4.7.

Single - budaya Sistem Medium

Ada banyak pertanyaan yang berkaitan dengan optimasi sistem produksi

embrio. Ini mungkin sebuah pertanyaan tentang tenaga kerja atau bahan
dipekerjakan di media. Karena lebih banyak yang dipelajari dari batas-batas di
mana dimungkinkan untuk beroperasi pada sapi produksi embrio, pikiran
kemudian lebih dapat ditujukan untuk kemungkinan cara menyederhanakan
proses produksi. Penyusunan Media adalah menuntut dan memakan waktu proses,
yang sering panggilan untuk mingguan atau dua mingguan perhatian untuk
menghindari risiko degradasi komponen-komponen tertentu. Dengan media
tunggal sistem, media untuk pematangan, fertilisasi dan kultur embrio semua bisa
dibuat dari sama solusi saham dasar, sehingga menghemat waktu.

4.7.1. cairan saluran telur sintetis (SOF) formulasi

Dalam produksi embrio sapi konvensional di vitro, oosit dan embrio dapat
terkena sebagai sebanyak empat media yang berbeda selama kemajuan mereka
melalui sistem produksi. Khas, media yang berbeda digunakan untuk setiap fase
produksi embrio (medium maturasi, fertilisasi menengah dan menengah kultur
embrio), meskipun ada orang-orang yang percaya bahwa ada potensi untuk
mengembangkan seluruh budaya protokol dari pematangan oosit melalui
pengembangan blastosis dalam media tunggal. Ini akan menghindari efek stres
yang mungkin timbul dari embrio yang ditransfer antara berbeda lingkungan
budaya, yang mungkin berbeda dalam pH dan osmolaritas dan di tingkat ion,
substrat energi dan faktor lainnya. Seperti tercantum dalam konteks sebelumnya,
media standar untuk IVMis TCM-199, baik dengan atau tanpa serum
suplementasi. Di Perancis, Lonergan et al. (1994d) dibandingkan SOF dengan
TCM-199 untuk pematangan oosit tetapi ditemukan untuk menjadi kurang efektif.
Di kemudian hari, di Ontario, bagaimanapun, Watson et al. (2000) melaporkan
studi di yang pematangan oosit dengan amino acidsupplemented sintetis cairan
saluran telur (cSOFMaa) mengakibatkan blastosis kualitas yang sebanding dengan
mereka matang dalam TCM-199 ditambah sapi yang baru lahir serum; hasil
mereka memimpin mereka untuk menyimpulkan bahwa formulasi ini dari media
SOF bisa menjadi media dasar yang efektif untuk oosit sapi pematangan. SOF
adalah media awalnya didasarkan pada analisis biokimia cairan oviductal domba
betina ini; selama bertahun-tahun, SOF telah diubah oleh peneliti dengan
penambahan asam amino serta lainnya modifikasi, seperti penambahan sitrat,
penghapusan glukosa dan penambahan etilendiamin asam tetra-asetat (EDTA).

Di Indiana, menggunakan beberapa modifikasi dari SOF, Gandhi dan

Krisher (1999) dan Gandhi et al. (2000) mampu menunjukkan bahwa SOF dapat
digunakan dengan sukses untuk dewasa dan oosit sapi budaya dan embrio,
sehingga pengembangan sebanding dengan yang di standar sistem multi-media
(lihat Tabel 4.8). Namun, untuk implikasi praktis dari pekerjaan tersebut menjadi
dievaluasi, perlu untuk memiliki banyak informasi tentang kemampuan embrio
IVP untuk menimbulkan tingkat kehamilan yang normal dan normal muda.

4.8. Sistem Budaya kimia Ditetapkan

Evaluasi media kultur untuk IVM dari oosit sapi telah terus berkembang
selama dekade terakhir menuju kondisi yang lebih didefinisikan. Hal ini sekarang
biasa untuk menggunakan ditentukan atau semidefined media dalam
mengevaluasi dampak dari protein suplementasi medium pematangan dan
perkembangan embrio selanjutnya (Aurich dan Hahn, 1994a; Tornesi et al., 1995;
Wright dan Collins, 1995).

4.8.1. Menggunakan cairan saluran telur sintetis (SOF)

Sebuah laporan oleh Calder et al. (1999) menunjukkan bahwa

suplementasi serum media SOF tidak wajib; Suplementasi asam amino dari SOF
dan budaya di bawah suasana CO2 5% selama IVM signifikan ditingkatkan
blastokista. Sebuah penelitian oleh Ali dan Sirard (2002a, b) mengevaluasi
Pengaruh FCS, BSA, dimurnikan BSA, lemak esensial bebas asam BSA dan
ayam-telur albumin sebagai protein suplemen selama IVMin SOF. Mereka juga
dievaluasi penggantian protein dengan makromolekul seperti polivinilpirolidon
(PVP) atau PVA. Mereka menemukan bahwa Sof saja bisa mendukung
pematangan dan bahwa embrio bisa diproduksi setelah oosit dikultur dalam
medium mengandung PVT; penulis mampu menunjukkan bahwa efek dari FSH
pada proses pematangan tergantung pada substrat hadir dalam medium.

4.8.2. TCM-199

Sebuah studi oleh Lonergan et al. (1994c, d) menunjukkan bahwa TCM-

199 dapat dianggap sebagai benar-benar IVMmedium didefinisikan mampu
mendukung pematangan sapi oosit dalam ketiadaan serum; mereka menganggap
ini menjadi penting langkah maju dalam pengembangan sistem budaya berguna
untuk mempelajari metabolisme tertentu persyaratan jatuh tempo oosit sapi.
Mawar-Hellekant et al. (1998) yang dimodifikasi budaya dasar menengah (TCM-
199) untuk menghasilkan enam media yang mengandung PVA, gonadotropin,
EGF dan estradiol serta berbagai substrat energi dan asam amino. Penulis menarik
beberapa kesimpulan dari hasil mereka: (i) jenis energi substrat atau nutrisi yang
disediakan selama IVM mempengaruhi kompetensi perkembangan berikutnya dari
oosit; (Ii) pematangan oosit in media sederhana yang mengandung glukosa
dengan laktat atau 11 asam amino atau glutamin atau laktat dan glutamine dapat
mendukung pembangunan sebagai mudah sebagai TCM-199; (Iii) media
pendukung setidaknya ekspansi sel kumulus moderat selama oosit pematangan
juga didukung blastokista berikutnya pengembangan. Sebuah studi oleh Palma et
al. (1999) mengevaluasi efek dari pematangan didefinisikan menengah pada
produksi embrio berikutnya;

4.8. Sistem Budaya kimia Ditetapkan

Evaluasi media kultur untuk IVMof oosit sapi telah terus berkembang
selama dekade terakhir menuju kondisi yang lebih didefinisikan. Hal ini sekarang
biasa untuk menggunakan ditentukan atau semidefined media dalam
mengevaluasi dampak dari protein suplementasi medium pematangan dan
perkembangan embrio selanjutnya (Aurich dan Hahn, 1994a; Tornesi et al., 1995;
Wright dan Collins, 1995).

4.8.1. Menggunakan cairan saluran telur sintetis (SOF)

Sebuah laporan oleh Calder et al. (1999) menunjukkan bahwa

suplementasi serum media SOF tidak wajib; Suplementasi asam amino dari SOF
dan budaya di bawah suasana CO2 5% selama IVM signifikan ditingkatkan hasil
blastokista. SEBUAH Penelitian oleh Ali dan Sirard (2002a, b) mengevaluasi
Pengaruh FCS, BSA, dimurnikan BSA, lemak esensial bebas asam BSA dan
ayam-telur albumin sebagai protein suplemen selama IVMin SOF. Mereka juga
dievaluasi penggantian protein dengan makromolekul seperti polivinilpirolidon
(PVP) atau PVA. Mereka menemukan bahwa Sof saja bisa mendukung
pematangan dan bahwa embrio bisa diproduksi setelah oosit dikultur dalam
medium mengandung PVT; penulis mampu menunjukkan bahwa efek dari FSH
pada proses pematangan tergantung pada substrat hadir dalam medium.

4.8.2. TCM-199

Sebuah studi oleh Lonergan et al. (1994c, d) menunjukkan bahwa TCM-

199 dapat dianggap sebagai benar-benar IVM didefinisikan menengah mampu
mendukung pematangan sapi oosit dalam ketiadaan serum; mereka menganggap
ini menjadi penting langkah maju dalam pengembangan sistem budaya berguna
untuk mempelajari metabolisme tertentu persyaratan jatuh tempo oosit sapi.
Mawar-Hellekant et al. (1998) yang dimodifikasi budaya dasar menengah (TCM-
199) untuk menghasilkan enam media yang mengandung PVA, gonadotropin,
EGF dan estradiol serta berbagai substrat energi dan asam amino. Penulis menarik
beberapa kesimpulan

dari hasil mereka: (i) jenis energi substrat atau nutrisi yang disediakan selama
IVM mempengaruhi kompetensi perkembangan berikutnya dari oosit; (Ii)
pematangan oosit in media sederhana yang mengandung glukosa dengan laktat
atau 11 asam amino atau glutamin atau laktat dan glutamine dapat mendukung
pembangunan sebagai mudah sebagai TCM-199; (Iii) media pendukung
setidaknya ekspansi sel kumulus moderat selama oosit pematangan juga didukung
blastokista berikutnya pengembangan. Sebuah studi oleh Palma et al. (1999)
mengevaluasi efek dari pematangan didefinisikan menengah pada produksi
embrio berikutnya;

TCM-199 digunakan dalam IVM, dengan atau tanpa OCS suplementasi.

Para penulis menyimpulkan dari data mereka yang pematangan tanpa protein
lakukan tidak mempengaruhi hasil embrio. sebagaimana dicatat sebelumnya, di
Perancis, Marquant-Le Guienne et al.

(1999) meneliti efek penggantian serum dengan HA di IVMmedium mereka; hasil

blastocyst dan

menetas tarif dengan HA yang sebanding dengan yang ditemukan dengan serum.

4.9. Stres oksidatif dalam oosit

Pematangan spesies oksigen reaktif (ROS) produksi proses normal dari

metabolisme sel. In vitro lingkungan biasanya meningkatkan produksi sel ROS,
yang sering terlibat sebagai utama penyebab kerusakan sel. Ada banyak bukti
bahwa ROS di oosit-pematangan dan perkembangan embrio budaya
mempengaruhi IVP ternak embrio (. Cetica et al, 1998; Geshi et al, 2000.). jalur
metabolisme yang berbeda, yang dimediasi oleh enzim seperti dismutas dismutase
(SOD) dan glutathione (GSH), mengontrol ROS seluler tingkat. GSH adalah
sulphydryl non-protein senyawa dalam sel ternak; itu berfungsi sebagai reservoir
untuk sistein. Hal ini diyakini bahwa kehadiran glutamin (Gln) nikmat
pemanfaatan jalur metabolik sel yang mencegah atau mengurangi kerusakan
oksidatif dan pengaruh berikutnya perkembangan embrio.

4.9.1. Peran glutation (GSH)

Hal ini diketahui bahwa sintesis GSH selama IVMof oosit sapi memainkan
bagian penting dalam berikutnya fertilisasi dan perkembangan embrio. Saya t juga
diakui cysteamine bahwa dalam IVM menengah merangsang sintesis GSH dan
meningkatkan perkembangan embrio. Hasil yang dilaporkan oleh Iudica et al.
(1999) di Argentina menyarankan bahwa Selain dari GSH (150 mg / ml) atau Gln
(150 mg / ml) untuk mereka media maturasi ditingkatkan embrio pengembangan.
Pada tahun yang sama, Furnus dan De Matos (1999) di negara yang sama
disajikan bukti yang menunjukkan bahwa pada sapi oosit yang tingkat-faktor
pembatas untuk sintesis GSH adalah sistein; perlu dicatat bahwa amino konstitutif
Asam yang terlibat dalam sintesis GSH adalah glisin, glutamat dan sistein (lihat
Gambar. 4.12). Makalah oleh De Matos dan Furnus (2000) dan De Matos et al.
(1995, 1997, 2000a, b, c, 2002) disajikan untuk menekankan pentingnya
mendorong sintesis GSH selama IVM; mereka menyimpulkan bahwa
suplementasi IVM medium sapi dengan thiolcompounds (b-ME, sistein, sistin)
untuk merangsang sintesis GSH adalah metode yang berguna meningkatkan
efisiensi produksi embrio.

Para penulis menyimpulkan bahwa tinggi tingkat GSH intraseluler setelah

induksi

sintesis GSH selama senyawa tiol IVM tetap selama IVF dan masih ada dimulai
dari kultur embrio. Di Jepang, Hashimoto et al. (2000b) menyelidiki efek dari
berbagai kadar glukosa dalam medium maturasi mereka (SOF dilengkapi dengan
asam amino 20); mereka juga memeriksa intraseluler ROS dan GSH konten oosit;
mereka menemukan bahwa berlebihan glukosa (20,0 mM) dalam medium
merugikan pengembangan oosit ke tahap blastokista, mungkin karena peningkatan
ROS dan penurunan kadar GSH intraseluler oosit.

Di Kanada, Ali et al. (2001) meneliti Pengaruh sistein, katalase dan SOD
pada IVM dan IVF oosit sapi. perbaikan yang signifikan dalam kompetensi
perkembangan oosit dicapai ketika sistein ditambahkan ke media maturasi tetapi
tidak ketika SOD atau katalase ditambahkan. Disarankan sistein yang
suplementasi meresapi COC selama IVM, sedangkan antioksidan yang efektif di
luar sel (katalase) tidak berpengaruh. Sebuah review oleh Nagai (2001) berkaitan
dengan bukti yang menunjukkan bahwa GSH adalah faktor intra-oosit penting
untuk peristiwa setelah pematangan pada sapi. Meskipun laporan efek positif,
peran ROS pada oosit dalam sistem IVMculture telah kontroversial; di sebagian
besar sel, antioksidan enzimatik sistem dapat melemahkan efek oksidatif stres
dengan pemulungan ROS. Di Argentina, Cetica et al. (2001) menemukan bahwa
enzim antioksidan Kegiatan berkurang dalam sel kumulus dan meningkat pada
oosit akibat pematangan; mereka menyimpulkan bahwa oosit mungkin mampu
mengendalikan peningkatan ROS karena aksi antioksidan enzimatik mereka
sendiri sistem.

Dalam spesies pertanian lainnya, juga sekarang mengakui bahwa faktor

utama yang mempengaruhi in vitro oosit dan kesejahteraan embrio meningkat
oksidatif menekankan. Sebuah studi oleh Gasparrini et al. (2000) pada efek
cysteamine selama IVMdemonstrated bahwa penambahan senyawa tiol (seperti
cysteamine) ke media ditingkatkan embrio efisiensi produksi. Pada babi, telah
terbukti bahwa kandungan GSH oosit babi matang adalah berkorelasi dengan
pemupukan berikutnya dan kemajuan perkembangan. Dalam pekerjaan dilansir
Jeong dan Yang (2001) di Amerika Serikat, kehadiran sistein dalam medium
maturasi secara signifikan meningkatkan pengembangan blastosis.

STUDI oleh Brad et al. (2002) menunjukkan bahwa oosit matang in vitro
memiliki tingkat lebih rendah dari GSH dibandingkan dengan oosit babi in vivo-
matang; itu penulis menyarankan bahwa ada kebutuhan untuk ditingkatkan
IVMmedium untuk babi.