TEMA 3.

AISLAMIENTO, SELECCIN,
MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE
CEPAS MICROBIANAS
1.- Fuentes para su obtencin
2.- Aislamiento y seleccin de microorganismos
Screening primario
Screening secundario
3.- Mantenimiento y conservacin de microorganismos
Objetivos
Tcnicas de mantenimiento y conservacin
Subcultivo seriado
Desecacin
Congelacin
Liofilizacin
4.- Conservacin de diferentes grupos microbianos
Algas
Bacterias
Virus
Hongos
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1. FUENTES PARA SU OBTENCIN

a. Suelo y agua
b. Fermentaciones naturales (obtener Saccharomyces de la fermentacin del vino, o Lactobacillus
del queso)
c. Animales y plantas, en el caso de las vacunas
d. Colecciones internacionales de cultivos tipo

FUENTES VS OBJETIVOS EN BIOTECNOLOGA

1. Clulas microbianas propiamente dichas (SCP, biofertilizantes, vacunas...): agua y suelo, animales y
plantas.
2. Macromolculas que sintetizan (enzimas, polisacaridos...): fermentaciones naturales, suelos y agua.
3. Productos del metabolismo, primario (compuestos esenciales para su crecimiento) y secundario
(compuestos no esenciales): suelo y agua, fermentaciones naturales.
4. Bioconversiones: suelo y agua.
5. Alimentos (queso, leche fermentada, encurtidos...): fermentaciones naturales.
6. La lixiviacin bacteriana de menas: suelo y agua.
7. Tratamiento de residuos y biorremediacin: suelo y agua.

2. AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS

A este proceso se le denomina screening, y consta de dos partes:
-Screening primario, buscar microorganismos potencialmente tiles en biotecnologa.
-Screening secundario, dentro de estos microorganismos observar cual es ms til (cual crece ms rpido, que
producto es mejor...), y luego se modifica este microorganismo.

2.1.- SCREENING PRIMARIO

Primero se realiza una suspensin del 10% de la fuente, generalmente el suelo, de esta forma se separan las
bacterias que estaban unidas a las partculas del suelo y se quedan en la suspensin).
A continuacin se realizan diluciones seriadas (1/10) para aislar las colonias y se realiza el recuento para ver
ufc/g. Se aplican tcnicas de seleccin para buscar las colonias que producen la sustancia de inters, hay que ver
que tengan actividad y frente a que, ver cuanto producen para ver si es rentable, e identificar el microorganismo.
 SELECCIN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBITICOS
Sembramos el microorganismo en estra en una placa donde hay otro microorganismo contra el que queremos
que actue el antibitico; ambos van a crecer; si el que hemos sembrado en estra produce antibitico contra el que
est sembrado en la placa, este no va a crecer alrededor de la estra.
Cuantificacin de la produccin de antibitico: Cultivamos ambos microorganismos, el que produce antibitico y
sobre el que queremos actuar. En el cultivo del productor de antibitico separamos las clulas del sobrenadante
de cultivo y nos quedamos con este (por centrifugacin), ahi est el antibitico. Aadimos el antibitico en la placa
donde habamos puesto a crecer el microorganismo sobre el que queremos actuar, y alrededor ponemos muestras
crecientes de un antibitico conocido a concentraciones conocidas, para despus, cuando midamos el halo, hacer
una recta de regresin y calcular la cantidad de antibitico que produce el organismo en proporcin a la cantidad
del antibitico conocido.
 SELECCIN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE FACTORES DE CRECIMIENTO
Ponemos un medio en el que crezca el factor de crecimento que nos interesa. Se coge un microorganismo de
prueba que es auxotrofo (mutante incapaz de crecer en un medio que no contenga un metabolito en concreto ya
que no es capaz de producirlo) y lo colocamos en un medio de cultivo que contenga todos los nutrientes menos el
factor de crecimiento que no puede producir, por tano, el microorganismo no va a crecer. A continuacin, los
microorganismos que hemos seleccionado para ver si producen el factor de crecimiento son sembraados en la
placa en estra, si alguno produce esta factor el microorganismo auxotrofo crecer alrededor de la estra del
microorganismo productor.
Un factor de crecimiento puede ser, por ejemplo, una vitamina.

SELECCIN DE MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ENZIMAS

Vamos a verlo con las celulasas (hidrolasas que cortan polmeros de glucosa unidos por enlaces -1,4. La
celulosa se usa en la industria textil y en la elaboracin de comprimidos ya que es inerte para los humanos al ser
incapaces de digerirla.
Para detectar las celulasas tenemos que aadir al medio el compuesto que nos interese, en este caso celulosa
(si fueran amilasas aadiramos almidn), se siembran los microorganismos aislados en estra, que crecen y
sintetizan las celulasas que degradan la celulosa, esto no se puede observar, asi que se aade un colorante que
se une especficamente a la celulosa, el rojo Congo que se aade sobre la placa y esta se tie de rojo menos en
las zonas donde el microorganismo que ha producido celulasas, ya que el rojo congo no tiene entonces sustrato al
que unirse.
En la industria es fundamental el proceso de seleccin, que nos permite rastrear miles de microorganismos para
encontrar el que nos interesa.

2.2.- SCREENING SECUNDARIO

Para conseguir pasar el microorganismo de la escala piloto a la escala industrial tenemos que:
-disear medios de cultivo a escala industrial
-realizar una mejora gentica de las cepas obtenidas
-desarrollar los sistemas de produccin industrial (como vamos a poder separarlo de los dems productos q se
van a obtener-purificacin y almacenamiento
-hacer un anlisis econmico final

3. MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN DE CEPAS MICROBIANAS

El mantenimiento implica cortos perodos de tiempo (das), y la conservacin, largos peridoso de tiempo (aos).
Para conservar y mantener una bacteria tenemos que:
1-Mantener los cultivos viables a lo largo del tiempo
2-Mantener los cultivos puros, sin contaminaciones
3-Mantener los cultivos estables (genticamente inalterable)
Hay que evitar que el microorganismo se duplique para que no se produzcan modificaciones en el DNA), para
ello vamos a modificar la temperatura, bajndola (a temperaturas altas las enzimas funcionan mejor, su
temperatura ptima es elevada) ya que asi su metabolismo est muy ralentizado (a -20C las bacterias no se
dividen ya que el agua no est en estado liquido).
 TCNICAS DE MANTENIMIENTO Y CONSERVACIN
1. Subcultivo seriado: es un mtodo vlido para el mantenimiento; consiste en resesembrar el microorganismo
cada cierto tiempo en su medio adecuado, segn la temperatura se va a mantener ms o menos tiempo:
-T ambiente (24C), durante 7-15 das, luego hay que refrescarlos, darles agua
-T frigorfico (4C), durante 1-3 meses

2. Desecacin: consiste en eliminar el agua evaporndola; es un mtodo vlido para microorganismos

esporulados que aguantan las altas temperaturas. Puede ser desecacin en:
-En suelo, arena, silicagel
-En papel de filtro
-Lquida (D-Drying), aplicando vaco, en desuso
-En bolitas de alginato
-En sal

3. Congelacin: algunos factores afectan a la viabilidad y estabilidad de este proceso:

- Edad de las clulas
- Velocidad de congelacin y descongelacin
- Temperatura de almacenamiento
- Agentes crioprotectores, que son sustancias que favorecen que las clulas no se rompan en el proceso, ya
que al congelar, el agua que est en el citoplasma se convierte en cristales que pueden romper la membrana,
estos agentes evitan la formacin de cristales de hielo
Para la congelacin se usan 3 temperaturas, -30 (congelador de frigorfico), -70C (nieve carbnica-anhdrido
carbnico en estado slido) y -196C (nitrgeno lquido). Generalmente se usan -70 ya que a -30C se forman
eutcticos.

4. Liofilizacin: se elimina el agua congelando y sublimando por el vaco. Hay ciertos factores que influyen en la
viabilidad y estabilidad de este mtodo:
- Los crioprotectores
- El tipo de microorganismo
- El nmero de clulas
- La temperatura de sublimacin (a mayor vaco, menor temperatura)
- Grado de deshidratacin alcanzado
- Atmsfera del tubo (se echa nitrgeno para eliminar el oxgeno en la ampolla y se cierra, as no queda agua
y se cierra hermticamente, la atmosfera que queda es nitrgeno, un gas inerte)
-condiciones de almacenamiento (se suele usar el frigorfico).

4. CONSERVACIN DE DIFERENTES GRUPOS MICROBIANOS

Con cada grupo de microorganismos se suelen usar diferentes tcnicas:
Algas: subcultivo, desecacin, congelacin
Bacterias: congelacin, liofilizacin (sobre todo al transportarlas), desecacin
Hongos: desecacin (suelen ser esporulados), liofilizacin
Virus: congelacin
Micoplasma: liofilizacin, congelacin
Lneas celulares: subcultivo, congelacin
En estos tres ltimos se suele usar la congelacin por nitrgeno al no tener pared celular.