Bilirrubina

En 1883, Ehrlich describi por primera vez una reaccin en muestras de orina de la formacin de un pigmento
rojo o azul cuando la bilirrubina se acoplo con una solucin de cido sulfanilico diazotizado. En 1913, Van
den Bergh aplico la reaccin de Ehrlich a las bilirrubinas sericas. Tambin uso alcohol como acelerador para
el acoplamiento de la bilirrubina al cido diazotizado.

Malloy y Evelyn desarrollaron la primera tcnica cuantitativa til para la bilirrubina en1937, mediante la
aceleracin de la reaccin con una solucin 50% de metanol, tcnica que evito la precipitacin de proteinas
que era una fuente de error en el mtodo de Van den Bergh. En 1938, Jendrassik y Grof usaron un
procedimiento que contena cafena-benzoato-acetatocomo acelerador para la reaccin azoacopladora.

La bilirrubina tambin se ha cuantificado con mtodos diferentes al acoplamiento al cido sulfanlico. Entre
estos mtodos se incluye una medicin directa de su color natural. La prueba incluye suero diluido con salina
hasta que iguale visualmente el color de una solucin de dicromato de potasio a 0.01%. Al nmero de veces
que debe diluirse el suero se le denomina ndice de ictericia.

En aos recientes, la bilirrubina se ha cuantificado por dilucin en una disolucin amortiguadora, seguida por
la medicin directa de la absorcin, usando un espectrofotmetro bien calibrado. Este mtodo se usa en el
laboratorio peditrico en recin nacidos en quienes el suero no contiene todava lipocromas amarillos que
interfieran. La hemolisis, que suele ser un problema en muestras peditricas, se elimina al medir una
segunda longitud de onda.

La bilirrubinometra no invasiva es ahora posible. Con varios mtodos, se determin la existencia de dos tipos
de bilirrubina. La fraccin que produjo un color en solucin acuosa en el mtodo de Van den Bergh fue
descrita como bilirrubina directa, en tanto que la fraccin que produjo un color slo despus de que se agreg
el alcohol fue denominada bilirrubina indirecta. Desde 1956 se conoce que la reaccin directa se da por el
diglucurnido de bilirrubina o bilirrubina conjugada, que es soluble en agua.

La reaccin indirecta, por lo tanto, est considerada por la bilirrubina no conjugada, que es insoluble en agua
pero se disuelve en alcohol para acoplarse con el reactivo diazo. Las bilirrubinas directa e indirecta deben
reportarse como conjugada y no conjugada, respectivamente. Con mayor frecuencia, se reportan bilirrubina
total y conjugada. La bilirrubina no conjugada puede determinarse al restar la bilirrubina conjugada de la
bilirrubina total.

Seleccin del mtodo

Por desgracia, ningn mtodo nico para la determinacin de bilirrubina reunir todos los requisitos de
laboratorio clnico. Para la evaluacin de ictericia en recin nacidos el mtodo de la espectrofotometra directa
es satisfactorio. Las fuentes de error en esta tcnica son la turbiedad, la hemolisis y los pigmentos lipocromos
amarillos.

La hemolisis y la turbiedad pueden eliminarse al medir una segunda longitud de onda, pero los lipocromos
amarillos no se pueden eliminar. Por lo tanto, este mtodo slo es vlido para recin nacidos, cuyo suero no
contiene lipocromos. En pacientes con ms de un mes, es necesario un procedimiento colorimtrico-diazo.
La mayora de los investigadores que han comparado los diferentes mtodos para la medicin de bilirrubina
estn de acuerdo en que casi todas las tcnicas disponibles darn resultados exactos para la bilirrubina total,
siempre que se disponga de estndares buenos. As, la eleccin del mtodo debe considerar si se prefiere una
tcnica manual sobre una automatizada, y si se determinara la bilirrubina directa. La eleccin de un mtodo
para la bilirrubina directa plantea los problemas ms grandes porque no hay mtodo de referencia o
estandarizacin adecuada disponible. Si se desea un procedimiento manual, entonces se aconseja el mtodo de
Evelyn-Malloy o el de Jendrassik-Grof. El segundo es ligeramente ms complejo pero tiene ventajas sobre el
mtodo de Evelyn-Malloy porque:
 Es insensible a cambios del pH en la muestra.
Es insensible a una variacin de 50 veces la concentracin proteica de la muestra.
Tiene sensibilidad adecuada, aun en concentraciones bajas de bilirrubina.
Tiene una turbiedad mnima y un blanco del suero relativamente constante.
No se ve afectado por la hemoglobina superior a 750 mg/dl.

Desde que Jendrassik-Grof desarrollaron el procedimiento original, se han realizado varias modificaciones
para acelerar la reaccin, reducir la interferencia, etc. Varios procedimientos de bilirrubina comercial ahora
usan un mtodo modificado de Jendrassik-Grof. Actualmente es una tcnica popular para los analizadores de
muestreo discreto que hay en el mercado.

Los mtodos recomendados para la determinacin de la bilirrubina total que usan todas las maquinas
automatizadas suelen dar resultados equivalentes. Por desgracia, las tcnicas para la bilirrubina directa no son
tan confiables. El mejor mtodo para la medicin de pequeas cantidades de la bilirrubina srica conjugada es
uno de investigacin que usa cromatografa liquida de alta resolucin, pero es demasiado difcil para uso
rutinario en el laboratorio. Casi todos los laboratorios clnicos usan el mtodo de Evelyn-Malloy o el de
Jendrassik-Grof.

Mtodo de Jendrassik-Grof para la determinacin de la bilirrubina conjugada

Se agrega suero o plasma a una solucion de acetato de sodio y benzoato de sodio-cafeina, a la que luego se le
agrega acido sulfanilico diazotizado para formar azobilirrubina purpura. El acetato de sodio amortigua el pH
de la reaccion de diazotizacion, mientras el benzoato de sodio-cafeina acelera el acoplamiento de la
bilirrubina con el acido sulfanilico diazotizado.

Esta reaccion es terminada con la adicion de acido ascorbico, que destruye el exceso del reactivo diazo. Se
agrega una solucion tetrato fuertemente alcalina para convertir la azobilirrubina purpura en azobilirrubina
azul, y la intensidad del color se lee a 600 nm.

Recoleccin de la muestra y almacenamiento.

Es preferible una muestra srica en ayunas, que no sea de naturaleza hemolizada ni lipmica. Antes de la
prueba, el suero debe guardarse en la oscuridad y medirse en cuanto sea posible (antes de 2 o 3 h) despus de
la recoleccin. El suero puede almacenarse en la oscuridad en un refrigerador por ms de una semana, y en el
congelador por un mes sin un apreciable cambio en la concentracin de bilirrubina.

Comentarios y fuentes de error.

La sangre normal contiene bilirrubina no conjugada. Alguna bilirrubina conjugada se reporta como normal
porque la metodologa disponible actual recupera parte de la bilirrubina total como un falso positivo. Sin
embargo, los mejores mtodos de rutina mantienen este error tcnico a un mnimo y reportan lmites
superiores de lo normal de menos de 0.2 mg/dl para la bilirrubina srica conjugada. En este mtodo se
compensan los pigmentos lipocromos, que estn presentes en el suero de adultos y nios de varios meses o
mayores. Sin embargo, una muestra hemolizada causar una disminucin en la bilirrubina srica en este
mtodo. Adems, debido a que la lipemia causa interferencia, son preferibles las pruebas sanguneas en
ayunas. Ocurre una prdida seria de bilirrubina despus de la exposicin a la luz fluorescente y a la del sol
indirecta y directa. Por tanto, es imperativo que se mantenga al mnimo la exposicin de muestras y
estndares a la luz, y que las pruebas y estndares se refrigeren en la oscuridad hasta que se realicen las
pruebas.
Urea

Las mediciones de urea se realizaron al principio en un filtrado libre de protenas de sangre total y con base en
la medicin de la cantidad de nitrgeno. Los mtodos analticos actuales han retenido esta costumbre y, por lo
comn, la urea se expresa en trminos de la concentracin de nitrgeno en vez de la concentracin de urea.

Se han empleado dos mtodos analticos para evaluar la urea. El ms antiguo y el que se usa con ms
frecuencia conlleva la hidrolisis de urea mediante la enzima ureasa (amidohidrolasa de urea), seguida de la
cuantificacin de ion amonio (NH4+) producido en la reaccin.

Con los primeros metodos colorimetricos se empleaba el reactivo de Nessler o la reaccion de Berthelot con
nitroprusiato para detectar NH+.5 El metodo cinetico mas comn empleado clinicamente acopla la reaccion
de ureasa con la deshidrogenasa de L-glutamato) y mide la tasa de desaparicion del dinucleotido de
nicotinamida y adenina (NADH reducido) a 340 nm.

Se ha descrito una modificacion de este metodo con ureasa bacteriana para medir urea en muestras de orina.
El amonio de la reaccion de ureasa se puede medir tambin por el cambio de color relacionado con un
indicador de pH. Este metodo ha sido incorporado en instrumentos que usan reactivos liquidos, un formato de
pelicula multicapas, y tiras de reactivo. Se puede usar un electrodo para medir la tasa dem incremento en la
conductividad cuando se producen iones amonio de la urea. La urea puede medirse por condensacion con
diacetil monoxima con la presencia de un cido fuerte y un agente oxidante para formar un derivado de
diacina amarillo. El hierro (III) y la tiosemicarbacida se adicionan para estabilizar la reaccin mixta a color.
La ventaja principal de este metodo directo de medicion de urea es que el amoniaco no interfiere. En otro
mtodo directo la urea reacciona con el o-ftalaldehido y la naftiletilendiamina para formar un cromogeno que
se puede medir.Se ha propuesto la espectrometria de masa con dilucin de isotopo como un mtodo definitivo
para urea El ensayo enzimatico acoplado de ureasa/GLDH realizado en un filtrado libre de proteina ha sido
usado como un mtodo de referencia.

La concentracin de urea se puede medir en plasma, suero u orina. Si se recolecta plasma, se deben evitar los
iones amonio y las concentraciones altas de citrato de sodio y fluoruro de sodio. El citrato y el fluoruro
inhiben la ureasa. Aunque el contenido de proteina de la dieta afecta la concentracion de urea, el efecto de una
sola comida que contenga protena es minimo y, por lo regular, no se requiere muestra de ayuno. Se
recomienda una muestra no hemolizada. La urea es susceptible a descomposicin bacteriana, asi que se deben
refri

Creatinina

Los mtodos empleados con ms frecuencia para medir creatinina se basan en la reaccin de Jaffe descrita por
primera vez en 1886.23 En esta reaccin, la creatinina reacciona con el cido picrico en disolucin alcalina
para formar un cromogeno rojo-naranja. Se obtienen resultados ms exactos cuando la creatinina en un
filtrado libre de protena se absorbe en tierra de Fuller (silicato de magnesio de aluminio) o reactivo de Lloyd
(silicato de aluminio de sodio), luego se eluye y se hace reaccionar con picrato alcalino. Debido a que este
mtodo es tardado y no se automatiza con facilidad, no se emplea de forma rutinaria.

Se han empleado dos mtodos para incrementar la especificidad de mtodos de anlisis para creatinina: un
mtodo de Jaffe cinetico y reaccin con varias enzimas. En el mtodo de Jaffe cintico, el suero se mezcla con
picrato alcalino y se mide la tasa de cambio en la absorbancia. Aunque este mtodo elimina algunos de los
reactantes no especificos, est sujeto a interferencia por cetoacidos a y cefalosporinas. La bilirrubina y la
hemoglobina pueden causar un sesgo negativo, probablemente un resultado de su destruccin en la base fuerte
utilizada. El mtodo de Jaffe cintico se emplea de forma rutinaria a pesar de estos problemas porque no es
caro, es rapido y facil de realizar.

Otro mtodo para el anlisis de creatinina ha sido la medicion del color formado cuando la creatinina
reacciona con 3,5-dinitrobenzoato. Este metodo ha sido adaptado con exito a una tira reactiva. Sin embargo,
el color producido es menos estable que el del cromogeno de Jaffe. Se han desarrollado metodos de
cromatografia liquida de alta presion (CLAP). En uno de los metodos se emplea el pretratamiento de la
muestra con cido tricloracetico para remover proteina, cromatografia de intercambio ionico y deteccion
ultravioleta (UV) de creatinina. Otro metodo combina la separacion por CLAP con determinacion
enzimaticade concentracion de creatinina. Ambos metodos han sido recomendados como metodos de
referencia paracreatinina serica. La espectrometria de masas con dilucin de isotopo ha sido propuesta como
un metodo definitivo.
cido rico

Como se muestra en la figura 9-4, el cido rico se oxida fcilmente a alantoina y, por tanto, puede funcionar
como un agente reductor en las reacciones qumicas. Esta propiedad se aprovechaba en los primeros
procedimientos analticos para la determinacin de cido rico. El mtodo ms comn de este tipo es el de
Caraway, que se basa en la oxidacin de cido rico en un filtrado libre de protena, con una reduccin
posterior de cido fosfotungstico a azul de tungsteno. El carbonato de sodio provee un pH alcalino necesario
para la formacin de color. Este mtodo carece de especificidad.

Los mtodos en los que se emplea uricasa (oxidasa de urato, EC 1.7.3.3), la enzima que cataliza la oxidacin
de cido rico a alantoina, son ms especficos. En el ms simple de estos mtodos se mide la absorcin
diferencial de cido rico y alantoina a 293 nm.

Se han desarrollado mtodos con reacciones enzimticas acopladas para medir el perxido de hidrogeno
producido cuando el cido rico es convertido en alantoina. La peroxidasa o catalasa se emplea para catalizar
una reaccin de indicador qumico. El color producido es proporcional a la cantidad de cido rico en la
muestra.

Se han elaborado mtodos de CLAP con varios tipos de columna. Estos metodos son sensibles y especificos;
podra ser necesario el tratamiento previo de la muestra para eliminar protena. La espectrometria de masas
con dilucion de isotopo ha sido propuesta como un posible metodo definitivo. El cido urico es estable en
plasma o suero despus de que han sido eliminados los eritrocitos. Las muestras de suero pueden ser puestas
en refrigeracion durante 3 a 5 dias.
Lactato

Mtodos espectrofotomtricos

La LD esta distribuida de manera extensa en el cuerpo. Las actividades altas se encuentran en el

corazon, higado,musculo esqueletico, rinon y eritrocitos; cantidades menores se encuentran en los
pulmones, musculo liso y cerebro. piruvico con la coenzima NAD+. La secuencia de reaccin se
describe en la ecuacin

Lactato + NAD+ piruvato + NADH + H+

La reaccion puede proceder ya sea en direccion directa (lactato [L]) o inversa (piruvato [P]). Ambas
reacciones han sido usadas en ensayos clinicos. La velocidad de la reaccion inversa es casi tres
veces mas rapida, lo que permite volumenes de muestra mas pequenos y tiempos de reaccion mas
cortos. Sin embargo, la reaccion inversa es mas susceptible al agotamiento de sustrato y perdida de
linealidad. El pH optimo para la reaccion directa es 8.3 a 8.9; para la reaccion inversa es 7.1 a 7.4.

La enzima lactato deshidrogenasa cataliza la oxidacin del lactato a piruvato con la reduccin
simultnea del NAD+ a NADH. Un mol de NAD+ se transforma en un mol de NADH por cada mol
de lactato presente en la muestra. La absorbanciadel NADH es directamente proporcional a la
concentracin de lactato.
El lactato de la muestra es oxidado por la enzima especfica lactato oxidasa (LOD). El perxido de
hidrgeno formado en esta reaccin es luego utilizado por la peroxidasa (POD) para generar un
cromgeno.
LOD
L-lactato + O2 piruvato + H2O2
POD
H2O2 + TOOS + 4-AAP cromgeno + 2 H2O
La intensidad cromtica del complejo formado es directamente proporcional a la concentracin de
L-lactato en la muestra y se determina midiendo el aumento de absorbancia a 540-550 nm.

Mtodos de oxidacin qumica

Utilizan permanganato o dixido de manganeso para degradar el lactato a acetaldehdo, monxido o

dixido de carbono. El acetaldehdo puede medirse espectrofotomtricamente o por cromatografa
de gases. Estos mtodos son laboriosos y lentos y adems es necesario controlar cuidadosamente las
condiciones de reaccin para evitar inexactitudes. Por estos motivos, son poco utilizados
actualmente en el laboratorio clnico, y estn en desuso.

Bibliografa
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