Isolamento e Caracterizao de

Imunoglobulina G de soro
de coelho (IgG)
IgG

A resposta imune consiste em dois

sistemas complementares, o sistema imune
humoral e o celular.
No centro da resposta imune humoral
esto protenas solveis chamadas anticorpos
ou imunoglobulinas, abreviadas como Ig.
A imunoglobulina G a principal classe
de molculas de anticorpo e uma das
protenas mais abundantes no soro.
IgG

Estrutura
Covalente da
molcula de IgG
IgG Estrutura tridimensional
da molcula de IgG
IgG
Ligao da IgG com um antgeno
tica
tica

BOM SENSO

RESPEITO PELO
ANIMAL
 tica
PRINCPIOS BSICOS
Comisso de tica no Uso de Animais (CEUA) da Prefeitura do
Campus Administrativo da USP em Ribeiro Preto - SP

Os princpios que servem de base para a normatizao desta CEUA foram

propostos em 1959 por Russel e Burch e ratificados em Assemblia da
UNESCO, em Bruxelas, em 27/01/78, que culminou com a Declarao dos
Direitos dos Animais, especificamente em seus artigos 8, letra a) e b) e
14.

- Refinamento - Visa a reduo da dor e do sofrimento animal atravs do

aprimoramento de tcnicas que permitam a manuteno da integridade
cientfica em um experimento.

- Reduo - Refere-se a incorporao de tcnicas e abordagens que

reduzam o nmero de animais utilizados.

- Substituio - Visa a busca e utilizao de mtodos que permitam a

obteno de resultados cientficos sem a utilizao de animais.
tica

Em nossa universidade
Antes de se iniciar a pesquisa deve-se preencher um
formulrio da Comisso de tica no uso de
animais (CEUA)
Informar

TODOS procedimentos tcnicos utilizados no

experimento com animal incluindo tcnicas de
sacrifcio.
Nmero de animais utilizados.
Local de trabalho.
tica
Notas importantes
Limpar bem o local do experimento antes e
aps o trabalho com o animal,pois este
exala odores que podem estressar outros
animais em teste.

O sacrifcio do animal deve ser feito em

local separado dos outros animais pois ele
emite sons e odores avisando que est em
perigo. Alm do estresse nos outros
animais, pode-se obter como conseqncia
resultados equivocados.
tica

Todas as pessoas que praticam experimentao

biolgica devem tomar conscincia de que o
animal dotado de sensibilidade, de memria e
que sofre sem poder escapar dor......
Animal

Coelho
Escolha do animal
Fmea

Anestesia (xilasina relaxante muscular (5 mg/Kg)

+ ketamina anestsico (35 mg/Kg))
Sangria
Puno cardaca (eutansia em cmara de CO2)
Obteno do soro
Animal

Animal e sexo

Coelho fmea: Animal dcil, de fcil manuseio,

controle e alojamento
2,5Kg 80mL sangue e 40mL soro
Primeira Etapa do Processo de
Purificao de IgG

Fonte de material: Soro de coelho

Precipitao com sulfato de

amnio 40% de saturao

Centrifugao

Dilise
Precipitao Salina
Precipitao salina

a sedimentao de uma macromolcula (no

eletrlito), a partir da ajuda de sais (eletrlitos).
Sendo que a sedimentao seguida de uma
filtrao (ou centrifugao) para que o material seja
completamente concentrado.

Ocorre quando a protena (macromolcula) est em

meio aquoso, em seu pI (ponto isoeltrico) e em
baixa fora inica.

Os precipitados proticos mantm sua conformao

nativa e podem ser dissolvidos novamente sem que
ocorra desnaturao.
Precipitao salina
SOLUBILIDADE
A solubilidade de uma protina depende de suas
interaes polares com o solvente aquoso.

O aumento da concentrao de ons ocasiona uma

competio entre a macromolcula e o on salino pelo
solvente. A solubilidade do on salino maior devido a
sua concentrao no meio, alm da sua propriedade
hidroflica. Assim, a adio de sal soluo promove a
precipitao da macromolcula, devido a competio
entre eles pela camada de solvatao.(salting out)

Solubilidade da protena aumenta em baixas

concentraes do sal, em meio aquoso, devido a baixa
fora inica do meio. ( salting in)
Precipitao salina
Precipitao salina

SALTING-IN
o aumento da solubilidade da protena (diminui a
interao protena-protena), devido a adio de
pequenas quantidades de sal (eletrlito) soluo.
O efeito maior em nions fracamente hidratados.
Precipitao salina

SALTING-OUT
a diminuio da solubilidade da protena (predominncia da
interao protena-protena), devido a adio de um sal
(eletrlito) soluo. O efeito maior em nions fortemente
hidratados.
Esse processo depende da hidrofobicidade da protena, da
fora inica do sal, da temperatura e do pH do meio.
Precipitao salina

SULFATO DE AMNIO (NH4)2SO4

um sal divalente, de grande solubilidade em gua, que
no promove a desnaturao da protena,
independentemente da sua concentrao.

utilizado em 40% de saturao, pois nessa porcentagem

ocorre a precipitao das fraes e globulinas do soro.

O sulfato de amnio largamente utilizado em protocolos

de isolamento de protenas. Em geral, fornece
preparaes com menor grau de contaminao e maior
concentrao da protena de interesse.
Perfil Eletrofortica das Protenas do Soro
Precipitao salina
Precipitao salina

Solubilidade

KCl

MgSO4

(NH4)2SO4

Fora inica
Centrifugao
 Centrifugao

A centrifugao um
processo de separao
em que a fora centrfuga
relativa gerada pela
rotao da amostra
usada para sedimentar
slidos em lquidos, ou
lquidos imiscveis de
diferentes densidades,
separando-os.
Centrifugao

UNIDADES
A velocidade com que a centrfuga
operada geralmente expressa em
termos de nmeros de rotaes por
minuto (rpm) do rotor. Frequentemente
desejavel expressar rpm como acelerao
angular ou o nmero de vezes que a fora
da gravidade excedida (n de gs).
Centrifugao

FRMULA DE CONVERSO

FCR = 0.00001118 R N2

Onde FCR a fora centrfuga relativa, R o raio

de centrifugao, em milmetros, e N a velocidade
de centrifugao em rotaes por minuto (rpm).

A unidade de medida da fora centrfuga relativa o

"g", sendo 1g equivalente acelerao da
gravidade na superfcie da terra.
Dilise
 Dilise

Mtodo baseado no princpio da difuso atravs de uma membrana

semi-permevel.

Utilizado para remover sais e molculas de baixo peso molecular de

uma soluo concentrada com protenas precipitadas durante o
processo de purificao.
 Dilise

COMO SER REALIZADA A DILISE NESSE

EXPERIMENTO?
A soluo concentrada contendo IgG colocada dentro do saco
de dilise, que nada mais do que um saquinho de membrana
semi-permevel (celulose) .

O saco de dilise
colocado em um recipiente
contendo uma soluo
tampo, a qual deve ser
trocada sempre que
necessrio, at que ocorra
a retirada total de sal e
haja o equilbrio entre a
soluo contendo IgG e a
soluo tampo. Com agitao constante
 VOLTANDO NOSSA
AMOSTRA...

Aps a
centrifugao,
despreze o
sobrenadante
e dissolva o
precipitado
Precipitao Centrifugao por Ressuspenda o em 3,5 ml de
salina (40% 10 minutos a 5000 precipitado com gua
de sulfato rpm (3913g). sulfato de destilada
de amnio) amnio a 40% e
Despreze o
o centrifugue
sobrenadante.
sob as mesmas
condies.
 Soluo contendo IgG

DILISE

em tampo
fosfato
0,02mol/L
pH 7,4
Cromatografia
Troca Inica (DEAE-celulose)
Anlise dos perfis cromatogrficos pelos
mtodos do spot test e leitura a 280nm

Eletroforese (SDS-PAGE)

Imunodifuso
Cromatografia
IgG

Caractersticas das protenas a serem

utilizadas para efeito desta etapa de
purificao

Imunoglobulina Cadeia Cadeia Coeficiente Massa MM cadeia Contedo pI

de coelho pesada leve sedimentao molecular pesada carboidrato

IgG 1 , 7S 150 000 50 000 2-3 7,0

IgM , 19 S 900 000 68 000 12 6,45

Cromatografia
Cromatografia de troca inica
DEAE-celulose

Celulose: polmero de
glicose. Apresenta ligaes
cruzadas de ponte de
hidrognio, tendo grupos
hidroxlicos altamente
oxidveis a grupos
carboxlicos, sendo esta a
razo que a capacita como
trocador.
Vantagem: poros largos,
facilita acesso das
substncias aos grupos
trocadores.
Grupos inicos positivos
ligados matriz:
dietilaminoetil
Cromatografia

Fase estacionria
DEAE-celulose (resina): trocador aninico fraco
(carga positiva)

Protenas carregadas negativamente ficam retidas na

coluna devido interao com a FE

RNH2 + H+ RNH3+
Cromatografia

Este mtodo de separao consiste na

competio entre os componentes
carregados da amostra e da fase mvel
pelos stios carregados da fase
estacionria

A FE slida e a FM lquida

Realizada em coluna clssica

Fluxo de solvente Cromatografia

Fluxo de solvente
TAMPO

Fluxo de solvente
+
+

+
+
+ SAL
TAMPO

+
+
+
Cromatografia

Os componentes adsorvidos pela FE podem ser eludos,

por deslocamento com outros ons com o mesmo tipo de
carga, porm estes ons devem apresentar maior fora
de interao com a fase estacionria.

A afinidade entre ons da fase mvel e matriz acoplada

ao grupo trocador podem ser controlados utilizando os
fatores como pH e fora inica.

Um aumento da fora inica, isto , da concentrao do

tampo, faz com que molculas do soluto eluam de uma
forma mais rpida e assim utilizamos um menor volume
de tampo
Cromatografia

O experimento...
Eluente usado: tampo fosfato 0,02 mol/L / pH 7,4 e
tampo fosfato 0,02 mol/L + NaCl 1 mol/L / pH 7,4

Amostra: soro de coelho precipitado com 40% de

sulfato de amnio, dialisado contra tampo fosfato.

Coluna: 8mL

Frao: 1 mL/tubo, sendo 15 tubos com tampo

fosfato 0,02 mol/L / pH 7,4 e 15 tubos com tampo
fosfato 0,02 mol/L + NaCl 1 mol/L / pH 7,4
Cromatografia

Capacidade da Coluna

1g resina = 10 mL FE 1 mL soro
0,8g resina = 8 mL FE 0,8 mL soro

1 mL soro 60 mg protena
0,8 mL soro 48 mg protena

0,5mL da frao precipitada a 40% da

aproximadamente 6mg de protena.

Vantagem: alta capacidade da coluna

Lembrando que

+-+ Ponto isoeltrico - +-

+ +
+ + -+ - -
+- - - - +
+
+
- -

+
+ +
-- -
- - +
+- + + + -+ - - -
+
- +- + - +
- +

Carga
Lquida + 0 -
pH = PI
Cromatografia

Metodologia
O pH inicial de 7,4 (tampo fosfato) a IgG est com
carga levemente negativa pois seu PI (7,0) muito
prxima deste pH. Sendo assim, a IgG e outras
protenas com cargas neutras ou positivas e levemente
negativa nesta fora inica eluiro diretamente

Protenas com carga negativa, neste caso (IgM) PI

6,45, ficaro retidas na coluna e sero eludas com
tampo fosfato 0,02 mol/L pH 7,4 contendo NaCl 1
mol/L, obedecendo o seguinte equilbrio:

DEAE+ IgM- + Cl- DEAE+Cl- + IgM-

Cromatografia
Perfil cromatogrfico de protenas eludas em
DEAE Celulose analisados pela leitura em 280nm
Cromatografia DEAE celulose
Spot Test
4.5
4.0
3.5 1M
abs 280nm

3.0 NacL 5 6 7 8
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
18 19 20 21
0.0
0 10 20 30
amostras

Aplicamos 0,5mL de soro de coelha normal precipitado e dialisado.

Amostra 19,5mg/mL
coluna 8,5x0,9cm (v= 5,4mL) 8mL
frao de 1,0mL/tubo
Eletroforese
Eletroforese

A eletroforese uma tcnica que envolve a

migrao de molculas ionizadas, quando submetidas a
uma diferena de potencial aplicada por uma fonte
eltrica. Essa migrao ocorre de acordo com sua
carga e sua massa molecular.
Utilizaremos essa tcnica para averiguar o grau de
pureza da IgG com base em sua massa molecular, assim
poderemos separar a IgG de outras protenas que possam
ter eludo com ela em determinadas fraes obtidas da
cromatografia.
Protenas so molculas anfteras, sua carga
depende do pH em que ela se encontra. Quando o pH
igual ao seu pI (ponto isoeltrico), a protena se encontra
com carga lquida nula e no ocorre migrao
eletrofortica.
Eletroforese Eletroforese SDS-PAGE
Para o tipo de
eletroforese com que
iremos trabalhar no
importa a carga da protena
pois cada molcula de
protena ir se ligar a um
grande nmero de
molculas do detergente
dodecil sulfato de sdio
(SDS), carregado
negativamente, superando a
carga intrnseca da prpria
protena e fazendo com que Assim, identificaremos a
ela migre em direo ao protena de interesse (IgG) no
eletrodo positivo, quando pelo seu pI, mas sim pelo sua
uma corrente eltrica massa molecular.
aplicada.
Eletroforese SDS Dodecil Sulfato de Sdio

+
protena
Eletroforese
Gel de Poliacrilamida

A poliacrilamida
uma mistura de
duas substncias:
acrilamida e
metilenobis-
acrilamida.
Eletroforese
Concentrao de Acrilamida

Misturando essas
duas substncias,
temos a formao de
uma rede.
Diferentes
relaes entre as
concentraes dessas
permitem a criao de
diferentes gradientes
de separao.
Eletroforese Perfil de migrao eletrofortica
A polimerizao da acrilamida forma um gel inerte com
ligaes cruzadas que conferem resistncia migrao das
protenas agindo como uma peneira molecular onde as protenas
maiores so retardadas muito mais do que as menores.
Eletroforese Preparao do Gel
Gel de Empilhamento (4%) Gel de Corrida (10%)
Tris 0.5 mol/L pH 6.8 500 uL Tris 1.5 mol/L pH 8.8 1500 uL
Acrilamida/bis 180 uL Acrilamida/bis 1333 uL
gua 1160 uL gua 1047 uL
SDS 10% 40 uL SDS 10% 80 uL
Temed 10% 10 uL Temed 10% 20 uL
Persulfato de amnio 10 uL Persulfato de amnio 20 uL
Eletroforese

Materiais utilizados na
eletroforese de poliacrilamida
Eletroforese
Preparao da cuba
para corrida
Eletroforese Mtodos de colorao
As protenas mais abundantes podem ser facilmente
detectadas (10ug) corando-se o gel com um corante como o
Coomassie blue, as protenas menos abundantes podem ser
visualizadas em gis tratados com colorao de prata ou ouro
(com o qual pequenas quantidades, como 10 ng de protena,
podem ser detectadas em uma banda).
Coomassie blue Prata Ouro
Eletroforese Estimando a Massa Molecular de uma protena

Atravs da migrao relativa dos padres de massa

molecular, podemos traar uma curva de calibrao e obter
o valor da Massa Molecular de uma protena.
1 - Padres de alto peso molecular
(PHARMACIA)
Tiroglobulina : 330.000 Da
Ferritina: 220.000 Da
Albumina: 67.000 Da
Catalase: 60.000 Da
Lactato desidrogenase: 36.000 Da

2 Padres de baixo peso molecular

(PHARMACIA)
Fosforilase B : 94.000 Da
Albumina: 67.000 Da
Ovoalbumina: 43.000 Da
Anidrase Carbnica: 30.000 Da
SBTI: 20.100 Da
Lactoalbumina: 14.400 Da
Eletroforese Eletroforese SDS-PAGE - Resultados
kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9
kDa
225 180
150 130
102 100
52
38 56

34

22

1- PADRES DE ALTO PESO MOLECULAR

2- PICO I DEAE-CELULOSE
3- PICO II - DEAE-CELULOSE
4- PICO I DEAE-CELULOSE
5- PICO II DEAE-CELULOSE
6- PICO II - DEAE-CELULOSE
7- PICO I - DEAE-CELULOSE
8- PICO II DEAE-CELULOSE
9- PICO I DEAE-CELULOSE
IMUNODIFUSO
 Como verificar a funcionalidade da imunoglobulina isolada

DIFUSO RADIAL DUPLA

Esta tcnica baseada no princpio de que ocorre a difuso do
antgeno e do anticorpo em um meio semi slido (agarose), com a
formao de complexos antgeno-anticorpo estveis que se precipitam
e formam um halo entre os orifcios.
Tcnica: Em uma camada de agarose que recobre uma lmina de vidro
so feitos orifcios. No orifcio central adicionado antgeno e nos
outros, diluies da amostra purificada. A lmina incubada por
24/48 horas. Observa-se o halo de precipitao entre os orifcios.
Aps a formao das linhas de precipitao a lmina lavada em NaCL
0,15mol/L e seca em estufa 370C. Aps este procedimento as lminas
so coradas com corante Comassie.

Anti IgG
Anti IgG

Pico 1 Pico 1 Pico 1 Pico 1

Gel aps corar

Gel antes de corar
 Anti IgG
Pico 2 Pico 1
Resultado da Imunodifuso

Anti IgG
Pico 2 Pico 1
Anti IgG

Pico 2 Pico 1

Anti IgG
Pico 2 Pico 1
Dosagem
de
Protena
Dosagem de Protena 1. Leitura a 280 nm
Sensibilidade: 50 a 100 mg/mL

Protenas possuem aminocidos aromticos e estes

apresentam absoro mxima em 280nm. Quanto maior a
quantidade de protena eluda, maior a absoro neste
comprimento de onda. (A = e.b.c)
Dosagem de Protena

Protenas apresentam absoro na regio de

280nm(aminocidos aromticos) e na regio abaixo de
220 nm (ligao peptdica)

Espectro de absoro ultravioleta da protena globular -quimotripsina

Dosagem de Protena

Vantagens leitura a 280

No destri a amostra e rpido
Em 280 nm e em ph neutro somente os aminocidos
triptofano, tirosina e cistina possuem absortividade
molar relativamente grande, mas esto presentes
em praticamente todas as protenas.
Mtodo mais preciso

Desvantagens leitura a 280

Qualquer substncia que absorva em 280 nm um
interferente.
Maior custo: equipamento caro.
Dosagem de Protena 2. Spot test
Sensibilidade: 0,05 a 4 mg/mL para dosagem (<0,05 para deteco)

Coomassie Brilliant
-
O3S

Blue
CH2 CH2
N N

Complexo:
H5C2 C2H5

Cadeias laterais R R

bsicas ou aromticas N

Cor: Azul
OC2H5
Dosagem de Protena

Vantagens Spot Test

Mtodo rpido e barato
Altamente especfico para protenas
Poucos interferentes
Uso de amostras pequenas e de baixa
concentrao
Complexo protena corante estvel
Resultados confiveis
Alta sensibilidade
Dosagem de Protena

Spot test pode ser utilizado para medidas

quantitativas:
Procedimento:
importante pipetar rigorosamente para no cometer erros
Mtodo trabalhoso para dosagem: recortar os crculos corados,
elu-los com SDS 1% e ler a absorbncia em 600nm.
Atravs da curva de calibrao feita com BSA calcular a
concentrao da amostra.

BSA 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1
(mg/mL)
Dosagem de Protena

Comparao entre Spot test e

leitura a 280 nm
Para a dosagem, a leitura em 280 nm
mais precisa, e com isso obteremos a
massa de protenas
Para o perfil da amostra, o spot test
pode ser utilizado por ser um mtodo
qualitativo barato e rpido
Dosagem de Protena Biureto
Sensibilidade: 1 a 10 mg/mL

3.1. Princpio do Mtodo:

Uma soluo de protenas na presena de ons Cu+2 em meio

moderadamente alcalino, forma um complexo violeta entre o
Cu+2 e os tomos de nitrognio das ligaes peptdicas. A
intensidade da cor diretamente proporcional concentrao
de protenas existente na amostra.

OH-
Protena + Cu+2 Complexo violeta