Desde el laboratorio a la clnica
Interpretacin de la electroforesis de hemoglobina
Desde el laboratorio a la clnica
E. Cela, C. Belndez y P. Galarn
Interpretacin de
la electroforesis de
hemoglobina
Elena Cela, Cristina Belndez y Paloma Galarn
Seccin de Oncohematologa Peditrica. Departamento de Pediatra. Hospital General Universitario Gregorio Maran. Madrid. Espaa.
ecela.hgugm@salud.madrid.org; cbelendez.hgugm@salud.madrid.org; pgalaron.hgugm@salud.madrid.org
De forma genrica, los sndromes clnicos que resultan de
las alteraciones de la hemoglobina (Hb) se conocen como
hemoglobinopatas y para conocerlos se interpretan diversas
pruebas de laboratorio, de las cuales la ms relevante es la
electroforesis (EF) de Hb.
La molcula de Hb humana1 est formada por 2 pares
de cadenas de globina, y a cada una de ellas se une una
Puntos clave
La electroforesis de hemoglobina es la prueba
de laboratorio ms relevante para el diagnstico
de los sndromes clnicos que resultan de las
alteraciones de la hemoglobina, es decir, de las
hemoglobinopatas.
Las 2 categoras fundamentales de
hemoglobinopatas son las variantes estructurales
y los sndromes talasmicos.
La electroforesis ms utilizada de forma inicial es
la realizada en acetato de celulosa a pH alcalino,
aunque en la actualidad muchas veces es desplazada
por la cromatografa lquida de alta resolucin.
Para la interpretacin de la electroforesis de
hemoglobina siempre hay que contar adems
con la historia clnica y otros mtodos de anlisis,
como el hemograma, el frotis de sangre perifrica, la
cuantificacin de HbA2 y HbF, el test de solubilidad y el
test de falciformacin.
Si hay dificultades de interpretacin pueden
usarse mtodos como el isoelectroenfoque o
incluso tcnicas de biologa molecular para anlisis
de ADN.
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molcula de hemo. Fisiolgicamente, se forman 6 va-
riantes:
Tres variantes transitorias embrionarias, denominadas Hb
Gower 1, Hb Gower 2 y Hb Portland.
HbF, que es la que predomina en la vida fetal.
HbA, que constituye ms del 95% de la Hb del adulto.
HbA2, tambin presente en un porcentaje menor (1-3,5%)
en el nio y en el adulto.
Las cadenas de globina que forman la molcula de Hb pos-
natalmente se asocian con la forma de un tetrmero, y se
designan como , , y . As, las variantes de Hb se for-
man por las siguientes cadenas hasta un total de 4:
HbA: 22.
HbF: 22.
HbA2: 22.
Hay muchas variantes de Hb determinadas genticamente
(heredadas)2 y aunque la mayora son inocuas, otras ocasio-
nan alteraciones clnicas notables. Las hemoglobinopatas
pueden agruparse en 3 categoras fundamentales, las ms
relevantes son las 2 primeras:
Variantes estructurales de la Hb, como la HbS (anemia
falciforme o drepanocitosis). Se atribuyen a la sustitucin
de aminocidos en las cadenas de globina. Se han descri-
to casi un millar, pero la mayora son un hallazgo casual
y clnicamente silentes. Las que ocasionan enfermedad se
deben a la sustitucin de aminocidos que conlleva cam-
bios en la estructura secundaria o terciaria del tetrmero
de Hb.
Fallo en la sntesis de una cantidad adecuada de Hb
normal (talasemias) por defecto en la produccin de 1 o
ms de las cadenas de globina. La clnica asociada surge
de la combinacin de una inadecuada sntesis de Hb y

de la acumulacin de cadenas de globina que no han
podido formar el tetrmero. Lo primero causa anemia
y microcitosis, y lo segundo, eritropoyesis ineficaz y
hemlisis.
Fallo en el salto normal que se produce en el neonato
de producir HbF a HbA (persistencia hereditaria de Hb
fetal).
La investigacin de los pacientes con sospecha de su-
frir una hemoglobinopata debe incluir una anamnesis
completa con antecedentes familiares, exploracin fsica
y anlisis de laboratorio. Estas pruebas se definieron ya
en 1975 por un panel de expertos del Comit Interna-
cional para la Estandarizacin en Hematologa 3-5: con-
taje de serie roja con ndices; Hb; hematocrito; frotis de
sangre perifrica; reticulocitos; metabolismo del hierro;
test de solubilidad; test de falciformacin; cuantifica-
cin de HbA 2 y HbF, y EF de Hb a pH alcalino. Si la
Hb detectada es inestable o con afinidad por el oxgeno
alterada, hay que aadir el test de estabilidad trmica
(por calor) y qumica (isopropanol). De este modo, se
puede hacer un diagnstico fiable en la mayora de los
casos, aunque a veces hay que recurrir a tcnicas ms
sofisticadas como la EF a pH cido, el estudio de globi-
nas, el isoelectroenfoque o incluso el anlisis molecular
de ADN.
Aunque las EF son muy utilizadas, en la actualidad mu-
chas veces estn desplazadas por la cromatografa lquida
de alta resolucin (HPLC)6, que es muy til para cuantifi-
car de forma rpida HbA2 y HbF, as como para identifi-
car variantes estructurales. Este mtodo es imprescindible
cuando se trata de analizar gran cantidad de muestras en
poco tiempo, como en el caso del cribado neonatal de ane-
mia falciforme.
Electroforesis en
acetato de celulosa
a pH alcalino1,7
Rutinariamente se realiza este tipo de EF a pH 8,4-8,6
usando una membrana de acetato de celulosa como sustrato,
y es un mtodo simple, rpido y sensible. Detecta las va-
riantes de Hb ms comunes, y tradicionalmente es la tcnica
ms utilizada para la evaluacin inicial.
A pH alcalino, la Hb es una protena cargada nega-
tivamente y que en un campo elctrico migra hacia el
nodo (+). Las variantes de Hb con distintas cargas en
su superficie se separan de la HbA y, por tanto, todas
las detectadas son diferentes de ella. Pueden haber Hb
anormales sin cambio en la carga, y por tanto no sern
diferenciadas
La figura 1 muestra las variantes de Hb ms frecuentes de-
tectadas por esta tcnica y puede observarse que se obtiene
una separacin de las HbC, S, F, A y J. Cuando se detecta
una variante es til cuantificar el porcentaje estimado por
un procedimiento similar al explicado ms adelante para la
HbA2 o por HPLC.
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Dificultades de
interpretacin8
Puede ser difcil detectar bandas menores como Hb Cons-
tant Spring, HbA2, Hb Bart y HbH.
En el neonato, en el que hay pequeas cantidades
de HbA y enormes de HbF, puede ser difcil detectar
HbA. Por eso siempre hay que recurrir a la EF en agar
citrato cuando no se detecte HbA, o utilizar isoelectro-
enfoque.
No es posible diferenciar entre HbS, D y G. No es
posible diferenciar entre HbC, E y O. Por ello, todas
las muestras en las que se detecta una sola banda en la
posicin de la HbS o C tambin se deben analizar en
agar citrato o con isoelectroenfoque para excluir la pre-
sencia de heterocigotos compuestos como HbSD, SG,
CE o CO.
Electroforesis
a pH cido
Es muy efectiva en la deteccin inicial de variantes de
Hb en combinacin con la anterior. La mayora de las
Hb tiende a desplazarse igual que la HbA, y las que lo
hacen de forma distinta es porque el aminocido sus-
tituido est relacionado con la unin al 2,3 DPG. Los
factores que intervienen en la separacin de las Hb son,
adems de la carga elctrica, las interacciones fisico-
qumicas entre la fase slida (agar) y las molculas de
Hb, que dependen de la localizacin superficial de la
mutacin.
La EF en agar citrato se realiza a pH 6 y presenta ms
problemas tcnicos que la anterior. Diferencia a la
HbC, S, A y F, y en ella corren igual que la A las HbD,
E, G, lepore, H y J; la Barts se sita en la misma po-
sicin que la F. En acetato de celulosa a pH 6,5 se se-
paran las HbH y Barts de otras variantes de movilidad
rpida.
Ctodo ()
Origen
C ----------- A2, E, O
S ----------- D, G
-----------
----------- F
A -----------
J -----------
----------- Barts
----------- H
nodo (+)
Figura 1. Representacin esquemtica de la movilidad de
algunas hemoglobinas anormales en electroforesis alcalina.
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Estimacin de la HbA2 Entre el 3,8 y el 8%: rasgo -talasemia, Hb inestables.

El aumento en la HbA2 es caracterstico de la talasemia
heterocigota. Se pueden hacer estimaciones tras elucin
desde una EF en acetato de celulosa o por cromatografa, ya
sea en microcolumna o por HPLC9,10.
Elucin desde acetato de celulosa: la separacin entre
HbS y A2 cuando la primera est presente, est disminuida.
Igualmente, este mtodo no es apropiado en presencia de
HbC, E y O, ya que la movilidad de stas es igual que la de
HbA2.
Cromatografa en microcolumna: depende de la interac-
cin de los grupos con carga de la resina de intercambio
inico de la columna con los grupos de la molcula de Hb.
La separacin de los componentes depende del pH, la carga
inica del buffer que se inyecta en la columna, el tipo de re-
sina, el volumen que se aade y el flujo.
HPLC: el mecanismo es similar al anterior y las fracciones
eludas se detectan por un detector de luz ultravioleta/visible
que integra los resultados a travs de un ordenador. El pro-
cedimiento es muy rpido, exacto y reproducible.
Interpretacin de los
valores de HbA2
Mayores del 8%: estos valores son raros. Repetir y excluir
una variante estructural.
Entre el 3,4 y el 3,7%: rasgo -talasemia con ferropenia,
rasgo -talasemia con variante adicional de variante de ca-
dena , interaccin de y -talasemia, difcil medicin por
presencia de HbS, interaccin de -talasemia y HbS, error
analtico.
Menores del 3,5%: resultado normal, talasemia, raros
casos de rasgo -talasemia, talasemia, enfermedad de la
HbH.
Estimacin de la HbF
La HbF puede estimarse por diversos mtodos basados en
su resistencia a la desnaturalizacin a pH alcalino o por
HPLC.
Interpretacin de los
valores de HbF
Entre el 0,2 y el 1%: normal.
Entre el 1 y el 5%: en 30-50% de los rasgos -talasemia, algu-
nas variantes heterocigotas y homocigotas de Hb, algunos hete-
rocigotos compuestos de variantes de Hb y rasgo -talasemia,
algunas enfermedades hematolgicas (aplasias, mielodisplasias,
etc.), espordico en algunas poblaciones afrocaribeas.
Entre el 5 y el 20%: ocasionalmente en rasgo -talasemia,
algunas variantes de Hb homocigotas, algunos heterocigo-

Tabla 1. Resultados en el hemograma y electroforesis en variantes de HbS y talasemia

Hb VCM HbS (%) HbA (%) HbA2 (%) HbF (%)

AS (rasgo falciforme) N N 35-48 52-65 < 3,5 <1

SS (anemia falciforme) N 88-93 0 < 3,5 5-10

S-0 talasemia 88-93 0 > 3,5 5-10

S-+ talasemia 50-93 3-30 > 3,5 1-10
-talasemia minor 0 70-95 > 3,5 1-10
-talasemia major 0 0 , N, > 45
a-talasemia rasgo N, N, 0 < 3,5 <1
Hb lepore (portador) 0 < 3,5 <1
-talasemia 0 < 3,5 5-20

Hb: hemoglobina; VCM: volumen corpuscular medio.

Tabla 2. Sugerencias en el diagnstico diferencial de variantes estructurales

EF en acetato de celulosa Variante ms probable Otras pruebas

Hemograma, cuantificacin, test

Banda en posicin HbS HbS, D, G, lepore
solubilidad, EF cida, IEF
Banda en posicin HbC HbC, E, O Cuantificacin, EF cida, IEF
Banda de migracin rpida HbH, I Cuerpos H, EF cida

EF: electroforesis; Hb: hemoglobina; IEF: isoelectroenfoque.

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Hemograma completo

Electroforesis a PH alcalino

Banda en la posicin Banda en otra posicin No se detecta banda

de HbS que la HbS anormal

Comparar con posiciones de

Test de falciformacin Comparar con posiciones de Hay muchas variantes que se
controles conocidos
Si no se detecta HbA, usar controles conocidos solapan con HbA, la mayora
EF a pH
agar cido
citrato o IEF EF a pH cido sin relevancia clnica. Si se
sospecha hemoglobinopata,
realizar otras pruebas (IEF,
EF cida, test estabilidad, EF
globinas...)

Figura 2. Estudio de variantes estructurales de hemoglobina.

tos compuestos de una variante de Hb y rasgo talasemia,
algunos tipos de persistencia hereditaria de HbF heteroci-
gotos, talasemia.
Entre el 15 y el 45%: algunos casos de talasemia
intermedia, persistencia heterocigota de HbF tipo afri-
cano.
Mayores del 45%: talasemia major, algunos casos de
intermedia, neonatos, persistencia homocigota de HbF
africana.
Diagnstico
7. Steinberg MH, Forget BG, Higgs DR, Nagels RL, Bum HF Laboratory
diagnosis of hemoglobin disorders. En: Steinberg MH, Forget BG, Higgs
DR, Nagels RL, editors. Disorders of hemoglobin: genetics, pathophysiolo-
gy, and clinical management. Cambridge, UK: Cambridge University Press;
2001. p. 910-40.
8. Bain BJ. Sickle cell haemoglobin and its interactions with other variant haemog-
lobins and with thalassemias. En: Bain BJ, editor. Haemoglobinopathy diagno-
sis. 2nd ed. Oxford: Blackwell Science Ltd,; 2006. p. 113-53.
9. Alperin JB, Dow PA, Peteway MB. Haemoglobin A2 levels in health and vario-
us haematological disorders. Am J Clin Pathol. 1977;67:219-26.
10. British Committee for standardization in haematology. Guidelines for the inves-
tigation of the a and b thalassaemia traits. J Clin Pathol. 1994;47:289.
11. OBrien SH. Decision analysis in pediatric haematology. Pediatr Clin North
Am. 2008;55:287-304.
12. Lanzkowsky P. Manual of pediatric haematology and oncology. 3rd ed. New
York: Academic Press; 2000. p. 137-200.
13. Nathan DG, Orkin SH. Hemolytic anemias and disorders of hemoglobin. En:
Nathan and Oskis haematology of infancy and childhood. 5th ed. Philadelphia:

diferencial11-13 WB Saunders Co.; 1998. p. 523-886.

Tras la completa historia clnica se aconseja seguir el esque-

ma de la figura 2 y tablas 1 y 2.
Bibliografa
Importante Muy importante
1. Dacie JV, Lewis SM. Practical haematology. Investigation of abnormal hae-
moglobins and thalassaemia. London: Churchill Livingstone; 1995. p. 249-86.
2. Marshall AL, Williams JW, Beutler E, Kaushansky K, Kipps TJ, Seligsohn
U, et al. Disorders of globin synthesis: the talassemias. Disorders of hemoglobin
structure. En: Williams haematology. 7th ed. New York: McGraw Hill; 2005.
p. 633-701.
3. International Committee for standardization in haematology. Simple electro-
phoretic system for presumptive identification of abnormal hemoglobins. Blood.
1978;52:1058-64.
4. International Committee for standardization in haematology. Recommendations
for a system for identifying abnormal hemoglobins. Blood. 1978;52:1065-7.
5. International Committee for standardization in haematology. Recommenda-
tions for neonatal screening for haemoglobinopathies. J Clin Lab Haematol.
1988;10:335-45.
6. Schroeder WA, Skelton JB, Skelton JR. Separation of hemoglobin peptides by
high performance liquid chromatography (HPLC). Hemoglobin. 1980;4;551-9.
Bibliografa recomendada
Dacie JV, Lewis SM. Practical haematology. London: Churchill
Livingstone; 1995.
El libro completo es una excelente revisin de los mtodos de
anlisis en hematologa, explicados de una forma sencilla,
precisa, prctica y muy detallada, y hay un captulo especfico
sobre electroforesis. Resulta muy til ante casos de difcil
interpretacin.
Lanzkowsky P. Manual of pediatric haematology and oncology. 3rd ed. New
York: Academic Press; 2000.
Es el manual imprescindible para referencia rpida en el
diagnstico y diagnstico diferencial de hemopatas. Los captulos
sobre talasemias y hemoglobinopatas son los que ms detallan la
interpretacin de la electroforesis.
Gua SEHOP 2009 sobre enfermedad de clulas falciformes peditricas.
Accesible en la pgina web de la Sociedad Espaola de
Hematologa y Oncologa Peditricas (www.sehp.net). Es
una gua de prctica clnica sobre el diagnstico, seguimiento y
tratamiento recomendado de esta hemoglobinopata estructural
desde un punto de vista eminentemente prctico.

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