Lopez-Lopez K - Biologia Molecular - Pregrado - Guias de Laboratorio 2017 PDF

BIOLOGIA MOLECULAR
GUIAS DE LABORATORIO
KARINA LOPEZ LOPEZ, Ing. Bioq., PhD

Docente de la asignatura Biologa Molecular y Celular
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA | SEDE PALMIRA
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Contenido
INTRODUCCIN ........................................................................................................................................... 2
OBJETIVOS.................................................................................................................................................... 3
REQUERIMIENTOS PARA INGRESAR AL LABORATORIO EL DIA DE LA PRCTICA. ............................. 4
GUIA PARA LA PRESENTACIN DE INFORMES DE LABORATORIO DE LAS PRCTICAS DEL CURSO
DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR .................................................................................................... 5
LINEAMIENTOS DE SEGURIDAD PARA EL LABORATORIO ..................................................................... 6
LINEAMIENTOS CONVIVENCIA EN EL LABORATORIO. ........................................................................... 8
PRACTICA No. 1. INTRODUCCION AL TRABAJO DE LABORATORIO ...................................................... 9
ANEXO 1. EQUIPOS BSICOS DE UN LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR .............................. 15
PRACTICA No. 2. USO DE MICROPIPETAS ............................................................................................... 19
PRACTICA No. 3. EXTRACCION DE DNA PLASMIDICO ........................................................................... 26
PRACTICA No. 4. VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS (DNA) MEDIANTE LA ELECTROFORESIS
EN GELES DE AGAROSA ............................................................................................................................ 30
PRACTICA No. 5. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR ................................................. 34
Como citar esta gua: Lpez-Lpez, K. 2017. Biologa Molecular: Guas de Laboratorio. Ed.
Universidad Nacional de Colombia. P 37.
GUIA DE LABORATORIO DE BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR. Elaborado por Karina Lpez Lpez (Ph.D), Febrero de 2017
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INTRODUCCIN
La biologa molecular y celular proporciona la informacin bsica para entender muchos de los
eventos bioqumicos y fisiolgicos que suceden dentro de la clula. El descubrimiento de la
clula y la elucidacin de la estructura molecular del material gentico, el DNA, fueron hitos
relevantes en la historia de la biologa, lo que permiti que esta rea adquiriera una importancia
grande en las ciencias.
Con el desarrollo de la biologa molecular se han logrado avances significativos en reas como la
medicina, donde se han obtenido nuevos medicamentos sintetizados por ingeniera gentica
para la cura de enfermedades tales como diabetes; en el rea agrcola y pecuaria, el estudio de
los genomas de animales y plantas est permitiendo el desarrollo de programas de
mejoramiento gentico ms rpido y eficientes mediante el uso de marcadores moleculares
(MAS, seleccin asistida por marcadores), se han elaborado herramientas para el diagnstico de
enfermedades en animales y plantas de manera rpida y a bajo costo empleando la tcnica de
PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y recientemente, con el desarrollo de nuevas
tcnicas de secuenciacin es posible conocer la totalidad de los nucletidos que constituyen
nuestro genoma por un costo muy bajo (mil dlares!). Finalmente, el conocimiento obtenido
durante el desarrollar del proyecto Genoma humano tendr implicaciones transcendentales
para la raza humana en un futuro no muy lejano, esperando poder conocer los procesos
moleculares que participan en la generacin de enfermedades tales como Cncer, Parkinson o
Alzheimer que actualmente son un problema de salud a nivel mundial.
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OBJETIVOS
1. Estudiar la clula como unidad estructural, funcional y responsable de la herencia

gentica en organismos unicelulares y pluricelulares.
2. Estudiar la estructura y funcin de cada una de los organelos celulares.
3. Estudiar las biomolculas portadoras de informacin: cidos nucleicos.
4. Estudiar el Dogma central de la biologa molecular y su papel en el funcionamiento
de la clula.
5. Conocer las diferentes tcnicas bsicas de biologa molecular que constituyen la
tecnologa del DNA recombinante.
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REQUERIMIENTOS PARA INGRESAR AL LABORATORIO EL DIA DE LA PRCTICA.
Portar bata blanca y guantes.

Es de vital importancia que el estudiante este familiarizado con la metodologa propuesta para
el desarrollo de la prctica, por lo tanto deber realizar un diagrama de flujo de la prctica. Este
consiste en una representacin grfica de un proceso; cada paso del proceso es representado
por un smbolo diferente que contiene una breve descripcin de cada etapa del proceso. El
diagrama de flujo deber presentarse como requisito para ingresar al laboratorio y deber ser
colgado en su puesto de trabajo. El grupo de trabajo que NO presente el diagrama de flujo, NO
podr ingresar a laboratorio.
Puntualidad. El estudiante deber estar presente cinco minutos antes de la hora de inicio de la
prctica para ingresar al laboratorio.
Leer los lineamientos de seguridad y convivencia en el laboratorio, con el fin de realizar las
practicas sin riesgos o accidentes dentro de las instalaciones del laboratorio.
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GUIA PARA LA PRESENTACIN DE INFORMES DE LABORATORIO DE LAS PRCTICAS

DEL CURSO DE BIOLOGIA MOLECULAR Y CELULAR
Los informes de laboratorio deben tener las siguientes partes:
Introduccin: debe indicar claramente el propsito del informe, relacionando igualmente en

forma selectiva la literatura pertinente con el principio de la metodologa usada en la prctica.
No incluya datos ni conclusiones del trabajo.
Objetivos: deben ser claros y concisos, iniciar con un verbo y ser similares a los planteados en la
gua de laboratorio.
Materiales y Mtodos: aqu se deben enlistar los materiales usados y las tcnicas metodolgicas
usadas en la realizacin de la prctica.
Resultados y discusin: escribe los resultados ms importantes y su posible explicacin.
Preguntas de anlisis: en esta seccin responde las preguntas que se muestran al final de cada
gua de laboratorio.
Bibliografa: Cite los textos consultados para la presentacin del informe, si tiene dudas realice
las citas basado en la revista Acta Agronmica.
Notas:
1. El informe de laboratorio se debe entregar escrito a mano y de manera individual.
2. Los informes se deben entregar cada 8 das, en el lugar que indique su coordinador.
3. La asistencia es obligatoria. En caso de no poder asistir presentar causa justificada y
entregar el informe de la prctica utilizando los resultados de sus compaeros de equipo.
4. En caso de no presentar causa justificada, el Informe se calificara sobre 4.0 (cuatro).
5. La nota final de cada prctica se calculara as: 50% asistencia y 50% informe de
laboratorio.
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LINEAMIENTOS DE SEGURIDAD PARA EL LABORATORIO
1. Observa la localizacin del equipo de seguridad y familiarzate con su uso.

(Extinguidores).
2. Utiliza ropa y calzado adecuados. Usa ropa sencilla. No arriesgues ropa fina. En lo
posible, usa calzado cmodo y evita los zapatos de tacn alto. No utilices calzado
descubierto. El pelo largo es mejor mantenerlo recogido.
3. Preprate para cada da de laboratorio leyendo cada protocolo y familiarizndote
con los principios y metodologas que involucran. Esto te ayudar a reducir la
probabilidad de tener accidentes y te har ms eficiente.
4. Lleva al laboratorio slo las cosas que vayas a emplear all. Busca fuera del
laboratorio un lugar adecuado para dejar tu comida, mochilas, libros, etc. No ocupes
con objetos innecesario tu espacio de trabajo en el laboratorio. Adems de las
herramientas de trabajo slo requieres tu cuaderno de laboratorio y algn manual o
protocolo.
5. No se debe comer, tomar o fumar en el laboratorio. En general, ninguna de las reas
cercanas a los laboratorios son adecuadas para ninguna de estas actividades. Lvate
las manos al entrar y salir del laboratorio.
6. Evita pipetear con la boca. Existen diferentes herramientas para utilizar con las
pipetas de vidrio. Familiarzate con su uso.
7. No corras, no juegues en el laboratorio. Las visitas de amigos se debern realizar en
el pasillo.
8. Apaga el celular o colcalo en modo silencioso, con el fin de evitar distracciones
durante la realizacin de la practica as como accidentes dentro del laboratorio.
9. Mantn limpia y ordenada tu rea de trabajo. Limpia tu mesa de trabajo con alcohol
o desinfectante antes de comenzar a trabajar y nuevamente al terminar tu trabajo.
10. Los objetos de vidrio o punzocortantes se deben manejar adecuadamente. Evita
accidentes.
11. Usa guantes cuando manejes reactivos cidos o bsicos concentrados o materiales
custicos como el fenol. Usa tapabocas y gafas de seguridad cuando trabajes con
hongos que presentan colonias polvorosas.
12. La autoclave deben manejarlo los encargados del laboratorio o aquellos estudiantes
que conozcan bien su manejo.
13. Desecha de manera responsable suelos y microorganismos de trabajo que ya no
uses. Por ejemplo, esteriliza mediante calor (autoclave) o hipoclorito los materiales
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de desechos que contengan restos de bacterias, hongos o virus patgenos de

plantas.
14. Utiliza la cmara de flujo laminar de manera responsable. Antate en la libreta de
uso del equipo, indicando fecha, hora y tiempo que utilizars la cmara de flujo. El
tiempo lmite de espera por la reserva ser de 15 minutos.
15. nicamente se podr utilizar la luz ultravioleta para esterilizar la cmara de flujo
laminar por las noches. Indicar en la puerta del laboratorio que este proceso se est
realizando para evitar exponer a los compaeros de trabajo.
16. No dejes prendido y sin vigilar tu mechero. Apgalo si vas a salir del laboratorio.
17. Maneja con mucho cuidado los reactivos mutagnicos (bromuro de etidio) o
peligrosos. Usa cubre bocas para pesar material como acrilamida, SDS, colorante,
lisozima, etc.
18. Ten cuidado cuando uses el horno de microondas. No llenes demasiado un frasco
con lquido. Asegrate de aflojar la tapa antes de meterlo. No agites lquidos que
acabas de sacar del horno. Asegrate de que marcaste bien el tiempo. No deben
meterse objetos de metal (ni siquiera una grapa).
19. Informa cualquier accidente y solicita ayuda si no sabes cmo manejar la situacin
(derrame de fenol, cidos, de un cultivo, reactivo, etc.).
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LINEAMIENTOS CONVIVENCIA EN EL LABORATORIO.
1. Principio de confianza. No se debern tomar reactivos o equipos de otros compaeros

sin la debida solicitud. As mismo no se debern mover cajas de petri, tubos o cualquier
material de trabajo sin la autorizacin del dueo. Marcar todo el material de trabajo con
el nombre del responsable, fecha y director de proyecto.
2. Respecto por el espacio de trabajo.
3. Si observas que un material o reactivo se va a acabar, reprtalo al encargado o bien
antalo en la libreta de pedidos.
4. Si ensucias algo..lmpialo. Tpico caso: horno de microondas, cajas de petri, etc,
material de vidrio para preparar medios o soluciones.
5. Si eres el ltimo, asegrate de que estn apagados los equipos, el aire acondicionado, la
luz y cierra la puerta con llave.
6. Si necesitas mover algn material, reactivo o equipo, solicita la autorizacin del
encargado del laboratorio.
7. Lavado y procesamiento de material. Pregunta los procedimientos adecuados y sguelos.
Si no enjuagas bien el material con agua destilada puedes afectar el experimento del
siguiente usuario. En el caso de material como cajas de petri y tubos de ensaye,
procsalos rpido pues otra persona puede necesitarlos.
8. Coloca nuevamente en su sitio todo el material que utilices. Si sacas algn reactivo de las
gavetas, regrsalos a su sitio adecuado. Mantengamos el orden de los reactivos. Si
utilizamos material de vidrio para preparar soluciones, lavemos el material de manera
adecuada y ponlo a secar. No dejes material sucio en las mesas del laboratorio.
9. Para reactivos que requieran refrigeracin y especialmente congelacin, lo adecuado es
mantenerlos en hielo o de ser posible en contenedores especiales que mantienen bajas
temperaturas (coolers).
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PRACTICA No. 1. INTRODUCCION AL TRABAJO DE LABORATORIO
INTRODUCCIN
El trabajo en el Laboratorio de Biologa Molecular requiere de una serie de normas de seguridad
para el usuario. Entre las normas de seguridad personal estn el uso obligatorio de bata blanca,
lavado de manos (antes de entrar y despus de salir del laboratorio), uso de tapabocas cuando
se requiera (dependiendo de los reactivos a utilizar), uso de guantes, ubicacin de extintores y
puerta de salida de emergencia.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO: Las normas de seguridad en el laboratorio son un requisito
importante que todo estudiante debe conocer. Conocer e identificar los riesgos y cuidados
cuando se manipulan sustancias peligrosas es clave para evitar accidentes. A continuacin se
describen algunos cuidados que todos debemos seguir en el laboratorio:
Uso de guantes: El uso de guantes se requiere cuando se trabaja con sustancias qumicas
peligrosas, sustancias irritantes, productos radioactivos o solventes. Se recomienda el uso de
guantes de nitrilo ya que garantizan una proteccin de casi todas las sustancias utilizadas en el
laboratorio de biologa molecular.
Luz Ultravioleta: La luz ultravioleta se utiliza en el laboratorio de biologa molecular de manera
rutinaria para detectar molculas de cidos nucleicos, producir mutaciones en el genoma,
esterilizar material, esterilizar la cabina de laboratorio, etc. La deteccin de las molculas de
DNA que contienen bromuro de etidio se realiza con exposicin de la muestra a luz UV
mediante el uso del equipo denominado Transiluminador. Es importante tener cuidado con la
exposicin directa o indirecta a luz UV ya que causa irritacin aguda del ojo despus de un
periodo de 30 minutos a 24 horas. Esto debido a que la retina no es sensible a la luz UV por lo
que el dao a los ojos se puede dar sin que nos demos cuenta. La piel tambin es sensible a la
luz UV. Se recomienda proteger tus ojos y piel utilizando gafas con proteccin a luz UV,
portando guantes, bata y limitando el tiempo de exposicin en general.
Electricidad: Es importante verificar el estado de enchufes antes de utilizarlos. Rotular los
tomacorrientes: 110 o 220 voltios y verificar que tipo de voltaje utiliza el equipo antes de
enchufarlo. Algunos equipos son susceptibles a altibajos en el voltaje, se recomienda utilizar
reguladores (tipo UPS).
Material de vidrio: Antes de usar material de vidrio, compruebe que este en perfecto estado.
Evite utilizar material que este roto o vencido. Al calentar material de vidrio debe hacerlo con
mucho cuidado ya que el calor no se percibe a simple vista (por ejemplo, vidriera tipo pyrex
encontrado en matraces, frascos, vasos de precipitado, etc), por lo que se recomienda utilizar
guantes especiales. Finalmente, recuerda rotular todos los vasos, matraces y material que
utilices.
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La manipulacin y uso inadecuado de equipos pueden generar accidentes o lesiones personales.

A continuacin se describen algunos de los cuidados a tener en cuenta al utilizar los siguientes
equipos:
Microondas: evitar introducir material metlico (grapas, aluminio, clavos, suelo con metales,
etc) al microondas para evitar accidentes. Nunca descuides las soluciones que se calienten,
recuerda que el microonda calienta mucho ms rpido que un horno convencional y en un
minuto el agua puede hacer ebullicin y rebosar el frasco que lo contiene. Utilice material de
vidrio adecuado para microondas. Si utiliza frasco, desenroscar la tapa antes de iniciar el
proceso de calentar la solucin. Antes de calentar una solucin, sacar el agitador o mosca,
recuerde, que este ltimo es de metal (imn). Nunca utilice el horno de microondas del
laboratorio para calentar sus alimentos. Utilice guantes especiales para tomar frascos calientes.
Plancha caliente: evite tocar la superficie o los frascos que se estn calentando.
Bao Mara: evite tocar la superficie o los frascos que se estn calentando.
Autoclave: solicitar ayuda si es la primera vez que usa el equipo. Evite dejar solo la autoclave, a
menos que sea automtica.
Nevera -80C: utilizar guantes especiales para temperaturas bajo cero, para evitar quemarse las
manos.
Mecheros: se debe tener precaucin al utilizarlos, en especial los que funcionan con alcohol. En
caso de incendiarse, mantenga la calma y cubra la superficie para eliminar el oxgeno o utilice el
extinguidor de incendios.
FICHAS DE DATOS SEGURIDAD DE REACTIVOS: En el laboratorio de Biologa molecular se utilizan

varios reactivos peligrosos, los cuales requieren ciertos cuidados en su manejo. Es importante
conocer las Fichas de datos de seguridad (FDS) de los reactivos a utilizar. Estas FDS nos brindan
informacin relativa a propiedades y caractersticas del reactivo qumico as como los cuidados a
tener al manipularlos. Conocer estas FDS nos permite reducir riesgos personales y
medioambientales ya que es obligacin de cada proveedor colocar una ficha con los datos
qumicos del reactivo, su peligrosidad a la salud y al medio ambiente, forma de desechar y como
manipularla para evitar accidentes. Las FDS utilizan smbolos que permiten al usuario
determinar de manera rpida las caractersticas peligrosas de los reactivos que manejamos. Por
ejemplo, el smbolo de una calavera indica que la sustancia es txica para humanos.
A continuacin se muestran los smbolos o iconos ms utilizados en su versin antigua (color
naranja y negro) y la actualizada (blanco y rojo). Es importante familiarizarse con estos
pictogramas con el fin de identificarlos en los reactivos qumicos y evitar riesgos a la salud,
integridad fsica y al medio ambiente:
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Pictogramas actualizados.
Pictogramas antiguos.
Fuente: Sistema Globalmente Armonizado de Clasificacin y Etiquetado de Productos Qumicos
(SGA). 2015. Sexta edicin revisada. Copyright Naciones Unidas.
Los reactivos ms utilizados en Biologa molecular y que presentan un riesgo personal o

medioambiental son:
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Fenol: Se utiliz como desinfectante y germicida. Es una sustancia venenosa si se ingiere o

inhala. Es corrosiva y fcilmente absorbida por la piel, causado un efecto anestsico que
aumenta los daos en la piel. Primeros auxilios: lave con suficiente agua y no utilice etanol.
Acrilamida: Se utiliza para preparar geles de poliacrilamida. Es un neurotxico potencial. Es
mutagnico, carcingeno y afecta la fertilidad en los seres humanos en exposiciones
prolongadas. Siempre utilizar tapabocas y guantes.
Bromuro de etidio: Se utiliza para detectar y cuantificar el DNA. Es una molcula carcingena.
Utilizar siempre guantes. Si la preparacin es a partir de polvo, utilizar mascara con filtro.
Cloroformo: Es voltil. Hay que tener cuidado en su manejo. Causa quemaduras en la piel. El
cloroformo puede causar explosiones si se mezcla con acetona o bases fuertes.
Alcohol isoamlico: Se utiliza para extraccin de DNA. Tiene un olor desagradable. Sus vapores
son venenosos.
Etil ter: Se utiliza para extraccin de DNA. Es muy voltil y altamente inflamable. Utilice pipetas
de vidrio. Nunca utilice micropipetas. Siempre trabajar en campana extractora de vapores y
evitar el uso de mechero o flamas cerca.
Dietil Pirocarbonato (DEPC): Inactiva nucleasas. Se utiliza en los protocolos de extraccin de
RNA. Es txico al reaccionar con amoniaco y formar uretano, un potencial carcingeno. Siempre
portar guantes cuando se maneje, ya que el amonio endgeno del cuerpo puede reaccionar y
causar irritacin de los ojos, membrana, mucosas y piel.
Compuestos marcados con fosforo 32 (32P): El 32P es ampliamente utilizado ya que es fcil de
detectar en ensayos de hibridacin de cidos nucleicos. Dado que emite partculas beta, debe
tenerse mucho cuidado al manipular estas sustancias que pueden ser dainas. Se recomienda
portar doble guante, zapato cerrado, doble bata, emplear barreras de plstico, utilizar un
contador Geiger para monitorear la radiacin y limpiar cualquier residuo de material
radioactivo.
Otros carcingenos: Hay una serie de sustancias con capacidad carcinognica, tales como:
Actinomicina, Colchicina, Colcemida, Cicloheximida, Acido yodo actico y Metotrexato
Bases y cidos: Al mezclar un cido o una base con agua, recuerda que siempre el cido o la
base debe agregarse sobre el agua, nunca al revs. En caso de quemaduras con cidos o bases
concentradas fuertes, nunca se lava la zona con agua, antes se debe neutralizar. Para cidos,
usar bicarbonato de sodio. Para sustancias bsicas, neutralizar la zona con cido actico al 1% o
vinagre.
Muchos de los reactivos utilizados en el laboratorio de biologa molecular son txicos y
peligrosos. Al preparar soluciones recuerde rotular con el nombre de las sustancias y la fecha en
que se prepar. Los fabricantes de reactivos tienen la obligacin de incluir una etiqueta con los
datos referentes a seguridad y cuidados.
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CUIDADOS EN GENERAL
1. Los qumicos no son dainos si se manejan de manera adecuada.
2. Siempre se debe portar guantes cuando se manejan sustancias peligrosas.
3. Nunca se debe pipetear con la boca una solucin.
4. Si accidentalmente algn qumico cae sobre la piel, inmediatamente lavar con
abundante agua (si procede) e informar al profesor o auxiliar de laboratorio. Si el
accidente fue grave reportar en la Unidad de salud de la Universidad.
5. Desechar los residuos en contenedores apropiados. Cuidemos el medio ambiente.
6. Por ltimo, Siempre pregunte si tiene alguna duda.
OBJETIVOS:
Conocer e identificar los riegos y cuidados a tener en cuenta cuando se manipulan reactivos
peligrosos en el laboratorio.
Conocer el uso adecuado de equipos presentes en el laboratorio para evitar daos
personales y al equipo.
Conocer las fichas de datos de seguridad e identificar los smbolos de seguridad que portan
todos los reactivos de uso en el laboratorio.
MATERIALES Y EQUIPOS:
Equipos de uso frecuente en el laboratorio de biologa molecular: Centrifuga, documentador de
imgenes, cmara de electroforesis verticales y horizontales, autoclave, plancha caliente,
nevera -80C, bao mara, termociclador (equipo para PCR), cabina de extraccin de gases, etc.
Frascos con reactivos qumicos de uso frecuente en el laboratorio.
METODOLOGIA:
1. Antes de iniciar, realizar una lectura de los lineamientos de seguridad para el laboratorio
y lineamientos convivencia en el laboratorio.
2. Realizar un recorrido por el laboratorio donde se identifiquen los diferentes equipos que
se utilizan, su uso en cada tcnica y cuidados al utilizarlo (anexo 1).
3. A cada grupo de trabajo se le darn tres frascos con reactivos qumicos. Cada grupo debe
identificar el nombre del reactivo qumico, su peso molecular (es clave si se van a
preparar soluciones de trabajo), etiqueta de seguridad (ficha de datos de seguridad) y
anotar en el cuaderno los riesgos a la salud, medioambiental y de seguridad del uso del
reactivo.
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4. Determinar con base a las instrucciones de la ficha de seguridad como y donde se debe
manipular: requiere guantes, bata, gafas de seguridad, uso de cabina de extraccin de
gases, manipulacin de los desechos en contenedores especiales, etc.
5. Dibuje al menos cinco equipos de laboratorio que le hayan llamado la atencin, seale
su funcin y mencione los cuidados que se deben tener en cuenta al manipularlos.
PREGUNTAS DE ANLISIS
1. Realice un resumen de lo realizado en la primera prctica de laboratorio de biologa
molecular.
2. Realice las fichas de seguridad para cada uno de los reactivos de uso rutinario en el
laboratorio de biologa molecular: Hidrxido de sodio (NaOH), cloroformo, etanol, cido
etilendiaminotetraactico (EDTA), dodecilsulfato sdico (SDS), fenol y bromuro de etidio.
3. Investigue el significado y cuidado a considerar cuando se manipula reactivos qumicos
con los siguientes smbolos.
BIBLIOGRAFIA
Perbal, B. 1998. A practical guide to molecular cloning.
Notas del curso Tcnicas en Biologa molecular. 2000. Cinvestav Campus Guanajuato. Mxico.
Sistema Globalmente Armonizado de Clasificacin y Etiquetado de Productos Qumicos (SGA).
2015. Sexta edicin revisada. Naciones Unidas.
http://www.unece.org/fileadmin/DAM/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev06/Spanish/01sp_part1.
pdf
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ANEXO 1. EQUIPOS BSICOS DE UN LABORATORIO DE BIOLOGA MOLECULAR
Plancha con agitador magntico: Equipo que permite disolver solutos durante la preparacin de
soluciones de trabajo. Como su nombre lo indica, se utiliza una barra magntica que se coloca
en un vaso de precipitado que contiene las soluciones a mezclar o el slido a disolver. El equipo
cuenta con un regulador de velocidad del magneto que permite disminuir o aumentar la
velocidad de agitacin. Algunos equipos cuentan con regulador de temperatura, que permite
calentar algunas soluciones que requieren la aplicacin de calor. Estos equipos son tiles para
preparar soluciones de trabajo, regular pH, etc.
Agitador orbital y de plataforma, a temperatura ambiente: Equipo que consta de una bandeja
colocada sobre una superficie que oscila, permitiendo la agitacin de muestras. Contiene un
regulador de velocidad que permite aumentar o disminuir la agitacin de muestras. Este equipo
se utiliza para teir y enjuagar geles de agarosa y poliacrilamida, lavar membranas de
hibridacin de cidos nucleicos, etc.
Autoclave: Equipo que permite esterilizar soluciones, medios de cultivo y material de plstico
utilizando vapor de agua a alta presin (calor hmedo). Las autoclaves de laboratorio se
emplean a una presin de vapor de una atmosfera por encima de la presin atmosfrica, lo cual
corresponde a una temperatura de 121 C. A esta temperatura, la gran mayora de los
microorganismos y esporas se inactivan, con excepcin de los denominados priones. La norma
universal dice que debe usarse a 121C por al menos 20 minutos. Este equipo es utilizado para
esterilizar disoluciones acuosas, material de plstico (puntas de micropipetas, tubos eppendorf
de 1.5m, 0.2 ml), medios de cultivo, etc. No se recomienda para esterilizar material de vidrio.
Para estos ltimos se recomienda utilizar un horno.
Balanza digital: Equipo utilizado para pesar pequeas cantidades de reactivos o solutos que se
utiliza en la preparacin de soluciones. Estas balanzas se destacan por su gran precisin.
Cuando se desea pesar cantidades muy pequeas se utiliza la balanza analtica, la cual es un
equipo que te permite realizar mediciones muy precisas. Estas balanzas son digitales y en
algunos equipos tienen un rango precisin de hasta 0.00001g. (0,01 mg).
Bao Mara: Equipo que sirve para calentar muestras o soluciones lentamente, sumergiendo el
recipiente que las contiene en otro mayor con agua que se lleva a o est en ebullicin. Este
equipo se utiliza en la extraccin de DNA (preparacin de la muestras con el buffer de
extraccin), en reacciones enzimticas, etc.
Cabina de flujo laminar: Equipo que permite trabajar en condiciones de esterilidad y ausencia de
partculas, mediante un barrido de aire filtrado e impulsado en rgimen laminar sobre la zona
de trabajo. Es utilizada para cultivo de microorganismos, tales como bacterias y hongos as
como para preparar reacciones de trabajo enzimticas, en especial PCR (reaccin en cadena de
la polimerasa).
Cmara de electroforesis: Equipo utilizado para visualizar muestras de cidos nucleicos (DNA y
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RNA) y protenas mediante la tcnica electroforesis. Esta tcnica separa las molculas segn la
movilidad de estas en un campo elctrico. Los cidos nucleicos al tener carga negativa migran
hacia el polo positivo. Hay diferentes tipos de electroforesis y por lo tanto, de equipos:
a) Electroforesis en geles de agarosa: es la tcnica ms comn utilizada en el laboratorio de
biologa molecular, en donde la matriz en donde se separan las molculas de cidos
nucleicos es de un material orgnico denominado agarosa, similar a la gelatina, que
tiene un poder de resolucin de 1 a 20kb. El equipo utilizado es una cmara de
electroforesis horizontal.
b) Electroforesis en geles de poliacrilamida: Cuando se desea mejor resolucin de
molculas de cidos nucleicos se utiliza una matriz de poliacrilamida, la cual permite
diferencias en tamao de hasta un simple par de bases (separa fragmentos de 20 -700
pb). El equipo utilizado es una cmara de electroforesis vertical. Para separar protenas
se utiliza este mismo tipo de gel y cmara.
c) Cuando se desea separar muchos fragmentos pequeos se utilizan cmaras de
electroforesis especiales denominadas sistemas de secuenciacin, las cuales tienen
dimensiones de 35 cm de ancho por 45 cm de largo.
Centrifugas: Preparacin de DNA plasmidico, genmico. Equipo que pone en rotacin una
muestra para separar por fuerza centrfuga sus componentes o fases, en funcin de su
densidad. Existen diferentes tipos de centrifugas, dependiendo del tamao de la muestra y la
velocidad de centrifugacin:
a. La micro centrifuga es una centrfuga de muy reducidas dimensiones diseada para la
centrifugacin de tubos pequeos (1.5 a 2 ml) y tiene una velocidad mxima de 12,000 a
14,000 rpm.
b. La ultra centrifuga es una centrifuga diseada para girar su rotor a una velocidad muy
alta y capaz de generar una aceleracin de hasta 1.000.000 g. (20,000 a 80,000 rpm). Al
girar tan rpido, es necesario tener cuidado en su manipulacin para evitar accidentes.
Estos equipos son ampliamente utilizados en la preparacin y limpieza de DNA.
Congelador a -20 C y -80 C: Es un equipo que mantiene la temperatura bajo cero, mediante el
uso de un aislamiento trmico y un mecanismo de transferencia de calor con el medio externo,
alcanzando temperatura de hasta -80 a -4 C. Este equipo es ideal para almacenar por largos
periodos muestras biolgicas (bacterias, tejido vegetal), cidos nucleicos (DNA y RNA) y algunos
kit que incluyen enzimas de restriccin o componentes susceptibles a daarse (Taq polimerasa.
Es importante verificar la temperatura ideal de almacenamiento, ya que algunos no se pueden
almacenar a -80 C o requieren un acondicionamiento especial.
Destilador de agua: purificar agua. Este equipo calienta el agua hasta hervir quedando
esterilizada, pasa al enfriador y se condensa finalmente en forma de agua 100% qumicamente
pura, ideal para el consumo humano. Bsicamente los equipos de destilacin constan de dos
recipientes conectados mediante un serpentn enfriador. El primer recipiente alberga el agua a
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tratar y el segundo recoge el agua purificada.

Equipo para documentacin de geles de agarosa: Equipo que consta de un transiluminador de
luz UV, que permite visualizar el DNA en geles de agarosa y una caja oscura conectada a una
cmara digital que transfiere la imagen a un computador. Este equipo evita la exposicin a luz
UV ya que no se observa el gel directamente, sino a travs de la pantalla del computador.
Espectrofotmetro: cuantificar cidos nucleicos y protenas. Equipo que sirve para medir en
funcin de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica
relativos a dos haces de radiaciones. Se utiliza para cuantificar cidos nucleicos y protenas.
Horno de hibridacin: hibridacin de cidos nucleicos. Equipo que tiene dos propiedades:
calentar y agitar la muestra. La muestra es una membrana que tiene unido los cidos nucleicos
de inters y se agita para mezclarlos con la sonda. La temperatura evita que se unan cadena de
DNA no complementarias entre s.
Horno esterilizador: Es un equipo que sirve para esterilizar material de laboratorio, utilizando
calor seco en un horno en atmosfera libre. Se recomienda esterilizar a 180C por 30 minutos o
160C por 1 hora, con el fin de garantizar la esterilizacin. Se requiere una duracin e intensidad
mucho mayor porque la conduccin del calor es menos rpida en aire seco que en aire
hmedo. Este equipo se utiliza para esterilizar material de vidrio en general y otros materiales
slidos estables el calor, tales como pinzas metlicas.
Horno de microondas: fundir agar y agarosa. Equipo utilizado para calentar soluciones y fundir
agar y agarosa, y que funciona mediante la generacin de ondas electromagnticas.
Incubadoras: para crecimiento de bacterias y hongos. Equipos que tiene la funcin comn de
crear un ambiente con las condiciones de humedad, temperatura y oxigeno adecuadas para el
crecimiento de bacterias y hongos. Hay dos tipos: con agitacin para crecer cultivos lquidos y
estticas, para cultivo en cajas de petri o medio slido.
Mquina de PCR (termociclador): normal, gradiente y tiempo real. Tambin conocido como
mquina de PCR o fotocopiadora de DNA. Es un equipo que permite realizar los ciclos de
temperaturas necesarios para una llevar a cabo la tcnica de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR). Existen en el mercado diferentes tipos de termocicladores:
a) Normal: realiza el PCR normal.
b) Gradiente de temperatura: permite ensayar diferentes temperaturas de alineamiento,
con el fin de estandarizar la reaccin de PCR.
c) Tiempo real: permite cuantificar la cantidad de DNA o RNA presentes en la muestra
original.
Mquinas de hacer hielo: Equipo necesario para producir hielo constantemente, ya que muchos
de los procesos en el laboratorio requieren mantener las muestras a temperaturas bajas pero
sin llegar al punto de congelacin.
Nevera a 4 C: refrigerar soluciones y material de trabajo. Equipo que mantiene la temperatura
18
hasta 4 C, ideal para preservar soluciones de trabajo, cultivos bacterianos, DNA y soluciones en
general que requieren refrigeracin.
pH metro: medir pH. Equipo utilizado para medir el pH de una solucin, mediante un sensor o
electrodo.
Termoblock: Bloque caliente de metal controlado por un termostato, que permite llevar a cabo
reacciones enzimticas.
Transiluminador UV: Equipo que permite la visualizacin de las bandas de DNA en geles de
agarosa teidos con bromuro de etidio. Existen tres tipos de transiluminadores que se
diferencian por la longitud de onda utilizada: 254 nm, 302nm y 365nm. Se recomienda utilizar el
de 302 nm ya que evita el dao al DNA, lo que permite su manipulacin y clonacin.
Vortex: mezclar soluciones. Equipo que porta un sistema de agitacin mediante el cual se agita
las muestras o soluciones. Esta agitacin es alta y se puede graduar.
19
PRACTICA No. 2. USO DE MICROPIPETAS
INTRODUCCIN
La tecnologa del DNA recombinante involucra la manipulacin de secuencias de DNA y la
construccin de molculas quimricas. Esta manipulacin requiere el manejo de volmenes
pequeos, a nivel de microlitros (l), para lo cual se utilizan equipos especializados
denominados micropipetas. Estos equipos permiten dispensar volmenes pequeos de lquidos
con la mayor exactitud. Existen dos tipos de micropipetas: de rango fijo o de rango variable. Las
micropipetas ms comunes utilizadas en un laboratorio de biologa molecular miden volmenes
variables de 0.1 l a 1000 l (1 ml), aunque es posible encontrar en el mercado micropipetas de
hasta 5 ml.
Las micropipetas utilizan puntas de plstico desechables, las cuales son diseadas para cada
micropipeta, dependiendo del rango de trabajo. Por ejemplo:
Modelo Rango de volumen Punta (color)

P2 0.2 l a 2 l blanca
P20 2 l a 20 l Amarilla, blanca
P200 20 l a 200 l Amarilla, blanca
P1000 100 l a 1000 l azul
1 ml= 1,000 l = 1 cm3
Las micropipetas puedes ser simples (monocanal) (Figura 1), es decir, utilizan una sola punta por
vez y de multicanal, la cual incorpora varias puntas a la vez (hasta 8 puntas) que absorben el
mismo volumen al tiempo (Figura 2). Estas ltimas son muy practicas cuando se realiza PCR
(Reaccin en Cadena de la Polimerasa), Pruebas de ELISA, Reacciones enzimticas o cualquier
experimento que requiera el uso de placas de 96 pocillos.
20
Figura 1. Micropipeta volumen variable, monocanal marca Labmate . Imagen tomada de

www.labmate-online.com
Existen algunos aspectos claves en el uso de la micropipeta a los cuales es necesario prestarle
especial atencin:
1. Se debe elegir la micropipeta de modo que el volumen a dispensar sea lo ms cercano
posible al volumen mximo posible para la micropipeta en cuestin.
2. Evitar bajar o subir el volumen ms all de lo determinado por el rango de la
micropipetas. Por ejemplo, para una micropipeta de rango 2 a 20ul, NUNCA mover a
volmenes de 50 ul o 1ul, porque se daara el sistema de calibracin.
3. Las puntas no deben sumergirse muy profundo en el lquido, sino solamente 2-3 mm
bajo la superficie.
4. Mantener la micropipeta en una posicin tan vertical como sea posible, nunca en
ngulo.
5. La aspiracin debe realizarse lentamente y uniformemente, no demasiado rpido.
6. No presionar la punta muy fuerte al cono de la micropipeta.
7. El mantenimiento regular y el chequeo de la calibracin garantiza que la micropipeta
opere de acuerdo a las especificaciones.
21
8. Si es la primera vez, practicar con una punta usada y agua, con el fin de evitar errores.
9. Para lquidos viscosos, como el glicerol, se debe pipetear lentamente.
10. Cada micropipeta tiene un manejo especial, por lo tanto se recomienda leerse el manual
del usuario o preguntar al encargado del laboratorio como se utiliza con el fin de
garantizar un uso adecuado y evitar daarla.
OBJETIVOS
Familiarizar al estudiante con los diferentes tipos de micropipetas y sus componentes.
Adquirir destrezas en el uso de las micropipetas.
Conocer cmo se verifica la calibracin de una micropipeta.
MATERIALES Y EQUIPOS
Cajas con puntas blancas, amarillas y azules
Micropipetas de diferentes marcas y diferentes rangos de medicin de volumen.
3 Vasos de precipitado de 100ml con agua
Tubos Eppendorf 1.5 ml
Recipiente para desecho de puntas
Balanza analtica
METODOLOGIA
I. CONOCIENDO LAS DIFERENTES MICROPIPETAS Y SUS COMPONENTES
1. Observa sobre la mesa de trabajo los diferentes tipos de micropipetas que existen en el
mercado. Las micropipetas eppendorf, fueron las primeras en salir al mercado, por lo
que muchas veces se les conoce como micropipetas eppendorf. Actualmente existen
en el mercado gran variedad de marcas, tales como: eppendorf, Gibco, Labmate, etc., lo
que ha facilitado su uso y ha disminuido costos. Cada tipo de micropipeta tiene un
sistema mecnico de absorcin diferente, por lo que es necesario leer el manual del
usuario con el fin de familiarizarte con su uso. En la Figura 1 se observan las diferentes
partes de que est compuesta una micropipeta de volumen variable monocanal o simple
de la marca Labmate. En la Figura 2 se observan las diferentes tipos de micropipetas
disponibles en el mercado marca Eppendorf :
22
Figura 2. Micropipeta volumen variable, marca Eppendorf. Imagen tomada de

www.eppendorf.com
2. Toma una micropipeta y familiarizate con su uso, sosteniendo la micropipeta con la

mano derecha y colocando el dedo pulgar sobre el botn o pistn superior. Presiona con
cuidado el pistn superior hasta sentir el primer tope y el segundo tope.
3. Coloca la micropipeta entre tus dos manos, con la izquierda sostn la micropipeta
horizontalmente y con la derecha, utilizando el dedo pulgar gira la rueda dentada para
fijar el volumen requerido. Recuerda que este volumen depende del rango de la
micropipeta, el cual est indicado en la parte superior del pistn.
II. MANEJO MICROPIPETAS.

1. Elegir la micropipeta adecuada para medir 100 ul. Recuerde utilizar una micropipeta que
incluya dentro de su rango el volumen a medir.
2. Debido a que estamos trabajando con micropipetas de volumen variable es necesario
seleccionar el volumen deseado (100 ul) utilizando para ello la rueda dentada hasta que
23
el indicador de volumen indique 100ul. En las micropipetas de 2 a 200ul los nmeros en

negro indican microlitros y los nmeros en rojos, dcimas de microlitros.
3. Ponerle la punta adecuada. Cada micropipeta viene con puntas desechables que se
colocan en cajas especiales que permiten su toma con rapidez. La punta de la
micropipeta est diseada para que encaje perfectamente. Si la punta queda floja,
verifique que est tomando la punta adecuada. Cuidado! Nunca sumerja la micropipeta
en el lquido sin punta, hacer esto daa la micropipeta.
4. Tomar el lquido con la punta de la micropipeta. Para ello presione (solo hasta el primer
tope) el pistn superior con el dedo pulgar y mantenerlo presionado mientras se
sumerge el extremo de la punta en el recipiente con agua. Slo el extremo de la punta
debe estar sumergido!
5. Suelta despacio el pistn y observa como entra el agua en la punta.
6. Ahora transfiere el lquido a un tubo Eppendorf. Coloca la punta de la micropipeta
dentro del tubo Eppendorf al cual vas a transferir el agua. Presiona suavemente el pistn
hasta que sientas el primer tope y presiona an ms para vencer esta resistencia y
expulsar el lquido.
7. Repita el proceso varias veces hasta que se familiarice con su uso.
8. Para liberar la punta, presionar el liberador de puntas y colocarla la punta usada en un
recipiente adecuado.
III. CALIBRACION DE MICROPIPETAS

1. Selecciona la micropipeta a calibrar y selecciona los valores a dispensar. Se debe
seleccionar el volumen mximo y el volumen mnimo o un volumen 10% menor que el
mximo. Ejemplo: si se selecciona la micropipeta de 20-200ul, se pesan 20ul y 2000ul;
volumen mnimo y mximo que mide la micropipeta seleccionada.
2. En una balanza analtica pesar un tubo Eppendorf de 1.5 ml nuevo. Tomar nota del dato
obtenido.
3. Colocar una punta plstica a la micropipeta, dispensar el volumen seleccionado de agua
destilada y transferirlo al tubo Eppendorf previamente pesado.
4. Pesar el tubo Eppendorf con el volumen de agua respectivo. Tomar nota del dato
obtenido.
5. Realizar 10 repeticiones para cada volumen seleccionado (mximo y mnimo). Cambiar
de tubo eppendorf y punta plstica cada vez que se realiza la repeticin de pesado.
6. Calcular el volumen de cada muestra de agua dispensada con la micropipeta, para cada
uno de los datos obtenidos:
Peso del agua = [peso del tubo + volumen de agua] [peso de tubo vaco].
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Recuerda: el agua tiene una densidad 1 g/ml, es decir, que un volumen de 20 ul de agua
pesa 20 mg.
Volumen de agua = Peso de agua
7. Calcular el Volumen promedio de los valores obtenidos (repeticiones) para cada

volumen seleccionado.
Volumen promedio = suma de los valores obtenidos divido entre el nmero de datos
evaluados.
8. Con el valor del volumen promedio obtenido calcular la exactitud de la micropipeta.

La Exactitud o Error Sistemtico, se define como la diferencia entre el volumen
dispensado y el volumen seleccionado en una micropipeta. Y se calcula con la siguiente formula:
A = V -VS
Donde:
A= Exactitud (accuracy)
V= Volumen promedio de los valores obtenidos
Vs= Volumen seleccionado en la micropipeta
Todas las micropipetas incluyen dentro del manual un certificado de calibracin de la exactitud
y este se expresa como un valor relativo:
% ACC= 100% x A/Vs
9. Investiga los valores de exactitud de la micropipeta utilizada en la prctica y compara

con los resultados obtenidos. Si hay una resultado fuera de los lmites establecidos por el
proveedor solicita se enven a calibrar las micropipetas inmediatamente al auxiliar de
laboratorio!
10. Reporte sus resultados y conclusiones en tu informe de laboratorio.
1. Investigue la diferencia entre micropipetas de rango fijo y de rango variable. Cundo se
debe utilizar cada una de ellas?
25
11. Realice una bsqueda de cada una de las diferentes tipos de micropipetas que existen en
el mercado. (incluya rango, marca, recomendaciones de uso y valores de exactitud y
precisin de la micropipeta.
2. Investiga como calcular la precisin de tu micropipeta. Utiliza los valores obtenidos y
realiza tus clculos. Compara y discute los resultados obtenidos.
3. Describa las diferentes tipos de puntas disponibles en el mercado y sus usos en las
diferentes tcnicas de biologa molecular.
26
PRACTICA No. 3. EXTRACCION DE DNA PLASMIDICO
INTRODUCCIN
La capacidad de construir molculas de DNA recombinantes y mantenerlas en las clulas se
denomina clonacin de DNA. Este proceso implica el uso de un vector de clonacin que aporta
la informacin necesaria para propagar el DNA clonado en la clula y un inserto de DNA que se
introduce dentro del vector.
Los vectores presentan tres caractersticas: un origen de replicacin, un marcador de seleccin y
un sitio mltiple de clonacin. Los vectores ms comunes son molculas de DNA circular
pequeo denominados plsmidos. Estos provienen de molculas de DNA circular que se
desarrollan de forma natural en muchas bacterias. En la mayora de los casos transportan genes
que codifican protenas que le brindan resistencia a antibiticos (tetraciclina, kanamicina,
cloranfenicol o ampicilina). Estos vectores presentan un alto nmero de copias, lo que permite
aumentar la cantidad de DNA que puede aislarse a partir de una poblacin de bacterias
transformadas.
El proceso de extraccin de DNA plasmidico involucra varios pasos:
1. Recuperacin de las bacterias transformante mediante centrifugacin.
2. Las bacterias se resuspenden en un solucin de glucosa y EDTA que rompen la pared
celular.
3. Estos esferoplastos son lisados con una solucin de SDS (un detergente) y NaOH (alcali).
4. La adicin de sales (acetato de potasio) precipita los desechos celulares y protenas,
dejando los cidos nucleicos en la solucin acuosa.
5. Para eliminar restos de protenas presentes en la solucin acuosa se trata con fenol y
cloroformo.
6. Finalmente se concentran los cidos nucleicos precipitndolos con un alcohol.
OBJETIVO:
Desarrollar habilidades para extraer DNA plasmidico de una clula bacteriana.
Minicentrifuga
Micropipetas
Puntas amarillas y azules para micropipetas
Tubos eppendorf de 1.6ml
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3 ml de un cultivo bacteriano de E. coli que porta un plsmido problema

Solucin I: 50 mM de glucosa, 25 mM de Tris.HCl pH 8, 10 mM EDTA (mantener en frio por un
mes)
Solucin II: O.2 M NaOH, 1% SDS (esta solucin debe prepararse en el momento y almacenar a
temperatura ambiente por una semana)
Solucin III: Solucin Acetato de Potasio pH 4.8 (mantener en fro por dos meses)
Isopropanol
Etanol 70%
TE(10:1): 10 mM Tris: 1mM de EDTA
METODOLOGIA:
1. Coloque en tubos de 1.5ml de cultivo bacteriano (E. coli que porta um plsmido) y
proceda a centrifugar a 12 000 rpm por 2 minutos. Elimine el sobrenadante (medio de
cultivo) con cuidado para no daar la pastilla.
2. Repita el paso 1. Para continuar al paso siguiente elimine todo el sobrenadante que le
sea posible, utilizando una toalla de papel e invirtiendo el tubo.
3. Adicione 150ls de la Solucin I fra y resuspenda aplicando vortex hasta que el pellet
forme una emulsin.
4. Adicione 300 ls de la Solucin II a temperatura ambiente y proceda a homogenizar por
medio de la inversin cuidadosa del tubo al menos 5 veces. NO APLICAR VORTEX.
Observe como a medida que se agita, la emulsin se vuelve translucida, indicio de que
hubo una buena homogenizacin y las clulas bacterianas se han lisado. A partir de este
paso, realice todos los siguientes pasos manteniendo en hielo la muestra bacteriana.
5. Adicione 300 ls de la Solucin III fra, invierta los tubos varias veces con cuidado.
Observe como la sal precipita los desechos celulares y protenas (cogulos blancos) y el
DNA queda disuelto en la fase acuosa.
6. Incube la muestra en hielo por 5 minutos.
7. Centrifugue a mxima velocidad durante 10 minutos a 4C.
8. Recupere el sobrenadante en un tubo nuevo y adicinele un 1 volumen de Isopropanol a
temperatura ambiente. Mezcle por inversion continua.
9. Incube en hielo por 10 minutos.
10. Centrifugue a mxima velocidad (12 000 rpm) durante 10 minutos a 4C.
28
11. Elimine con cuidado el sobrenandante, evitando eliminar una pastilla o pellet localizada
en el fondo del tubo. Este pellet es el DNA. Debe observar cristalino, si esta blanco o
sucio (caf) indica que est contaminado con protenas.
12. Para eliminar sales, adicione a la pastilla de DNA 1 ml de Etanol 70% a temperatura
ambiente e invierta varias veces.
13. Centrifugue por 3 minutos a mxima velocidad (12 rpm). Elimine el etanol.
14. Invierta los tubos con la pastilla sobre una toalla de papel y permita que se evapore el
etanol por 5 minutos.
15. Resuspenda en un 50l de TE la pastilla obtenida y almacene a -0C. Marcar bien el tubo
con los datos del equipo y fecha de extraccin, ya que este DNA se utilizar en la prctica
No. 4.
1. Realice un esquema del proceso de extraccin de DNA plasmidico e incluya fotografas
de cada paso con el fin de visualizar los cambios que sufre la clula bacteriana hasta la
obtencin del DNA puro.
2. Investigue en la literatura las siguientes preguntas:
a. Para qu se utiliza la solucin de SDS durante el proceso de extraccin de DNA
plasmidico?
b. Cul es la funcin del acetato de potasio en el proceso de extraccin de DNA
plasmidico?
c. Porque alcohol se puede reemplazar el isopropanol y cul es la funcin de este
reactivo en el proceso de extraccin de DNA?
d. Cul es la funcin del EDTA en la solucin de TE que se utiliza para resuspender
el DNA?
e. Porque el DNA plasmidico de debe almacenar a -20 grados?
3. Defina plsmido. Investigue dos plsmidos de uso comn en el laboratorio de biologa
molecular. Dibuje los esquemas de cada uno de ellos y describa sus caractersticas.
BIBLIOGRAFIA:
1. Ausubel F., Brent, R., Kingston, R., et al. 1999. Short protocols in molecular biology.
Cuarta Edicin. John Wiley & Sons. New York. Vol. 1 y vol. 2.
2. Birnboim H. C. and J. Doly. 1979. A rapid alkaline extraction procedure for screening
recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7:1513.
29
3. Brown T.A. 1995. Gene cloning, an introduction. 3ra edicin. Editorial Chapman &
may. London.
4. Sambrook, J., Fritsch, E and Maniatis, T. 1989. Molecular cloning: a laboratory
manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vol. 1,2, y 3.
5. Watson J. D.; Baker T. A., Bell S. P., Gann A., Levine M. y R. Losick. 2006. Biologa
molecular del gen.5ta edicin. Editorial Medica Panamericana.
30
PRACTICA No. 4. VISUALIZACION DE ACIDOS NUCLEICOS (DNA) MEDIANTE LA

ELECTROFORESIS EN GELES DE AGAROSA
INTRODUCCION
La tcnica de electroforesis se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo

elctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. Las molculas de cidos nucleicos (DNA y RNA)
porta carga negativa y al aplicar un campo elctrico migran al polo positivo (+). Esta tcnica
permite la separacin de molculas (DNA, RNA y protenas) con base al tamao. Se utiliza como
soporte un polmero gelatinoso de agarosa o acrilamida, similar al utilizado en cromatografa de
columna. Para llevar a cabo esta metodologa se utilizan cmara de electroforesis tipo
horizontal para geles de agarosa y tipo vertical para geles de poliacrilamida.
La agarosa es un polmero de residuos alternados de D- y L- galactosa unidos por enlaces
glicosidicos (1 3) y (1 4). La agarosa estndar (temperatura de alta fusin) se obtiene
de dos algas marinas: Gelidium y Gracilaria. Este tipo soporte se utiliza para separar fragmentos
de cidos nucleicos de tamao 50 20.000 pb y tiene una fuerza de resolucin de 100 a 1000
pb, la cual es menor que la ofrecida por los geles de poliacrilamida.
Existen varios factores que determinan la velocidad de migracin del DNA a travs de geles de
agarosa:
El tamao molecular del DNA: las molculas de DNA de doble cadena migran a travs del
gel a una velocidad que es inversamente proporcional al logaritmo de 10 del nmero de
pares de bases, lo que significa que las molculas grandes migran distancias cortas y las
molculas pequeas distancias largas en el gel.
La concentracin de agarosa: se utiliza concentracin bajas (0.5%) para separar
fragmentos de hasta 25 kb y concentraciones altas (1.5%) para separar fragmentos
pequeos (80 pb).
La conformacin del DNA: el DNA relajado migran ms lento que el DNA compactado. Se
recomienda linealizar las molculas para conocer su tamao exacto.
La presencia de bromuro de etidio.
El buffer de electroforesis: se pueden utilizar tres tipos de buffer, TAE (Tris- Acetato-
EDTA), TBE (Tris-Borato-EDTA) y TPE (Tris-Fosfato-EDTA).
El voltaje aplicado: se recomienda utilizar de 5-10 V por cm del gel de agarosa. Evitar
altos voltajes que pueden daar el gel y calentar el buffer de electroforesis.
El tipo de agarosa utilizado: en el mercado se pueden adquirir diferentes tipos de
agarosa, desde la estndar (extrada de Gelidium y Gracilaria) hasta modificadas
qumicamente, tales como la agarosa de baja punto de fusin que permite realizar
reacciones enzimticas en el gel de agarosa.
31
Una vez el DNA ha migrado en el gel de agarosa, ste se puede visualizar utilizando molculas
fluorescentes tales como Bromuro de etidio (tener cuidado al manejarlo, ya que es un
compuesto cancergeno), Sybr safe (Invitrogen ), EZ-Vision (Amresco ), etc. Todas estas
molculas se intercalan en la doble cadena de DNA y al exponerlas a la luz ultravioleta
fluorecen.
OBJETIVO
Desarrollar habilidades para la preparacin de geles de agarosa y electroforesis de molculas de
DNA.
Cmara de electroforesis horizontal
Porta geles
Microondas
Fuente de poder a 80 voltios.
Foto-documentador de geles de agarosa (Molecular Imager Gel DocXR+ Systems BIORAD ).
Guantes de ltex
Micropipetas
Puntas blancas
Un frasco con tapa azul
Una probeta de 100ml
REACTIVOS
Agarosa
Buffer TAE 1X
Bromuro de etidio 10mg/ml o una molcula que reemplace su funcin.
Buffer de carga 6X
Marcador de peso molecular
DNA problema
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METODOLOGIA
1. Preparacin del soporte del gel (portageles). Utilizando cinta adhesiva precintar los lados
abiertos del portageles y reforzar los mrgenes inferiores y las esquinas. Algunos
portageles presentan unos soportes negros en los extremos que permite sellarlos.
Colocar a 0.5 cm de uno de los extremos el peine de plstico que formara los pozos,
procurando que quede paralelo al fondo del soporte.
2. Preparacin del gel de Agarosa: Calcular la cantidad de agarosa y buffer TAE 1X
requeridos para preparar un gel de agarosa al 0.8%. Este clculo se realiza con base al
tamao del portageles a utilizar. Pesar la agarosa requerida en un frasco de tapa azul,
aadir el volumen de buffer TAE1X requerido con una probeta y llevar al microondas por
30-60 segundos o hasta que la agarosa se funda y quede cristalina. Precaucin: la
solucin puede estar muy caliente al salir del microondas, tomar la botella con un guante
especial para objetos calientes. Dejar enfriar la solucin en la mesa de trabajo a 40C
aproximadamente. Agregar 1l de Bromuro de etidio por cada 100l de solucin de
agarosa (1%). Verter la solucin de agarosa dentro del soporte del gel muy lentamente
para evitar la formacin de burbujas. Si se llegan a formar burbujas, eliminarlas con una
punta amarilla o una esquina de papel servitoalla. Dejar solidificar a temperatura
ambiente hasta que polimerice la agarosa. Precaucin: El Bromuro de etidio es un agente
carcingeno, utilizar guantes en todo momento de su manipulacin y desecharlos una
vez terminado.
3. Colocar el gel de agarosa en la cmara de electroforesis: Una vez polimerizada la agarosa
en el portageles se elimina la cinta o soportes negros y ste se coloca dentro de la
cmara de electroforesis. Verificar que los pozos estn ubicados en el extremo del
electrodo negativo (color negro). Aadir el buffer TAE1X hasta cubrir perfectamente
toda la superficie del gel sin derramar. Con cuidado quitar el peine haciendo un poco de
palanca sin romper los pozos
4. Preparacin del DNA problema: El DNA se mezcla con un buffer de carga 6X (1ul de
buffer por cada 5 ul de muestra), el cul incrementa la densidad de la muestra y permite
visualizar las muestras durante la electroforesis. En este caso usaremos Azul de
bromofenol y xileno cianol. En una cinta de parafina y con una micropipeta formaremos
gotas de 1l de buffer de carga 6X por cada muestra a visualizar y luego mezclaremos los
DNA problemas con cada gota azul.
5. Cargado de las muestras problema en el gel de agarosa: Cargar con una micropipeta la
mezcla previamente preparada de DNA problema dentro cada uno de los pozos del gel
de agarosa. Colocar en uno de los pozos un marcador de peso molecular que permitir
determinar los tamaos del DNA problema. Si se requiere cuantificar, se puede colocar
un marcador de concentracin conocida. En la prctica se utilizar un marcador de peso
molecular GeneRuler 1 kb DNA Ladder Fermentas .
33
6. Corrido electrofortico: Cerrar la tapa de la cmara de electroforesis y conectar el

electrodo negro (ctodo) del lado donde estn los pozos con las muestras y el electrodo
rojo (nodo) en el lado contrario. Aplicar 80 voltios por aproximadamente treinta (30)
minutos. Si los cables han sido colocado correctamente, se deben observar burbujas del
nodo al ctodo (debido a la electrolisis).
7. Visualizacin del DNA problema: Usando guantes sacar con cuidado el gel de agarosa
con el soporte y colocar en el Foto-documentador de geles de agarosa (Molecular
Imager Gel DocXR+ Systems BIORAD ). Seguir las instrucciones del equipo y visualizar el
gel aplicando luz ultravioleta. Tomar la foto y guardar en un archivo en el computador.
PREGUNTAS DE ANALISIS
1. Se visualizarn los DNA genmicos purificados en la prctica #3, discuta y argumente los
resultados, describa la calidad y cantidad de DNA purificados, de Usted y sus
compaeros.
2. Investigue los diferentes tipos de agarosa disponible en el mercado y cuando se
recomienda utilizar cada una de ellas.
3. Discuta y argumente, porque se utilizan diferentes concentraciones de geles de agarosa
durante la visualizacin del DNA.
4. Investigue cuando se recomienda utilizar geles de Poliacrilamida en reemplazo de un gel
de agarosa.
5. Investigue la diferencia entre utilizar buffer TAE y buffer TBE.
6. Investigue el protocolo de preparacin de geles de poliacrilamida para visualizar
protenas (SDS-PAGE) e incluya que se utiliza para teir las protenas y visualizarlas.
Compare con el protocolo para preparar geles de agarosa (metodologa aprendida en
esta prctica).
BIBLIOGRAFIA
Sambrook J., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second Edition.
1989.
34
PRACTICA No. 5. REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA - PCR
INTRODUCCION
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una tcnica poderosa que permite la

amplificacin o sntesis rpida de muchas copias de un fragmento especfico de DNA. El PCR fue
inventado por el bioqumico estadounidense Kary Mullis, tcnica que revoluciono las
investigaciones en biologa molecular y que lo llevo a recibir el Premio Nobel de Qumica en
1993.
Como esta tcnica imita la sntesis o replicacin de DNA en la clula, se requiere aadir a la
reaccin de sntesis in vitro los mismos elementos requeridos in vivo, tales como Primers
(cebadores, oligos), DNA blanco, DNA polimerasa y una mezcla de los cuatro
desoxiribonucleotidos trifosfatos (dNTPs). No se requiere aadir protenas accesorias
adicionales para separar las cadenas, ya que se utiliza calor para romper los puentes de
hidrogeno que unen a las bases nitrogenadas mediante un equipo digital denominado
Termociclador. Como se aplica calor, es necesario utilizar una DNA polimerasa termoestable,
como la Taq polimerasa, extrada de microorganismos termfilos.
Esta tcnica involucra varias etapas, que tienen como objetivo amplificar el DNA de inters. A
continuacin se describen cada una de las tapas:
Etapa de iniciacin. El DNA blanco es desnaturalizado, es decir, separadas ambas

cadenas mediante la aplicacin de calor a una temperatura de 94 -96C, por 1-5 minutos.
Etapa de Amplificacin: consta de 25-40 ciclos que involucran tres pasos en cada uno:
1. Desnaturalizacin: el DNA es desnaturalizado, separadas las dos cadenas
mediante calor, aplicando una temperatura de 94C, por 30-60 seg.
2. Alineamiento: los primers se alinean (aparean) con el DNA blanco. Esta
temperatura depende de la secuencia de los primers y usualmente est
comprendida entre 50-65C, por 30-60 seg.
3. Elongacin /extensin: una vez se han unido los primers, la DNA polimerasa inicia
la sntesis de la cadena complementaria del DNA blanco. La temperatura de
polimerizacin de la Taq polimerasa es de 72C y el tiempo depende del tamao
del fragmento a amplificar variando entre 30-60 seg. La polimerasa adiciona 1000
bases/ minuto aproximadamente.
Elongacin final: una vez completados los ciclos, se realiza una extensin con el fin de
completar los extremos de los fragmentos amplificados a una temperatura de 72C
por 10 minutos.
35
Terminacin.
Algunas modificaciones del PCR son: PCR anidada, PCR inverso, PCR con adaptadores, PCR en
tiempo real, RT-PCR, etc.
Esta tcnica tiene amplios usos, como se describen a continuacin:
Amplificar fragmentos de DNA de inters para clonacin.

Identificacin de patgenos.
Deteccin de secuencias especificas sin clonacin previa.
Establecimiento de polimorfismos de secuencia.
Diagnstico de enfermedades.
Estudios evolutivos.
Resolucin de problemas forenses y arqueolgicos.
Deteccin de clulas tumorales.
OBJETIVOS
Describir las pautas y recomendaciones generales para la Reaccin en cadena de
polimerasa.
Identificar la funcin de los diferente reactivos y soluciones usados en la PCR.
METODOLOGIA
Cada grupo de laboratorio amplificar un fragmento del gen ribosomal 18S de
aproximadamente 450 pb.
1. Marcar tubos PCR de 200ul con el nmero del grupo y primers a utilizar.
2. Calcular las cantidades a utilizar de los diferentes reactivos de acuerdo a la siguiente
tabla:
Soluciones stock (C1) Concentracin final en la Volumen a tomar de la

reaccin de PCR (C2) solucin stock (V1)
dNTPs 2mM 0.2mM
MgCl2 25mM 2mM
36
Buffer Taq 10X 1X

Primers R 5uM 0.1uM
Primers F 5uM 0.1uM
Taq polimerasa 5U/ul 0.025U
DNA (100ng/ul) 10ng
Agua
La frmula para realizar los clculos es C1V1 = C2V2.

Se despeja V1,
V1 = C2V2 / C1
El volumen final es 50ul y se ajusta con agua destilada estril.
3. Preparar la reaccin de PCR, agregando en el tubo de PCR las cantidades de reactivos

calculadas en el siguiente orden: 1. Agua, 2. dNTPs 3. MgCl2, 4. Buffer Taq, 5. Primers R y
F, 6. DNA y 7.Taq polimerasa. Mezclar con cuidado con la punta de la micropipeta.
4. Llevar los tubos al termociclador y poner a correr el programa especificado por el
instructor del laboratorio. Esta amplificacin tomara aproximadamente 3-4 horas.
5. Verificar el resultado de la amplificacin en un gel de agarosa al 1.2%.
PREGUNTAS DE ANALISIS
1. Realice una pequea resea de la historia de la tcnica de PCR.

2. Describa de manera breve y con sus propias palabras la funcin de cada uno de los
reactivos utilizados en la PCR.
3. Investigue como se realiza la prueba de paternidad utilizando la tcnica de PCR.
4. Investigue algunos ejemplos de genes utilizados como blancos para identificar
patgenos de plantas. Por ejemplo, en bacterias, hongos y virus
BIBLIOGRAFIA
1. Perbal, B. 1998. A Practical Guide to Molecular Cloning. Segunda edicin. John Wiley &
Sons. New York. 812 p.
2. Rapley, R. 2000. The Nucleic Acid Protocols-Handbook. Humana Press. New York. 1050 p.
37
3. Sambrook, J., Fritsch, E and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory Press. Vol. 1,2, y 3.
4. Fermentas. 2010-2011. Manual del proveedor. Captulo 3. PCR, qPCR, RT-PCR & dNTPs.

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