KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. TUJUAN PERCOBAAN
Setelah percobaan ini, mahasiswa diharapkan dapat :
Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi
Mengoperasikan alat kromatografi cair dengan baik dan benar
Menganalisa suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif
dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.

II. ALAT DAN BAHAN YANG DIGUNAKAN

Alat yang digunakan
Perangkat HPLC + Ijnektor + pencetak kromatogram
Kolom licosphere C-18
Syiringe
Penyaring milipone
Bahan yang digunakan
Cafein
Methanol

III. TEORI SINGKAT

Kromatografi adalah metode suatu proses fisik yang digunakan untuk
memisahkan komponen-komponen dari suatu campuran senyawa kimia. Dalam
kromatografi, campuran tersebut dibuat sebagi zona yang sempit (kecil) pada
salah satu ujung media porus seperti adsorben, yang disebut alas atau landasan
kromatografi. Zona campuran kemudian digerakan dengan larutan suatu cairan
atau gas yang bergerak sebagai pembawa, melaui media porus tersebut, yang
berupa partikel-partikel yang diam (tidak bergerak, statisiones). Sehingga
akibatnya masing-masing komponen dari campuran tersebut akan terbagi
(terdistribusi) secara tidak merata antara alas yang diam dan cairan atau gas
yang membawanya. Akibat selanjutnya, masing-masing komponen akan
bergerak (bermigrasi) pada kecepatan yang berbeda (differential migration) dan
dengan demikian, akan sampai pada ujung lain dari alas tersebut pada waktu
yang berlainan, dan dengan demikian terjadilah pemisahan diantara komponen-
komponen yang ada. (Bahti, Husein H. 2011: 4).
Kromatografi merupakan salah satu metode pemisahan komponen-komponen
campuran yang berdasarkan distribusi diferensial dari komponen-komponen
sampel diantara dua fasa, yaitu fasa gerak dan fasa diam. Salah satu teknik
kromatografi yang dimana fasa gerak dan fasa diamnya menggunakan zat cair
adalah HPLC (High Performance Liquid Chromatography) atau didalam bahasa
Indonesia disebut KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi).
Teknik HPLC merupakan suatu metode kromatografi cair-cair, yang dapat
digunakan baik untuk keperluan pemisahan maupun analisis kuantitatif. Analisis
kualitatif dengan teknik HPLC didasarkan pada pengukuran luas area standar.
Pada prakteknya, metode pembandingan area standar dan sampel kurang
menghasilkan data yang akurat bila hanya melibatkan suatu konsentrasi standar.
Oleh karena itu, dilakukan dengan menggunakan teknik kurva kalibrasi. (Wiji,
dkk. 2010 : 17).
HPLC yang modern telah mucul akibat pertemuan dari kebutuhan, keinginan
manusia untuk meminimalis pekerjaan, kemampuan teknologi, dan teori untuk
memandu pengembangan pada jalur yang rasional. Jelas sebelum era peralatan
yang modern bahwa LC (Liquid Chromatography) memiliki kekuatan
pemisahan yang sangat ampuh, bahkan untuk komponen-komponen yang
berhubungan sangat erat. LC harus ditingkatkan kecepatannya, diotomasasi, dan
harus disesuaikan dengan sampel-sampel yang lebih kecil, waktu elusi yang
beberapa jam (Underwood, Day. 2002 : 553).
HPLC berbeda dari kromatografi kolom cairan konvensional dalam hal
digunakan bahan pengisi kolom berupa partikel yang sangat kecil berukuran
sampai 3-5 m (1m = 10-6 m). Sehingga mengharuskan digunakannya tekanan
tinggi sampai 20.000 Kpa ( 200 atmosfir) untuk mengalirkan fasa gerak melalui
kolom tersebut.
Ternyata, penggunaan bahan pengisi kolom yang lebih kecil ini bukan saja telah
memperbaiki kecepatan analisis, tapi (dari ini yang lebih penting) ialah telah
menghasilkan suatu teknik dengan daya pisah yang tinggi. HPLC mempunyai
kelemahan- kelemahan yang diantaranya, peralatannya lebih rumit, tidak murah,
dan perlu pengalaman. Untuk beberapa jenis zat, metode ini kurang sensitif.
Selain itu sampel disyaratkan harus stabil dalam larutan.
Berdasarkan kepolaran fasa geraknya, HPLC dibagi menjadi 2 macam yaitu :

a) Fase Normal HPLC

HPLC jenis ini secara esensial sama dengan kromatografi kolom. Meskipun
disebut normal, ini bukan bentuk biasa dari HPLC. Kolom ini diisi dengan
partikel silika yang sangat kecil dan pelarut nonpolar seperti heksan sebuah
kolom sederhana memiliki diameter internal 4,6 mm (dan kemungkinan kurang
dari nilai ini) dengan panjang 120 nm-250 nm. Senyawa-senyawa polar dalam
campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar
dibanding dengan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang
non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. Apabila pasangan fasa
diam lebih polar daripada fasa geraknya maka sistem ini disebut HPLC fase
normal.

b) Fase Balik HPLC

Pada HPLC jenis ini, ukuran kolomnya sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi
non polar melalui pelekatan hidrokarbon dengna rantai panjang pada
permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Dalam
kasus ini, akan terdapat interaksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul
polar dalam campuran yang melalui kolom. Interaksi yang terjadi tidak sekuat
interaksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fasa diam)
dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu molekul-molekul
polar akan lebih cepat bergerak melalui kolom. Sedangkan molekul-molekul non
polar akan bergerak lambat karena interaksi dengan gugus hidrokarbon.

Terdapat beragai zat aditif yang digunakan oleh produsen makanan dan
minuman diantaranya : natrium benzoat, vitamin c, dan kafein untuk masing-
masing tujuan tertentu. Ketiga zat aditif tersebut merupakan senyawa yang
memiliki sifat kepolaran yang berbeda, dan memiliki gugus kromofor yang
menyebabkan senyawa tersebut dapat menyerap sinar UV. Berdasarkan
karakteristik senyawa ini memungkinkan dilakukan analisis dengan teknik
HPLC yang menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar.
* Vitamin C atau asam askorbat
Vitamin berupa kristal putih dengan rumus molekul C6H8O6, larut dalam air
dan alkohol, dialam ditemukan dalam buah-buahan dan sayuran, dapat disintesis
dari glukosa. Vitamin C merupakan komponen esensial makanan manusia untuk
perawatan kulit. Kekurangan vitamin ini dapat menimbulkan sariawan, luka
pada gusi, badan kurus, dan anemia. Setiap hari diperluka 70-100 mg.
Vitamin C adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus kromofor yang
dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar UV. Karakteristik
senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC menggunakan kolom
nonpolar seperti C-18 dan fasa geak polar seperti metanol atau air.

* Natrium Benzoat atau natrium benzena karboksilat

Tanpa warna atau atau serbuk amorf putih, C6H6COONa. Larutan dalam iar dan
sedikit larut dalam etanol. Senyawa ini dibuat melalui reaksi natrium hidroksida
dengan asam benzoat dan digunakan dalam industri zat warnadan sebagai
pengawet makanan. Zat ini dulu digunakan sebagai antiseptik.

* Kafein
Alkohol dengan rumus molekul C5H10N4O2. Berupa padatan kristal berwarn
aputih dan berasa pahit, ditemukan dalam daun dan biji dari pohin kopi, dalam
daun teh, dalam biji kola.

Reservoir Pelarut
Jumlah reservoir pelarut :
(1) bisa salah satu atau lebih; berisi pelarut organik seperti heksana, atau air,
atau campuran air dan pelarut organik seperti metanol,tergantung kepada
 apakah kita bekerja menggunakan fasa normal atau fasa terbalik atau
metode kromatografilainnya.
(2) Bila system KCKT dilengkapi dengan alat pencampuran(atau mempunyai
lebih dari satu pompa) yang memungkinkan membuat campuran-campuran
pelarut dengan komposisi yang diatur dengan bantuan suatu programener,
maka diperlukan lebih dari satu reservoir, sistem ini diperlukan untuk
melakukan elusi bergradien dimana komposisi pelarut diubah-ubah selama
pengelusian.

Pelarut fasa gerak dipompa dari reservoir oleh sistem pompa, demikian sehingga
campuran pelarut dengan komposisi tertentu dapat mengalir tanpa denyutan
(pulseless). Kecepatan aliran dapat diatur antara 0,1 10 mL/menit.
Gas yang terlarut dalam pelarut fasa gerak yang digunakan harus dibuang
terlebih dahulu (de-gassing), selain itu, pelarut harus di saring dahulu agar bebas
dari partikel partikel kecil yang tidak larut Pada saluran-saluran pelarut biasanya
dipasang saringan (berukuran 2-10 m) untuk mencegah partikel-partikel kecil
yang tidak larut tadi, masuk kedalam kolom. Saringan ini harus diganti atau
dibersihkan bila terjadi penyumbatan.Diantara jenis-jenis pompa yang paling
umum digunakan untuk sistem HPLC adalah jenis pompa isap dan tekan
(reciprocating).
Pompa isap dan tekan yang sederhana mempunyai kecepatan isap yang tetap.
Artinya, waktu yang diperlukan untuk langkah mengisis sama dengan waktu
untuk langkah memompa. Pompa seperti ini memerlukan perendam denyutan
yang baik. Oleh karena itu, pompa jenis ini umumnya menggunakan dua
pengisap yang masing-masing bekerja kebalikan satu dari yang lainnya. Setiap
pengisap memppunyai dua katup pengendali.Pelarut diisap ke dalam ruang
pengisap melalui katup pemasukkan dan kemudian ditekan ke luar melalui katup
pengeluaran. Untuk melakukan elusi bergradien diperlukan dua sistem pompa
yang masing-masing mempunyai satu atau dua penghisap. Ada dua macam
rancangan utama pompa gradien yaitu pecampuran tekana tinggi yang
mempunyai hantaran dua pompa dan pencampuran tekana rendah dengan
hantaran satu pompa.Rancangan pompa gradien yang pertama, yakni sistem
pencampuran tekanan tinggi, mempunyai dua pompa dan satu pengendali,
masing-masing pompa menghantarkan satu sistem pelarut. Fungsi pengendali
adalah mengatur kecepatan aliran masing-masing pelarut sesuai dengan
komposisi yang diinginkan dan juga berfungsi untuk menjamin terjadinya
pengadukan yang baik oleh suatu pengaduk dinamik. Setiap pompa mempunyai
dua penghisap dan setiap penghisap mempunyai dua katup. Jenis yang kedua,
pompa pembagi bertekanan rendah hanya mempunyai satu penghisap. Untuk
melakukan elusi gradien hanya diperlukan satu pompa. Pompa ini mempunyai
katup pembagi, tidak mempunyai pengendali gradien.Dengan katup-katup
pembagi dimungkinkan untuk membuat suatu campuran terner (tiga jenis
pelarut) dengan perbandingan yang diinginkan. Jadi untuk melakukan gradien
gradien tidak diperlukan lebih dari satu pompa. Katup-katup pembagi ini
dikendalikan oleh suatu microprocessor dan terbuka selama langkah pemasukan
pelarut. (Bahti, Husein. H . 2011 : 34-40)

Prinsip kerja instumentasi HPLC

HPLC menggunakan fasa gerak untuk memisahkan komponen dari sebuah

campuran komponen (analit). Prinsip keja HPLC adalah pemisahan setiaap
komponen dalam sampel berdasarkan kepolarannya. Yang paling membedakan
HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan
tinggi untuk mendorong fasa gerak. Fasa diam yang biasa digunakan (pada
kolom) HPLC jenis fasa terbalik adalah RMe2SiCl, dimana R adalah rantai
alkana C-18 atau C8. Sementara fasa geraknya berupa larutan yang diatur
komposisinya (gradien elusi), misalnya : air:asetonitril (80:20), hal ini
bergantung pada kepolaran analit yang akan dipisahkan. Campuran analit akan
terpisah berdasarkan kepolarannya, dan waktu retensinya akan berbeda, hal ini
akan teramati pada spektrum yang punsak-puncaknya terpisah.
Prinsip dasar HPLC adalah pemisahan komponen-komponen terjadi karena
perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Keunggulan
menggunakan HPLC dibandingkan kromatografi gas yaitu terletak pada
kemampuannya untuk menganalisis cuplikan yang tidak menguap dan labil pada
suhu tinggi. HPLC tidak terbatas pada senyawa organik tapi mampu
menganalisis senyawa anorganik, mampu menganalisis cuplikan yang
mempunyai molekul tinggi (beratnya), mampu menganalisis cuplik yang
mempunyai titik didih yang sangat tinggi seperti polimer.

Cara kerja instumentasi HPLC

Prinsip kerja alat HPLC adalah pertama fasa gerak dialirkan melalui kolom
kedetektor dengan bantuan pompa. Kemudian cuplikan dimasukan ke dalam
aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Didalam kolom terjadi pemisahan
komponen-komponen campuran karena perbedan kekuatan interaksi antara
solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan
fasa diam akan keluar dari kolom terlebih dahulu. Sebaliknya solut-solut yang
interaksinya kuat dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih lama. Setiap
komponen yang campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detektor kemudian
direkam dalam bentuk kromatogram.

Komponen-komponen instrumentasi HPLC

1. Fasa Gerak
Fasa gerak dari HPLC merupakan zat cair yang disebut eluen atau pelarut.
Dalam HPLC fasa gerak selain berfungsi untuk membawa komponen-komponen
campuran menuju ke detektor, selain itu juga dapat berinteraksi dengan solut-
solut. Oleh karena itu, fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor
penetu keberhasilan proses pemisahan. Persyaratan zat cair yang akan digunakan
sebagai fasa gerak sebagai berikut:
a) Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan
dianalisis
b) Zat cair harus murni, untuk menghindari masuknya kotoran yang dapat
mengganggu interpretasi kromatogram
c) Zat cair harus jernih, untuk meghindari penyumbatan pada kolom
d) Zat cair harus mudah diperoleh, murah, tidak mudah terbakar dan tidak
beracun
e) Zat cair tidak kental dan harus sesuai dengan detektor

Fasa gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari
partikel-partikel kecil. Selain itu adanya gas dalam fasa gerak juga harus
dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama
do pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.
Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fasa gerak tetap selama
elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama
elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi
bergradien diguakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks
terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik
adalah campuran larutan buffer dengan metanol atua campuran air dengan
asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fasa gerak yang paling sering
digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang
terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan
fase normal ini kurang umum dibanding fase terbalik.

2. Kolom
Kolom HPLC biasanya terbuat dari stailess steel, akan tetapi ada juga yang
terbuat dari gelas berdinding tebal. Kolom utama berisi fasa diam, tepat
terjadinya pemisahan campuran menjadi komponen-komponen. Bergantung
keperluannya kolom utama dapat digunakan untuk analisis atau preparatif setiap
komponen yang keluar kolom ditampung pada tabung yang berbeda dan
keluaran HPLC dihubungkan dengan fraction colector selain kolom utama
dikenal pula kolom pengaman.
Kolom utama berisi fasa dian dan jenisnya bervariasi bergantung pada
keperluan, misalnya dikenal kolom C8, C-18, cyanopropyl, dan penukar ion.
Kolom utama untuk HPLC biasanya berukuran panjang berkisar antara 5-30 cm
dan diameter dalam berkisar 4,510 mm.

Kolom pengaman (guard coloumn) disebut juga pra-kolom karena letaknya

sebelum sistem pemasukan cuplikan. Kolom ini berukuran pendek 5 cm dengan
diameter 4,6 mm biasanya dipaking dengan partikel silika berukuran besar dari
ukuran partikel kolom utama. Kolom pengaman mempunyai dua fungsi yaitu:
menyaring kotoran yang terbawa oleh fasa gerak dan untuk menjenuhkan fasa
gerak dalam rangka menghindarkan terjadinya erosi fasa diam oleh aliran
pelarut.
Kolom merupakan jantung kromatograf, keberhasilan atau kegagalan analisis
bergantung pada pilhan kolom dan kondisi kerja yang tepat. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
a) Kolom analitik
Garis tengah dalam 2-6 mm, panjang bergantung pada jenis kemasan, untuk
kemasan pelikel biasanya panjang kolom 50-100 cm, untuk kemasan
mikropartikel berpori biasanya 10-30 cm.

b) Kolom preparatif
Umumnya bergaris tengah 6 mm atau lebih besar, dan panjang 25-100 cm.

3. Pompa

Pada HPLC, pompa ini berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui
kolom yang berisi serbuk halus. Digunakan pompa bertekanan tinggi dalam
metode ini sebagai akibat penggunaan fasa gerak yang berupa zat cair yang akan
sukar mengalir dalam kolom yang dipadatkan dengan serbuk halus. Oleh karena
itu, agar zat cair dapat melewati kolom secara tepat maka dibutuhkan bantuan
pompa yang bertekana tinggi. Pompa yang digunakan dalam HPLC harus
memenuhi persyaratan sebagai berikut :

a) Menghasilkan tekanan sampai 5000 psi

b) Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
c) Bahan tahan korosi
d) Keluaran bebas pulse

Dikenal 3 jenis pompa yang masing-masing memiliki keuntungan yaitu :

a) Pompa Reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara
gerakan piston maju mundur yang dijalankan oleh motor. Gerakan piston
memberikan aliran eluen yang konstan, memiliki volume internal kecil (35-400
mL) menghasilkan tekanan tinggi (sampai 10.000 psi). Piston berupa batang
gelas dan berkontak lengsung dengan pelarut.

b) Pompa Displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) tersiri dari tabung yang dilengkapi
pendorong yang digerakkan oleh motor. Menghasilkan aliran yang cenderung
tidak tergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. Memiliki
keterbatasan kapasitas pelarut ( 250 mL) dan tidak mudah untuk pergantian
pelarut.

c) Pompa Pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi.Pompa jenis ini
murah, tetapi memiliki keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan
(<2000 psi) kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan tekanan balik
kolom.

4. Injector Sample

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikan secara langsung ke dalam fase

gerak yang mengalir dibawah tekanan menuju kolom menggunakan alat
penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang
dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.
Salah satu jenis penyuntik untuk memasukan sampel ke dalam sistem (kolom)
kromatografi adalah penyuntik loop.
Dalam prakteknya, loop tidak perlu diisi penuh, tapi bila tidak diisi penuh
akan mengakibatkan lebih jeleknya presisi hasil eksperimen dan ketergantungan
presisi tersebut kepada bagaimana si-operator menggunakan penyuntik.
Perlu diingat, bahwa penyuntik tidak boleh dicabut sebelum pegangan (handle)
penyuntik diputar dari posisi load (pengisap) ke posisi inject (suntik).
Karena sampel akan mengalir ke saluran pembuangan. Hal yang terakhir ini
tentunya tidak diinginkan, pegangan penyuntik harus diputar cepat agar
pemutusan aliran ke dalam diinginkan. Pegangan penyuntik harus diputar cepat
agar pemutusan aliran ke dalam kolom, antara posisi pengisian (load) dan posisi
penyuntikan (inject) berlangsung cepat.Yang menjadi faktor ketidak tepatan
pengukuran HPLC salah satunya terletak pada keterulangan pemasukan cuplikan
kedalam paking kolom. Masalahnya kebanyakan memasukan cuplikan kedalam
kolom dapat menyebabkan band broadening. Oleh karen itu cuplikan yang
dimasukkan harus sekecil beberapa puluh mikroliter. Beberapa teknik
pemasukan cuplikan kedalam sistem dapat diuraikan sebagai berikut :
a) Injeksi Syringe
Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe
yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Akan tetapi keterulangan injeksi stringe ini
sedikit lebih baik dari 2-3 % dan sering lebih jelek.

b) Injeksi Stop Flow

Aliran pelarut dihentikan sementara, sambungan pada ujung kolom dibuka dan
cuplikan disuntikan langsung kedalam ujung kolom. Setelah menyambung
kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. Untuk memasukkan cuplikan
kedalam fasa gerak perlu dua langkah : sejumlah volume cuplikan disuntikkan
ke dalam loop dan posisi load. Cuplikan masih berada dalam loop ; kran
diputar untuk mengubah posisi load menjadi posisi injeksi dan fasa gerak
membawa cuplikan kedalam kolom (kran cuplikan).

c) Kran Cuplikan
Jenis pemasukan cuplikan ini disebut juga loop dan paling banyak digunakan.
Untuk memasukan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu 2 langkah, yaitu:
sejumlah volume cuplikan disuntikan ke dalam loop dalam posisi load, cuplikan
masih berada dalam loop; kran diputar untuk mengubah posisi load menjadi
posisi injeksi dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.
 5. Detektor

Ada dua jenis detektor yaitu detektor selektif, adalah detektor yang peka
terhadap golongan senyawa tertentu saja. Dan detektor universal, yaitu detektor
yang peka terhadap golongan senyawa apapun kecuali pelarutnya. Diantara
detektor yang digunakan dalam KCKT adalah
a) Detektor Universal
Detektor Ultra Violet Visible (Sinar Tampak)
Detektor UV terutama digunakan untuk pendeteksian senyawa-senyawa organik.
Detektor UV dilengkapi dengan pengatur panjang gelombang, sehingga panjang
gelombang UV yang digunakan dapat dipilih sesuai dengan jenis cuplikan yang
diukur.
Detektor UV-Visible (uv-sinar tampak) paling banyak digunakan, karena
sensitivitasnya yang baik mudah menggunakannya, tidak merusak senyawa yang
di analisis, dan memungkinkan untuk melakukan elusi bergradien. Ada yang
dipasang pada panjang gelombang tetap yaitu pada panjang gelombang 254 nm,
dan ada yang panjang gelombangnya dapat dipilih sesuai dengan diinginkan
antara 190-600 nm. Detektor dengan panjang gelombang variabel ini ada yang
dilengkapi alat untuk memilih panjang gelombang secara otomatis dan dapat
me-nol-kan sendiri (allto zero). Detektor jenis ini juga ada yang menggunakan
drode erray (sebagai pengganti photo tube), sehingga dapat melakukan
pembacaan absorban yang kontinyu pada berbagai panjang gelombang.

Detektor Indeks Bias

Detektor indeks bias memberi respons terhadap senyawa yang dianalisis apapun,
termasuk pelarutnya sendiri. Prinsip dasar kerja detektor ini adalah perubahan
indeks bias karena adanya komponen sampel dalam pelarut. Detektor ini bersifat
tidak merusak (non-destruktif), sensitivitasnya cukup tinggi (minimum 10-6 g)
dan umumnya digunakan dalam pekerjaan preparatif. Dengan detektor ini tidak
dapat dilakukan elusi bergradien. Detektor ini digunakan dalam kromatografi
eklusi dan dalam analisis karbohidrat.
Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam menggunakan detektor indeks bias :
Bila digunakan lebih dari satu pelarut, maka campuran dahulu hingga
homogen dan bebaskan dari gas terlarutnya.
Setelah detektor dihidupkan, tunggu beberapa lama sebelum digunakan
sampai detektor stabil.
Bila digunakan lebih dari satu detektor yang dipasang berurutan, maka
tempatkanlah detektor indeks bias pada urutan terakhir.
Untuk saluran pembuangan, gunakanlah selang teflon berdiameter dalam
(inner diameter) yang besar tapi pendek.
Tempatkan detektor pada kondisi suhu yang dipelihara tetap.
Jaga agar sel indeks bias selalu bersih.
Sel pembanding harus diisi dengan pelarut yang telah dilewatkan melalui
kolom,
Detektor Spektrometer Massa
 Detektor Spektrometer Inframerah

b) Detektor Selektif
Detektor Fluoresensi
Didasarkan kepada prinsip bahwa molekul-molekul tertentu dapat menyerap
energi pada panjang gelombang yang lebih pendek membentuk suatu keadaan
tereksitasi dan kemudian secara hampi bersamaan turun kembali ke keadaan
dasar (ground state) dengan memancarkan energi pada panjang gelombang yang
lebih panjang.

Detektor Konduktivitas Listrik

Detektor elektrokimia biasanya didasarkan pada daya hantar listrik
(konduktometri) dan polarografi. Detektor jenis konduktometri biasanya
digunakan untuk mendeteksi solut-solut yang dapat mengalami reaksi redoks
baik senyawa organik maupun anorganik. Adapun persyaratan detektor yaitu:
cukup sensitif, stabilitas, dan keterulangan tinggi, tidak erusak cuplikan, respon
linier terhadap solut, reliabilitas tinggi dan mudah digunakan.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut :
a) Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprousibel
b) Mempunyia sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada
kadar sangat kecil
c) Stabil dalam pengoperasiannya
d) Mempunyia sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan
pelebaran pita
e) Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada
kisaran yang luas

6. Rekorder

Rekorder adalah alat untuk mencetak hasil percobaan pada lembar berupa
kumpulan puncak (kromatogram) kromatogram HPLC yang didapat berguna
untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Luas peak menyatakan konsentrasi
komponen dalam campuran dan jumlah peak menyatakan jumlah komponen.
Analisis kualitatif dapat dilakukan dengan cara membandingkan waktu retensi
(rt) analit atau sampel dengan waktu retensi standar. Sedangkan analisis
kuantitatif depat dilakukan dengan didasarkan pada luas peak atau tinggi peak
dengan metode standar kalibrasi.
IV. LANGKAH KERJA

1. Terlebih dahulu menyiapkan fase gerak yang akan digunakan untuk analisa
dan memasukkan ke botol fase gerak yang tersedia.
2. Memeriksa ketersediaan cairan seal wash pada pompa, bila habis (sudah
lama harap ditambahkan).
3. Memasang kolom sesuai kebutuhan analisa (posisi panah kolom kearah
bawah)
4. Menyalakan instrument,pompa,detector (tombol power ada di belakang
instrument).
5. Menjalankan CPU computer dan monitor.
6. Mengaktifkan server monitor pada pojok kanan bawah layar monitor.
7. Membuka software choromeon 6.8
8. Membuka panel instrument (bila ada warning tekan OK)
9. Melakukan koneksi software pada instrument dengan memberikan tanda
ceklis pada pump dan detector.
10. Melakukan purging pada chanel fase gerak yang akan digunakan :
Melakukan knob purging pada pompa
Mengatur prosentasi pada pompa
Klik purge pada software
 Bila selesai purging, menutup kembali knob purgenya
11. Mengalirkan kolom dengan fase gerak yang diinginkan pada flow 1
ml/menit.
12. Menyalakan lampu UV/Vis pada detector sesuai kebutuhan analisa
13. Membiarkan kolom beraliri fase gerak selama 30-60 menit.
14. Memindahkan window software keposisi browser.
15. Membuat squent, instrument method (program) dan processing data.
16. Bila sequent, program dan proses method telah dibuat,klik batch start.
17. Mengklik ready check untuk memastikan sequent telah siap running, lalu
start.
18. Melakukan injeksi standart dan sampel.
Catatan : bila ingin menginjek sampel, posisi injeksi pada posisi LOAD
(atas),bila sudah ada warning waiting for injection , lalu memutar injector
keposisi inject.
19. Melakukan processing data (ada pada logam bagian prose kuantitasi)
20. Bila analisa telah selesai,mencuci terlebih dahulu kolom yang digunakan
dengan kandunangan air : Me OH selama 30-60 menit.
21. Mengakhiri pencucian kolom dengan dialiri methanol 100% selama 30
menit.
22. Mematikan flow pompa dan lampu yang digunakan.
23. Menutup software cromelon beserta monitornya.
24. Mematikan instrument HPLC dan software nya.

DAFTAR PUSTAKA

http://noviechemist.blogspot.co.id/2013/01/laporan-praktikum-hplc.html
Diakses pada : 9 Mei 2016 pukul 16 : 07

Lutfi Achmad.2009.kromatografi Cair kinerja Tinggi