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RESULTADOS
Caractersticas do core genoma e Pangenoma dos S. aureus
Um conjunto de sequencias do genoma de S. aureus publicamente
disponvel foi transferido do NCBI incluindo 48 genomas completamente
montados (completely assembled genomes ). A partir deste conjunto, uma rvore
filogentica foi construda usando a sequncia concatenada de sete genes
conservados housekeeping (arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi e yqiL) comumente
usados para definir complexo clonal em estudos clnicos de S. aureus usando o
MLST (Figura 1A). A cepa mais afastada foi a o isolado MSHR1132 australiano
de S. aureus pertencente ao complexo clonal 75 (17). Em seguida, um conjunto
representativo de 64 cepas de S. aureus (Dataset S1) foram filtradas a partir
deste maior conjunto de dados baseado em quatro critrios: (i) resistncia a
frmacos [MRSA, MSSA, VRSA e VISA] (Figura 1B), (ii) especificidade do
hospedeiro (humano versus animal) (Fig. 1C), e (iii) epidemiolgica (MRSA
associado comunidade), cuidados de sade MRSA (HA-MRSA) e MRSA
associado ao gado (LA-MRSA)] (Fig. 1D). Assim, a topologia da rvore acoplada
com informaes fenotpicas clnicas e epidemiolgicas permitindo o
desenvolvimento de um conjunto heterogneo de cepas representativas da
espcie S. aureus.
Utilizamos estas 64 cepas para construir o pangenome do S. aureus que
pode ser usado para descrever esta espcie bacteriana. O pangenome est
dividido em trs sees: (i) o genoma central (core) (o conjunto de
genes compartilhados por praticamente todas as cepas em uma
espcie), (ii) o genoma acessrio (o conjunto de genes presentes em
alguns, mas no em todos, representantes de uma espcie), e (iii) o
genoma nico (genes nicos para membros individuais da espcie).
Porque o pangenome composto de milhares de genes, ele oferece
uma maior resoluo para a tipagem de estirpes em comparao com
tcnicas de genotipagem como MLST.
As 64 estirpes de S. aureus examinadas produziram um
tamanho de pangenoma de 7,457 genes. Baseado neste conjunto de
dados, o genoma central composto de 1.441 genes, o genoma
acessrio composto por 2.871e o genoma nico composto de
3.145 genes (Fig. 2A). Anotaes funcionais de genes no pangenome
realizado usando a base de dados Clusters of Orthologous Groups (COG) (19)
revelaram uma distribuio nica de categorias funcionais entre os trs
diferentes conjuntos de pangenomas. Quando os genes foram classificados em
metablicos e no metablicos, a maior frao do genoma do ncleo consistia
de genes com funes metablicas (58%). Estes incluram aqueles envolvidos
no metabolismo central, incluindo gliclise/gliconeognese, a via de fosfato de
pentose, e ciclo TCA. Uma frao muito menor do contedo do gene metablico
observado no genoma acessrio e nico (33% e 18%, respectivamente).
O tamanho do pangenoma e seu aumento no tamanho aps a adio
novas estirpes pode ser usado para prever a taxa futura de descoberta de
novos genes em uma espcie. Utilizamos uma abordagem de amostragem para
obter um conjunto de pangenomas de S. aureus permutados aleatoriamente
(com desagregaes especficas de genes totais, genes partilhados, e novos
genes). Ao ajustar uma funo de decaimento exponencial duplo para o
nmero de genes compartilhados, estimamos o genoma ncleo/central de S.
aureus para 1.425 genes (Fig. 3). Descoberta de novos genes e contagem de
genes totais foram usados para obter ajustes funo da lei do Heap,
resultando em valores de -0,58 e 0,31, respectivamente. O parmetro
determina o comportamento da curva. Para valores> 0, a funo no tem
assntota, indicando que o repertrio do pangenome de S. aureus pode crescer
indefinidamente quanto mais sequncias so sequenciadas.
DISCUSSO
O pangenoma de S. aureus foi montado e aplicado para destacar a
diversidade gentica, metablica e patognica das espcies. Uma nfase
particular foi colocada na anlise de capacidades metablicas e na distribuio
de fatores de virulncia. Com base no contedo do pangenoma, os GEMs do
metabolismo foram reconstrudos e implantados para 64 cepas de S. aureus
para determinar suas diferenas funcionais atravs da computao de mdia
mnima composies (omputing minimal media compositions) e capacidades de
crescimento em mais de 300 nutrientes de fontes aerbicas e anaerbicas.
Todas as estirpes foram preditas por serem auxotrfica para a niacina e a
tiamina, enquanto que as estirpes auxotrficas especificas foram preditos para
riboflavina, guanina e leucina entre outros (Tabela 1). Modelos de capacidades
de crescimento predito e identificao de fatores de virulncia permitiram a
criao de esquemas de classificao que poderiam distinguir grupos de
estirpes baseado em relativamente poucos traos. Os resultados aqui
apresentados demonstram que as comparaes das capacidades metablicas
preditas pelo GEM entre diferentes estirpes de uma espcie que pode ser
usado para identificar biomarcadores de estirpes e para descobrir e elucidar
determinantes metablicos de virulncia.
Identificao e caracterizao da composio de uma espcie
Pangenome uma poderosa ferramenta para analisar a diversidade
genmica de uma taxonomia. O pangenome de S. aureus aqui descrito
composto por 7.457 genes nicos. Destes, 1.441 genes so compartilhados
entre todas as estirpes na espcie, formando um genoma central. A atribuio
funcional dos genes centrais revelou que eles esto mais associados com
funes housekeeping (i.e., controle de maquinaria de expresso gentica e
bioqumica bsica). Em mdia, 56% dos genes do genoma de S. aureus faz
parte do genoma central (core). Isso confirma observaes de que S. aureus
uma espcie clonal (22). Recentes estudos demonstraram que mesmo as
mutaes no genoma de isolados de S. aureus estreitamente relacionados
podem ter efeitos na virulncia, proliferao e persistncia de cepas de S.
aureus (6). Portanto, uma anlise mais profunda do conjunto das variantes
genticas poderia oferecer insights adicionais sobre a patogenicidade de S.
aureus.
Os 1.441 genes centrais foram alinhados para produzir uma filogenia
confivel comparados com aqueles derivados de um nmero limitado de genes
(Fig. S2). Em geral, a filogenia consistente com a informao da literatura,
incluindo a concordncia entre as ST e a clade. Contudo, foram observadas
algumas excees: (i) a o grupo ST5 est includo dentro de um clade
parafiltico correspondente a CC5 e (ii) S. aureus COL (ST250) colocado no
ST8 Clade embora essas excees sejam consistentes com histria evolutiva
de S. aureus [i.e., o clade parafiltico inclui membros do mesmo complexo
clonal e ST8 o predito antepassado de ST250 (40)], as diferenas entre
genotipagem do MLST e a filogenia apresentada sublinham as limitaes de
tcnicas de tipagem molecular para diferenciar entre estirpes. Alm disso, no
que se refere especificidade da distribuio das estirpes de LA-MRSA ao
longo da rvore indica que eles se originaram atravs de diferentes eventos
independentes. Em particular, identificamos um clade monofiltico de cepas
ST398, um clade de cepas de diferentes linhagens (ST425, ST133 e ST151), e
duas estirpes includas em diferentes clades (correspondentes a ST5 e ST1).
Em contraste com o genoma central, o tamanho do pangenome foi
usado para prever, via extrapolao, o nmero de sequncias genmicas
necessrias para delimitar o repertrio de genes de um clade. Nossa anlise de
regresso mostra que o pangenome de S. aureus aberto, indicando que o
repertrio de genes desta espcie teoricamente ilimitado. Este resultado est
de acordo com um experimento de microarranjo de DNA envolvendo 36 cepas
de S. aureus (41), em que a variabilidade gentica extensiva foi relatada. Uma
parte elevada de genes nicos foram encontrados por estarem
relacionados com elementos genticos mveis (isto , transposons,
fagos e plasmdeos), que podem sofrer aquisio de novos mdulos
funcionais via HGT, incluindo resistncia aos frmacos e virulncia
(42). Alm dessas ideias evolucionrias, o pangenome tem
implicaes prticas importantes. A presena/ausncia de genes a
partir do genoma dispensvel (isto , genes exclusivo de algumas
cepas) representa uma alternativa de alta resoluo para o MLST que
utilizamos para diagnosticar grupos distintos de patognicos
baseadas em biomarcadores especficos.
Examinamos especificamente a presena de fatores de virulncia no
genoma central e no pangenomes. Em geral, a maior parte do viruloma de S.
aureus conservado nas 64 estirpes examinadas. Existe apenas um VF nico
para uma nica estirpe (i.e., o gene etb, codificando a toxina exfoliativa B),
enquanto 54 VFs foram compartilhados por um pequeno nmero de estirpes,
mas no estavam presentes em todas as estirpes. Alguns fatores de virulncia
esto redundantemente presentes em todas para superar a imunidade do
hospedeiro. Por exemplo, vrias enterotoxinas so variantes nicas em
diferentes estirpes para evitar a deteco por um sistema imunolgico
dinmico do hospedeiro. A grande maioria do viruloma composto dos genes
core (central) e pseudocore (compartilhado pela maioria das cepas). A
presena destes genes interessante a partir do ponto de vista da evoluo
porque implica que S. aureus tem desenvolvido um sistema altamente
conservado para realizar seu ciclo infeccioso. De um ponto de vista aplicado,
esses genes podem representar alvos para inibidores da virulncia ou
estratgias teraputicas baseadas em anticorpos (43).
Para obter insights sobre a diversidade metablica entre cepas de S.
aureus, produzimos 64 GEMs especficos de estirpes e os utilizamos para
simular capacidades de crescimento em diferentes fontes de nutrientes. A
verificao experimental de meios de suporte de crescimento foram
parcialmente confirmadas. concebvel que certos nichos de doenas podem
ativar caminhos biossintticos latentes sob condies, e o fato de que os genes
nestas vias no se desenvolveram em pseudogenes indica que podem ter
relevncia na adaptao de nichos (44).
Uma anlise de agrupamento baseada em fentipos metablicos
calculados distinguem grupos de estirpes uns dos outros. Uma distino que
surgiu foi a identificao do isolado USA300 como o nico com a capacidade de
catabolizar a espermidina devido a presena de espermidina acetiltransferase
codificada por speG. Em humanos, sabe-se que a espermidina potencializa a
morte de queratincitos S. aureus em conjunto com pptidos antimicrobianos
(45) e vrias classes de antibiticos, especialmente -lactamicos (46).
Recentemente, estudos descobriram regies de ACME (incluindo a arginina
regio de arco catablico) em muitas estirpes diferentes, no-USA300 (47,48).
No entanto, a associao do locus speG com o ACME incomum fora de
USA300. Portanto, a aquisio de speG tem provavelmente foi til na rpida
disseminao das cepas USA300. O geme speG foi transferido horizontalmente
de S. epidermis, um colonizador de pele humana (49). Portanto, uma
comparao futura de capacidades metablicas compartilhadas entre as cepas
de S. aureus e S. epidermis pode fornecer mais informaes. Alm disso, o
antibiticos que interferem especificamente com as capacidades especficas da
estirpe tais como os identificados aqui oferecem novas formas de inibir
propagao epidemiolgicos de estirpes particularmente infecciosas.
Os GEMs aqui apresentados abrem as espcies de S. aureus para um
conjunto de mtodos e tcnicas de biologia de sistemas (50). Por exemplo,
usando esses modelos, fcil prever genes essenciais em diferentes condies
(encontramos uma mdia de 190 genes essenciais para as 64 estirpes em
meio LB; Dataset S1). Alm disso, um nico gene tem sido estendido ao estudo
de letalidade e descoberta de antibiticos sinrgicos (51). Em concluso, a
abordagem comparativa multiescala utilizada neste trabalho fornece
percepes sobre a diversidade das espcies de S. aureus. Mtodos histricos
para a classificao de cepas de S. aureus desenvolveram-se desde a digitao
de fagos at abordagens PFGE e MLST (52). Novo tecnologias de
sequenciamento de DNA de alto rendimento e tcnicas de anlise continuaro
a melhorar a nossa capacidade de rastrear e patgenos. Anlise computacional
de GEMs construdos para mltiplos estirpes de uma espcie fornece uma
poderosa ferramenta que pode fornecer informaes sobre os determinantes
metablicos da virulncia, novos biomarcadores capazes de distinguir certas
cepas uma da outro, e descobrir novos alvos farmacolgicos.
MATERIAIS E METODOS
Construindo um conjunto de dados representativo de S. aureus
Species.
As sequncias genmicas para todas as cepas de S. aureus foram
baixadas a partir do site ftp do NCBI (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/). Para
estabelecer a relao filogentica existente entre representantes de S. aureus,
a anlise filogentica conduzido usando um concatamer de um jogo de sete
housekeeping genes (arcC, aroE, glpF, gmk, pta, tpi e yqiL) para construir uma
rvore filogentica (Fig. 1). Mltiplos alinhamentos de sequncia foram
realizado com ClustalW (55). Anlise de mxima verossimilhana (ML) foi
realizado utilizando-se a ferramenta Phyml (56), com um Whelan e Goldman
modelo de substituio de aminocidos. Apoio estatstico foi obtido por
bootstrapping no paramtrico em 100 resampled conjuntos de dados. Um
conjunto de 64 estirpes foram seleccionadas a partir do dendrograma para
criar um conjunto heterogneo de dados em termos de (i) (MRSA, MSSA, VRSA
e VISA), (ii) hospedeiro especificidade (humano vs. animal), (iii) virulncia /
associao ambiental (CA-MRSA, HA-MRSA e LA-MRSA), e (iv) rvore topologia.
Queremos amostrar estirpes de diferentes clusters de a rvore. Portanto, o
conjunto de dados final foi projetado para ser, como possvel, uma
representao imparcial de todo as espcies de S. aureus.
Texto SI
Anlise de genes de S. aureus atpicos. Para investigar o efeito de HGT
Eventos na espcie S. aureus, buscamos genes atpicos
Dentro de cada estirpe por computao da composio de DNA (teor de
GC)
E as diferenas de uso de codes entre genes centrais e pangenes (59).
Um total de 4,277 e 1,788 genes atpicos foram identificados com o
Genoma mdio com 49 e 28 genes nicos presentes com base em
GC contedo e codon bias, respectivamente. A maioria dos
Os genes atpicos no tm nenhuma classe funcional COG conhecida. A
filogentica
Origem de cada gene atpico de S. aureus foi
O nr-banco de dados. Para cada gene o melhor no-S. Aureus hit foi
Tomada como a fonte de transferncia putativa (PTS). Hiptese
Que eventos mais recentes de HGT foram indicados por genes com
menos
S. aureus hits, i.e., aqueles mais semelhantes ao gene de consulta do
que a
PTS. Utilizamos este nmero como um ndice para estimar a
ancestralidade de
Os eventos HGT para cada PTS, uma medida que chamamos de
"ancestralidade
ndice "(AI). S foi possvel encontrar um PTS significativo
Para 25% dos genes atpicos que identificamos. Aqueles PTS com um AI
> 2 corresponderam principalmente a eventos de HGT ocorridos no
gnero
Nvel, enquanto a maioria dos mais recentes PTS (um AI 2)
Correspondeu a eventos de HGT em nveis taxonmicos mais altos
(ordem,
Classe e filo). Neste grupo, encontramos uma alta representatividade
Protenas, tais como protenas hipotticas, protenas de mobilizao,
E genes de resistncia a antibiticos, e factores de virulncia.
Avaliamos o efeito de eventos de HGT na formao da diversidade
Dentro dessa espcie. A anlise de genes atpicos mostrou como esses
So principalmente derivados de dadores taxonmicamente
relacionados (isto ,
Representantes da mesma espcie / gnero), com uma parte menor
De genes provenientes de bactrias associadas ao hospedeiro. Esta
descoberta
Sugere a presena de uma barreira taxonmica que
Quantidade de HGT nesta espcie. Os eventos do HGT podem ser
Fonte de novas resistncias aos antibiticos. Portanto, o
Nmero de genes nicos por genoma pode identificar estirpes mais
Propensos a HGT e, portanto, mais propensos a adquirir novas
funcionalidades.
Como a virulncia e os genes de resistncia aos antibiticos
Envolvidos em eventos de HGT (42, 77), cepas com maior
Genes nicos (e, portanto, mais predispostos troca de
Podem representar uma grande ameaa para a sade pblica,