INTRODUCCIN A LA VALIDACIN DE

MTODOS ANALTICOS
Control de Calidad de Medicamentos
Facultad de Ciencias Exactas UNLP

Validar
es establecer, mediante estudios de laboratorio debidamente
documentados, que la capacidad de un procedimiento
(produccin, limpieza) o de un mtodo (analtico) satisface los
requisitos para las aplicaciones deseadas.
Es decir, es demostrar que el mismo es apropiado para el uso
propuesto.
Objetivos: confiabilidad, seguridad, efectividad

Por qu validamos? Un sistema validado es un sistema estable, capaz y

robusto y es as como nos interesa mantenerlo, dado que estas
caractersticas son esenciales para mantener altos niveles de calidad

1
Qu se debe validar?
# Mtodos analticos
(no codificados en farmacopeas o modificados)
Mtodos de control de materias primas (MP)
# Mtodos de limpieza
Mtodos de control de proceso
# Mquinas de produccin
Mtodos de control de producto intermedio
# Equipos analticos
Mtodos de control de producto terminado
# Personal Mtodos para estudios de estabilidad

# Procesos Mtodos bioanalticos

# Computadoras, Programas y Sistemas

Validacin - Bibliografa
USP 34 (2011) - <1225> Validacin de Procedimientos Farmacopeicos
FA 7 Ed. <1130> Validacin de Mtodos Analticos
http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/fna_pdfs.asp

Disposiciones ANMAT 1930/92, 853/99, 2819/04

FDA (2013) Bioanalytical Method Validation
http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm368107.pdf

FDA (2014) Analytical Procedures and Methods Validation for Drugs and Biologics
http://www.fda.gov/downloads/drugs/guidancecomplianceregulatoryinformation/guidances/ucm386366.pdf

ICH (2005) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology (Q2 R1)
http://www.ich.org/products/guidelines/quality/article/quality-guidelines.html

EMA (2011) Guideline on Bioanalytical Method Validation

http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2011/08/WC500109686.pdf

2
Validacin de Mtodos Analticos
Antes de comenzar...
Equipos calificados
Materiales y reactivos adecuados
Sustancias de referencia (SR) adecuadas
Personal capacitado y entrenado
Conocimiento previo del anlisis estadstico a realizar

La importancia de confiar en la SR
Muestra RESULTADO
Mtodo Analtico
Cuando se APLICA un mtodo analtico sobre una muestra, se obtiene un
resultado que, como se confa en el mtodo empleado, se atribuye a las
caractersticas del producto

3
La importancia de confiar en la SR
Sust. referencia
Muestra RESULTADO
Mtodo Analtico

Cuando se VALIDA un mtodo analtico, se obtiene un resultado que,

como se confa en la sustancia de referencia sobre la cual se aplica (ttulo
conocido, exactamente pesada y totalmente disuelta), se adjudica al
desempeo del mtodo analtico que se est evaluando

Parmetros de Validacin
Especificidad
Determinamos siempre
Linealidad y rango todos estos
Precisin parmetros?

Exactitud
Lmite de Deteccin (LD) y de Cuantificacin (LC)
Estabilidad de muestras y soluciones
Robustez
Estos parmetros se pueden determinar de varias maneras (segn el mtodo
analtico, el objetivo y/o alcance, las condiciones operativas) pero siempre
empleando SUSTANCIA DE REFERENCIA CONFIABLE del analito

4
 Validacin de Mtodos Analticos
Es de notar que si
bien la robustez no se Parmetros de Validacin
encuentra incluida en
la tabla anterior, la
misma debe ser
considerada en el
momento oportuno
durante el desarrollo
de todo mtodo
analtico.
Validation of Analytical Procedures Text and Methodology (ICH 2005)

Especificidad
La especificidad de un mtodo es su capacidad para evaluar
inequvocamente al analito en presencia de otros componentes
que pueden estar presentes:

# Impurezas Buscamos siempre

# Productos de degradacin todos esos
componentes?
# Componentes de la matriz
# Excipientes

5
Especificidad
Si se dispone de los componentes que forman la matriz que acompaa al
pa (prod. degradacin, excipientes, fluido biolgico), se debe demostrar
que no interfieren mediante la comparacin de los resultados obtenidos
con muestras de [SR + matriz] respecto a muestras de la [matriz sin SR].

Si no se dispone de dichos componentes, se pueden comparar los

resultados que el mtodo arroja para las muestras (que contienen dichos
componentes, conocidos o no) con los obtenidos por otro mtodo (oficial
o previamente validado) cuya especificidad est demostrada.

En el caso de mtodos analticos para estudios de estabilidad, los componentes que

acompaan al activo se pueden generar por degradacin forzada: termlisis,
hidrlisis acuosa, alcalina y cida, fotlisis, oxidacin

Especificidad
Alternativa para mtodos por HPLC (GC)
Establecer la especificidad evaluando la pureza de pico: si el detector es UV
con arreglo de diodos (HPLC-DAD) o un espectrmetro de masas (HPLC-MS)

6
Especificidad por cociente a dos
Se debe medir la absorbancia de una solucin de SR Luego se mide la abs de la
del pa 2 longitudes de onda (1 y 2). Luego: muestra a las mismas 1 y 2:

ASR (1) = A11 (1)*b*CSR Am (1) = A11 (1)*b*Cm

ASR (2) = A11 (2)*b*CSR Am (2) = A11 (2)*b*Cm
El cociente de las expresiones anteriores ser: Y el cociente:
ASR (1) = A11 (1) Am (1) = A11 (1)
ASR (2) A11 (2) Am (2) A11 (2)

Como la sustancia es la misma y tambin lo son las condiciones de operacin

(solvente, temperatura), los valores de A11 a ambas , tanto para la muestra
como para el SR, deben ser iguales (< 1%) en
ausencia de interferencias. Es decir: ASR (1) = Am (1)
ASR (2) Am (2)

Especificidad (resumen)
cuando se conoce la matriz (excipientes declarados, matriz biolgica reproducible)

Se aplica el mtodo
Posibles
interferencias analtico (peso, disuelvo,
SR del analito sonico, centrifugo, diluyo,
(peso, ttulo)
etc.) sobre alcuotas de
Posibles
interferencias ambas muestras

Se puede procesar una MUESTRA que contenga dicha matriz por el mtodo que estoy
validando y por otro ya validado o farmacopeico (apto para matrices desconocidas)
OTRAS
Si el detector es DAD o MS se puede evaluar la pureza de pico
OPCIONES
Si es por UV (o HPLC-UV) se puede aplicar el mtodo del cociente a dos

Importante: se debe re-determinar la especificidad del mtodo cada vez que cambia la matriz (ej. distintas marcas)

7
Linealidad y Rango
# La linealidad de un mtodo analtico es su capacidad de producir resultados
directamente proporcionales a la concentracin de analito, dentro de un
intervalo o rango de concentraciones.

# Se demuestra mediante la construccin de una curva de calibracin (respuesta

vs. concentracin). Dicha curva se construye alrededor de la concentracin de
trabajo, y sus extremos determinan el rango de aplicabilidad del mtodo.

# Se debe preferir siempre el modelo ms simple, si bien las reglamentaciones

contemplan situaciones donde pueda ser necesario realizar una transformacin
previa de los datos, o aplicar modelos alternativos al lineal (ej. inmunoensayos).

Linealidad
La curva de calibracin se puede hacer con o sin replicados Ejemplos:

Cinco niveles de concentracin, 3 rplicas independientes a cada nivel (N=15)

Cinco niveles de concentracin, a partir de 2 SC madre por diluciones cruzadas (N=5)

*
*
* * S1 S2
*
* *
*
* *
*
*
M1 M2 M3 M4 M5
*
*
*

Con replicados Al trabajar sin replicados, nunca conviene obtener

(m=5, N=15) todas las soluciones de una misma solucin madre

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 Linealidad
Concentracin (x) Seal (y)
0,1 19,97 b*0,1+a
Luego se debe verificar que 1,0 201,54 b*1,0+a
La correlacin y linealidad sean aceptables: .
r 0.99 y r2 0.98 (o superior) 10 2005,3 b*10+a
Anlisis de Residuales Residuos 0
Significancia de la correlacin: ANAVA/lack of fit Test de Student
Que sea una buena curva de calibracin:
IC de la ordenada al origen debe incluir al 0

Adicionalmente, se recomienda verificar que:

Una vez encontrada la ecuacin y = bx + a, se introducen los valores experimentales
de y (ej. area, abs), y se obtienen las concentraciones predichas, las que deben estar
dentro del 15% del valor nominal (terico).

Linealidad - Tratamiento estadstico

Con o sin replicados, siempre se puede hacer: Suma de Cuadrados
GL Fcalculado
cuadrados Medios
1) Test de Student
H0 = No hay correlacin entre x e y (r2=0) Regresin SR = ( y
i y) 2
p-1 SR/p-1 CMreg/CMerror
Si tcalc > t crt Se rechaza H0 Error SE = ( yi yi )2 N-p SE/N-p
r (n 2)
t calculado Total ST = (y i y)2 N-1
(1 r 2 )
2) ANAVA
H0 = No hay correlacin entre x e y (r2=0) Para rechazar esa H0, el test de Student
y el ANAVA son equivalentes (si hicieron
Si Fcalc > Fcrt Se rechaza H0 Hay correlacin
bien las cuentas, Fcalc = (tcalc)2).
3) Residuos de la regresin: suma, distribucin Sin embargo, del ANAVA obtenemos
ms informacin, sobre todo el CMerror
necesario para el clculo de IC.
Slo si tenemos replicados, se puede hacer:
4) Lack of fit
5) Anlisis de residuales: Cochran, transformaciones

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Linealidad (resumen)
es la respuesta directamente proporcional a la concentracin?
0,8
0,7
y = 0,0409x + 0,008 Etapa de anlisis estadstico de los datos
R = 0,997
0,6 Se debe verificar que:
0,5
0,4
IC de la ordenada al origen debe
0,3 incluir al cero
0,2
r 0.99 y r2 0.98 (o superior)
0,1
0 La correlacin sea significativa
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
(rechazar la H0 de no correlacin
mediante un test t o ANAVA)
SRC1 SRC2 SRC3 SRC4 SRC5 Anlisis de Residuales Residuos 0

Para materias
primas o
SRM1 SRM2
especialidades, no
hace falta incluir la
Esquema de una curva a 5 niveles, sin
matriz de
excipientes en las
Peso1 SR Peso2 SR
(ttulo) (ttulo)
replicados (etapa experimental)
muestras

Linealidad (resumen)
es la respuesta directamente proporcional a la concentracin?
100,00 Etapa de anlisis estadstico de los datos
90,00 y = 4,1167x - 0,9416
80,00 R = 0,9832 Se debe verificar que:
70,00 IC de la ordenada al origen debe incluir al cero
60,00
50,00
r 0.99 y r2 0.98 (o superior)
40,00 La correlacin sea significativa (rechazar H0 de
30,00 no correlacin mediante un test t o ANAVA)
20,00
10,00 Anlisis de Residuales Residuos 0
0,00
0 4 8 12 16 20
Opcional (x tener replicados)
Puedo ver el ajuste al modelo lineal
(ensayo de lack of fit o falta de ajuste)
Puedo plantear una transformacin de los
Para mtodos diluciones datos si tengo problemas de dispersin
bioanalticos, es
recomendable
preparar las
muestras en la
misma matriz
Esquema de una curva a 6 niveles, tres
Peso1 SR Peso2 SR Peso3 SR
biolgica (ej.
plasma blanco)
(ttulo) (ttulo) (ttulo) rplicas a cada nivel (etapa experimental)

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 Precisin
La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia entre los
resultados cuando el mtodo se aplica en forma repetitiva
Interpreta los errores aleatorios del mtodo
Da idea de la dispersin de las medidas alrededor de su valor medio o central
se expresa como desviacin estndar o coeficiente de variacin (CV)

y y
2

sn 1
i

n 1 sn 1
CV % 100
y Y

Precisin - Niveles
Precisin del sistema (o equipo, o instrumento): se calcula como el CV% de varias determinaciones
de una misma solucin de SR. Puede hacerse a un nivel (100% o concentracin de trabajo) o a
varios niveles (ej. 80, 100 y 120%) de concentracin.
No tiene especificacin criterio?

Repetibilidad, precisin intra-ensayo o precisin del mtodo: CV% de N muestras independientes

evala el mtodo, desde la preparacin de la muestra hasta la medicin instrumental. Implica
mismas condiciones operativas en un intervalo de tiempo corto (mismo analista, equipo, da). Se
puede hacer de diversas maneras: 9 muestras que cubran el rango (ej. 3 rplicas a 3 niveles), 6
muestras al 100%, o muchas ms.
Criterio de Aceptacin CV 2%
Precisin intermedia o inter-da: distintas condiciones en distintos das, dentro del mismo
laboratorio (diferentes analistas, equipos, etc). Se recomienda emplear diseos factoriales, se
contemplan todos los factores que pueden variar.

Reproducibilidad: expresa la precisin entre laboratorios. Se realiza slo para estudios

colaborativos, protocolos estandarizados, monografas de farmacopeas

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Precisin - Niveles
P. del
sistema

Precisin del
mtodo

Precisin intermedia

Reproducibilidad o fortaleza

Precisin (resumen)
hay concordancia entre medidas repetidas?
Opcional

+ +
Peso SR
(ttulo) + Matriz

Sonicacin

Si se replica todo el experimento, variando todos los factores (analista, da, equipo)
PRECISIN INTERMEDIA O INTER-DA
Ejemplo:
El da 1, el analista 1 y el analista 2 preparan cada uno tres muestras a la
concentracin de trabajo (100%).
El da 2, hacen lo mismo. Resultado: el CV entre TODAS esas muestras (N=12)
es la precisin intermedia del mtodo al 100%.

12
Precisin (resumen)
hay concordancia entre medidas repetidas?
Opcional

+ +
Peso SR
(ttulo) + Matriz

Sonicacin

Si se replica solamente la etapa analtica del mtodo, desde la pesada hasta la lectura (dems factores ctes.,
un analista, mismo da, etc.) REPETIBILIDAD, PRECISIN INTRA-ENSAYO o DEL MTODO (Debe ser < 2%)%
Ej. 1: Un analista prepara, el mismo da, 3 rplicas al 80%, 3 al 100% y 3 al 120% de la concentracin de trabajo
el CV entre los resultados de cada grupo (N=3) es la precisin del mtodo al 80, 100 y 120%.
Ej. 2: Un analista prepara, el mismo da, seis rplicas al 100% el CV entre los resultados (N=6) es la precisin del
mtodo al 100%
Ej. 3: se preparan cuatro rplicas a los mismos niveles de concentracin que se usaron para construir la curva de
calibracin Precisin del mtodo (N=4) evaluada en todo el rango.

Precisin (resumen)
hay concordancia entre medidas repetidas?
Opcional

+ +
Peso SR
(ttulo) + Matriz

Sonicacin

Si slo se replica la lectura o medida analtica PRECISIN DEL SISTEMA

Ejemplo:
En el ej. 2 anterior, una de las soluciones se lee seis veces (o ms)
Precisin del Sistema (N=6 o superior) al 100%.

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Exactitud
Interpreta los errores sistemticos o
tendencia del mtodo analtico, es decir
que expresa la proximidad entre el
resultado y el valor real.
Generalmente se expresa como
%Recuperado, Error Absoluto o Relativo

Se determina empleando soluciones de SR, de ttulo conocido,

replicadas, comprendidas o abarcando el rango de linealidad, a las que
se agregan los excipientes del producto o la matriz de trabajo y
se someten a todas las etapas del mtodo

Ensayo de Recuperacin

Exactitud (resumen)
se parece el valor medido al valor real o terico?
V2

Peso SR Matriz V3
V1
(ttulo)
Sonicacin

Con esos datos calculo el valor

esperado: por ej. si peso 22 mg de una AMta
SR 98% sdtc = 21,56 mg tericos

Con esos datos calculo el

valor medido o hallado

necesito una SR para transformar un valor de seal en un valor de masa o concentracin hallada!!!
Criterio: si el ensayo mide el efecto que las diferentes etapas del mtodo pueden tener
sobre el resultado, puedo usar como SR para los clculos a una solucin que NO haya
pasado por dichas etapas

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Exactitud (resumen)
se parece el valor medido al valor real o terico?
V2

Peso SR Matriz V3
V1
(ttulo)
Sonicacin

Con esos datos calculo el valor

esperado: por ej. si peso 22 mg de una AMta
SR 98% sdtc = 21,56 mg tericos
Si ASR ... CSR
AMta.. X: CMta Con esos datos calculo el
valor medido o hallado
Entonces. Mg hallados: CMta.V3.V2
V1
Recuperacin = mg hallados.100
mg tericos Ej. 19,87 mg hallados
CSR
Es decir, ASR

Recuperacin = 19,87.100 = 92,16% SR sin

prdidas
21,56

Evaluamos la exactitud mediante un ensayo de recuperacin Peso SR

(ttulo)

Exactitud - Tratamiento de datos

- Presentacin de los datos Mg tericos Mg hallados % Recup.

Se informan los valores obtenidos, y se calculan los errores y/o M1 30.1 30.0 99.67
la recuperacin (prxima al 100% y con una dispersin M2 30.7 31.0 100.98
aceptable) M3 30.5 30.0 98.36
Error Absoluto Y Y M4 30.4 29.7 97.70

Error Relativo

Y Y 100 M5 31.2 30.8 98.72
Y M6 29.8 30.0 100.67
Y 100 =30.45 Y =30.42
Recup
Y
- Realizar un test de hiptesis {ensayo t -Student-}
H0 = No hay Errores Sistemticos (%R = 100) 100 %R
Si tobs < ttabla No tenenemos evidencia de que existan t ob
CV
errores sistemticos n

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Exactitud - Tratamiento de datos
- Graficar concentracin (o mg) hallada vs. agregada

*
Luego se debe verificar que
Challada

La correlacin y linealidad sean aceptables:

*
* *
*
* * r 0.99 y r2 0.98 (o superior)
Significancia de la regresin: ANAVA Student
*
* *

Anlisis de Residuales
*
*
*
*
*
Si no hay errores sistemticos
Cagregada IC de la ordenada debe incluir al 0
IC de la pendiente debe incluir al 1

Mtodo recomendado por la USP 34

Exactitud (resumen)
Finalizado el ensayo de recuperacin, se llega a tablas como estas:
Ej. Seis replicas al 100%
Mg tericos Mg hallados % Recup.
M1 30.1 30.0 99.67
M2 30.7 31.0 100.98
M3 30.5 30.0 98.36
M4 30.4 29.7 97.70
M5 31.2 30.8 98.72
M6 29.8 30.0 100.67

Recup. Media = 99,35% - CV = 1,32% Precisin del mtodo al 100%

Conclusin: es exacto?
i. Mg tericos vs. Hallados
ii. Test t (entre %Recup.
Media y 100%)

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Exactitud (resumen)
Finalizado el ensayo de recuperacin, se llega a tablas como estas:
Ej. Tres replicas al 80, 100 y 120%
Conclusin: es exacto? Mg tericos Mg hallados % Recup.
i. Mg tericos vs. Hallados M1 24.0 23.8 99.17
ii. Test t (entre %Recup. 80% M2 24.2 24.2 100.0
Media y 100%) M3 23.9 23.7 99,16
M4 30.4 29.7 97.70
100% M5 31.2 30.8 98.72
M6 29.8 30.0 100.67
M7 36.1 36.2 100.28
Cuando se evala exactitud
120% M8 36.5 36.2 99.18
mediante un ensayo de
recuperacin, tambin se evala M9 35.9 35.7 99.44
la precisin Recup. Media al 80% = 99,44% - CV = 0,48%
En este caso, podemos conocer Recup. Media al 100% = 99,03% - CV = 1,52%
la precisin del mtodo al 80, Recup. Media al 120% = 99,63% - CV = 0,58%
100 y 120% y la total. Recup. Media TOTAL = 99,37% - CV = 0,89%

Exactitud y Recuperacin... son lo mismo?

La EXACTITUD se puede determinar mediante un ensayo de
RECUPERACIN, y en ese caso pueden tomarse como sinnimos,
aunque no siempre. Ejemplo: mtodos bioanalticos, cuando se usa
estndar interno (SI)

Adems, la EXACTITUD se puede determinar de otras formas,

por ejemplo, por comparacin contra otro mtodo
(farmacopeico o previamente validado)
En estos casos, EXACTITUD y RECUPERACIN son
parmetros diferentes, que brindan informacin diferente

17
Lmites de Deteccin y de Cuantificacin
El lmite de deteccin (LD) es la concentracin ms baja de analito que
puede detectarse (no necesariamente cuantificarse) en una muestra, bajo
las condiciones experimentales establecidas.

El lmite de cuantificacin (LC o LLOQ, lowest limit of quantification) es la

menor concentracin de analito que puede determinarse con precisin y
exactitud en la muestra, bajo las condiciones experimentales establecidas.

Existen diversas formas de determinarlos, segn se trate de mtodos

instrumentales o no. Sin embargo, en ciertas situaciones (por ej., mtodos
analticos para el ingrediente mayoritario en una MP y/o PT), se puede reemplazar
la DETERMINACIN del LC real por su ESTABLECIMIENTO en un valor dado
Lmite inferior del rango

Lmites de Deteccin y de Cuantificacin

En aquellos casos donde es necesario conocer estos lmites, se pueden aplicar tres mtodos:

1. En base a una inspeccin visual

Aplicable principalmente a mtodos no instrumentales (ej. TLC), consiste en analizar
muestras de concentracin conocida del analito para establecer el nivel mnimo al cual el
mismo puede ser detectado (LD) confiablemente.

2. En base al cociente Seal/Ruido

Aplicable slo a mtodos con ruido
en la lnea de base. Se considera
aceptable una relacin S/R=3 para
el LD y S/R=10 para el LC
S/R= seal/ruido

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 Lmites de Deteccin y de Cuantificacin
3. En base a la SD de la respuesta y la pendiente
Consiste en estimar los lmites de acuerdo a las siguientes expresiones:
3.3 s 10 s s = SD de la respuesta
LD LC
b b b = pendiente de la curva de calibracin (sensibilidad)

Formas de estimar SD de la respuesta:

# A partir de la SD del blanco: se preparan y analizan varias muestras blanco para calcular la
SD de sus respuestas.
# A partir de una curva de calibracin cercana al LD/LC: se preparan muestras conteniendo el
analito en concentraciones cercanas al LD/LQ y con ellas se construye una curva de
calibracin. Tanto la SD de la regresin ( s ( y ) ) como la SD de la ordenada ( s (a ) ) pueden ser
usadas como SD de la respuesta en las expresiones anteriores.
# A partir de la curva de calibracin del mtodo: la SD de la regresin ( s ( y ) ) puede ser usada
como estima (ms grosera) de la SD de la respuesta en las expresiones anteriores.

Lmites de Deteccin y de Cuantificacin

3. En base a la SD de la respuesta y la pendiente
Consiste en estimar los lmites de acuerdo a las siguientes expresiones:
3.3 s 10 s s = SD de la respuesta
LD LC
b b b = pendiente de la curva de calibracin (sensibilidad)

Cuando el LC se obtiene por este mtodo, el valor estimado debe ser

luego validado (incluido en linealidad, exactitud y precisin) mediante
el anlisis independiente de un nmero adecuado de muestras de
s( y) s (a )
concentracin = LC

19
 Lmites de Deteccin y de Cuantificacin
Evalan la sensibilidad analtica del mtodo
La sensibilidad de calibrado corresponde a la pendiente de la curva de
calibracin
Un mtodo es sensible cuando frente a una pequea variacin en la
concentracin se obtiene una significativa variacin en la seal
La sensibilidad analtica corresponde al cociente entre la sensibilidad de
calibrado y la desviacin estndar de la medida (SD de la respuesta)
Mayor sensibilidad analtica a menor LD y LC

Estabilidad
Determinacin de la estabilidad de muestras y/o soluciones bajo diferentes
condiciones. Muy importante para mtodos bioanalticos
Estab. frente a ciclos de congelamiento/descongelamiento: se somete a las muestras a tres ciclos
(24 hs. a la T de almacenamiento, luego se deja descongelar solo, y se repite el ciclo) de al menos
tres alcuotas, tanto a las bajas como a las altas concentraciones.

Estab. a corto plazo: las muestras (y concentraciones, tres alcuotas de c/u) se dejan descongelar
a T ambiente y se conservan as el tiempo esperado de anlisis (entre 4 y 24 hs).

Estab. a largo plazo: en las condiciones normales de conservacin (freezer, por ejemplo) durante el
perodo de tiempo mximo, desde la recoleccin de las muestras hasta el momento de anlisis de
la ltima muestra. Tambin se realiza sobre las soluciones madre (o sc stock) si stas se re-utilizan.

Estab. de muestras procesadas: se determina la estabilidad tanto del principio activo como del
estndar interno frente a las condiciones normales de procesamiento, durante el tiempo que dura
el anlisis (preparacin de la muestra, tiempo en el inyector, tiempo de corrida, etc.)

20
 Robustez
La robustez de un mtodo analtico es la medida de su capacidad de no ser
afectado por variaciones (pequeas, pero deliberadas) en alguno de sus
parmetros.
Ejemplos de variaciones que pueden estudiarse:
# Diferentes tiempo de extraccin
# Diferentes lotes/marcas de reactivos
# Diferentes tiempos de valoracin
# Efecto de la temperatura
# Diferentes analistas
# Diferentes instrumentos, lotes/marcas de columnas cromatogrficas
# Influencia del pH, composicin de la fase mvil, flujo

Se debe hacer siempre, para todas las variables posibles?

Robustez
Si bien para el caso de uno o dos factores se podran aplicar diseos sencillos
(mono o bifactoriales) para estudiar su influencia y/o interaccin, no es lo ms
comn ya que slo interesa identificar aquellos factores que podran influenciar
los resultados. Es por ello que se estudian slo dos niveles de cada factor, varios
factores a la vez

Diseos Factoriales a dos niveles

Ms completo: diseo 2k A dos niveles:
Brinda la mxima informacin pero requiere Nivel nominal o bajo
y nivel extremo o alto
2k ensayos (ej. 32 experimentos para 5 factores)

21
 Qu sucede si queremos evaluar, por ejemplo, 7 factores?

Robustez Con un diseo 2k clsico, seran necesarios

al menos 27 = 128 experimentos!!

Nombre de Nivel Superior N A B C D E F G Rta.

Significado Nivel Inferior (-)
la Variable (+) 1 - - - - - - -
A Analista Juan Pedro 2 + - - - - - -
B pH fase mvil 4.00 4.10 3 - + - - - - -
C Flujo fase mvil 1.00 1.10
D Columna Col. A Col. B 50 - - + - - - -
E Temp. Horno 40 C 40.5 C
F Equipo HPLC A HPLC B
80 - + + - - - -
G Calidad del SV Marca A Marca B
81 + + + - - - -

100 + + - - - - -
101 + - + - - - -
102 + + + + - - -

128 + + + + + + +

Robustez - Diseos Fraccionales

Consisten en realizar slo una fraccin del total de experimentos, de manera de
perder la mnima informacin posible.

Matriz de Placket-Burman (n) variables (n + 1) ensayos

Condicin: que el n de ensayos sea mltiplo de 4, es decir, 4(n+1) ensayos

N de N mximo de
Ensayos factores
4 3
8 7
12 11
16 15 DESVENTAJAs DE LOS DISEOS FRACCIONALES
- Debido a la reduccin en el n de experimentos, aparece cierto grado
de CONFUSIN
(mayor cuanto mayor sea la relacin factores/experimentos)
- Estimacin del error y GL del error

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 Robustez - Matrices de Placket-Burman
En la figura,
cada factor
es una
columna, y
cada fila un
experimento

Extrado de: Armstrong, N. A.

(2006). Pharmaceutical
experimental design and
interpretation. Boca Raton, FL:
CRC/Taylor & Francis.

Robustez - Matrices de Placket-Burman

Cmo hacemos las cuentas?
En un anlisis de varianza, un factor (A, por ejemplo) tiene efecto si Fcalc=CMA > Fcrt
CMerror
En este caso,
SCA=DP2 y GL A=1 CMA=DP2
Donde DP = Dif. o Efecto Prom de A = (Promedio A+) (Promedio de A-)

Como no nos quedan GL para el error (diseo muy reducido), se lo estima con el valor
de la precisin del mtodo determinada anteriormente CMerror=SD2

Finalmente, Fcalc= CMA = DP2 ? Fcrt Criterio de Aceptacin

CMerror SD2
En el ensayo de robustez, se consideran factores
robustos aquellos para los cuales no rechazamos H0
Se usa un Fcrt = 2 (criterio conservador!!)
Se considera que el mtodo es robusto
respecto al factor A si:
|DPA| < SD 2
SD : Desviacin Standard de Repetibilidad

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 Siguiendo con el ejemplo anterior de 7 factores...

Robustez ac vemos las cuentas a un solo nivel de concentracin de las muestras.

Se repite todo a tres niveles, ejemplo 80, 100 y 120% (ver ejemplo en la gua)

Nombre de Nivel Superior N A B C D E F G Rta.

Significado Nivel Inferior (-)
la Variable (+) 1 + + + + + + + 2,1
A Analista Juan Pedro 2 + + - - - - + 3,2
B pH fase mvil 4.00 4.10 3 + - + + - - - 1,8
C Flujo fase mvil 1.00 1.10 4 + - - - + + - 3,0
D Columna Col. A Col. B 5 - + + - + - - 2,5
E Temp. Horno 40 C 40.5 C 6 - + - + - + - 4,0
F Equipo HPLC A HPLC B
7 - - + - - + + 3,3
G Calidad del SV Marca A Marca B
8 - - - + + - + 1,2

|DPA|=|(2,1+3,2+1,8+3,0)-(2,5+4,0+3,3+1,2)| = 0,225
4 4 Conclusin:
|DPD|=|(2,1+1,8+4,0+1,2)-(3,2+3,0+2,5+3,3)| = 0,725 El mtodo es robusto en
4 4 relacin al analista, pero no
en relacin a la columna
Si, por ejemplo SDmtodo= 0,25 SD 2 = 0,354

Otras consideraciones
Efecto de Carry-Over: importante en mtodos instrumentales, consiste
en determinar si existe algn tipo de efecto de arrastre por analizar
muestras en orden aleatorio de concentracin. Si existiera ( 20% del
LLOQ en una muestra blanco) no se deben aleatorizar los ensayos, e
incluso se puede planificar el anlisis de muestras blanco luego de
muestras concentradas.

Revalidacin: se hace necesario re-validar cuando se producen cambios,

tales como el mtodo de sntesis de la droga, la composicin del
producto terminado, algn parmetro del mtodo analtico, etc.
El grado de revalidacin necesario como as tambin otras situaciones no
enumeradas aqu que pudieran requerir revalidacin CRITERIO

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 Otras consideraciones
Aptitud del Sistema (System Suitability Testing): consiste en evaluar
los parmetros caractersticos de un mtodo farmacopeico para
verificar que los mismos se encuentren dentro de lmites aceptables.
Ejemplo:
2 t R 2 t R1
Rs
Donde tR son los tiempos de retencin y Wi son los
anchos de pico en la base
W1 W2
Donde W5% es el ancho de pico al 5% de la altura y f W5%
es la distancia del mximo del pico hasta el borde
As
inicial del pico, tambin medida al 5% de la altura 2 f

Datos anmalos o influyentes: deben ser establecidos estadsticamente (Test de Dixon,

Test de Grubbs).
Slo se consideran outliers (y por lo tanto se pueden descartar) si se encuentra una
explicacin a los mismos.

Resumiendo...
La Validacin de un Mtodo Analtico debe ser verificada nicamente por estudios de
laboratorio.
Debe estar adecuadamente documentada.
Cada parmetro de validacin debe determinarse con un patrn o sustancia de
referencia (SR).
La exigencia de uno u otro parmetro depender del uso del mtodo, es decir, del
destino del mtodo.
Los mtodos farmacopeicos no deben ser validados, excepto los destinados a
estudios de estabilidad o validacin de limpieza.
nicamente se les aplicar el test de Aptitud del Sistema (o de adecuabilidad)
Los mtodos se deben revalidar cuando se introduce algn cambio en el mismo o
cuando la matriz y/o la concentracin del analito en un producto se ha modificado.

Un Mtodo Validado es un Mtodo Confiable

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