Tesis. Bacterias y Reduccion de Colorantes.1

INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA
CONTRIBUCIN DE LAS BACTERIAS

METANOGNICAS Y SULFATO REDUCTORAS EN LA
REDUCCIN DE LOS COLORANTES TIPO AZO.
TITULACIN POR TESIS
QUE PARA OBTENER EL TTULO DE
INGENIERO BIOTECNLOGO
PRESENTA
MAGDALENA DEL ROSARIO MENDOZA HERNNDEZ
CD. OBREGN, SONORA. FEBRERO DE 2005

i
DEDICATORIA
A mi familia.
ii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por permitirme el privilegio de la vida, la fuerza, la entereza y los medios

para que me fuera posible alcanzar esta meta..... Gracias.
A mi familia, a quienes dedico este logro, gracias por haber sido mi apoyo,
especialmente a mi mam, y Eduardo, te amo.
A el Dr. Francisco Cervantes Carrillo por haberme apoyado en el desarrollo de

esta empresa, e invitarme a formar parte de uno de sus proyectos de
investigacin.
A todos los colaboradores de los laboratorios de Ecodesarrollo y Anlisis

Especiales, de la unidad centro del Instituto Tecnolgico de Sonora.
A mis amigas: Cris, Oly, Eli, Caro, Shema, gracias por que juntas nos atrevimos a
iniciar esta meta, por que gracias a su apoyo y las vivencias juntas, esta ser una
etapa inolvidable de nuestras vidas.
A todas aquellas personas que de una u otra forma tuvieron que ver con la
realizacin de este trabajo, gracias.
Finalmente, gracias a mis maestros por haberme enseado lo valioso de los

conocimientos cientficos y su aplicacin.
iii
RESUMEN
La industria textil es un rubro de la economa mundial de gran peso; en Mxico ha

resultado una rama industrial en constante desarrollo. Durante el proceso de
teido de las fibras textiles se emplean colorantes sintticos; los ms empleados
en la actualidad son los colorantes tipo azo, cuyo impacto en el ambiente ya se ha
demostrado en estudios previamente realizados. Como consecuencia a esto se
han propuesto diversos mtodos para la eliminacin de los colorantes tipo azo de
los efluentes textiles, y disminuir su impacto al medio; el mtodo biolgico ha dado
mejores resultados, de stos, los consorcios microbianos anaerobios han
demostrado una eficiencia considerable, que lo denotan como viable para este fin.
Los grupos trficos presentes en los consorcios microbianos anaerobios son muy
variados, entre ellos destacan los microorganismos metanognicos y los sulfato
reductores. El objetivo de este trabajo fue determinar la contribucin de ambos
grupos trficos en la reduccin de colorantes tipo azo, empleando como sustratos
cido actico, hidrgeno, cido propinico y metanol. Los resultados que se
obtuvieron muestran que las bacterias sulfato reductoras tienen un mayor efecto
en esta reaccin, con actico, hidrgeno y propinico; mientras que el metanol
result un sustrato poco apropiado para la azo reduccin. Se encontr que existe
una correlacin entre la reduccin del enlace azo y la presencia del inhibidor BES,
lo cual concuerda con estudios previos.
iv
NDICE
I. Captulo 1. Introduccin ................................................................................. 1

Introduccin ....................................................................................................... 1
1.1 Justificacin .............................................................................................. 2
1.2 Planteamiento del problema ..................................................................... 3
1.3 Objetivos .................................................................................................. 3
1.3.1 Objetivo general ............................................................................... 3
1.3.2 Objetivos especficos ....................................................................... 4
1.4 Hiptesis ................................................................................................... 4
II. Captulo 2. Marco Terico ............................................................................. 5
2.1 Generalidades .......................................................................................... 5
2.2 Historia y clasificacin de los colorantes .................................................. 6
2.2.1 Historia ............................................................................................. 6
2.2.2 Clasificacin de los colorantes ......................................................... 7
2.2.3 Mecanismo de fijacin de los colorantes ......................................... 9
2.3 Impacto de los colorantes tipo azo .......................................................... 9
2.3.1 Impacto de los colorantes azo en la salud ....................................... 9
2.3.2 Impacto ambiental de los colorantes azo ......................................... 10
2.4 Origen de los efluentes textiles ................................................................ 10
2.5 Mtodos para la decoloracin de efluentes textiles ................................. 13
2.5.1 Eliminacin no biolgica del color .................................................... 13
2.5.2 Eliminacin biolgica de colorantes tipo azo ................................... 13
2.5.2.1 Reduccin de colorantes azo por microorganismos aerobios .. 15
2.5.2.2 Reduccin de colorantes azo por microorganismos anaerobios 15
2.5.2.2.1 Reduccin de colorantes azo por consorcios microbianos
v
anaerobios ........................................................................................ 18
2.5.2.2.2 Metanognesis ..................................................................... 18
2.5.2.2.3 Sulfatoreduccin ................................................................... 21
III. Captulo 3. Metodologa ............................................................................... 25
3.1 Lugar de experimentacin ........................................................................ 25
3.2 Inculo ...................................................................................................... 25
3.2.1 Origen ............................................................................................... 25
3.2.2 Sustrato ........................................................................................... 26
3.2.3 Medio basal ..................................................................................... 26
3.2.4 Tiempo de residencia hidrulica ...................................................... 27
3.2.5 Otras caractersticas del consorcio microbiano .............................. 27
3.2.6 Tipo de reactor ............................................................................... 28
3.2.7 Eficiencia del birreactor ................................................................... 29
3.3 Tratamientos ............................................................................................ 29
3.3.1 Materiales ......................................................................................... 29
3.3.2 Medio basal para ensayos ............................................................... 29
3.3.3 Sustratos empleados ........................................................................ 30
3.3.4 Inhibidores ........................................................................................ 31
3.4 Tipo de colorante ...................................................................................... 31
3.5 Bioensayos ............................................................................................... 32
3.6 Mtodos analticos ................................................................................... 33
3.6.1 Medicin del color ........................................................................... 33
3.6.2 Metano ............................................................................................ 33
3.6.3 Sulfato ............................................................................................. 34
IV. Captulo 4. Resultados y discusin .............................................................. 36
Conclusiones y recomendaciones ..................................................................... 43
Referencias bibliogrficas ................................................................................. 44
vi
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Ventajas y desventajas de procesos de decoloracin no biolgica

aplicados a efluentes textiles ........................................................................ 14
Tabla 2. Estequiometra de la degradacin anaerbica de propionato,

acetato, metano, e hidrgeno ...................................................................... 24
Tabla 3. Equivalencias en base a demanda qumica de oxgeno (DQO) .... 31
Tabla 4. Distribucin de los componentes de cada bioensayo .................... 32
Tabla 5. Porcentajes de decoloracin, medias y desviacin estndar

despus de 71 horas, para el sustrato cido actico .................................. 37
Tabla 6. Porcentajes de decoloracin obtenidos a las 42 horas de

incubacin, con una mezcla de H2/CO2, como sustrato .............................. 39
Tabla 7. Porcentajes de decoloracin, medias y desviaciones estndar,

empleando cido propinico como sustrato a las 66 horas de incubacin . 40
Tabla 8. Porcentajes de decoloracin, medias y desviaciones estndar

obtenidos a las 96 horas de incubacin, con metanol como sustrato ......... 42
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura qumica de algunos colorantes tipo azo ................... 8
Figura 2. Operaciones involucradas en la industria textil algodonera, y los

contaminantes generados en cada etapa .................................................... 12
Figura 3. Reduccin de colorantes azo .................................................. 17
Figura 4. Conversin de materia orgnica en reactores anaerobios

metanognicos ............................................................................................. 19
Figura 5. Ciclo de oxidacin del carbono .................................................. 20
Figura 6. Ciclo del azufre ........................................................................ 21
Figura 7. Competicin por sustratos entre bacterias sulfato-reductoras y

metanognicas o acetognicas ................................................................... 23
Figura 8. Esquema del biorreactor empleado para la reactivacin del lodo

empleado para los Bioensayos ....................................................... 28
I. CAPTULO 1
INTRODUCCIN
La industria textil, a escala mundial, es una de las empresas con mayor

crecimiento. En Mxico esta industria se ha desarrollado a pasos acelerados.
Actualmente, en Cd. Obregn y sus alrededores existen alrededor de 9 plantas
textiles que emplean colorantes textiles tipo azo.
La importancia del estudio de los colorantes tipo azo reside en se emplean

ampliamente en la industria textil, a pesar de que tienen una considerable
persistencia en el medio. Adems, son txicos y sus derivados son mutagnicos y
cancergenos.
Recientemente se han efectuado estudios (Dos santos et al., 2004; Dos Santos et
al., 2004(B); Van der Zee, 2002) donde se ha encontrado que los tratamientos
anaerbicos son capaces de degradar colorantes tipo azo con bajos costos, y
pequeos espacios para su operacin; de ah que se presente el tratamiento
anaerbico como una alternativa viable para la degradacin de los colorantes tipo
azo.
A pesar de lo anterior, la informacin con la que se cuenta acerca de la cintica

de la reduccin de los colorantes tipo azo; empleando lodos activados como
tratamiento biolgico para su eliminacin, no ha sido elucidado completamente. De
tal manera que la contribucin de las bacterias sulfato reductoras y metanognicas
2
an es desconocida, acentuando la necesidad de investigaciones que generen

estos datos con el fin de disear plantas de tratamiento anaerobio con mayor
eficiencia.
1.1 JUSTIFICACIN
La informacin que existe actualmente acerca de los mecanismos por los que se
rige la reduccin de los colorantes tipo azo, por medio de consorcios anaerobios
en un sistema de tratamiento de aguas residuales es escasa, lo cual ha impedido
la consolidacin de los mismos como alternativa de tratamiento.
El presente trabajo pretende aportar informacin relacionada con la contribucin

de las bacterias sulfato reductoras y metanognicas, presentes en un consorcio
anaerobio obtenido a partir de una planta tratadora de aguas residuales de la
regin, con el fin de determinar el mecanismo mediante el cual se efecta la
reduccin de colorantes, por efecto de un tratamiento biolgico empleando
sistemas anaerobios.
La informacin recabada durante el presente trabajo podr ser de utilidad para

elucidar los mecanismos de reduccin de los colorantes azo y producir lodos
granulares que se adapten mejor a las condiciones de los efluentes textiles, para
su tratamiento.
3
1.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los efluentes de las industrias textiles presentan en su composicin colorantes de

carcter recalcitrante, por lo que constituyen un riesgo para el equilibrio del medio
ambiente y todos sus elementos. Adems, como resultado de la falta de
informacin, los mtodos de tratamiento para estos efluentes an no han sido
adecuadamente diseados, debido a la carencia de conocimientos suficientes
respecto a los mecanismos mediante los cuales se desarrolla la reduccin de los
colorantes tipo azo. De ah la necesidad de generar informacin que contribuya al
esclarecimiento de los mecanismos mediante los cuales se lleva a cabo dicho
fenmeno. Un mejor entendimiento del papel que juega cada uno de los grupos
trficos que conforman los consorcios de los sistemas anaerobios, permitir
establecer mejores estrategias para optimizar la restauracin de cuerpos de agua
contaminados con efluentes textiles.
1.3 OBJETIVOS
Objetivo general.
Determinar la contribucin de los microorganismos metanognicos y sulfato

reductores, presentes en un consorcio microbiano bajo condiciones anaerobias, en
la reduccin de colorantes tipo azo.
4
Objetivos especficos
Bloquear el metabolismo de las bacterias metanognicas, con el fin de

observar el papel de las bacterias sulfato reductoras, y viceversa, en la
reduccin de los colorantes.
Identificar el grupo de microorganismos que presenta una contribucin ms

notable en dicha reduccin.
Constatar el tipo de microorganismos que se desarrollen en los

experimentos, basados en el metabolismo que presentan; as, en el caso
de las bacterias metanognicas se medir la formacin de metano, y en el
caso de las bacterias sulfato reductoras se determinar la reduccin del
sulfato.
1.4 HIPTESIS
Las bacterias sulfato reductoras tendrn un impacto positivo en la reduccin de los

colorantes tipo azo debido a la presencia de sulfato en el medio.
5
II. CAPTULO 2
MARCO TERICO
2.1 GENERALIDADES
En cualquier sitio del mundo las sociedades generan residuos; las cantidades y
las caractersticas de stos dependen del proceso que los genere. As, el hombre
se ha visto en la necesidad de disear procesos de tratamiento enfocados al reuso
de los contaminantes, a la recuperacin de la energa potencial en ellos, y el reuso
del agua, principalmente (Lettinga et al., 1998).
Existen diversos mtodos para el tratamiento de residuos; mismos que se

clasifican principalmente en tres grupos: fsicos, qumicos, y biolgicos. La
instalacin y el equipo necesario para los dos primeros grupos generalmente
resulta muy costoso. Los tratamientos biolgicos, en cambio, presentan otros
inconvenientes como la alta susceptibilidad a sustancias txicas, y los diversos
requerimientos metablicos.
El tratamiento biolgico anaerobio, en especial, presenta notables ventajas: bajo

consumo de energa; bajo rendimiento de biomasa; la generacin de metano, que
puede ser empleado como fuente de energa; las instalaciones de los equipos son
generalmente de menor tamao comparado con los aerobios; adems pueden ser
alimentados por efecto de la gravedad, por mencionar algunos (Lettinga et al.,
6
1998). Los mtodos biolgicos anaerobios han recibido mucha atencin en los
ltimos aos, sobretodo debido a que por medio de stos mtodos pueden ser
tratados diversos residuos y efluentes que se caracterizan por una difcil
degradacin; tal es el caso de los efluentes textiles, ricos en colorantes tipo azo,
objeto de esta investigacin.
2.2. HISTORIA Y CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES
2.2.1 HISTORIA
El hombre, desde sus inicios ha buscado dar vida a su entorno colorendolo. El

vestigio ms antiguo del empleo de colorantes se remonta a la antigua China y se
cree que es del ao 2600 aC. Los primeros colorantes que el hombre manipul
provenan de fuentes naturales vegetales o animales. No fue hasta en 1856 que
inici la sntesis de colorantes, cuando el ingls William Henry Perry obtuvo
accidentalmente la anilina prpura y descubri que presentaba excelentes
propiedades colorantes (Welham, 2002). A partir de esta fecha inici toda una
industria qumica que ha continuado su evolucin hasta la actualidad; segn
Zollinger, en el ao 1987 se producan 109 Kg de colorantes anualmente,
alrededor del mundo.
7
2.2.2 CLASIFICACIN DE LOS COLORANTES
Los colorantes son compuestos aromticos que presentan la cualidad de absorber

energa electromagntica en el rango visible ( 350 700 nm ). Presentan en su
estructura grupos cromforos que se caracterizan por tener un sistema de
electrones deslocalizados con dobles enlaces conjugados; y grupos auxocromo,
cuyos sustituyentes se caracterizan por la capacidad de donar electrones. Los
grupos cromforos ms comunes son: azo (-N=N-), carbonilo (-C=0), -CH=, nitro (-
N02), y quinonas. Los auxocromos ms importantes son los grupos amino (-NH2),
carboxilo (-C00H), sulfonato (-SO3H), e hidroxilo (-0H) (Van der Zee, 2002).
Los colorantes pueden clasificarse con base al color, la estructura qumica, y el

mtodo para la aplicacin del color (ndice de color). Este ltimo fue editado en
1924 por la Sociedad de Colorantes y Pinturas y la Asociacin de Qumicos
Textiles y Colorantes, mismo que es actualizado cada 3 meses. Este compendio
enlista cerca de 28 000 colorantes comerciales. Basndose en el ndice de color,
los colorantes se clasifican en 15 clases de aplicacin: cidos, reactivos,
complejos metlicos, directos, bsicos, mordientes, dispersos, solventes,
fluorescentes, sulfuros, aninicos, a la tina, pigmentos y otros (Van der Zee, 2002).
El 70% de los colorantes que se producen comercialmente est representado por

colorantes tipo azo (Zollinger, 1987), ste grupo de colorantes se caracteriza por
ser reactivos, y formar enlaces covalentes entre los grupos OH, NH- o SH-, y las
fibras de algodn, lana, seda y nylon. Estos colorantes son empleados sobretodo
para producir coloraciones amarillas, naranja y rojas (Christie, 2001). En la figura 1
se muestra la estructura de algunos colorantes tipo azo.
8
O OH
S
Cl
O NH 2
HO N N
O
S HO
O N
HO
N
Cl
N N
N N
O S O
NH HO O
Cl
N O Na
Naranja reactivo 14 Rojo cido 266
Na O O
O O
S S Na O
O O
+
N
-
O O
NH OH N N O
S
Na
O N
O
N
HN
N N O
O
S Na OH
Cl
NH
N O
HO O
Rojo reactivo 4 Naranja mordiente 1

Na
O
O
S O
HO OH
O
O
HO OH
N N S
O
O
H2N
Na S N N
O
O
Naranja cido 7 Amarillo mordiente 10

O Na
O
S
N N N N
O
HO
OH
O S O
O
Na
Amarillo directo 4
Figura 1. Estructura qumica de algunos colorantes tipo azo (Van der Zee, 2002).
9
La capacidad de los colorantes para adherirse a las fibras estar en funcin del
tipo de colorante que se emplee, al igual que de sus caractersticas fsicas y
qumicas.
2.2.3 MECANISMO DE FIJACIN DE LOS COLORANTES
Las fibras adsorben el color como resultado de las interacciones que forman con
los grupos reactivos de los colorantes, formando puentes de hidrgeno,
interacciones de tipo Van der Waals e interacciones hidrofbicas, mismas que
estn en funcin de las caractersticas del colorante y de las fibras (Zollinger,
1987). La eficiencia de la fijacin vara de acuerdo al tipo de colorante, y oscila
alrededor de un 98% para colorantes bsicos y un 50% para los colorantes
reactivos (ONeill et al., 1999).
2.3 IMPACTO DE LOS COLORANTES TIPO AZO.
2.3.1 IMPACTO DE LOS COLORANTES AZO EN LA SALUD
Los colorantes tipo azo no solo son utilizados en la industria textil; tambin son
empleados en la industria farmacutica, as como en la fabricacin de alimentos y
cosmticos. Muchos de los colorantes puestos en el mercado han sido ligados a
10
diversas patologas carcinognicas en humanos (ONeill et al., 1999; Collier et al.,

1993; Dillon et al., 1994; Kaur et al., 1993; Levine, 1991; Rafii et al., 1990).
Despus de la ingestin de un colorante tipo azo, ste es reducido, de tal manera

que el enlace azo se rompe, liberando aminas aromticas que resultan txicas
para los mamferos. La azoreduccin en mamferos es catalizada por enzimas
hepticas y por bacterias con actividad azoreductasa en el tracto intestinal (Martn
y Kennelly, 1981).
2.3.2 IMPACTO AMBIENTAL DE LOS COLORANTES AZO
Los efluentes textiles provocan efectos indeseables en el medio ambiente, como

las coloraciones no deseadas y la bioacumulacin en los ecosistemas que afectan.
Lo anterior es resultado de la difcil degradacin de los colorantes azo debido a su
naturaleza txica, carcinognica y recalcitrante (Van der Zee, 2002).
En la actualidad, las industrias textiles representan un rubro importante en la

economa mundial, lo cual se refleja en la creciente cantidad de efluentes
generados y que, debido a la lenta degradacin natural de stos, se han
acumulado en el medio. Lo anterior ha provocado la contaminacin de lagos, ros
y la bioacumulacin de estos compuestos txicos en peces y plantas (Van der
Zee, 2002).
11
2.4 ORIGEN DE LOS EFLUENTES TEXTILES
Los efluentes textiles se caracterizan por la extrema variacin que presentan en

varios parmetros, como: demanda qumica de oxgeno (DQO), demanda
bioqumica de oxgeno (DBO), pH, concentracin de colorante, salinidad,
temperatura, etc. Todo lo anterior en funcin del tipo de colorante, del proceso y
de las sustancias qumicas empleadas durante el proceso hmedo y seco de
teido (Talarposhti et al., 2001).
En la figura 2 se presentan las operaciones que involucra el proceso de tincin de

las telas en la industria textil.
A continuacin se describen las etapas mencionadas en el prrafo anterior: etapa

preparatoria de la tela para fortalecerla (sizing), donde se adiciona almidn,
alcohol de polivinilo (PVA) y carboximetil celulosa, con el fin de proporcionar
fuerza a las fibras; etapa post-preparatoria (desizing), para eliminar los agentes
empleados en la etapa anterior; lavado, consiste en eliminar impurezas de las
fibras, empleando soluciones alcalinas para separar aceites naturales, grasas,
ceras y surfactantes; blanqueo, busca eliminar colores indeseables presentes en
las fibras, para ello se emplean sustancias qumicas como el hipoclorito y el
perxido de hidrgeno; tratamiento con hidrxido de sodio (mercerizing), para
incrementar la fuerza, el lustre y la afinidad del colorante, es un proceso qumico
continuo cuya finalidad es incrementar la capacidad de las fibras para adsorber los
colorantes; teido, en esta etapa se adicionan los colorantes, esta operacin
requiere grandes cantidades agua, no solo para la tina de color, sino tambin para
el paso posterior de lavado. Dependiendo del proceso pueden ser aadidas otras
sustancias como formaldehdo, sales, surfactantes y metales (Dos Santos et al.,
2004(B)).
12
Etapa preparatoria de
las fibras
Agentes
Etapa post- fortalecedores,
preparatoria enzimas, almidn,
ceras, amonio.
Desinfectantes e
insecticidas, NaOH,
jabn, surfactantes,
grasas, almidones, Lavado /
pectinas, aceite, limpieza
agentes
antiestticos y
solventes.
Agua, halgenos
Blanqueado orgnicos absorbibles,
silicato de sodio o
estabilizantes orgnicos.
NaOH y otras
sales. Tratamiento
alcalino
Colorantes, metales,
Teido sales, surfactantes,
sulfuro, formaldehdo.
Lavado
Fin
Figura 2. Operaciones involucradas en la industria textil algodonera, y los

contaminantes generados en cada etapa (Adaptado de EPA, 1997; Mattioli et al.,
2002).
13
2.5 MTODOS PARA LA DECOLORACIN DE EFLUENTES TEXTILES
2.5.1 ELIMINACIN NO BIOLGICA DEL COLOR
Los mtodos no biolgicos para el tratamiento de efluentes textiles pueden

clasificarse en tres grupos: fsicos, qumicos, y fisicoqumicos. Cada tratamiento ha
emplear se elegir en base al tipo de colorante que contenga el efluente y su
composicin, principalmente (Van der Zee, 2002). En la tabla 1 se muestran
algunos de los procesos fsicos, fisicoqumicos y qumicos para el tratamiento de
efluentes textiles.
2.5.2 ELIMINACIN BIOLGICA DE COLORANTES TIPO AZO
Estas tcnicas se basan en la biotransformacin microbiolgica de los colorantes;

sin embargo, debido a que estos son compuestos estables y de larga vida, su
degradacin se torna en un proceso complejo (Van der Zee, 2002).
14
Tabla 1. ventajas y desventajas de algunos procesos de decoloracin no biolgica

aplicados a efluentes textiles (Robinson et al., 2001; Dos Santos et al., 2004 (B)).
Mtodo Descripcin Ventajas Desventajas

Procesos de Se emplean sustancias oxidantes Decoloracin de Generacin de
oxidacin como perxido de hidrgeno y colorantes solubles lodos.
avanzada. fierro (reaccin de Fenton). e insolubles
Ozonizacin Oxidacin que se efecta Se aplica en forma Vida media corta
empleando gas ozono. gaseosa, no altera (20 min.).
el volumen.
Fotoqumico Reaccin de oxidacin que emplea No hay produccin Formacin de
conjuntamente perxido de de lodos. subproductos
hidrgeno y rayos ultravioleta. indeseados.
Oxidacin con Reaccin de oxidacin empleando Inicia y acelera la Produccin de
hipoclorito de Cl- para atacar el grupo amino. ruptura del enlace aminas
sodio azo. aromticas.
Destruccin Reaccin de oxidacin que emplea Degrada Altos costos de
electro- electricidad (electrlisis). compuestos no electricidad.
qumica. peligrosos.
Carbn Remocin por adsorcin fsica. Buena remocin Es costoso.
activado. de colorantes.
Filtracin con Separacin fsica del colorante. Remocin de todo Produccin de
membrana. tipo de colorantes. lodos
concentrados.
Intercambio Se emplean resinas de Las resinas No es efectiva
inico. intercambio inico. pueden ser para todos los
regeneradas. tipos de
colorantes.
Coagulacin Se emplean sulfato ferroso y Factible Elevada
electro-cintica. cloruro frrico. econmicamente. produccin de
lodos.
Coagulacin / Emplean agentes coagulantes, Elimina gran Generacin de
floculacin. (polmeros y sales de aluminio), variedad de lodos
que forman flculos y precipitan. colorantes. concentrados.
15
2.5.2.1 Reduccin de colorantes azo por microorganismos aerobios.
Bacterias. Se ha demostrado que las bacterias aerobias con un sistema

enzimtico de azoreductasas, son capaces de llevar a cabo la degradacin de
colorantes azo (Van der Zee, 2002).
Debido a que la mayora de los colorantes son aromticos y contienen grupos nitro
y sulfnico, son recalcitrantes para la mayora de las bacterias aerobias (Claus et
al., 2002). Por lo tanto, se impide el ataque de las enzimas oxigenasas al enlace
azo (Fewson, 1988), mismas que catalizan la incorporacin de oxgeno al anillo
aromtico de compuestos orgnicos, provocando la ruptura del anillo de los
compuestos aromticos (Madigan et al., 2003).
Hongos. La capacidad de los hongos para reducir los colorantes azo se debe a la
produccin de exoenzimas como las peroxidasas y las fenoloxidasas, que son
capaces de reducir compuestos fenlicos y aromticos (Duran et al., 2002). Otras
enzimas que presentan un mecanismo similar al anterior son las lignina y
manganeso peroxidasas, cuya reaccin involucra 2 transferencias sucesivas de
electrones, donde los sustratos, como los colorantes azo, reducen las enzimas a
su estado original (Stolz et al., 2001).
2.5.2.2 Reduccin de colorantes azo por microorganismos anaerobios.
Los microorganismos anaerobios mantienen condiciones de potencial redox bajas

(<- 50 mV), lo cual permite la generacin de los intermediarios reducidos
necesarios para la azoreduccin (Beidylli et al., 1998).
16
La decoloracin anaerbica de colorantes azo es una reaccin de reduccin que

rompe los enlaces azo; el resultado de lo anterior son aminas aromticas; mismas
que carecen de color, por lo que la azo reduccin, es equivalente a la azo
decoloracin, en condiciones anaerbicas (Van der Zee, 2002). La ruptura del
enlace azo involucra la transferencia de cuatro electrones en 2 etapas sucesivas,
en cada etapa se transfieren dos electrones hacia el colorante azo, que acta
como aceptor final de electrones (Dos Santos et al., 2004(A)).
( R1-N=N-R2) + 2e- + 2H+ R1-HN-NH-R2 (intermediario hidroazo)
( R1-HN-NH-R2 ) + 2e- + 2H+ R1-NH2 + R2-NH2 (ruptura del enlace azo)
El mecanismo exacto de esta reaccin, an no ha sido elucidado por completo,

pero se ha supuesto la intervencin de acarreadores de electrones como las
flavinas, que pueden actuar como acarreadores de electrones de flavoprotenas
dependientes de NADPH, hacia los colorantes azo, como aceptores de electrones
(Gingell y Walker, 1971).
La reduccin anaerbica de colorantes azo comprende mecanismos diferentes,

pueden distinguirse entre azoreduccin directa e indirecta. La azoreduccin directa
implica la transferencia enzimtica de equivalentes reducidos originados de la
oxidacin de sustratos orgnicos hacia los colorantes azo. Las enzimas que
intervienen en ste proceso no necesariamente son especficas (Van der Zee,
2002). Ver figura 3.
En la azoreduccin biolgica indirecta intervienen transportadores de electrones,

que pueden ser cofactores reducidos como: NADH, NAPH, FMNH2 Y FADH2, que
actan como donadores de electrones secundarios, transfiriendo los electrones
hacia el colorante azo (Gingell y Walker, 1971).
17
DE Red. Colorante DE Red. MR Ox. Colorante

B azo B azo
DE Ox. Aminas Aminas
Aromticas DE Ox. MR Red. aromticas
Reduccin directa Reduccin biolgica indirecta
H2S Colorante
azo
Aminas
S0 aromticas
Reduccin Qumica directa
Figura 3. Reduccin de colorantes azo (Van der Zee, 2002). DE Ox.= Donador de
electrones oxidado. DE Red.= Donador de electrones reducido. MR Ox. = Mediador redox
oxidado. MR Red. = Mediador redox reducido.
La azo reduccin qumica puede efectuarse adicionando diversos agentes

reductores a los efluentes; adems, puede ser el resultado de la intervencin de
reductores biognicos como el sulfuro como lo report Van der Zee (2002).
Los efluentes textiles generalmente contienen sulfato en concentraciones

variables; su presencia en estos, se debe a su empleo como aditivo en el proceso
de teido, o que se forme por oxidacin de otros compuesto de azufre, como el
sulfuro, hidrosulfuro o ditionita; tambin, puede generarse como resultado de la
neutralizacin de efluentes alcalinos con cido sulfrico (Van der Zee, 2002). Se
ha encontrado que el sulfuro se genera en biorreactores anaerobios durante el
tratamiento de efluentes, por las bacterias sulfato reductoras, lo cual destaca la
posibilidad de la reduccin qumica se torne en una reaccin secundaria de
decoloracin(Van der Zee, 2002).
18
2.5.2.2.1 Reduccin de colorantes azo por consorcios microbianos anaerobios.
Es poco lo que se conoce acerca de la azoreduccin efectuada por consorcios

microbianos encontrados comnmente en plantas de tratamiento de aguas
residuales. Sin embargo, se ha demostrado la aplicabilidad en reactores
anaerobios de stos para la reduccin de colorantes azo (Dos Santos et al., 2004
(A); Dos Santos et al., 2004(B); Cervantes et al., 2001). En al figura 4 se muestran
las reacciones que intervienen en la conversin de materia orgnica compleja en
reactores anaerobios.
2.5.2.2.2 Metanognesis.
El metano es producido por la accin de las arqueobacterias metanognicas que

se desarrollan en ambientes anxicos. Los sustratos empleados para la
metanognesis se clasifican en tres grupos generales: los sustratos
monocarbonados, como el dixido de carbono; los sustratos metlicos, como el
metanol; y los sustratos acetotrficos, como el acetato (Madigan et al., 2003).
Los estudios sobre metanognesis han demostrado que la produccin biolgica de

metano tiene lugar a travs de una serie exclusiva de reacciones en las que
intervienen coenzimas especificas y de alta complejidad; estas coenzimas se
clasifican como las que transportan la unidad de C1 (molcula de dixido de
carbono que se introduce al ciclo) desde el sustrato inicial, CO2, hasta el producto
final, metano; y las coenzimas que en la reaccin redox suministran los electrones
necesarios para la reduccin de CO2 a metano.
19
Polmeros complejos.
Protenas Carbohidratos Lpidos
Hidrlisis
Azcares reductores. cidos grasos de cadena corta
Acidognesis
Productos intermedios (butirato, propionato, etc)
Acetognesis H2/ CO2
Homoacetognesis
Acetato
Metanognesis
hidrogenotrfica
Metanognesis Metanognesis
Acetoclstica
CH4 / CO2
Sulfato reduccin
H2S / CO2
Figura 4. Conversin de materia orgnica compleja en reactores anaerobios

metanognicos (Dos Santos et al., 2004 (A); Gujen y Zehnder, 1983).
20
En la figura 5 se muestra el ciclo de oxidacin del carbono, en el se observa la

intervencin de organismo metanognicos.
El ciclo de C1 involucra 6 cofactores especficos: Metilfurano, es el primer

transportador de CO2; tetrahidrometanopterina (H4MPT), es el siguiente cofactor a
travs del cual el C1 pierde una molcula de agua y sufre dos reducciones;
coenzima M (cido 2-mercaptoetanosulfnico), es el sustrato para la ltima
reaccin de reduccin que emplea como enzima la metil reductasa, esta reaccin
est catalizada por un sistema multienzimtico: Metil coenzima M-reductasa, con
sus componentes A y B, coenzima FAD, coenzima F420 y F430. (Rodrguez et al.,
1993, Thauer, 1998). En base a la bioqumica de este ciclo para la reduccin de
CO2, se han encontrado compuestos que actan como inhibidores, tal es el caso
de el cido 2- bromoetanosulfnico, cuya inhibicin se basa en la estructura de la
metil coenzima M (Thauer, 1998).
Compuestos orgnicos
Aerobio
CH4 CO2
Anaerobio
Metangenos Homoacetognicos
Compuestos orgnicos
Figura 5. Ciclo de oxidacin- reduccin del carbono (Adaptado de Madigan, et al.,

2003).
21
2.2.2.3 Sulfatoreduccin.
Muchas bacterias y arqueobacterias son capaces de efectuar la reduccin

desasimilativa del sulfato, son un grupo de microorganismos metablicamente
verstiles. En base a la capacidad oxidativa las bacterias sulfato reductoras
pueden clasificarse en dos grupos: las que oxidan compuestos orgnicos
completamente hasta CO2; y las que efectan una oxidacin incompleta, donde el
acetato es usualmente el producto final. Los donadores de electrones mas
utilizados por estos microorganismos incluyen cidos orgnicos, cidos grasos,
alcoholes e hidrgeno (Van Houten, 1996). En la figura 6 se muestra el ciclo del
azufre, en l se pueden observar las posibles intervenciones de bacterias
sulfatoreductoras.
Compuestos orgnicos
azufrados.
Procesos de mineralizacin
SO4 S-2
Oxidacin anaerobia por bacterias fototrficas Oxidacin espontnea

Oxidacin biolgica con O2 o NO3- Sulfato reduccin desasimilatoria
Reduccin desasimilatoria de azufre
Figura 6. Ciclo del azufre (Robertson y Kuenen, 1992).

22
Cabe mencionar que se ha encontrado que el molibdato de sodio tiene la

capacidad para inhibir la sulfato reduccin (Lovley et al., 1994 (A)). Esto se debe a
que el molibdato posee una estructura muy parecida a la del sulfato, de esta
manera, es un inhibidor competitivo de la ATP sulfurilasa, enzima que convierte el
sulfato con ATP a adenosin- fosfosulfato (APS) y pirofosfato; debido a lo anterior,
la cantidad requerida para inhibir la sulfato reduccin ser dependiente de la
concentracin de sulfato en el medio. El molibdato es un inhibidor de la sulfato
reduccin, no as del metabolismo fermentativo de este grupo de
microorganismos.
Competencia entre Metangenos y sulfatoreductores en biorreactores anaerobios.

Esta competencia (ver figura 7) es influenciada por muchos factores, tales como:
la cintica de crecimiento de los microorganismos, la termodinmica de las
reacciones metablicas de su metabolismo, las propiedades de inmovilizacin (Isa
et al., 1986), las limitaciones de sustrato (Liu y Fang, 1998), las condiciones
ambientales, la disociacin del sulfuro; la temperatura y el pH. Obviamente
tambin estar influenciada por la composicin de los lodos.
La termodinmica de las reacciones metablicas efectuadas por los

microorganismos pueden emplearse para predecir los resultados de esta
competencia con sustratos comunes e intermediarios de la materia orgnica
oxidada. Ver tabla 2.
Resultados de investigaciones previas (Colleran et al., 1995) han demostrado que

cuando el sulfato se adiciona en exceso, el propionato y el butirato son
degradados ms rpidamente por bacterias sulfatoreductoras que por otros
consorcios sintrficos.
23
Materia orgnica compleja
Hidrlisis / Fermentacin
cidos grasos (>C2)
Acetognesis
H2/CO2 Acetato
Sulfato
Metanognesis reduccin
CH4 + CO2
Sulfato reduccin Sulfato reduccin
H2S + CO2
Figura 7. Competicin por sustratos entre bacterias sulfato-reductoras y

metanognicas o acetognicas (Van Houten, 1996).
24
Tabla 2. Estequiometra de la degradacin anaerbica de propionato, acetato,

metano e hidrgeno; por bacterias sulfatoreductoras y metanognicas ( Thauer, et
al., 1977).
Reaccin G
Propionato
CH3CH2COOH- + 3H2O CH3COO- +HCO3- + H+ +3H2 + 76.1
- -2 - - -+ +
CH3CH2COOH + .75 SO4 CH3COO +HCO3 +.75HS .25H - 37.7
Acetato
CH3COO- + H2O CH4 + HCO3- - 31.0
CH3COO- + SO4-2 HS- + 2HCO3- - 47.6
Metanol
4CH3OH 3CH4 + HCO3- + H+ + H2O - 313.0
4CH3OH +3 SO4-2 4HCO3- + 3HS- + 4H2O + H+ - 362.0
4CH3OH + 2 HCO3- 3 CH3COO- + H+ + 4 H2O -220.0
Hidrgeno
4H2 + HCO3- + H+ CH4 + 3H2O - 136.0
4H2 + SO4-2 + H+ HS- + 4H2O - 151.9
25
III. CAPTULO 3
METODOLOGA
3.1 LUGAR DE EXPERIMENTACIN
La presente investigacin se realiz en Los laboratorios de Ecodesadorrollo y de

anlisis especiales de la Direccin de Recursos Naturales del Instituto Tecnolgico
de Sonora, Unidad centro.
3.2 INCULO
3.2.1 ORIGEN
El lodo granular empleado durante el desarrollo de esta investigacin provino de

un digestor anaerobio de la planta de tratamiento de aguas residuales de la
Cervecera Modelo del Noroeste, ubicada en la zona industrial 2 de Ciudad
Obregn, Sonora.
Durante su almacenamiento, el lodo se mantuvo en refrigeracin, y

posteriormente, cuando fue necesario se reactiv colocndolo en un biorreactor
26
anaerobio, bajo condiciones que sern descritas en las secciones 3.2.2, 3.2.3 y
3.2.4.
3.2.2 SUSTRATO
Para la reactivacin del consorcio microbiano se emple un medio basal

enriquecido con glucosa a una concentracin de 2 g/l de demanda qumica de
oxgeno (DQO).
3.2.3 MEDIO BASAL
El medio basal empleado para activar el inculo se prepar en base a la siguiente

formulacin, macronutrientes: NH4Cl, 280 mg/l; K2HPO4, 250 mg/l; MgSO47H2O,
100 mg/l; CaCl22H2O, 10 mg/l. Los micronutrientes se adicionaron al medio en
una proporcin de 1 ml/l de una solucin concentrada preparada de la siguiente
manera: FeCl24H2O, 2000 mg/l; H3BO3, 50 mg/l; ZnCl2,50 mg/l; CuCl22H2O, 38
mg/l; Na2SeO5H2O, 162 mg/l; MnCl24H2O, 500 mg/l; (NH4)6Mo7O47H2O, 50
mg/l; AlCl36H2O, 90 mg/l; CoCl26H2O, 2000 mg/l; NiCl26H2O, 92 mg/l; EDTA
(sal dipotsica de cido etilendiamino tetractico) , 1000 mg/l; y 1 ml/l de HCl
(36%).
Se adicionaron adems, 5 g/l de bicarbonato de sodio, como sistema de

amortiguamiento para ajustar el pH a 7.00 0.2, empleando HCl concentrado y
NaOH 10M.
27
3.2.4 TIEMPO DE RESIDENCIA HIDRULICA
El tiempo de residencia hidrulica (TRH) se calcul en base al volumen del

biorreactor (V), 1.5 l; y al flujo de alimentacin de influente (F) 0.125 l /h; el
resultado fue un TRH de 12 h; valor que se ajust en la prctica, para asegurar
una eficiencia en el consumo de sustrato del orden del 92 al 98%.
TRH = V/F= 1.5 / 0.125 = 12h.
3.2.5 OTRAS CARACTERSTICAS DEL CONSORCIO MICROBIANO
Con el fin de establecer la cantidad de lodos a emplear en los bioensayos, se

determin el contenido de slidos suspendidos totales (SST), los slidos
suspendidos voltiles (SSV) y los slidos suspendidos fijos (SSF).
Los SST se determinaron de la siguiente manera, se tomaron 10 g (para cada

repeticin) de lodo previamente tamizado (tamiz # 40) y se colocaron en un crisol
previamente puesto a peso constante; posteriormente se mantuvieron en el horno
a una temperatura de 103-105C (Estndar Mtodos), hasta que el peso no
present variacin; se determin el peso y se obtuvo el valor de los SST.
Seguidamente, se introdujeron los crisoles en la mufla a 500C por un lapso de 30
minutos, hasta que los valores del peso se mantuvieron constantes; el valor
obtenido fueron los SSF. Los SSV se obtuvieron de la diferencia de los SST y los
SSF.
28
3.2.6 TIPO DE REACTOR
El biorreactor empleado para la activacin del consorcio microbiano se mantuvo

bajo operacin en continuo, en condiciones anaerobias. Para ello se mont un
reactor UASB con los siguientes componentes: una salida de gas, que se burbuje
en NaOH (10%); una salida de efluente, del cual se tomaron muestras para
determinar la DQO, para verificar la eficiencia del reactor en base al
aprovechamiento de sustrato; una entrada de influente, regulado por una bomba
que se adapt al TRH fijado; una toma para lodos. Ver figura 8.
Efluente
Salida de biogas.
Toma de lodos
Lodos anaerobios
Influente
Figura 8. Esquema del biorreactor empleado para la reactivacin del lodo

empleado para los bioensayos.
29
3.2.7 EFICIENCIA DEL REACTOR
La eficiencia del biorreactor se determin basndose en el protocolo de DQO;

esto, teniendo como base que el influente present una concentracin de 2g de
DQO/l, as al determinar la DQO de salida se obtuvo el porcentaje de la eficiencia
del biorreactor, que como se mencion anteriormente se mantuvo a un porcentaje
mayor al 90%.
3.3 TRATAMIENTOS
3.3.1 MATERIALES
Para llevar a cabo los experimentos se emplearon botellas serolgicas de vidrio,

con una capacidad de 120 ml. Con el fin de mantener las condiciones anxicas las
botellas fueron selladas con tapones de hule y un seguro de aluminio.
3.3.2 MEDIO BASAL PARA ENSAYOS
La formulacin empleada para el medio basal de los ensayos fue la siguiente,

macronutrientes: NH4Cl, 280 mg/l; CaCl22H2O, 10 mg/l; K2HPO47H2O, 250 mg/l;
MgSO47H2O, 100 mg/l; y micronutrientes 1 ml/l de la solucin madre preparada
en base a la siguiente formulacin: FeCl24H2O, 2000 mg/l; H3BO3, 50 mg/l; ZnCl2,
50 mg/l; CuCl22H2O, 38 mg/l; Na2SeO5H2O, 162 mg/l; MnCl24H2O, 500 mg/l;
30
(NH4)6Mo7O47H2O, 50 mg/l; AlCl36H2O, 90 mg/l; CoCl26H2O, 2000 mg/l;

NiCl26H2O, 92 mg/l; EDTA, 1000 mg/l; y 1 ml/l de HCl (36%). Adems, se
adicion bicarbonato de sodio (5 g/l) para amortiguar el medio a un pH de 7 con
una fase gaseosa conteniendo 20% de dixido de carbono.
3.3.3 SUSTRATOS EMPLEADOS
Los sustratos probados durante esta investigacin fueron: hidrgeno, cido

actico, cido propinico y metanol.
El hidrgeno se adicion en forma de gas. Se desplaz el oxgeno de cada botella

serolgica por un lapso de 8 minutos con una mezcla de hidrgeno y dixido de
carbono (80/20%, respectivamente); con el volumen que se adicion se obtuvo
una concentracin aproximada de 1 g DQO/l. Para este ensayo la formulacin del
medio basal se modific ligeramente supliendo el bicarbonato por una solucin de
fosfatos para garantizar el sistema de amortiguamiento y mantener un pH de 7.
Los fosfatos se adicionaron en las siguientes concentraciones: KH2PO4, 60 mM; y
K2HPO4, 82.8 mM.
El metanol se adicion en una concentracin equivalente a 1 g de DQO /l; para

ello de prepar una solucin madre, con el fin de que el volumen adicionado no
modificara la concentracin del medio basal. De igual forma se adicionaron el
cido actico y cido propinico. Cabe mencionar que el medio basal no sufri
modificaciones para el caso de estos sustratos.
Las concentracin de las soluciones madre se prepararon en base a la

informacin presentada en la tabla 3.
31
Tabla 3. Equivalencias en base a demanda qumica de oxgeno (DQO)

(modificado de Lettinga et al., 1998).
Sustrato gDQO/g de sustrato

cido actico 1.067
Metanol 1.5
Propinico 1.513
Hidrgeno 8.00
3.3.4 INHIBIDORES
Los inhibidores que se emplearon fueron molibdato de sodio para inhabilitar la va

metablica de la sulfato-reduccin y BES para inhibir la metanognesis.
El molibdato de sodio se adicion a cada botella serolgica de tal manera que se

tuviera una concentracin final de 30 mM (Anderson y Lovley, 2000), para lo cual
se prepar una solucin madre de concentracin conocida. El cido 2-bromoetano
sulfnico (BES) se adicion en la misma concentracin.
3.4 TIPO DE COLORANTE
El colorante empleado durante este trabajo de investigacin fue el naranja reactivo

14 (NR14), mismo que est clasificado como un colorante monoazo. Su estructura
32
se muestra en la figura 1.Este colorante se seleccion debido a que, en estudios

previos se determin que la tasa de decoloracin que presenta es muy baja (Van
der Zee, 2002).
Se adicion a cada botella serolgica de tal manera que se obtuviera una

concentracin de 0.15 mM, para ello se prepar una solucin concentrada y
posteriormente se dosific a cada tratamiento.
3.5 BIOENSAYOS
Los distintos tratamientos que se ensayaron durante esta investigacin se

muestran en la tabla 4.
Tabla 4. Distribucin de los componentes de cada bioensayo llevado a la prctica

durante esta investigacin. Ausencia de componente Presencia del componente
sealado.
Tratamiento Lodo BES Molibdato

Control estril --
Tratamiento 1 --
Tratamiento 2 --
Tratamiento 3
Tratamiento 4 -- --
33
Cabe recordar que cada tratamiento present los siguientes componentes: medio
basal, colorante, y cualquiera de los otros componentes de acuerdo a la tabla 4.
Los tratamientos se realizaron por triplicado.
3.6 MTODOS ANALTICOS
3.6.1 MEDICIN DE COLOR
Esta determinacin se efectu de la siguiente manera: se tomaron muestra de

cada botella serolgica de aproximadamente 3 ml, se centrifugaron por un lapso
de 10 min a 4500 rpm, se tom una alcuota , y se diluy en una proporcin de 1:3
con una solucin de fosfatos (10.86 g/l de NaH2PO42H2O; 5.38 g/l de
Na2HPO42H2O), conteniendo cido ascrbico (200 mg/l) como antioxidante. Para
que el cido ascrbico cumpliera su funcin antioxidante, se adicion justo antes
de realizar la medicin. Posteriormente se determin la absorbancia de cada
muestra en un espectrofotmetro Termo Spectronic Genesis 20, modelo 4001; a
una longitud de 433 nm (absorbancia mxima del colorante naranja reactivo 14)
(Van der Zee, 2002).
3.6.2 METANO
La determinacin de este gas se hizo con el fin de corroborar la contribucin de los

microorganismos metanognicos en el proceso de decoloracin. La medicin de
este gas se efectu en un cromatgrafo de gases Varian, modelo 380. Se obtuvo
34
la concentracin de metano presente en cada botella serolgica, calculado el rea

bajo la curva que present cada muestra inyectada. El cromatgrafo cont con un
detector de ionizacin de flama (FID) y una columna Porapak Q con una malla
80/100. Las temperaturas de operacin de la columna, del puerto de inyeccin y
del detector fueron 60, 200 y 220C, respectivamente.
Las muestras gaseosas se tomaron con una jeringa marca Hamilton, con seguro
para evitar escapes. El volumen de muestra inyectada fue de 100 l.
3.6.3 SULFATO
La concentracin de sulfato se determin empleando un equipo de cromatografa

lquida de alta presin (HPLC) marca Waters, modelo Alliance Waters 2690. Para
llevar a cabo esta determinacin se tomaron muestras de cada tratamiento,
previamente centrifugado, como se especific en la medicin de color, con la
diferencia de que no se hicieron diluciones, y las muestras fueron centrifugadas a
6500 rpm por 10 min. Las muestras se colocaron en los vieles adaptados para ello
y se congelaron hasta el momento en que se hizo la medicin.
Para la deteccin del in sulfato se emple una columna para aniones de alta
resolucin, del fabricante Water IC-PackTM; y un detector de conductividad, de los
mismos fabricantes, modelo 432.
Se emple un eluyente de borato/gluconato, para ello se prepar una solucin

concentrada de borato/ gluconato con 16 g/l de gluconato de sodio; 18 g/l de cido
brico y 25 g/l de tetraborato de sodio decahidratado. A partir de la solucin
anterior se prepar el eluyente con los siguientes componentes: solucin
concentrada de borato/ gluconato, 20 ml; n-butanol, 20 ml y nitrilo actico, 120 ml;
35
todo lo anterior se afor a 1000 ml con agua desionizada, y se procedi a su

filtrado con papel Watman # 1; previo al empleo de esta solucin en el equipo de
HPLC se sonic, con el fin de desplazar el oxgeno disuelto en la solucin, para
evitar interferencias en las mediciones.
36
IV. CAPTULO 4
RESULTADOS Y DISCUSIN
En este captulo se muestran los resultados obtenidos en los experimentos

llevados acabo durante el desarrollo de este trabajo de investigacin. El anlisis
estadstico se llev acabo empleando el programa MINITAB versin 13.20 para
windows 98.
La contribucin de las bacterias metanognicas y sulfato reductoras se determin

con base a los porcentajes de decoloracin que se presentaron en cada
experimento. Los tiempos de incubacin de variaron de acuerdo con las tasas de
decoloracin.
Las mediciones de metano en cada experimento corroboraron el efecto del

inhibidor BES sobre la metanognesis, observndose que s hubo diferencias
entre la produccin de metano de acuerdo a cada tratamiento, notndose que s
existe una inhibicin de esta ruta metablica como ya se ha mencionado en
diversos estudios (Gastn et al., 1993, Dos Santos 2004(B), Van der Zee, 2002,
Paulo, 2002). Por otro lado, los resultados arrojados por la medicin de sulfato no
fueron concluyentes, debido a la posible interferencia del colorante remanente en
las muestras u otro de los componentes del medio basal de los experimentos.
37
En la tabla 5 se muestran los porcentajes de decoloracin obtenidos durante el

desarrollo del experimento 1, donde se emple cido actico como sustrato, bajo
las condiciones que ya se especificaron en el captulo 3.
Tabla 5. Porcentajes de decoloracin, medias y desviacin estndar despus de

71 horas, para el sustrato cido actico.
Tratamiento % Decoloracin Desviacin

(media) estndar
Estril* 6.2a 5.415
BES 64.347b 0.506
Molibdato de sodio 51.385c 2.425
Ambos inhibidores** 66.508b 1.586
Sin inhibidores*** 59.347b 1.997

* Este trmino se refiere a la ausencia de lodos y de microorganismos, ya que el medio fue esterilizado
previamente en un autoclave a 16 Lb/in2. ** Se adicionaron al medio BES y molibdato de sodio a
concentraciones iguales. *** No inhibidores, en presencia del consorcio microbiano. Los superndices
diferentes(abc) muestran que los tratamientos presentan diferencias significativas y los que poseen la
misma letra no presentan diferencias significativas.
De acuerdo con el anlisis estadstico de los datos arrojados por el experimento,

se determin que existen diferencias significativas entre el tratamiento estril y los
otros tratamientos; lo cual se debe a la ausencia de microorganismos o
mediadores redox (Dos Santos et al., 2004(A); Dos Santos et al., 2004(B); Van der
Zee, 2002) que favorecieran la reduccin del enlace azo y la decoloracin del
medio.
Tambin se presentaron diferencias significativas entre el tratamiento con

molibdato de sodio y los tratamientos con BES, ambos y sin inhibidores,
observndose que el primero present un menor porcentaje de decoloracin con
38
respecto a los dems. Esto evidencia que el metabolismo de los microorganismos

sulfato-reductores podra jugar un papel importante en la decoloracin de este tipo
de contaminantes. Por otro lado, los resultados sugieren que los microorganismos
metanognicos aparentemente no tienen un impacto significativo en la reduccin
del enlace azo. Lo anterior sugiere que el acetato no result un buen sustrato para
estimular la azo reduccin, lo cual no concuerda con la bibliografa respecto al
tema (Madigan et al., 2003, Rodrguez et al., 1993, Thauer, 1998), sto sugiere
entonces, que la decoloracin en los otros tratamientos pudo haber sido
acentuada por diferentes factores; tal es el caso de estudios realizados por Dos
Santos (2004), donde encontr que el BES aparentemente favorece la ruptura del
enlace azo reduciendo los intermediarios requeridos para que se lleve acabo esta
reaccin. Lo anterior aunado a la influencia que ejerce el metabolismo microbiano
de las bacterias sulfato reductoras sobre la reduccin del enlace azo, provocaron
un mayor porcentaje de decoloracin que el provocado por la actividad de las
bacterias metanognicas (tratamiento con molibdato). Desde otra perspectiva, el
bajo porcentaje de decoloracin que se observ en el tratamiento con molibdato
pudo deberse al hecho de que las enzimas que intervienen en el proceso de
reduccin del acetato para producir metano, no emplean NAD+ o NADP+,
cofactores que se ha demostrado que son el donador primario de electrones para
la azo reduccin biolgica y que adems participan en la cadena respiratoria de la
sulfato-reduccin (Dos santos et al., 2004(A)). Es necesario tener en cuenta, que
en base a la energtica de las reacciones metablicas el acetato es mejor sustrato
para la sulfato reduccin que para la metanognesis (ver tabla 2) (Van Houten,
1996; Thauer, 1977).
La tabla 6 muestra los resultados obtenidos del experimento que se llev a cabo
empleando como sustrato la mezcla de H2/CO2, como se indica en el captulo 3,
en el apartado 3.3.2.
39
Tabla 6. Porcentajes de decoloracin obtenidos a las 42 horas de incubacin, con

una mezcla de H2/CO2, como sustrato.

(media) estndar
Estril* 0a 0
BES 86.170b 0.806
Ambos inhibidores** 73.316d 0.607
Sin inhibidores*** 88.385e 0.332

previamente en un autoclave a 16 Lb/in2. ** Se adicionaron al medio BES y molibdato de sodio a
concentraciones iguales. *** No inhibidores, en presencia del consorcio microbiano en cuestin. Los
superndices (abcd) muestran los tratamientos que tienen diferencias significativas y los que poseen la
misma letra no presentan diferencias significativas.
En la tabla 6 se presentan los resultados obtenidos en este experimento, en ellos

se observa que se presentaron diferencias significativas entre todos los
tratamientos, adems el tiempo de incubacin para este caso fue menor, debido a
que este sustrato fue consumido con mayor rapidez, evidencindose en una
decoloracin del medio ms rpida. El tratamiento estril debe sus diferencias, con
respecto a los dems tratamientos, a la ausencia de la actividad metablica, como
ya se mencion anteriormente.
El tratamiento que present un mayor porcentaje de decoloracin fue el que

careca de inhibidores, lo cual se debe a que ninguno de los grupos trficos en
cuestin se encontraba inhibido, por lo que su accin conjunta fue notoria. Por otro
lado, en los resultados (tabla 6) se aprecia que con hidrgeno como sustrato si es
notoria una mayor contribucin de las bacterias sulfato reductoras en la reduccin
del enlace azo, esto puede deberse en gran medida a que el hidrgeno
representa, energticamente, un mejor sustrato para la metanognesis (ver tabla
40
2) como lo sealan Thauer (1977), Abram y Nedwell (1978) y Van Houten (1996);
adems, este grupo trfico presenta una mayor afinidad por este sustrato en
presencia de sulfato (Abram y Nedwell, 1978; Winfrey y Zeikus, 1977); sin
embargo, es necesario tener presente que el inhibidor BES pudo haber acentuado
ms la decoloracin en este caso, segn lo que ya se mencion anteriormente
(Dos Santos et al., 2004 (B)).
En la tabla 7 se observan los resultados de los porcentajes de decoloracin que se

obtuvieron en el experimento de cido propinico como sustrato.
Tabla 7. Porcentajes de decoloracin obtenidos, las medias y las desviaciones

estndar, empleando cido propinico como sustrato a las 66 horas de incubacin.

(media) estndar
Estril* 4.139a 0.479
BES 63.185b 3.981

previamente en un autoclave a 16 Lb /in2. ** Se adicionaron al medio BES y molibdato de sodio en
(abc) muestran los tratamientos que tienen diferencias significativas y los que poseen la misma letra no
presentan diferencias significativas.
El anlisis estadstico arroj que existen diferencias significativas entre el

tratamiento estril y los dems tratamientos; lo anterior debido a la ausencia de
microorganismos que por efecto de su actividad potenciaran el efecto de
decoloracin del colorante en cuestin.
41
El tratamiento con molibdato de sodio, cuyo propsito fu evidenciar la actividad

metablica del grupo de bacterias fermentadoras de propinico y metangenos
presentes en el consorcio microbiano, present una decoloracin
significativamente menor que los tratamientos con BES, en presencia de ambos
inhibidores y en ausencia de los mismos; lo cual indica que la decoloracin por
efecto del metabolismo de los microorganismos metangenos, de nuevo, fue
mnima con respecto a los otros casos. Lo cual puede ser el resultado de varios
factores. Primeramente, cabe aclarar que el molibdato solamente inhibe el proceso
de reduccin del sulfato, pero no afecta el proceso de fermentacin del propionato
ni la metanognesis. La fermentacin del propionato, por otro lado genera acetato
e hidrgeno como productos principales. De esta forma, tanto el acetato como el
hidrgeno estn disponibles para la metanognesis y para efectuar el proceso de
decoloracin. Aparentemente, aqu el proceso de metanognesis gan la
competencia por los electrones disponibles al proceso de decoloracin, con lo cual
se obtuvo un menor grado de decoloracin. Sin embargo, cuando se aplicaron
ambos inhibidores, se bloque tanto la sulfato-reduccin como la metanognesis,
pero no el proceso fermentativo de conversin de propionato a hidrgeno y
acetato. Por lo tanto el hecho de que no se haya presentado una diferencia entre
este ltimo tratamiento con el control incubado sin inhibidores puede explicarse
por el papel que juegan las bacterias fermentadoras del propionato. Adems el
hidrgeno, que se genera durante el proceso fermentativo, ha sido reportado como
uno de los mejores sustratos que soportan procesos de decoloracin (Dos Santos,
2004 (A)).
En la tabla 8 se indican los porcentajes de decoloracin que se obtuvieron durante

el desarrollo de esta investigacin, en este caso se trata del metanol como
sustrato.
42
Tabla 8. Porcentajes de decoloracin, medias y desviaciones estndar obtenidos a

las 96 horas de incubacin, con metanol como sustrato.

(media) estndar
Estril* 0a 0
BES 39.254b 2.805
Molibdato de sodio 36.605b 5.254

previamente en un autoclave a 16 Lb/in2. ** Se adicionaron al medio BES y molibdato de sodio en
(abc) muestran los tratamientos que tienen diferencias significativas y los que poseen la misma letra no
presentan diferencias significativas.
De acuerdo al anlisis estadstico efectuado, se evidencia que existen diferencias

significativas entre el tratamiento carente del consorcio microbiano, estril y los
dems tratamientos.
No se observ ninguna diferencia significativa entre los dems tratamientos debido

a que este sustrato no es utilizado con tanta facilidad por los microorganismos
presentes en el consorcio microbiano; lo anterior se refleja en que se requiri un
mayor tiempo de accin, para obtener resultados notorios en la decoloracin del
medio y no hubo diferencias entre ellos. Con base a los estudios realizados por
Thauer (1977) y Van Houten (1996) sobre la energtica metablica se hubiera
esperado que las bacterias sulfato reductoras tuvieran un papel mas notorio, que
sin embargo en este experimento no se not. (ver tabla 2). Los resultados
concuerdan con otros autores que indican que el metanol no es un sustrato
apropiado para procesos de decoloracin (Dos Santos, 2004(A); Paulo, 2002).
43
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Los resultados de este estudio muestran que la contribucin de las bacterias

sulfato reductoras es mayor que los microorganismos metanognicos durante la
decoloracin de compuestos azo, por lo que se afirma la hiptesis de este estudio.
Los resultados tambin indican que las bacterias fermentadoras del propionato
podran jugar un papel importante en procesos de decoloracin.
Se recomienda, en futuros trabajos, evaluar otras condiciones experimentales que

permitan arrojar informacin ms completa sobre la contribucin de los diferentes
grupos trficos involucrados en la decoloracin de compuestos tipo azo.
44
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Tesis. Bacterias y Reduccion de Colorantes.1

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INSTITUTO TECNOLGICO DE SONORA

CONTRIBUCIN DE LAS BACTERIAS

TITULACIN POR TESIS

QUE PARA OBTENER EL TTULO DE

MAGDALENA DEL ROSARIO MENDOZA HERNNDEZ

CD. OBREGN, SONORA. FEBRERO DE 2005

A Dios por permitirme el privilegio de la vida, la fuerza, la entereza y los medios

A el Dr. Francisco Cervantes Carrillo por haberme apoyado en el desarrollo de

A todos los colaboradores de los laboratorios de Ecodesarrollo y Anlisis

Finalmente, gracias a mis maestros por haberme enseado lo valioso de los

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Tabla 3. Equivalencias en base a demanda qumica de oxgeno (DQO) .... 31

Tabla 4. Distribucin de los componentes de cada bioensayo .................... 32

Tabla 5. Porcentajes de decoloracin, medias y desviacin estndar

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Tabla 7. Porcentajes de decoloracin, medias y desviaciones estndar,

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