactamasa , la sensibilidad a penicilina predice la sensibilidad a AMP, SAM, AMC, PIP y TZP.
M. El crecimiento de cualquier UFC dentro del halo de inhibicin indica resistencia, no importa los mm de inhibicin que tenga el halo. En este caso, la cepa debe
ser referida al CNDR. En caso de observarse una zona de inhibicin entre 15 y 16 mm (intermedio) se debe confirmar el resultado por un mtodo de dilucin,
por lo que la cepa, tambin debe ser enviada al CNDR.
N. Ver nota de Enterococcus en pgina 299.
Captulo 16: Susceptibilidad antimicrobiana

301
1. Al realizar los antibiogramas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Klebsiella

oxytoca, Acinetobacter spp y Pseudomonas aeruginosa deben ponrsele de rutina los discos
de ceftriaxona (CRO) (cefepima, FEP, en el caso de Pseudomonas), amoxicilina/cido clavulnico
(AMC) y ceftacidima (CAZ) con el propsito de detectar BLEE (ver prueba de BLEE en captulo
16.2). Si la prueba detecta BLEE debe adjuntarse una nota advirtiendo que el microorganismo
aislado debe considerarse resistentes a todas las cefalosporinas de primera, segunda, tercera y
cuarta generacin, (excepto cefoxitina), aztreonam y cualquier penicilina excepto carbapenems
(impipenem, ertapenem, meropenem).
III. FUNDAMENTO DEL METODO PARA REALIZAR LA PRUEBA DE

SUSCEPTIBILIDAD
F undament os f isiolgicos: Ver captulo 16.1.
Control de calidad: Quincenalmente los laboratorios de la Red, deben realizar control de calidad
de los discos de sensibilidad utilizando las cepas de ATCC que se indican en el captulo 16.
Temperaturas y tiempos de incubacin: Ver captulo 16.1 de susceptibilidad por difusin
en agar (Kirby Bauer).
IV. BIBLIOGRAFA
1. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial Disks
Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. Disk diffusion. National Comittee for
Clinical Laboratory Standards, Volume 24 No.1, 2004. Pensylvania, USA.
2. Pruebas de Sensibilidad a Agentes Antimicrobianos en Diagnstico Microbiolgico. Elmer W.
Koneman, Stephen D. Allen, William M. Janda, Paul C. Schereckenberger y Washington C. Winn,
Captulo 15. 5a Edicin, 1996. Editorial Medica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
3. Galas M., Corso A. III Curso Latinoamericano de Actualizacin en Antimicrobianos. PAHO / OPS,
INEI, CNDR. Managua Nicaragua, 2000.
4. Manual de Haemophilus influenzae, Instituto Nacional de Salud (Colombia) / Organizacin
Panamericana de la Salud. Taller Sobre la Identificacin Bioqumica y Serolgica de Haemophilus
influenzae y Streptococcus pneumoniae. Managua, Nicaragua, 1998.

Bibliografa BLEE:
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6. Pagani L, Migliavacca R, Pallecchi L. Emerging Extended-Spectrum -Lactamases in Proteus
mirabilis . Journal of Clinical Microbiology, 2002;40(4):1549-1552.
7. Gruteke P, Wil Goessens W, van Gils J. Patterns of Resistance Associated with Integrons, the
Extended-Spectrum -Lactamase SHV-5 Gene, and a Multidrug Efflux Pump of Klebsiella
pneumoniae Causing a Nosocomial Outbreak. Journal of Clinical Microbiology, 2003; 41(3):
1161-1166.
8. M. Quinteros, M. Radice, N. Gardella Extended-Spectrum -Lactamases in Enterobacteriaceae in
Buenos Aires, Argentina, Public Hospitals. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2003;
47(9): 2864 - 2867.
9. Poirel L, Menuteau O, Agoli N et al. Outbreak of Extended-Spectrum -Lactamase VEB-1-Producing
Isolates of Acinetobacter baumannii in a French Hospital. Journal of Clinical Microbiology,
2003; 41(8): 3542-3547
10. Endimiani A, Luzzaro F, Perilli M et al Bacteremia Due to Klebsiella pneumoniae Isolates
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11. Paterson DL, Wen-Chien Ko, Von Gottberg A et al. Outcome of Cephalosporin Treatment for
Serious Infections Due to Apparaently Susceptible Organisms Producing Extended-
Spectrum b-Lactamases: Implications for the Clnical Microbiology Laboratory. Journal of
Clinical Microbiology, 2001;39(6):2206-2212.
12. Grupo KES. Programa Latinoamericano de Control de Calidad en Bacteriologa y Resistencia
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de Enfermedades Infecciosas INEI, Dr. Carlos G. Malbrn, Buenos Aires, Argentina, Boletn No.1,
2001.
13. Ferraro MJ, Wikler MA, Craig WA and others. Performance Standards for Antimicrobial
Disks Susceptibility Testing; Fourteenth Informational Supplement. Disk diffusion. National
Comittee for Clinical Laboratory Standards, Volume 24, No. 1, 2004. Pensylvania, USA.

CAPTULO 17.
Fundamentos fisiolgicos y
bioqumicos de las pruebas
I. INTRODUCCIN:
La utilizacin de los medios de cultivo se basa, en evidenciar la presencia o ausencia de diferentes
enzimas, que dirigen el metabolismo bacteriano a lo largo de diversas vas. Un conjunto determinado de
enzimas o su carencia discrimina gnero y especies bacterianas. La forma usual de detectar una enzima
se basa en el principio de que si est presente, utilizar un sustrato determinado que ha sido puesto
adrede en el medio de cultivo o en una prueba bioqumica determinada. Los productos terminales de la
accin enzimtica son detectados a travs de indicadores de pH o por el aparecimiento de pigmentos
que hacen virar el color del medio.
Algunos medios de cultivo iniciales contienen inhibidores cuyo propsito es el de favorecer el crecimiento
de unos pocos gneros bacterianos. Este principio se conoce como selectividad y es bastante frecuente
su empleo cuando las muestras tomadas provienen de partes del cuerpo donde el posible agente causal
se acompaa de una microbiota amplia y abundante.
1. FUNCIONES DE LOS COMPONENTES BSICOS DE LOS MEDIO DE CULTIVO:

1.1. Sustrato:
Reacciona con una enzima especfica y da origen a productos terminales que pueden ser cidos o
alcalinos.
1.2. Indicador de pH:

Detectan productos terminales de la utilizacin del sustrato. Son colorantes aadidos para indicar los
cambios que hay en el medio durante el crecimiento de los microorganismos. Estos indicadores son
sensibles a los cambios de pH, por lo tanto, los virajes de color de los mismos indican de manera indirecta
la presencia de productos terminales del empleo de sustratos. Los ms usados son: rojo fenol, rojo neutro,
prpura de bromocresol y azul de metileno.
1.3. Nutriente:
En la mayora de los casos, las bacterias no crecern slo con la presencia del sustrato bsico, por lo
que se requiere agregar diversos nutrientes que varan, dependiendo de los requerimientos de cada
bacteria.
1.4. Inhibidores:
Son utilizados ms en medios selectivos iniciales, pero hay que tener en cuenta que no todos los
microorganismos deseados sern inhibidos y no todos los deseados crecern. La selectividad de agentes
qumicos y colorantes es afectada por la cantidad y tipo de nutriente presente.
Captulo 17: Fundamentos fisiolgicos y bioqumicos de las pruebas 305

PRINCIPIO BSICO PARA LA DETECCIN DE UNA REACCIN BIOQUMICA
II. MEDIOS DE CULTIVO PARA ENTEROBACTERIAS Y V. cholerae

1. AGAR Mac CONKEY (MacC): MEDIO SELECTIVO
1.1. Fundamento:
Es un medio selectivo y diferencial que se emplea para discriminar las bacterias gramnegativas en
fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben a los
grampositivos.
1.2. Composicin:
1.2.1. Nutriente: Peptona
1.2.2. Sustrato: Lactosa
1.2.3. Inhibidores: Sales biliares y cristal violeta
1.2.5. Amortiguador: Cloruro de Na
1.2.6. Indicador de pH: Rojo neutro
1.2.7. Temperatura de incubacin: 35-37oC
1.2.8. Tiempo de incubacin: 18-24 horas
306 Captulo 17: Fundamentos fisiolgicos y bioqumicos de las pruebas

1.3. Tcnica de inoculacin:

1.3.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo.
1.3.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inculo de manera circular en un extremo del plato
(tomar de referencia el punto donde se escribi el nmero de la muestra) tal que abarque un rea
aproximada de 1 cm de dimetro. Hacer el inculo en forma circular de aproximadamente 10 mm
de dimetro con un asa redonda o hisopo.
1.3.3. Dejar secar el inculo hasta que desaparezca la humedad.
1.3.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato.
1.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio en la
forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminacin.
1.3.6. Incubar el plato en forma invertida.
1.3.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar.
Figura No. 1: Forma final de un plato estriado

con la tcnica convencional.

Resultado: UFCs no fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan incoloras o transparentes.
Resultado: UFCs fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan de color rosado.
2. CALDO SELENITO:
2.1. Fundamento:
El caldo Selenito sirve para el enriquecimiento de salmonellas y shigellas a partir de muestras como
heces y orina. Es inhibidor de otros coliformes que incluyen algunas de las especies de Shigella. Este

medio funciona mejor bajo una reducida tensin de oxgeno, y para que sea ms ptimo, se recomienda
distribuirlo en tubos que proporcionen por lo menos 5 cm de profundidad. El medio preparado es claro
y ligeramente amarillento. El sobrecalentamiento a la hora de la preparacin y el almacenamiento
prolongado pueden modificar el color a rojo ladrillo o rojizo, lo cual afecta la eficacia microbiolgica.
2.2. Composicin:
2.2.1. Nutriente: Peptona, lactosa
2.2.2. Inhibidor: Selenito
2.2.3. Amortiguador: Fosfato de sodio
2.2.4. Agua destilada
2.2.5. PH final 7.0 0.1

2.3.1. Si el material es slido se pone un inculo (por ejemplo, hisopo rectal) cargado directamente en
el caldo, si el material es lquido (heces diarricas), se ponen en una relacin 1:1 con el caldo.
2.3.2. Tiempo de incubacin: 8-12 hrs. En este perodo el caldo se vuelve turbio.
2.3.3. Temperatura de incubacin: de 35- 37oC.
2.3.4. Hacer un subcultivo de la superficie del caldo y sembrarlo en agar Salmonella Shigella. No agite
el tubo antes de tomar la muestra. Procedimiento: Ver el medio Agar Salmonella y Shigella (ASS)

Resultado: Se observa turbidez en el caldo por crecimiento adecuado.
Resultado: Hay poca turbidez o ausencia de la misma por falta de crecimiento adecuado.
3. AGAR SALMONELLA Y SHIGELLA (ASS). MEDIO SELECTIVO:
3.1. Fundamento:
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de algunos bacilos entricos, especialmente los que
pertenecen a los gneros Salmonella y Shigella.
3.2. Composicin:
3.2.1. Nutriente: Peptonas.
3.2.2. Sustratos: Lactosa, Tosulfato de Na, Citrato de Na, Citrato de NH4 y Hierro III.
3.2.3. Inhibidor: Verde brillante y bilis de buey
3.2.5. Indicador de pH: Rojo Neutro
3.2.6. Temperatura de incubacin : 35 - 37 oC
3.2.7. Tiempo de incubacin :18-24 horas


3.3.1. Inoculacin primaria.
3.3.1.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo.
3.3.1.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inculo de manera circular en un extremo del plato
(tomar de referencia el punto donde se escribi el nmero de la muestra) tal que abarque un
rea aproximada de 1 cm de dimetro.
3.3.1.3. Dejar secar el inculo hasta que desaparezca la humedad.
3.3.1.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato.
3.3.1.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio enla
3.3.1.6. Incubar el plato en forma invertida.
3.3.1.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar.
A partir del Caldo Selenito:

3.3.1.8. Con un asa redonda tomar un inculo de la superficie del Selenito y sembrarlo en el medio de
ASS como se indica en los numerales 3.3.1 al 3.3.7. No agite el tubo antes de tomar la
muestra.

Resultado: UFCs no fermentadoras de la lactosa: las colonias se observan incoloras o transparentes.
3.4.2. Esecherichia coli ATCC 25922
Resultado: UFCs fermentadoras de lactosa: las colonias se observan de color rosado plido.
4. AGUA PEPTONADA ALCALINA (APA):

4.1. Fundamento:
El enriquecimiento en este caldo favorece al aislamiento de Vibrio cholerae cuando hay pocos
microorganismos, como en muestras de personas convalecientes y de portadores asintomticos.
4.2. Composicin:
4.2.2. Inhibidor: Cloruro de Na
4.2.3. pH: 8.4 a 8.5
4.2.4. Temperatura de incubacin : 35 -37 oC
4.2.5. Tiempo de incubacin : de 6 a 8 horas
4.3. Tcnica de inoculacin de la muestra en el caldo de enriquecimiento APA:

4.3.1. Con una pinza previamente flameada, tomar el hisopo proveniente del medio de transporte
Cary Blair.

4.3.2. Introducir el hisopo en el caldo.

4.3.3. Incubar a una temperatura de 35 a 37 oC por un periodo de 6 a 8 horas.
4.3.4. Realizar un subcultivo en el medio de TCBS (ver Agar TCBS).

4.4.1. Vibrio cholerae CNDR AT-1
Resultado: Se observa turbidez en el caldo. Buen aislamiento en la resiembra en TCBS.
Resultado: Se observa poca o ninguna turbidez en el caldo. Ninguna UFC en la resiembra en TCBS.
5. AGAR TIOSULFATO CITRATO SALES BILIARES SACAROSA (TCBS):
5.1. Fundamento:
El medio es utilizado para el aislamiento y cultivos selectivos de V. cholerae y otros vibriones entero
patgenos (V. parahaemolyticus).
5.2. Composicin:
5.2.1. Nutriente: Peptonas
5.2.2. Sustrato: Sacarosa
5.2.3. Inhibidores: Bilis de buey
5.2.4. Indicador de pH: Azul de bromotimol y azul timol
5.2.5. Temperatura de incubacin : 35 -37 oC
5.2.6. Tiempo de incubacin : 18-24 horas
5.3. Tcnica de inoculacin del caldo de enriquecimiento APA al medio de Cultivo

TCBS:
5.3.2. Con un asa redonda tomar un inculo de la superficie del caldo APA y ponerlo de manera
en un extremo del plato (tomar de referencia el punto donde se escribi el nmero de la muestra)
tal que abarque un rea aproximada de 1 cm de dimetro. Hacer el inculo en forma circular con
un dimetro de aproximadamente 1cm.
5.3.3. Dejar secar el inculo hasta que desaparezca la humedad.
5.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrante restantes del medio en la
5.3.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonia (UFC) que va a trabajar.
NOTA: En un plato de TCBS puede trabajarse cmodamente 4 muestras por plato.


5.4.1. Vibrio cholerae CNDR AT-1
Resultado: UFCs de color amarillo, 2-4 mm, brillantes, planas o convexas, bordes bien definidos.
Resultado: No hay crecimiento.
6. AGAR SANGRE DE CARNERO (ASC):
6.1. Fundamento:
Este medio de cultivo es adecuado para el crecimiento de microorganismos exigentes, aerobios comunes
y bacterias facultativas. La presencia de sangre permite comprobar la presencia de algunas hemolisinas
y tipo de hemlisis.
6.1.1. Estreptolisina O (SLO):
Es lbil al oxgeno, antignica, inhibida por el colesterol y txica para una gran variedad de tipos
celulares. Debido a su labilidad frente al oxgeno, es la responsable fundamental de la beta hemlisis, que
se ve por debajo de la superficie del agar.
6.1.2. Estreptolisina S (SLS).
Es estable frente al oxgeno, no es antignica pero txica para una gran variedad de tipos celulares. Es
activa tanto en la hemlisis superficial como en la profundidad del agar.
6.2. Composicin:
Para su preparacin se pueden utilizar diferentes bases como: Tripticasa Soya Agar (TSA), Mueller
Hinton (MH), Casena con harina de Soya (Casoy) y otros.
La cantidad de sangre de carnero que se agrega, es de acuerdo al uso que se le pretende dar. De manera
general, como medio inicial se emplea un volumen tal que quede a una concentracin de 5%.

6.3.2. Con un asa redonda o un hisopo poner el inculo de manera circular en un extremo del plato
(tomar de referencia el punto donde se escribi el nmero de la muestra) tal que abarque un rea
aproximada de 1 cm de dimetro.
6.3.3. Dejar secar l inculo hasta que desaparezca la humedad.
Realizar dos o tres estras a profundidad.
6.3.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio en
la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminacin.
6.3.7. Seleccionar las colonias alfa o beta hemolticas.


Resultado: Lsis total de los eritrocitos, se observa un halo transparente alrededor de la colonia. La
hemlisis es mayor en las zonas de las estras profundas.
6.4.2. Steptococcus pneumoniae ATCC 49619
Resultado: Lsis parcial de los eritrocitos, se observa un halo verde alrededor de la colonia.
Resultado: No hay lsis de los eritrocitos, no hay halo alrededor de la colonia.
7. AGAR NUTRITIVO (AN). MEDIO DE ENRIQUECIMIENTO NO SELECTIVO:

7.1. Fundamento:
Es un medio para microorganismos poco exigentes. Es utilizado con el propsito de reproducir, mantener
o verificar la pureza de subcultivos antes de realizar pruebas bioqumicas y serolgicas. Tambin se
utiliza para obtener cultivo con crecimiento confluente (por ejemplo, serpentiforme) cuando se necesita
obtener suficiente inculo con el propsito de realizar simultneamente muchas pruebas.
7.2. Composicin:
7.2.1. Nutrientes: Peptona de carne y extracto de carne
7.2.2. Amortiguador: Cloruro de sodio
7.2.3. Agar
7.3. Tcnica de inoculacin de la muestra en el medio de Cultivo

7.3.1. Para observar la pureza del cultivo:
7.3.1.1. Rotular el plato que contiene el medio de cultivo.
7.3.1.2. Con un asa redonda y poner el inculo de manera circular en un extremo del plato (tomar
de referencia el punto donde se escribi el nmero de la muestra) tal que abarque un rea
aproximada de 1 cm de dimetro.
7.3.1.3. Dejar secar el inculo hasta que desaparezca la humedad.
7.3.1.4. Utilizar un asa redonda esterilizada para dispersar la muestra en el primer cuadrante del plato.
7.3.1.5. Esterilizar nuevamente el asa, dejarla enfriar y estriar los 3 cuadrantes restantes del medio
en la forma convencional, con el objetivo de tener colonias aisladas y evitar contaminacin.
7.3.1.6. Incubar el plato en forma invertida.
7.3.1.7. Seleccionar las Unidades Formadoras de Colonias (UFCs) que va a trabajar. Verificar si las
colonias que se van a trabajar estn puras y no contaminadas.
NOTA: A partir de la verificacin la cepa se puede guardar, trabajar la bioqumica, antibiograma y
serologa si es necesario.
7.3.2. Para obtener un crecimiento confluente:

7.3.2.1. Si se utiliza un medio en plato petri, dividir su parte posterior en 4 a 12 reas iguales, em-
pleando para ello un marcador indeleble.
7.3.2.2. Tome una UFC (cercirese que no arrastra otra UFC) y simbrela el rea elegida en forma
serpentiforme. Ver figura No. 2.
Figura No. 2: Plato dividido en 8 reas con estriado y

crecimiento en forma serpentiforme
7.3.2.1. Si se utiliza el medio en tubo de vidrio, estriar la superficie del agar con un movimiento en
forma de S a medida que se retira el asa del tubo.
7.3.2.2. Incubar el tubo.
7.3.2.3. Verificar si hay suficiente crecimiento para realizar todas las pruebas.
NOTA: No es conveniente guardarlas cepas a partir del crecimiento en tubo, ya que no hay suficiente
y no se observa bien la pureza del microorganismo.

Resultado: Se observa un crecimiento confluente.
8. AGAR MUELLER HINTON (AMH)
8.1. Fundamento:
Se usa principalmente para realizar pruebas de sensibilidad ante diferentes antimicrobianos. Es adems
una base apropiada para preparar Agar sangre de Carnero, obtenindose as un medio necesario para
el aislamiento primario de microorganismos de difcil crecimiento.
8.2. Composicin:
Nutrientes: Infusin de carne, hidrolizado de casena, almidn, Agar.


Ver captulo de susceptibilidad antimicrobiana.
8.4. Control de Calidad

Resultado: se observa un crecimiento confluente.
III. MEDIOS BIOQUIMICOS:
1. AGAR HIERRO TRES AZUCARES O TRIPLE AZCARES Y HIERRO (TSI):
1.1. Fundamento:
Este medio se utiliza para determinar la capacidad de los bacilos gramnegativos para fermentar lactosa,
sacarosa y glucosa, as como para determinar su capacidad de producir H2S (cido sulfhdrico).
1.1.1. Fermentacin de los Carbohidratos:
El medio contiene dos cmaras de reaccin, en la parte inclinada se fermenta la sacarosa y la lactosa
y en la parte profunda se fermenta la glucosa. Se puede fermentar los 3 carbohidratos o uno de ellos
depende de la bacteria que se estudie.
1.1.2. Produccin de Sulfuro de Hidrgeno:
Si la bacteria tiene la enzima tiosulfatasa, reacciona con el tiosulfato de Na como una fuente de azufre
para la produccin del sulfuro de hidrgeno, el cual es incoloro, pero al reaccionar con sales de hierro,
en este caso citrato frrico, se produce un precipitado de color negro. Para que esto ocurra debe haber
un pH cido, lo cual se consigue con la fermentacin de la glucosa.
1.1.3. Produccin de Gas:
El primer paso es la fermentacin de la glucosa, uno de cuyos productos terminales es el cido frmico.
Si la bacteria tiene la enzima deshidrogenasa frmica, el cido frmico es descompuesto en CO2 y H2.
1.2. Composicin del medio:

1.2.1. Nutrientes: Peptona
1.2.2. Sustratos: Glucosa, Lactosa, Sacarosa, Sulfato Ferroso, Tiosulfato de Sodio
1.2.3. Indicador de pH: Rojo fenol
1.2.4. Temperatura de Incubacin: 35-37oC
1.2.5. Tiempo de Incubacin: 18-24 horas
NOTA: En caso de sospechar de Salmonella Typhi hay que dejar incubar hasta 48 horas.

SUSTRATO ENZIMA PRODUCTO TERMINAL

Fermentacin de Carbohidratos:
Lactosa Galactsido permeasa Acido pirvico
(glucosa + Galactosidasa Acidos mixtos
galactosa)
Glucosa Glucosa Acido pirvico
6 fosfato deshidrogenasa Acidos mixtos
Sacarosa Invertasa Acido pirvico
Acidos Mixtos
Produccin de gas:
Ac. Frmico Deshidrogenasa frmica CO2 + H2
Produccin de H2S:
Tiosulfato Tiosulfatasa H2S
de sodio (incoloro)
Precipitado de color negro Sales de hierro

Citrato de Na

1.3.1. Rotular el tubo que contiene el medio de cultivo.
1.3.2. Seleccionar una UFC y tomar un inculo con un asa recta. El inculo debe ser tomado de la
superficie de la UFC. No tome la muestra por arrastre ya que puede llevar partes de
otras UFCs.
1.3.3. Introducir el asa en forma vertical hasta unos 2-3 mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado de
no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosfrico y se anulan las
condiciones de anaerobiosis.
1.3.4. Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma
de S a medida que se retira el asa del tubo.
1.3.5. Incubar el tubo.
1.3.6. Leer la reaccin bioqumica del medio.

Resultados: A/AG
Parte inclinada: Fermentacin de lactosa y sacarosa*. Hay viraje de color del rojo al amarillo.
Parte profunda: Fermentacin de la glucosa con produccin de gas abundante. Hay viraje de
color del rojo al amarillo. El agar se observa fragmentado por la presencia abundante de gas.
*La fermentacin de la sacarosa por parte de Escherichia coli es variable.


Resultados: K/K
Parte inclinada: No hay fermentacin de lactosa ni sacarosa. No hay viraje de color.
Parte profunda: No hay fermentacin de la glucosa, ni produccin de gas. No hay viraje de color.
Resultados: K/AG+
Parte inclinada: No hay fermentacin de lactosa ni sacarosa. No hay viraje de color.
Parte profunda: Fermentacin de la glucosa con produccin de gas abundante. Presencia de
precipitado negro en toda la parte profunda. Hay viraje de color del rojo al amarillo el cual
no se observa por la presencia del sulfuro de hidrgeno.
2. LISINA HIERRO AGAR (LIA):
2.1. Fundamento:
Es un medio para detectar enzimas que descarboxilan o desaminan la lisina en bacilos gramnegativos.
Adicionalmente detecta enzimas que producen sulfuro de hidrgeno y gas proveniente de la glucosa.
2.1.1. Prueba de descarboxilacin de la Lisina:
Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa, la descarboxilacin de la lisina produce cadaverina, un
producto terminal alcalino que acenta el color violeta del medio. Un requerimiento previo de la
descarboxilacin es un pH cido, el cual se logra con la fermentacin de la glucosa. Esta reaccin se
lleva a cabo en anaerobiosis, por lo que se observa en la parte profunda del medio.
2.1.2. Prueba de desaminacin de la Lisina:
La desaminasa de la lisina acta solo en ambiente de aerobiosis por lo que se ver en la parte inclinada.
La desaminacin de la lisina termina en productos cetocidos que en combinacin con el Fe+++,
(proveniente del citrato de amonio frrico) hacen que la molcula combinada se observe de color rojo
intenso. El indicador de pH no interviene en este caso. Por esta razn, la lectura de esta reaccin no
se abrevia con los smbolos de cido (A) sino como R (rojo).
No existen enterobacterias que posean las dos enzimas (descarboxilasa y desaminasa de la lisina) por
lo que slo se tiene que observar, o una de ambas reacciones o la ausencia de ambas. Cuando no hay
desaminasa ni descarboxilasa, en la parte inclinada se observar una alcalinizacin del medio por
crecimiento y muerte bacteriana, la cual har que esta parte se observe de color violeta (K) y en la parte
profunda, acidificacin por los productos terminales de la fermentacin de la glucosa. En este caso, la
parte profunda se observar de color amarillo (A).
2.1.3. Produccin de Sulfuro de Hidrgeno:
La presencia de la enzima tiosulfatasa actuar sobre el tiosulfato de sodio y se producir H2S, que en
presencia del hierro proveniente del citrato de amonio frrico, formarn un precipitado de color negro.
2.1.4. Produccin de Gas:
La presencia de la enzima deshidrogenasa frmica actuar sobre el cido frmico proveniente de la
fermentacin de la glucosa y en consecuencia, habr gas de CO 2 y H2.

2.2. Composicin:
2.2.2. Sustratos: Lisina, glucosa, citrato de amonio frrico, tiosulfato de sodio

Descarboxilacin o desaminacin de la lisina:
Lisina Lisina Decarboxilasa Cadaverina
Lisina Lisina Desaminasa cido acetocarbnico
Fermentacin de carbohidratos:
Glucosa Glucosa 6 fosfato cido pirvico
Deshidrogenasa cidos mixtos
Produccin de gas:
cido Frmico Deshidrogenasa frmica CO2
Produccin de H2S
Tiosulfato de sodio Tiosulfatasa H2S
(incoloro)
Precipitado
de color negro Sales de hierro

2.3.2. El medio debe ser inoculado con la misma UFC que se sembr en TSI.
2.3.3. Introducir el asa ven forma vertical hasta unos 2-3mm antes de llegar al fondo. Tener cuidado
de no tocar el fondo del vidrio del tubo porque puede entrar aire atmosfrico y se anulan
las condiciones de anaerobiosis. Repetir dos veces mas este procedimiento, de tal manera que
las tres punciones se hagan en los vrtices de un tringulo imaginario.
2.3.4. Estriar la parte inclinada del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma
de S a medida que se retira el asa del tubo.


Resultados: K/Kg
Parte inclinada: No hay desaminacin de la lisina. El medio no vira de color. Se observa violeta.
Parte profunda: Descarboxilacin de la lisina positiva. Fermentacin de la glucosa con produc-
cin moderada de gas. No se observa el viraje de la acidificacin de la glucosa por la alta
produccin de cadaverina. No hay viraje de color. El medio se observa violeta y turbio. El me-
dio se observa fragmentado por la presencia moderada de gas.
Resultados: K/A
Parte inclinada: No hay desaminacin de la lisina. El medio no vira de color. Se observa violeta.
Parte profunda: No hay descarboxilacin de la lisina, ni produccin de gas ni H2S. Hay viraje de
color del violeta al amarillo.
Resultados: R/Ag+
Parte inclinada: Desaminacin de la lisina positiva. Hav viraje de color del violeta al rojo intenso.
Parte profunda: No hay descarboxilacin de la lisina. La fermentacin de la glucosa hace virar
el medio del violeta al amarillo. Se produce gas y un precipitado de color negro por la pre-
sencia del sulfuro de hidrgeno.
3. MOVILIDAD, INDOL, ORNITINA (MIO):
3.1. Fundamento:
Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, as como las enzimas descarboxilasa
de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilacin de la
orinitina y produccin de indol.
3.1.1. Movilidad:
Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medio ayuda a diferenciar las mviles
de las no mviles.
3.1.2. Produccin de Indol:
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, el aminocido triptfano ser degradado en varios productos
entre los cuales est el indol, el cual se hace visible al agregarle el reactivo de Kovac (p-
dimetilaminobenzaldehido) o Erlich con un color rosado intenso. Sin la presencia de la enzima y ausencia
del indol, el reactivo se ve transparente.
3.1.3. Descarboxilacin de la ornitina:
Detecta la presencia de la enzima descarboxilasa de la ornitina, que de estar presente desdobla la
ornitina en putrescina, un producto con pH alcalino, lo que hace instensificar el color violeta del medio.

3.2. Composicin:
3.2.2. Sustratos: Ornitina, glucosa y triptofano.
3.2.3. Indicador de pH: Prpura de bromocresol
Triptfano Triptofanasa Indol

Orinitina Ornitina descarboxilasa Putrescina
Glucosa Glucosa 6-fosfato Acidos mixtos
Deshidrogenasa Acido pirvico

3.3.2. Con un asa recta, tomar un inculo del agar nutritivo o TSA.
3.3.3. Introducir el inculo en forma vertical, en un trayecto de 0.5cm, si el tubo contiene 2mL de MIO.
3.3.4. Retirar el asa a lo largo de la misma lnea de puncin del agar.
3.3.6. Leer la reaccin bioqumica del medio. Para ver si hubo produccin de indol se agregan 2 gotas
del reactivo de Kovac. La presencia de indol se detecta por un rpido aparecimiento de un
color rosado intenso en la parte superior del medio.
NOTA: Un movimiento excesivo del asa puede dar como resultado un patrn de crecimiento a lo
largo de la lnea de puncin, que puede ser interpretada falsamente como movilidad positiva, al igual que
una puncin mas profunda que lo indicado.

Resultado: Movilidad positiva: Se observa turbidez difusa en el medio
Produccin de indol positiva: Al agregar dos gotas del reactivo de Kovac aparece rpidamente un anillo
de color rosado intenso.
Descarboxilacin de la ornitina positiva: El medio no vira de color. Se observa de color violeta.
Resultado: Movilidad negativa: Slo hay crecimiento a lo largo de la puncin del inculo. El medio se
observa transparente.
Produccin de indol negativa: Al agregar dos gotas del reactivo de Kovac no hay viraje de color. El
reactivo aparece transparente.

Descarboxilacin de la ornitina negativa: El medio vira de color del violeta al amarillo, ms intenso en
la parte profunda.
4. UREA DE CRHISTENSEN:
4.1. Fundamento:
Detecta la presencia de la enzima ureasa. Cuando la bacteria tiene la enzima, la urea es desdoblada a
amonio y CO2. El amonio alcaliniza el medio haciendo virar el indicador al rosado intenso.
4.2. Composicin:
4.2.2. Sustratos: Urea
4.2.3. Amortiguadores: Cloruro de sodio, fosfato de potasio monobsico
4.2.6. Tiempo de incubacin: 18-24 horas. Mximo 4 das

Urea ureasa NH4 (Amonio)

4.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento en forma de
S, a medida que retira el asa del tubo.

Resultado: Ureasa negativa: no hay viraje de color.
Resultado: Ureasa positiva: hay viraje de color a rosado intenso.
5. CITRATO DE SIMONS:
5.1. Fundamento:
Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el citrato como nica fuente de carbono.

5.2. Composicin:
5.2.1. Sustrato: Citrato de Na, fosfato de amonio monobsico.
5.2.2. Amortiguadores: Fosfato de potasio dibsico, cloruro de sodio, sulfato de magnesio.
5.2.3. Indicador de pH: Azul de bromotimol
5.2.5. Tiempo de Incubacin: 24 48 horas. Mximo 4 dias

Citrato Citratasa Hidrxido de Na y Carbonato de sodio

5.3.1. Rotular el tubo que contienen el medio de cultivo.
5.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento de ida y
vuelta en forma de S a medida que se retira el asa del tubo.

Resultado: Citrato positivo: No hay crecimiento ni viraje de color. Se observa de color verde.
Resultado: Citrato negativo. Viraje de color del verde al azul y crecimiento en la superficie.
6. ACETATO DE SODIO:
6.1. Fundamento:
Es un medio sinttico en el que la nica fuente de carbono y de energa es el acetato. Su utilizacin
ocurre en aerobiosis, resultando en alcalinizacin del medio con el consiguiente viraje del indicador de
pH de verde a azul.
6.2. Composicin:
Sustrato: Acetato de sodio.
Amortiguadores: Cloruro de sodio, sulfato de magnesio, fosfato de amonio monobsico, fosfato de
potasio dibsico.
Indicador de pH: Azul de bromotimol.

6.3.1. Rotular el tubo que contienen el medio de cultivo.

6.3.3. Estriar la superficie del agar desde el fondo a la parte superior con un movimiento serpentiforme
a medida que se retira el asa del tubo.
6.3.4. Incubar el tubo de 35 o a 37oC por 7 das, revisando diariamente la presencia de cambios
en la reaccin.

Resultado: Hay viraje de color del verde al azul. El viraje de color se observa a las 24 horas.
Crecimiento en la superficie del medio.
Resultado: No hay crecimiento en la superficie del medio ni viraje de color en 7 das. El medio se
observa de color verde.
7. MALONATO Y FENILALANINA DESHIDROGENASA

(CALDO MALONATO FENILALANINA):
7.1. Fundamento:
Evala la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como nica fuente de carbono y la
desaminacin de la fenilalanina, en forma combinada. Las enterobacterias no tienen la capacidad
enzimtica de realizar las dos reacciones simultneamente, por lo que, o se observa la utilizacin del
malonato o la desaminacin de la lisina. Las bacterias que no utilizan el malonato no poseen la enzima
fenilalanina desaminasa, por lo que es posible reacciones de malonato y fenilalanina desaminasa
negativas.
7.2. Composicin:
7.2.1. Nutriente: Extracto de levadura.
7.2.2. Sustrato: Malonato de sodio y L-fenilalanina.
7.2.3. Amortiguadores: Fosfato de potasio mono bsico, fosfato de potasio dibsico, cloruro de sodio.
7.2.4. Indicador de pH: Azul de bromotimol.
7.2.5. Temperatura de incubacin: 35-37oC.
7.2.6. Tiempo de incubacin: 18-24 horas, mximo 2 das.
Fenilalanina Fenilalanina Acido fenil

desaminasa pirvico
Compuesto de HCl + Hierro III

color verde musgo


7.3.1. Rotular el tubo que contiene caldo.
7.3.3. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ngulo agudo del
menisco formado por el caldo.
7.4. Utilizacin del Malonato:

7.4.1. Control de Calidad:
Resultado: Malenato positivo. Hay viraje de color del verde claro al azul intenso.
Resultado: Malenato negativo. No hay viraje de color. El medio conserva su color verde.
7.5. Desaminacin de la fenilalanina:

Si el malonato es negativo se realiza la prueba de fenillalanina, agregando 1 gota de HCl (cido
clorhdrico). En este momento el caldo se torna amarillo y luego 2 gotas de Fe2Cl3 (Cloruro frrico).
7.5.1. Control de Calidad:
Resultado: No hay viraje de color. El medio se observa de color amarillo.
7.5.1.2. Proteus mirabilis ATCC 25933
Resultado: Hay viraje de color del verde claro al verde musgo
8. ROJO DE METILO (RM):
8.1. Fundamento:
Esta prueba permite diferenciar 2 vas metablicas para la utilizacin de la glucosa: cido mixta y
butanodilica.
Las bacterias RM positivas producen grandes cantidades de cidos, capaces de disminuir el pH < 4.4.
Las bacterias RM negativas continan metabolizando los cidos hasta productos neutrales que causan
una reversin del pH inicial hasta 6.0. Este comportamiento diferencial se pone en evidencia al agregar
un indicador de pH (Rojo de Metilo) que vira de color al rojo si el pH del medio es menor de 4.4 o no
vara de color si el pH est por encima de ese valor o es amarillo si el pH es > 6.2
8.2. Composicin:
8.2.2. Sustrato: Glucosa

8.2.3. Amortiguador: Fosfato de potasio dibsico


8.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo.
8.3.5. Agregar dos gotas de rojo de metilo.
8.3.6. Leer la reaccin inmediatamente

Resultado: Rojo de metilo positivo. Inmediatamente se observa un anillo color rojo en la superficie del
medio al agregar 2 gotas de rojo de metilo.
Resultado: Rojo de metilo negativo. Se observa anillo color amarillo en la superficie del medio al
agregar dos gotas de rojo de metilo.
9. VOGUES PROSKAUER (VP):
9.1. Fundamento:
Evala la utilizacin de la glucosa por una va alterna a la del cido pirvico.El producto terminal es
el acetil metil carbinol (acetona, 3-hidroxi-2-butanona), un compuesto incoloro que es detectado en dos
pasos: 1. alcalinizacin del medio con hidrxido de potasio (KOH al 40%). En presencia de oxgeno, el
compuesto vira a lo cual provoca, en presencia del Oxigeno, la oxidacin del Acetil-Metil-Carbinol a
diacetilo. 2. Al agregarle alfanaftol, el diacetilo vira a un color zapote intenso.
9.2. Composicin:
9.2.2. Sustrato: Glucosa
9.2.3. Amortiguador: Fosfato de potasio dibsico


9.3.5. Agregar 4 gotas de KOH al 40%.
9.3.6. Agregar 6 gotas de alfanaftol.
9.3.7. Leer la reaccin despus de 30 minutos.

Resultado: Produccin de acetilmetilcarbinol positiva: se observa un anillo de color zapote intenso en
la superficie del medio.
Resultado: Produccin de acetilmetilcarbinol negativa: se observa anillo color amarillo en la superficie
del medio.
10. MUCATO:
10.1. Fundamento:
El mucato es una sal del cido mcico que es utilizado por algunas bacterias como nica fuente de
carbono. A diferencia del citrato y malonato, los productos terminales acidifican el medio, lo cual hace
virar el indicador de pH del azul al amarillo.
10.2. Composicin:
10.2.2. Sustrato: cido mcico
10.2.3. Indicador de pH: Azul de bromotimol
10.2.4. Temperatura de incubacin: 35-37 oC
10.2.5. Tiempo de incubacin: 48 horas.

10.3.2. Con una asa recta, tomar el inculo reciente del agar nutritivo o TSA.
10.3.3. Homogenizar en el caldo, un pequeo inculo de la cepa pura y reciente.
10.3.4. Inclinar el tubo e inocularlo, tocando la superficie interna del tubo, en el ngulo.

Resultado: Mucato positivo. Viraje del color del azul al verde claro o amarillo.


Resultado: Mucato negativo. No hay viraje de color. El caldo se observa de color azul.
11.ORTO-NITRO PARA-FENIL GALACTOSIDASA (ONPG):
11.1. Fundamento:
Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen tanto lactosa permeasa como -galactosidasa, dos
enzimas necesarias para la produccin de cido en la prueba de fermentacin de la lactosa.
La permeasa es necesaria para que la molcula de lactosa pueda penetrar en el interior de la clula
bacteriana, donde la -galactosidasa puede degradar el enlace galactsido, produciendo glucosa y
galactosa.
Las bacterias no fermentadoras de lactosa, carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir
cido a partir de la lactosa. Las bacterias fermentadoras lentas de lactosa carecen de la enzima
-galactsido permeasa, o su actividad es deficiente; pero poseen la enzima -galactosidasa y dan
reaccin de ONPG positiva.
La prueba ONPG detecta la enzima -galactosidasa mucho ms rpido que la misma prueba de
fermentacin de lactosa. Y es til para la identificacin de los fermentadores tardos de la lactosa
deficientes en -galactsido permeasa.
- La o-nitrofenil--D- galactopiransido (ONPG) es similar a la lactosa, excepto porque la glucosa ha
sido sustituida por un grupo orto-nitrofenilo.
- El ONPG permeabiliza la pared bacteriana ms rpidamente que la lactosa y bajo la accin de la
-galactosidasa (que si poseen los fermentadores lentos de lactosa), se hidroliza a galactosa y
o-nitrofenol.
- El o-nitrofenol es un compuesto que no tiene color cuando est unido al D-galactopiransido, pero
es amarillo en su forma libre (no unido), lo que permite la visualizacin de la hidrlisis.

Vase siguiente diagrama:
ONPG
o-nitrofenilo
Enlace galactsido
galactosa
-galactsido permeasa deficiente (bacteria
fermentadora tarda de lactosa
Pared bacteriana
o-nitrofenilo - galactosidasa
o-nitrofenilo libre
( compuesto amarillo)
galactosa galactosa ONPG positivo
11.2. Composicin:
11.2.1. Sustrato: O-nitrofenil--galactopiansido.
11.2.2. Termperatura de incubacin: 35-37oC.
11.2.3. Tiempo de incubacin: 18-24 horas.

11.3.1. En un tubo que contenga 0.5 mL de agua destilada estril, agregar un inculo de la cepa
problema. Hacer una suspensin cuya densidad debe ser mayor que la escala 0.5 de
MacFarland.
11.3.2. Agregar a esta suspensin el disco de ONPG.

11.4.1. Escerichia coli ATCC 25922
Resultado: ONPG positivo. Viraje de color al amarillo.
Resultado: ONPG negativo. No hay viraje de color. El agua se observa turbia.

12.FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS EN CALDO:

12.1. Fundamento:
Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar los carbohidratos
(azcares) produciendo cidos o cidos y gas visibles.
Se utiliza una base rica en nutrientes, cuyo indicador de pH es el prpura de bromocresol. El
carbohidrato requerido se agrega, ya sea en forma de discos comerciales impregnados o adicionando
al caldo el carbohidrato previamente esterilizado por filtracin.
La ventaja de usar discos es que la base sirve para todos los carbohidratos y que este se agrega al
momento de ser requerido.
Para observar la formacin de gas deben colocarse en forma invertida tubos de Durham, cerciorndose
que el tubo quede completamente sumergido en el caldo.
12.2. Composicin:
12.2.1. Nutriente: Peptonas y extracto de carne
12.2.2. Sustrato: Carbohidrato adicionado segn el lote a preparar.
12.2.3. Amortiguador: Cloruro de sodio
12.2.4. Indicador de pH: Prpura de bromocresol
12.2.6. Tiempo de Incubacin: 18-24 horas si esta negativo se deja hasta 7 das.
12.3. Tcnica de inoculacin
12.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo de prpura de bromocresol simple.
12.3.4. Si el caldo utilizado no contiene el carbohidrato, proceda a tomarlo del frasco comercial que
lo contiene. Utilice una pinza previamente flameada para extraerlo del frasco. Auxliese de otra
pinza (previamente flameada) para doblarlo e introdzcalo hasta el fondo del caldo.

Resultado: Fermentacin positiva: Dependiendo del carbohidrato. Hay viraje de color del violeta al
amarillo. Puede observarse o no gas en el tubo de Durham. El caldo se observa de color violeta y el tubo
de Durham se observa sin caldo o con pequeas burbujas de gas en la parte superior (presencia de gas)
o completamente lleno de caldo (ausencia de gas).
Fermentacin negativa: Dependiendo del carbohidrato. No hay viraje de color ni se observa gas en el
tubo de Durham. El caldo se observa de color violeta y el tubo de Durham se observa lleno de caldo.

12.CALDO DE MOELLER PARA DETERMINAR DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS:

13.1. Fundamento:
La base para descarboxilasa de Moeller se emplea para la diferenciacin bioqumica de los bacilos
entericos y microorganismos a fines, mediante pruebas que involucran la descarboxilacin de los
aminocidos. Los aminoacidos ms empleados son: Lisina, Ornitina y Arginina las cuales se agregan
para obtener una concentracin final de 1 o 2% en el medio base. Los aminoacidos se esterilizan por
filtracin, ya que la esterilizacin por calor desnaturaliza las proteinas.
A diferencia de la base de carbohidratos, la de Moeller lleva glucosa con el propsito de discriminar entre
las reacciones positivas de las negativas. Una reaccin de descarboxilacin de aminoacidos alcaliniza
el medio (contrario a los carbohidratos) por lo que el prpura de bromocresol no variar
significativamente de color. Si la bacteria no descarboxila el aminoacido contenido en el caldo,
fermentar la glucosa produciendo cidos que harn virar el prpura de bromocresol al amarillo. De esta
manera, el color prpura indica descarboxilacin y amarillo ausencia de descorboxilacin.
La prueba de descarboxilacin requiere de una atmsfera libre de oxgeno, por lo que el medio ya
inoculado debe sellarse con aceite mineral estril.
El medio tiene incorporado un indicador de pH combinado (prpura de bromocresol y rojo cresol).
13.2. Composicin del medio:

13.2.1. Nutrientes: Peptonas, extracto de levadura, piridoxal.
13.2.2. Sustrato: Aminocido segn requerimiento. Dextrosa (glucosa) para discriminar los positivos de
los negativos.
13.2.3 Indicador de pH: Prpura de bromocresol y rojo cresol.
13.2.4. Temperatura de Incubacin: 35-37oC.
13.2.5. Tiempo de Incubacin: 18-24 horas.

Lisina lisina decarboxilasa Cadaverina
Ornitina ornitina descarboxilasa Putrecina
Arginina arginina dehidrolasa Citrulina
NOTA:
El producto terminal de la arginina (citrulina) es convertido en ornitina, luego se da la descarboxilacin
y como producto final resulta la putrecina.
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas que actan sobre sustratos especficos, capaces de
reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los aminocidos para formar aminas alcalinas. Cada
enzima descarboxilasa es especfica para cada aminocido.


13.3.4. Volver el tubo a la posicin vertical, lo cual tiene el efecto de sumergir el punto de inocula-
cin bajo la superficie.
13.3.5. Agregue de 5 a 10 gotas de aceite mineral estril.
13.4. Control de Calidad

Descarboxilacin de lisina positiva: El caldo no vira de color. Se observa de color prpura.
Descarboxilacin de arginina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo.
Descarboxilacin de ornitina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo.
Resultado:
Descarboxilacin de lisina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo.
Descarboxilacin de arginina negativa: El caldo vira de color del violeta al amarillo.
Descarboxilacin de ornitina positiva: El caldo no vira de color. Se observa de color prpura.
IV. MEDIOS DE CULTIVO PARA BACILOS GRAMNEGATIVOS NO FERMENTADORES:
1.1. Fundamento:
El tetrametil-parafenilendiamina dihidrocloruro al 1% se emplea para la determinacin de la
citocromooxidasa. Este reactivo sustituye al oxgeno como aceptor de electrones para la respiracin
bacteriana, proceso que se lleva a cabo en la membrana celular. En su estado reducido es incoloro, pero
en presencia de la enzima citocromooxidasa se oxida formando el azul de indofenol, visible en los
primeros 10 segundos de la prueba.
1.2. Procedimiento:
Realice la prueba a partir de un cultivo de 18-24 horas de un medio que no contenga azcares, ni
sangre.
1.2.1. Utilizando un palillo de madera tome una UFC del plato donde ha sido reproducida la bacteria
en estudio (agar nutritivo, Mueller Hinton, agar BHI).
1.2.2. Disperse la colonia sobre la tira.
1.2.3. Descarte el palillo en el contenedor conteniendo cloro.

1.2.4. El desarrollo de un color de morado a prpura en los primeros 10 segundos, indica una reac-
cin positiva. La prueba no debe leerse en un tiempo mayor ya que el oxgeno atmosfrico
interferir oxidando el reactivo y dando resultados falsos positivos.
NOTA: El crecimiento en un medio que se ha acidificado debido a la fermentacin de carbohidratos no
debe emplearse ya que la acidez inhibe la enzima citocromo oxidasa.

Resultado: Positivo. Presencia de la enzima indofenoloxidasa. Se observa un color prpura en la tira
reactiva el cual aparece en los primeros 10 segundos.
Resultado: Negativo. Ausencia de la enzima indofenoloxidasa. No hay viraje de color en la tira reactiva.
2. PRUEBA DE MOVILIDAD AL FRESCO

Las bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo nmero y localizacin varan entre los diferentes
gneros y especies. Las Pseudomonas poseen uno o ms flagelos polares, pero la especie aeruginosa slo
posee 1 flagelo polar.
La movilidad en fresco se realiza como procedimiento de primera eleccin para detectar la movilidad de
especies bacterianas que no crecen bien en agar semislido.
2.2. Procedimiento:
En un portaobjetos limpio, colocar una gota de solucin salina estril al 0.85%.
2.2.1. Con un palillo de madera tomar una colonia o un pequeo inculo de la cepa y mezclarlo con
la solucin salina. Asegrese de no excederse en la cantidad de inculo para evitar una falsa
interpretacin de la movilidad.
2.2.2. Coloque sobre la mezcla un cubreobjetos y obsrvelo al microscopio con objetivo 40X.


3. GLUCOSA OF (OXIDACIN-FERMENTACIN):
3.1. Fundamento del medio de cultivo:
Los medios bioqumicos usados para las bacterias fermentativas no pueden ser aplicados a las bacterias
oxidativas que producen cidos dbiles insuficientes para hacer virar el indicador de pH y debido a esto,
Hugh y Leifson disearon un medio OF (oxidativo-fermentativo) que se adapta a las propiedades de los
bacilos gramnegativos no fermentadores.
Los bacilos gramnegativos fermentadores oxidativos utilizan vas alternativas a la va de Embden-
Meyerhof a travs de las cuales es oxidada la glucosa. El trmino oxidacin significa la forma en que
el cido pirvico transfiere sus iones hidrgeno. Al carecer de la enzimas deshidrogenasas, necesarias
para oxidar el cido pirvico a cido lctico y otros cidos mixtos, las bacterias oxidativas transfieren
los iones hidrgeno del cido pirvico al ciclo de Krebs, donde se une al oxgeno para formar agua.
Este medio es til para la diferenciacin de microorganismos no fermentadores. La consistencia
semislida del agar, el uso de azul bromotimol como indicador de pH y la inclusin de una pequea
cantidad de buffer de difosfato estn destinados a aumentar la deteccin de cidos.
3.2. Composicin:
3.2.1. Nutrimentos: Peptona.
3.2.2. Sustrato: Glucosa.
3.2.3. Amortiguadores: Cloruro de sodio y fosfato de potsico dibsico.
3.2.4. Indicador de pH: Azul de bromotimol.
3.3. Procedimiento:
3.3.1. Rotular con la muestra los dos tubos necesarios para la prueba OF (oxidativo-fermentativo).
3.3.2. Con un asa recta, inocular una buena carga de la bacteria, introduciendo el asa hasta el
fondo del tubo.
3.3.3. Utilizando el mismo inculo, siembre otro tubo, de la misma manera que el anterior.
3.3.4. Con un gotero, deje caer 9 gotas (0.5 mm) de aceite mineral estril, a uno de los tubos
inoculados. Esto favorecer un ambiente anaerobio.
3.3.5. Deje sin apretar el tapn de rosca del tubo sin aceite mineral para favorecer un ambiente aerobio.
3.3.6. Incubar ambos tubos a 35 oC por 24 horas.

Resultado: Oxidacin de la glucosa positiva. Se observa viraje de color al amarillo en la parte superior
del tubo sin aceite mineral (reaccin en aerobiosis). No hay actividad en el tubo con aceite mineral
(reaccin en anaerobiosis). No hay viraje de color.
Resultado: Oxidacin de la glucosa negativa. Fermentacin de la glucosa positiva. Hay viraje de color
a lo largo de los dos tubos (aerobiosis y anaerobiosis).

4. AGAR P:
El agar P contiene digestivo pancretico de gelatina que proveen aminocidos y magnesio, potasio y
iones sulfato que realzan la produccin de piocianina. La piocianina es un pigmento azul verde o azul
turquesa no fluorescente que se difunde alrededor del crecimiento de Pseudomonas aeruginosa. Algunas
cepas pueden producir pequeas cantidades de pioverdina o fluorescena.
4.2. Composicin:
Nutrimentos: Digestivo pancretico de gelatina.
Suplementos: Sulfato de potasio, cloruro de magnesio.
4.3. Procedimiento:
4.3.1. Rotular el tubo.
4.3.2. Con un asa recta, tomar un inculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentina.
4.3.3. Dejar el tapn de rosca semiabierto para favorecer un ambiente aerobio.
4.3.4. Incubar el tubo a 36 oC durante 18 a 24 horas, mximo por 2 das.
4.3.5. Finalizada la incubacin, observar la presencia de un pigmento de color azul en toda la zona de
crecimiento.
Resultados:
Produccin de piocianina positiva: Presencia de un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el
Produccin de piocianina negativa: Ausencia de un pigmento azul-verde o azul turquesa sobre el

Resultado: Produccin de piocianina positiva: Se observa un pigmento verde azulado o azul turquesa
sobre el crecimiento bacteriano.
Resultado: Produccin de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin pigmento.
5. AGAR F:

Ver Agar P. El agar F realza la elaboracin de pioverdina o fluorescena e inhibe la formacin de
piocianina, por accin de los fosfatos que estimulan la formacin del pigmento pioverdina.
5.2. Composicin:
Nutrimentos: Digestivo pancretico de casena y pptico de tejido de animal.
Suplementos: Fosfato de potasio dibsico y sulfato de magnesio.

5.3. Procedimiento:
5.3.1. Rotular el tubo que contiene el agar inclinado.
5.3.2. Con un asa recta, tomar un inculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentiforme.
5.3.3. Dejar el tapn de rosca semiabierto para favorecer un ambiente aerobio.
5.3.4. Incubar el tubo a 36 oC por 18 a 24 horas, mximo por 2 das.
5.3.5. Finalizada la incubacin, observar con una lmpara de ultravioleta (luz de Wood), la presencia
de fluorescencia.

Resultado: Produccin de piocianina positiva: Se observa fluorescencia verde amarillenta en toda la zona
de crecimiento bacteriano cuando el tubo se expone a luz ultravioleta.
Resultado: Produccin de piocianina negativa: Se observa crecimiento sin fluorescencia cuando el tubo
se expone a luz ultravioleta.
6. CRECIMIENTO EN AGAR CETRIMIDA:

La cetrimida un agente qumico que acta como detergente catinico disminuyendo la tensin superficial
en el medio. Como resultado, muchas bacterias son inhibidas por esta accin. La presencia de cloruro
de magnesio y sulfato de potasio estimulan la formacin del pigmento azul verde o azul turquesa no
fluorescente piocianina y el pigmento verde-amarillo fluorescente de pioverdina que puede ser detectado
bajo luz ultravioleta de onda larga (400nm.)
6.2. Composicin:
6.2.1. Nutrimientos: Peptona de gelatina.
6.2.2. Suplementos: Cetrimida (Bromuro de cetil-trimetil-amonio).
6.2.3. Cloruro de magnesio y sulfato de potasio.
6.3. Procedimiento:
6.3.1. Rotular el plato.
6.3.2. Con un asa recta, tomar un inculo del agar nutritivo o TSA y estriar en forma serpentiforme.
6.3.3. Incubar a 36 oC durante 18 a 24 horas, mximo por 2 das.
6.3.4. Finalizada la incubacin, observar con una lmpara de de Wood, la presencia de fluorescencia.

Resultado: Crecimiento en cetrimida positivo: Hay buen crecimiento con pigmento azul verde o azul
turquesa no fluorescente y verde amarillento fluorescente que detecta la pioverdina o fluorescena en
presencia de luz ultravioleta.


Resultado: Crecimiento en cetrimida negativo. No hay crecimiento.
7. REDUCCIN DE NITRATOS:

El caldo de nitrato es til en la identificacin de microorganismos aerobios y anaerobios facultativos
gramnegativos
- La presencia de nitritos en el medio de prueba se detecta al agregar el reactivo A (alfa naftilamina)
y B (cido sulfanlico) en igual proporcin, stos detectan los nitritos con formacin de un colorante
rojo intenso de diazonio, (para-sulfobencenoazo-alfa naftilamina) despus de 1 a 2 minutos, lo cual
indica que los nitratos fueron reducidos a nitritos (reaccin positiva).
- Si no se observa color despus del agregado de los reactivos de prueba, indica que no se han
reducido nitratos a nitritos (reaccin negativa) o que han sido reducidos a productos diferentes a
los nitritos como amonaco (NH3), nitrgeno molecular (N 2) (desnitrificacin), xido ntrico (ON) u
xido nitroso (N2O) e hidroxilamina.
Debido a que los reactivos slo detectan nitritos, es necesario agregar una pequea cantidad
(aproximadamente 20 mg) de polvo de cinc a todas las reacciones negativas (incoloras) para
confirmar que son verdaderamente negativas. Los iones cinc reducen los nitratos a nitritos y el viraje
de un color rojo despus de 5 a 10 minutos, indica que la reaccin es verdaderamente negativa.
- La reduccin de nitratos a gas nitrgeno u oxido nitroso se denomina desnitrificacin. En el medio
caldo, la formacin de gas nitrgeno se detecta por la presencia de burbujas de gas en la parte
superior del tubo de Durham colocado en forma invertida, lo cual es considerado como una reaccin
positiva.
(Reduccin de
Nitratos Nitritos + Reactivos A y B Color rojo intenso
Nitratos a Nitritos)
Reaccin Positiva
Nitratos Nitratos + Reactivos A y B Caldo incoloro (No hubo

(Reaccin negativa) Reduccin de
Nitratos)
Reaccin
Ms Cinc Color rojo
verdaderamente
negativa
Nitratos Gas Nitrgeno En tubo de Durham: Reaccin

U otros: (NH3, ON, N 2O) burbujas de gas positiva

Nota: En el caso de Pseudomonas aeruginosa la interpretacin del esquema anterior es diferente ya que
convierten los nitratos a nitritos pero que tambin producen gas de nitrgeno en gran cantidad y por lo
tanto la deteccin de los nitritos despus de agregar los reactivos no es observable. Esto se puede
comprobar fcilmente al agregar aproximadamente 20 mg de cinc. Cuando los nitratos no han sido
convertidos a nitritos, el cinc hace la conversin y el viraje a color rojo intenso se hace presente. Sin
embargo, en el caso de las Pseudomonas aerugionsa este viraje no se presenta, lo que comprueba la
conversin La produccin de gas nitrgeno es detectada por la presencia de burbujas en la parte superior
del tubo de Durham.
7.2. Composicin:
7.2.1. Nutrientes: Peptona de carne
7.2.2. Sustrato: Nitrato de potasio
7.2.3. Cloruro de sodio
7.3. Reactivos requeridos:

7.3.1. Reactivo A: Alfanaftilamina.
7.3.2. Reactivo B: cido Sulfanlico.
7.3.3. Polvo de Cinc.

7.4.4. Incubar a 35 oC durante 18 a 24 horas.
7.4.5. Finalizada la incubacin, agregar 500L del reactivo A.
7.4.6. Inmediatamente agregar 500L del reactivo B.
7.4.7. Leer en los primeros 1 a 2 minutos.
7.4.8. Si no hay viraje de color, agregar una pizca (alrededor de 20 mg) de polvo de cinc.
7.4.9. Observar y anotar si hay presencia de burbujas en el tubo de Dirham.
Resultado:
Conversin de nitratos a nitritos positiva: Viraje al color rojo intenso entre 1 a 2 minutos al agregar los
Conversin de nitratos a nitritos negativa: No hay viraje de color al agregar los reactivos de prueba.
Confirmacin de la negatividad de nitratos a nitritos: Despus de agregar 20 mg polvo de cinc hay viraje
de color al rosado durante los primeros 5 a 10 minutos.
Presencia de gas libre de nitrgeno: Presencia de burbujas en el tubo de Durham.


Resultado: Reduccin de nitratos a nitritos positiva. No hay viraje de color despus de agregar los
Produccin de gas de nitrgeno a partir de nitratos positiva: Se observan burbujas de gas en la parte
superior del tubo de Durham.
7.5.2. Enterococcus faaecalis ATCC 29212
Resultado: Reduccin de nitratos a nitritos negativa. No hay viraje de color despus de agregar los
Confirmacin: Luego de la adicin de aproximadamente 20 mg de cinc el caldo vira a color rojo entre
5 a 10 minutos y la reaccin es verdaderamente negativa.
Produccin de gas de nitrgeno a partir de nitratos negativa: No hay burbujas de gas en el tubo de
Durham. Todo el tubo aparece lleno con el caldo.
8. HIDRLISIS DE ARGININA:

Este medio se usa para determinar la presencia de la enzima dihidrolasa que convierte la arginina en
el producto primario citrulina que luego es convertido en ornitina, el cual se descarboxila para formar
putrescina. Este ltimo alcaliniza el medio, lo cual acenta el color prpura del medio.
8.2. Composicin:
8.2.1. Nutrimentos: Peptona y extracto de carne
8.2.2. Sustratos: Disco conteniendo arginina y glucosa
8.2.3. Indicador de pH: Prpura de bromocresol y rojo cresol

8.3.1. Rotular el tubo que contiene el caldo base (sin arginina).
8.3.4. Incubar a 35 oC durante 18 a 24 horas.
Resultado:
Dihidrlisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un prpura ms
acentuado.
Dihidrlisis de arginina negativa: Hay viraje de color al amarillo por fermentacin de la glucosa.


Resultado: Hidrlisis de arginina positiva: No hay viraje de color. El caldo se observa con un prpura
mas intenso.
Resultado: Hidrlisis de arginina negativa: Hay viraje de color al amarillo por la fermentacin de la
glucosa.
9. HIDRLISIS DE GELATINA:

El medio de cultivo de gelatina sirve para determinar la gelatinlisis o licuefaccin de la gelatina a travs
de la enzima gelatinaza.
9.2. Composicin:
9.2.1. Nutrimentos: Peptona de casena.
9.2.2. Sustrato: Gelatina

9.3.1. Rotular el plato.
9.3.3. Hacer un inculo redondo y puntiforme en el centro del plato.
9.3.4. Incubar a 36oC por 24 horas de incubacin. Mximo 4 das de incubacin, vigilando diariamente
alguna reaccin positiva.
Resultado: Hidrlisis de la gelatina positiva: Se observa un halo opaco alrededor del inculo.

Resultado: Hidrlisis de la gelatina positiva. Se observa un halo opaco alrededor del inculo.
Resultado: Hidrlisis de la gelatina negativa. No se observa un halo opaco alrededor del inculo.
V. GRAMPOSITIVOS:
1.1. Fundamento:
La catalasa es una enzima que cataliza el perxido de hidrgeno (H2O2) en oxgeno y agua. La libe-
racin del oxgeno se puede observar a simple vista por la formacin de burbujas.

1.2. Procedimiento:
1.2.1. Recoja, con un asa varias colonias de 18-24 horas de crecimiento.
1.2.2. Colquelas sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio limpio.
1.2.3. Agregue una gota de H2O2 al 3%. La formacin inmediata denota una reaccin positiva. La
produccin puede ser leve, moderada o intensa.
1.3. 23.3 Control de calidad:

Resultado: Presencia de la enzima catalasa. Produccin inmediata e intensa de burbujas.
Resultado: Ausencia de la enzima catalasa. No hay produccin de burbujas.
2. PRUEBA DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LA OPTOQUINA:

2.1. Fundamento:
La optoquina (hidrocloruro de etilhidrocuprena), es un compuesto al cual S. pneumoniae es susceptible
en bajas concentraciones (5g o concentraciones menores) y por tanto inhibe su crecimiento.
La optoquina puede inhibir el crecimiento de otros Streptococcus alfa hemolticos, pero en con-
centraciones altas. Es soluble en agua y se difunde rpidamente en el medio, por lo tanto, los discos de
papel filtro impregnados con optoquina pueden ser colocados directamente sobre la superficie del agar
para la realizacin de la prueba.
2.2. Procedimiento:
2.2.1. Trabaje con un cultivo puro. Inocule una placa de agar sangre bovina al 5%.
2.2.2. Estre el inculo en 3 4 direcciones, lo cual favorecer un crecimiento homogneo del micro-
organismo.
2.2.3. Coloque el disco de optoquina en el centro del inculo inicial e incube de 18-24 horas en CO2.
2.2.4. Mida el tamao de la zona de inhibicin (en mm).

Resultado: Halos de inhibicin 14 mm. Zonas de inhibicin mayor o igual a 14 mm son interpretadas
como susceptibles.
Resultado: Halos de inhibicin 14 mm. Zonas de inhibicin menores a 14 mm son interpretadas como
resistentes.


3.1. Fundamento:
Las sales de bilis, especficamente el desoxicolato y el taurocolato de sodio tienen la capacidad de lisar
selectivamente a Streptococcus pneumoniae, cuando una suspensin del microorganismo se agrega a
una solucin de las sales (suspensin realizada a partir de un cultivo fresco de 18-24 horas en agar
sangre de carnero al 5%).
S. pneumoniae produce enzimas autolticas que son las responsables de la caracterstica umbilicada de
la colonia en cultivos viejos. La adicin de sales de biliares a la suspensin de la bacteria activa las
autolisinas y acelera el proceso de lisis, lo cual est asociado a la disminucin de la tensin superficial
entre el medio y la membrana celular bacteriana.
3.2. Procedimiento:
3.2.1. A partir de un subcultivo puro, prepare una suspensin densa del microorganismo en
solucin salina estril, con una turbidez igual al patrn No. 1 de la escala de McFarland.
3.2.2. Para cada microorganismo tome dos tubos de 12 x 75 mm, marque un tubo como tubo prueba
(P), y el otro como tubo control (TC).
3.2.3. Coloque en cada tubo 0,5 ml de la suspensin salina del microorganismo; al tubo prueba
adicione 0,5 ml de desoxicolato de sodio al 10% y al tubo control adicione 0,5mL de la
solucin salina estril (0,85%).
3.2.4. Mezcle suavemente los tubos e incube a 37 oC por un perodo de 2 horas.
3.2.5. Examine la lisis del cultivo por aclaracin del mismo despus de 1 y 2 horas de incubacin.
Soluble en bilis (reaccin positiva): Hay un aclaracin visible de la suspensin del tubo que contiene
desoxicolato de sodio y sin cambios en la suspensin control con solucin salina.
Insoluble en bilis (reaccin negativa): No hay cambio en la turbidez de la suspensin del tubo que
contiene desoxicolato de sodio, en comparacin con la suspensin control en solucin salina.
NOTA: Un resultado de solubilidad parcial es interpretado como positivo.

Resultado: Solubilidad en bilis positiva: Se observa claridad o transparencia en el tubo.
Resultado: Solubilidad en bilis negativa: Se observa turbidez en el tubo.
4.1. Fundamento:
Se basa en la capacidad que tienen ciertas bacterias, en particular los Estreptococos del grupo D y
especies de Enterococcus spp, de tolerar grandes concentraciones de bilis (40%). Para detectar esta alta
tolerancia se agrega esculina, la cual es hidrolizada si la bacteria se desarrolla. La hidrlisis de la

esculina da como resultado la formacin de glucosa y un compuesto denominado esculetina. Esta a su

vez reacciona con los iones frricos para formar un complejo negro.
4.2. Procedimiento:
4.2.1. Rotular un tubo para coagulasa
4.2.2. Agregar 100 L de agua destilada estril.
4.2.3. Tomar 2 3 colonias de un cultivo fresco y hacer una suspensin homognea.
4.2.4. Con una pinza estril colocar el disco de bilis esculina dentro del tubo que contiene la suspensin.

Resultado: Negativa: El disco se observa de color amarillo plido.
5. PRUEBA DE TOLERANCIA A LA SAL:

La prueba de tolerancia a la sal (caldo con 6.5% de NaCl) diferencia las especies de Enterococcus de
los Streptococcus del grupo D no enterococos (Streptococcus bovis).
5.1. Fundamento:
Se basa en la capacidad de la bacteria de desarrollarse en presencia de cantidades variadas de cloruro
de sodio (NaCl). Es una propiedad que ha sido utilizada para caracterizar varios gneros y especies
bacterianas, incluyendo los Streptococcus del grupo viridans. En este caso se utiliza la concentracin
de Cloruro de Sodio al 6,5%.
5.2. Procedimiento:
5.2.1. Rotular el tubo que contiene caldo nutritivo con 6.5% de cloruro de Sodio.
5.2.2. Tomar 2 3 colonias de un cultivo puro de 24 horas de incubacin. Hacer una suspen-
sin homognea. Si el caldo se inocula con cantidad excesiva de bacterias, l inoculo puede
ser reportado como si desarrollara crecimiento, lo cual sera un resultado falso positivo.

Resultado: Positivo. Turbidez en el caldo por crecimiento de la bacteria.
Resultado: Negativo. No se observa turbidez en el caldo por ausencia de crecimiento de la bacteria.

6. PRUEBA DE PYR (DETERMINACIN DE LA ENZIMA PIRROLIDONIL ARILAMIDASA):

La prueba de PYR se utiliza como prueba rpida para la diferenciacin presuntiva de los Enterococcus
spp de los Streptococcus del grupo D (S. bovis).
El sustrato utilizado es la L-pirrolidonilo naftilamida (PYR por sus siglas en ingls). Este compuesto es
hidrolizado por la enzima pirrolidonilopeptidasa. La hidrlisis del sustrato por esta enzima libera
naftilamida libre, que se detecta al agregar el reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido. Si la
hidrlisis se llev a cabo, se forma un compuesto de color rojo cereza oscuro.
6.2. Procedimiento:
6.2.1. Con un palillo descartable tomar 2 3 colonias del cultivo puro de 24 horas de incubacin
y realizar un frotis en la superficie del cuadrante de la lmina que ha elegido para el caso.
La lmina contiene cuatro cuadrantes para trabajar.
6.2.2. Agregar una gota del reactivo p-dimetil-dimetil-aminocinamaldehido
6.2.3. Realizar la lectura inmediatamente. Si no hay desarrollo de color realizar la segunda lectura
al minuto de haber agregado el reactivo.

Resultado: Positivo: Desarrollo de un color rojo cereza oscuro.
Resultado: Negativo: Se observa un color amarillo o naranja (color del reactivo).
VI. BIBLIOGRAFA:
1. Manual de Medios de Cultivos: E. Merk, Darmstadt Alemania, Edicin 1994.
2. Pruebas Bioqumicas en Diagnstico microbiolgico. Elmer W. Koneman editor, captulos del 2 al 7,
5 edicin 1996, Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina.
3. Pruebas Bioqumicas para la identificacin de Enterobacterias: Actualizacin Diagnstica. Cap. I,
Servicio de Enterobacterias. Departamento de Bacteriologa, Instituto Nacional de Enferme-
dades Infecciosas, INEI Dr. Carlos G. Malbrn, 2000, Buenos Aires, Argentina.
4. Dr. Lpez Cruz SR. y colaboradores. Reacciones Bioqumicas ms comunes en Enterobacterias
en: Manual de Bacteriologa Mdica. Curso de Capacitacin en Bacteriologa Mdica 3 edicin,
2001, Ministerio de Salud. Centro Nacional de Diagnstico y Referencia CNDR, APHL
(Public Health Laboratories) /AID, Proyecto de Fortalecimiento de los Laboratorios de Salud
Pblica Post Huracn Mitch, Managua, Nicaragua, 2001.
5. Lauderdale T-L, Chapin KC, Murray PR. Reagents in: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R.
Murray Editor. 7th. Ed., 1999, chap. 128, American Society for Microbiology, Washington, D.C.
6. Chapin KC, Murray PR. Media in: Manual of Clinical Microbiology. Patrick R. Murray, editor. 7th.
Ed., 1999, chap. 130, American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Esta obra fue impresa en los talleres de
LITOGRAFA NICARAGENSE
(LITONIC)
Managua, Nicaragua.
Tiraje: 150 ejemplares.
Se termin de imprimir en
enero de 2005.

Manual de Procedimientos Bacteriologia CNDR 2004

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Edicin 2004

La edicin 2004 del Manual de Procedimientos

El presente documento, como Manual de Procedimientos tiene su sustento

La Ley No. 423 Ley General de Salud, en su Arto.4 establece:

De igual manera, la Ley General de Salud, en su Arto.2 establece que

Es responsabilidad de los representantes de establecimientos proveedores

Lic. Margarita Gurdin

Dr. Enrique Alvarado Abaunza

Dr. Alcides Gonzlez Mairena

Equipo Tcnico de Bacteriologa del CNDR

Dr. Sergio R. Lpez Cruz

Lic. Victoria Caldern

Lic. Juan Carlos Matute

Lic. Anielka Baltodano

Tc. Julissa vila

Lic. Javiera Meja

El presente Manual de Procedimientos de Bacteriologa Mdica, edicin 2004, no puede

Complejo Nacional de Salud Dra. Concepcin Palacios.

Captulo 15. Procedimientos para la identificacin de Neisseria gonorrhoeae ........................ 263

Captulo 16. Susceptibilidad antimicrobiana: Procedimientos para la sensibilidad

Captulo 17. Fundamentos fisiolgicos y bioqumicos de las pruebas......................................... 305

Jos Antonio Alvarado C.

Dr. Sergio Lpez

II. ENFERMEDAD INFECCIOSA:

Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa 1

2.1. Vibrio cholerae 01:

2.2. Shigella dysenteriae 1:

2.3. Vibrio cholerae 01:

2.4. Shigella dysenteriae 1:

2 Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa

Aqu una pequea lista de enfermedades producidas por oportunistas:

ENFERMEDAD MICROORGANISMO OPORTUNISTA PATGENO VIRULENTO VIRULENTO

* Slo en condiciones especiales.

Captulo 1: Conceptos fundamentales para comprender la enfermedad infecciosa 3

Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa 5

1. MEDICIN DE LA EXACTITUD Y PRECISIN DE LA SENSIBILIDAD

2. EXPLICACIN DE CMO INTERPRETAR LOS VALORES DE LAS GRFICAS DE

Grfica No. 1. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIN:

6 Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa

Ejemplo 2: con el antimicrobiano Sulfametoxazol Trimetoprim 23.75/1.25g y la cepa de

Grfica No. 2. BUENA PRECISIN Y MALA EXACTITUD:

Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa 7

Ejemplo 3: con el antimicrobiano ciprofloxacina 5g, y la cepa de Staphylococcus aureus ATCC

Grfica No. 3. BUENA PRECISIN Y BUENA EXACTITUD:

8 Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa

Grfica No. 4. BUENA EXACTITUD Y MALA PRECISIN:

Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa 9

3.1. Error menor (em):

3.2. Error mayor (ema):

3.3. Error muy mayor o grave (emm):

3.3.1. En relacin al gnero y especie:

III. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FIABILIDAD Y LA REPRODUCIBILIDAD

10 Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa

1.2. Factores ambientales:

1.4. Materiales de laboratorio:

1.5. Mtodo de prueba:

1.7. Examen y lectura:

Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa 11

2. CONTROL DE CALIDAD DE LOS EQUIPOS:

2.2. Horno para esterilizar cristalera:

2.6. Bao de Mara:

12 Captulo 2: Control de Calidad en Bacteriologa

IV. CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO: