Cambios epigenticos detectados en plantas de lpulo

micropropagadas

Resumen: La micropropagacin es una tcnica ampliamente utilizada en el lpulo (Humulus

lupulus L.). Sin embargo, hasta donde sabemos, la estabilidad gentica y epigentica de los
microplantes nunca ha sido probada antes. En el presente estudio, se establecieron dos
accesiones de lpulo in vitro y se micropropagaron durante 2 aos. Se analiz la estabilidad
gentica y epigentica de las plantas in vitro con varias tcnicas moleculares: polimorfismo de
ADN amplificado al azar (RAPD), polimorfismo amplificado por microsatlites de retrotransposn
(REMAP) y polimorfismo de amplificacin sensible a la metilacin (MSAP). No se encontr
variacin gentica entre las plantas control y tratadas, incluso despus de 12 ciclos de
micropropagacin. Se detect variacin epigentica, primero, cuando se compararon las
muestras de campo y las muestras in vitro. Casi un 30% de los fragmentos detectados
presentaron el mismo patrn de alteraciones en todos los vitroplantes. En segundo lugar, los
niveles ms bajos de la variacin epigentica se detectaron entre las plantas de las diferentes
subculturas. Parte de esta variacin detectada pareca estar acumulada a lo largo de los 12
subculturas secuenciales ensayadas.

Introduccin
La micropropagacin es un mtodo fcil y
econmico que permite obtener enormes
cantidades de plantas clonales en un corto
perodo de tiempo. Tambin es
independiente de la temporada una vez que
se establece. Una ventaja adicional de la
tcnica es el establecimiento de colecciones
clonales de especies seleccionadas, que
pueden facilitar la conservacin de lneas
seleccionadas a partir de muestras
genticamente representativas. En el caso
especfico de Humulus lupulus, una planta
diica de trepado de la familia Cannabaceae,
slo se cultivan plantas femeninas, ya que
los productos finales (cidos alfa y beta) son
ms abundantes en las inflorescencias
femeninas (cono). Es interesante notar que
la cantidad y tipo de resinas producidas es el
rasgo fenotpico principal que difiere entre
las variedades de lpulo. Los huertos estn
invariablemente plantados con material
clonal de uno de los cultivares estndar
producidos por propagacin vegetativa
(Neve, 1991). Los cultivares de lpulo
actuales tienen orgenes diversos y son el
resultado de una larga historia de uso
humano, que se remonta al siglo VIII. Los
cultivares ms antiguos podran haber sido el
resultado de procesos de cra no
intencionados causados por la propagacin
vegetativa de plantas de lpulo locales que
posibilitan el establecimiento de poblaciones
homogneas. La posterior seleccin y
reproduccin fue intencional. La mayora de
los cultivares comerciales usados hoy en da
son el resultado de una progenie propagada
vegetativamente de individuos
seleccionados.
La micropropagacin permite no slo la
produccin en masa de plantas clonales, sino
que tambin es una etapa bsica para
diferentes procedimientos de cultivo de
tejidos en la mayora de las especies de
plantas. En el salto, la micropropagacin se
utiliza como paso previo en la eliminacin de
virus (Postman et al., 2005), almacenamiento
en fro (Reed et al., 2003), crioconservacin
(Martnez et al., 1999) Regeneracin
(Gurriara'n et al., 1999), y transformacin
(Horlemann et al., 2003). Se ha informado de
que el cultivo de tejidos induce una variacin
gentica denominada variacin somaclonal.
Este fenmeno fue descrito por Larkin y
Scowcroft (1981) como la variacin que
surge en cultivos celulares, plantas
regeneradas y sus progenies. Esto es
obviamente relevante para la base de la
micropropagacin misma, ya que el
mantenimiento de la fidelidad gentica de
los regenerantes, generalmente de genotipos
seleccionados, es el objetivo principal del
proceso. Adems, la variacin producida en
este paso inicial influira en el rendimiento de
las tcnicas de cultivo posteriormente
aplicadas a las plantas micropropagadas.
Varios factores, como la definicin del medio,
la fuente de los explantes, la edad del cultivo
y el genotipo de la planta donante se han
propuesto como factores que influyen en el
tipo y la frecuencia de la variacin
somaclonal (Brar y Jain, 1998). La tcnica de
micropropagacin utilizada en este trabajo,
ramificacin axilar, es el sistema ms
extendido en micropropagacin y tambin se
considera la ms adecuada para garantizar
la estabilidad gentica de las plantas
obtenidas (Martins et al., 2004). Sin
embargo, es importante tener en cuenta que
la micropropagacin puede implicar
alteraciones relacionadas con el dao celular
y del ADN, incluyendo el estrs oxidativo
(Cassells y Curry, 2001) causado por el uso
de agentes oxidativos para esterilizar los
explantes primarios y los tejidos lesionantes
en ambos, iniciando Culturas y subcultivos.
La variacin somaclonal es un trmino
amplio que abarca cualquier fenmeno que
genere variacin gentica o epigentica que prevalencia de retrotransposones en los
pueda reflejarse en cambios fenotpicos en
las plantas regeneradas. Los marcadores
basados en ADN proporcionan una manera
eficiente de detectar las mutaciones
inducidas por el cultivo de tejidos, ya que
estos marcadores no se ven afectados por
factores ambientales. Al mismo tiempo,
debemos asumir que la probabilidad de
cambio est distribuida al azar a lo largo del
genoma, incluso si en algunos casos se han
descrito puntos preferenciales de mutacin,
como en el centeno o el ajo (revisado en
Va'zquez, 2001). Desde este punto de vista,
un enfoque basado en el anlisis aleatorio
del genoma parece el ms apropiado,
aunque, hasta la fecha, no se ha desarrollado
un ensayo simple para evaluar la variacin
somaclonal. Algunas de las tcnicas
moleculares utilizadas para detectar la
variacin gentica son los marcadores
basados en la reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR), tales como el polimorfismo
de ADN amplificado aleatoriamente (RAPD),
la repeticin de secuencia simple inter (ISSR)
y el polimorfismo de longitud de fragmento
amplificado (AFLP). Primero se desarrollaron
para detectar diferencias entre genotipos
(Smulders, 2005). A pesar de los
inconvenientes especficos de cada una de
estas tcnicas, ventajas tales como su
amplia seleccin del genoma, el alto nmero
de marcadores obtenidos en cada reaccin y
la idoneidad para diferentes genomas sin
necesidad de conocimiento previo hicieron
estas tcnicas de perfilado multilocus
poderosas herramientas en estudios de La
estabilidad gentica despus de la
micropropagacin (Martins et al., 2004; Nas
et al., 2004; RenauMorata et al., 2005;
Lakshmanan et al., 2007). En tales estudios,
han ayudado al xito en la bsqueda de
mutaciones puntuales en plantas derivadas
de cultivo de tejidos. Recientemente, se han
utilizado otras tcnicas basadas en
secuencias de transposn en la evaluacin
de la variacin somaclonal como
polimorfismo amplificado inter-
retrotransposn (IRAP) y polimorfismo
amplificado por microsatlites de
retrotransposn (REMAP) (Smy'kal et al.,
2007). La dispersin, la ubicuidad y la
genomas de las plantas proporcionan una
excelente base para el desarrollo de
sistemas de marcadores.
Contienen secuencias largas, definidas y
conservadas que pueden usarse para la
clonacin de marcadores especficos y
secuencias flanqueantes. En segundo lugar,
los miembros activos de replicacin de una
familia de retrotransposones producirn
nuevas inserciones en el genoma, lo que
conduce al polimorfismo (Kalendar et al.,
1999). La activacin del retrotransposn
relacionado con los procesos de estrs, tal
como se produjo durante el cultivo in vitro,
ha sido ampliamente descrito (revisado en
Grandbastien, 2004). La activacin tambin
se ha relacionado con la disminucin en la
tasa de metilacin del genoma relacionado
con el cultivo in vitro (Liu et al., 2004) como
se inform anteriormente para H. lupulus
(Peredo et al., 2006, 2008). Por otra parte,
las variaciones de metilacin del ADN han
sido postuladas no slo para la activacin de
elementos transponibles, sino tambin como
un mecanismo subyacente de la
mutagnesis inducida por el cultivo de
tejidos como alteraciones fenotpicas debidas
a la activacin o silenciamiento de genes, a
eventos de rotura cromosmica y cambios de
secuencia. Existen varias tcnicas para
medir la estabilidad de los niveles de
metilacin, incluyendo metilacin global,
mtodos secuenciales especficos basados
en modificaciones de bisulfito del ADN, y
polimorfismo amplificado sensible a la
metilacin (MSAP). MSAP es una tcnica
basada en AFLP que utiliza isosquizmeros
sensibles a la metilacin. MSAP se ha
aplicado ampliamente para evaluar la
estabilidad epigentica en plantas
micropropagadas (Peraza-Echeverria et al.,
2001; Li et al., 2002, 2006; Smy'kal et al.,
2007). A pesar del poder de cada una de
estas tcnicas, ninguna tcnica es ideal o
suficiente, tomada sola, para la evaluacin
de la variacin. Se debe utilizar una
combinacin de varias tcnicas para evaluar
las plantas micropropagadas. En el presente
trabajo, se utilizaron tres marcadores
moleculares (RAPD, MSAP y REMAP) para
evaluar, en primer lugar, las diferencias
entre plantas de campo e in vitro, y segundo,
la variacin producida a lo largo de 12
subculturas secuenciales de las
microplantas. Para evitar el efecto
dependiente del genotipo de la variacin
somaclonal, se incluyeron en el ensayo dos
variedades que se encuentran entre las
principales variedades cultivadas en EE.UU. y
Espaa, 'Nugget' y 'Columbus'. Hasta donde
sabemos, este es el primer informe sobre la
estabilidad gentica y epigentica del lpulo detectadas con cada cebador RAPD, se
micropropagado a largo plazo.
Materiales y mtodos
Materiales vegetales
Dos cultivares de lpulo, 'Columbus' y
'Nugget', fueron seleccionados para el
ensayo debido a su alto inters comercial. El
material vegetal fue obtenido de una
plantacin comercial de Humulus lupulus L.
localizada en Villanueva de Carrizo (Len,
Espaa). Los materiales vegetales originales
para la micropropagacin fueron ramas
jvenes recogidas en marzo de 2003 de
plantas femeninas adultas en uso comercial.
Se descart el meristema final de cada rama,
por lo que slo se usaron meristemas de
nodos para el cultivo in vitro. La
esterilizacin consisti en un paso de 20
minutos en una solucin de leja al 15%
seguida de tres lavados del tejido de la
planta en agua destilada estril. Las estacas
nodales se transfirieron luego a un medio de
10 ml de MS (pH 5,8, sacarosa al 3%, agar al
0,8%) en tubos de 16 mm de 100 mm y se
subcultivaron cada 60 d transfiriendo los
cortes a medio fresco. Doce ciclos de
subcultivos se completaron en este ensayo
(2 aos). Un total de 84 plantas fueron
seleccionadas para el anlisis molecular: dos
plantas de campo de cada cultivar utilizadas
como controles de campo y 40 plantas in
vitro del cultivar 'Nugget' y 40 del cultivar
'Columbus', correspondientes a 10 plantas de
la primera , Tercero, noveno y 12 ciclo. El
ADN total se extrajo de hojas mantenidas a
80C con un Mini Kit de Planta DNeasy
(Qiagen).
ADN polimrfico amplificado
aleatoriamente
Las reacciones de RAPD se llevaron a cabo
de acuerdo con el mtodo de Pillay y Kenny
(1996) con ligeras modificaciones. Cada
reaccin contena 5-10 ng de ADN, 1 tampn
de reaccin, 2 mM de Cl2Mg, 0,2 mM de cada
dNTP, 0,2 mM de cebador y 1 U de Taq
polimerasa (Invitrogen) en un volumen final
de 20 ml. Para evaluar la fiabilidad y
repetitividad de los patrones de bandas
realiz una doble extraccin de ADN en una
muestra de campo. A continuacin, los ADN
se trataron como muestras independientes y
se amplificaron por triplicado. El conjunto
completo de cebadores OPA (Operon
Technologies) ms cinco cebadores de OPC
(1-5) se ensayaron en el ensayo. La
temperatura de recocido utilizada con los
cebadores oscil entre 39 y 51 C, aunque 42
C fue la temperatura seleccionada para la
mayora. El protocolo de amplificacin
incluy una etapa de desnaturalizacin inicial
de 4 min a 94C, luego 45 ciclos de 1 min a
94C, 1 min a la temperatura de hibridacin
y 2 min a 72C seguido de una etapa de
alargamiento final de 8 min a 72C . Las
muestras se almacenaron entonces a 4C
hasta que se cargaron 15 ml de cada
muestra en un gel de agarosa al 2% y se
pasaron a 70 V durante 4 h.
Polimorfismo amplificado por
microsatlites de retrotransposon
Los REMAP se realizaron de acuerdo con el
mtodo de Branco et al. (2007) con ligeras
modificaciones. Los cebadores inversos de
los 50 terminales de secuencias LTR de Ogre
(Y299398) y Cyclop (J000640) (Smy'kal,
2006) y los cebadores inversos de SSRs de
lpulo (3a88, 5-2, 7a82, 11a59, HlTA4,
HlGT1, HlTG2, Y HlTG5) (Brady et al., 1996,
Jakse et al., 2002) se utilizaron en el ensayo.
Las muestras se agruparon para el anlisis, y
se analizaron dos plantas de la misma
subcultura en la misma reaccin. Cada
reaccin contena 5-10 ng de ADN, 1 tampn
de reaccin, 2 mM de Cl2Mg, 0,2 mM de cada
dNTP, 0,2 mM de cebador de SSR, 0,2 mM de
cebador de retrotransposn y 1 U de Taq
polimerasa (Invitrogen) en un volumen final
de 20 ml. El protocolo de amplificacin
incluy una etapa de desnaturalizacin inicial
de 4 min a 94C, luego 45 ciclos de 1 min a
94C, 1 min a 42C y 2 min a 72C seguido
por una etapa de alargamiento final de 8 min
a 72C. Las muestras se almacenaron
entonces a 4C hasta que se cargaron 15 ml
de cada muestra en un gel de agarosa al 2%
y se pasaron a 70 V durante 4 h.
Polimorfismo amplificado sensible a
la metilacin
El anlisis MSAP del cultivar 'Columbus' se
realiz de acuerdo con Cervera et al. (2002).
Cada muestra consisti en cinco plantas
agrupadas de la misma subcultura. Los
anlisis de MSAP se realizaron usando los
digeridos EcoRI-MspI y EcoRI-HpaII. Las
amplificaciones pre-selectivas y selectivas se
llevaron a cabo con los parmetros de
ciclismo AFLP clsicos. Los cebadores
utilizados para la amplificacin pre-selectiva
fueron EcoRI y HpaII / MspI + 0, mientras que
para la amplificacin selectiva los cebadores
fluorocromelados utilizados fueron EcoRI +
AAC, ACT, ACG (Applied Biosystem) e
iniciadores no marcados HpaII / MspI + ACT,
AAT, Y TCC. Al final de la PCR selectiva, las
muestras fueron sometidas a electroforesis
en un secuenciador automtico ABI PRISMs
3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystem).
Los patrones de banda se analizaron con el
programa Genemaper (Applied Biosystems) y
se corroboraron mediante inspeccin visual.
Se analizaron un total de dos muestras
agrupadas por subcultivo de cuatro
subcultivos diferentes (1, 3, 9 y 12) y una
planta de control de campo. Para evitar
problemas de repeticin, dos extracciones
independientes de ADN de una planta de
control de campo se ensayaron como
muestras independientes para el anlisis
MSAP.
Anlisis de los datos
La presencia / ausencia de RAPD, REMAP, y
MSAP bandas se determin mediante
inspeccin visual y anot como 1/0. Cada
fragmento amplificado se consider un locus
y se defini por su tamao. Slo se tomaron
en cuenta las bandas que mostraban una
seal clara y fcilmente detectable. Los
cambios epigenticos en los patrones de
bandas MSAP se estimaron mediante anlisis
de conglomerados. Un vecino que se uni a
un anlisis de agrupamiento se llev a cabo
utilizando el programa PAST
(PAlaeontological STatistics, versin 1.54,
Hammer et al., 2006). Para obtener los
rboles se utilizaron varias medidas de
similitud (Euclidean, Correlation, Dice,
Jaccard, Jukes-Cantor), que estaban
disponibles en el programa PAST. Con el
objetivo de examinar la fiabilidad y minimizar
los errores topolgicos del rbol obtenido, se
realiz una prueba de arranque (n 1000).
El valor de confianza bootstrap (PB) para
cada rama se calcul como el nmero de
veces que una rama de rbol se agruparon
de la misma manera en los rboles
muestreados. Los cambios de metilacin
observados en las muestras se estimaron
mediante el anlisis de los patrones de
banda completa de cada par de
isosquizmeros. Los loci se consideraron
polimrficos, implicando cambios
epigenticos, cuando hubo diferencias en su
presencia / ausencia en los patrones de
EcoRI-MspI y EcoRI-HpaII entre el control de
campo y las muestras micropropagadas y / o
entre subcultivos in vitro. Se calcularon los
porcentajes de loci polimrficos entre plantas
de campo e in vitro y entre las diferentes
subculturas. En este estudio, los singletons
se definieron como cualquier banda presente
slo en una de las muestras analizadas y
tambin, se ha considerado una banda de
singleton una no encaja en el patrn
esperado. Por ejemplo, una banda que no
est presente en las plantas de campo pero
est presente en las in vitro es un loci
polimrfico, pero tambin puede incluir un
singleton si esta banda no se detecta en una
de las muestras micropropagadas (Figura 1,
sealizada Con un asterisco). El tipo
especfico de cambio epigentico en cada
sitio de restriccin se describi de acuerdo
con la combinacin de presencia o ausencia
de banda detectada en EcoRI-HpaII y
EcoRIMspI digiere como se describe en
Peredo et al. (2006).

Resultados

Micropropagacin de cultivares de
lpulo

Las plantas permanecieron en los ciclos de

micropropagacin durante 2 aos
completando 12 ciclos de micropropagacin,
sin problemas crecientes. El desarrollo
completo de las plantas in vitro se consigui
sin ninguna fase de callo. El enraizamiento
espontneo se present en todos los
vitroplantes sin aadir ninguna hormona al
medio de cultivo, usualmente comenzando
despus de 10 d en cultivo. No se observaron
alteraciones fenotpicas durante el proceso
en las plantas micropropagadas. El grupo de
plantas in vitro por subcultivo y cultivar fue
siempre superior a 60 plantas
independientes de las cuales se separaron
10 plantas para el anlisis molecular.
Figura 1. MSAP patrones detectados en el cultivar 'Columbus' correspondiente a la combinacin de iniciadores EcoRI TCC / HpaII MspI A
Tabla 1. Nmero de loci detectados en cultivares de lpulo 'Nugget' y 'Columbus' mediante tcnicas RAPD y REMAP y loci detectados
aAnlisis realizado sobre muestras agrupadas; Ver la seccin '' Materiales y mtodos '' para ms info
Anlisis RAPD
Se analizaron dos accesiones de salto,
'Nugget' y 'Columbus'. La suma total de las
muestras analizadas fue de 84, e incluy 40
plantas micropropagadas de cada cultivar
ms dos plantas de control de campo. Se
seleccionaron trece cebadores RAPD de los
ensayados por su confiabilidad y estaban presentes en 'Nugget', con un
repetitividad: OPA 01, 02, 03, 04, 06, 07, 08,
11, 12, 16, 18 y OPC 02 03. Un total de 95
bandas fueron Detectado en 'Nugget' con un
promedio de 7,3 bandas por cebador (Tabla
1). En total, 93 bandas, con una media de
7,2, fueron detectadas en 'Columbus'. Se
puntuaron casi 8000 bandas en total,
variando en tamao de 0,3 a 1,5 kb. Hubo
claras diferencias en los patrones de banda
detectados para cada adhesin. Para los dos
cultivares analizados, no se observ
variacin entre plantas de la misma adhesin
cuando se compararon plantas de campo y
plantas in vitro. Al mismo tiempo, no se
detectaron cambios entre las plantas
micropropagadas, independientemente del
nmero de subcultivos.
Anlisis REMAP
Se ensayaron un total de 16 combinaciones
de cebadores en ambos cultivares. Trece
produjeron patrones claros y repetitivos,
mientras que las combinaciones de
cebadores Cyclop / HlGT1, Ogre / HGA4 y
Ogre / HGT1 se excluyeron debido a la falta
de amplificacin clara y repetitiva. En el caso
de Columbus, se detectaron 111 bandas con
un promedio de 8,5 por combinacin de
cebadores, mientras que 114 bandas
promedio de 8,7 (Tabla 1). Se observaron
patrones de banda diferentes y
caractersticos para cada cultivar en algunas
combinaciones de cebadores. No se detect
variacin para 'Columbus' o 'Nugget' cuando
se compararon los perfiles de bandas de los
controles de campo con las plantas
micropropagadas de cada cultivar. Adems,
no se detect ninguna variacin entre los
patrones de banda REMAP de las plantas
micropropagadas de diferentes subculturas.
Anlisis MSAP
Campo y plantas de lpulo
micropropagadas cv. 'Columbus' se
analizaron con siete combinaciones de
cebadores (EcoRI / MspI-HpaII act / aat, aac /
aat, acg / aat, act / act, aac / act, aac / tcc y
acg / tcc). Se registraron un total de 355 loci
MSAP claros y repetitivos. El nmero medio
de loci detectados por combinacin de
cebadores fue de 50,9 con un mximo de 73
para la combinacin de cebadores EcoRI +
ACG / HpaII-MspI + TCC y un mnimo de 31
para AAC / AAT (Tabla 1).
Tabla 2. Loci polimrficos de MSAP detectados en lpulo cs.

Plantas 'Columbus' entre plantas de campo y micropropagadas y entre plantas micropropagadas a lo largo de
La suma de los porcentajes se seala en negrita cursiva.

Plantas 'Columbus' entre plantas de campo y micropropagadas y entre plantas micropropagadas a lo largo de 12 ciclos
La suma de los porcentajes se seala en negrita cursiva.
Los loci polimrficos se detectaron en cada cambios presentes en los loci polimrficos
Tabla 3. Cambios en la metilacin del ADN detectados en plantas de lpulo de campo y micropropagadas.

Figura 2. rboles basados en las distancias genticas calculadas con los loci de MSAP realizados en plantas de campo y micropropagadas de

Figura 2. rboles basados en las distancias genticas calculadas con los loci de MSAP realizados en plantas de campo y micropropagadas de c
combinacin de cebadores cuando se
compararon las plantas de lpulo de campo
con las de micropropagacin.
Adicionalmente, se detectaron polimorfismos
cuando se realiz la comparacin entre las
plantas micropropagadas del mismo ciclo de
subcultivo o diferentes. Los porcentajes de
polimorfismos se detallan en la Tabla 2. Ms
del 56% de los loci observados fueron
monomrficos cuando las plantas
micropropagadas se compararon con las
plantas de campo. Casi el 30% de los
fueron compartidos por todas las plantas in
vitro independientemente del nmero de
subculturas que haban estado, mientras que
otro 15% de los loci presentaron diferentes
patrones de variacin en uno o varios de los
ciclos subcultivos. En total, el 13,2% de los
loci detectados presentaron singletons, que
se definieron como bandas presentes / que
carecen slo de una de las muestras
analizadas (Figura 1). Se realiz una segunda
interpretacin de los patrones de banda, esta
vez con referencia a los cambios producidos
durante los ciclos de micropropagacin y
considerando la primera subcultura como
control de variacin. Ms del 80% de los loci
detectados eran monomrficos. Casi el 9%
de los loci totales fueron polimrficos y
presentaron un patrn compartido por al
menos todas las muestras de una subcultura.
De esta variacin, slo el 1,1% de los loci
polimrficos eran exclusivos de la tercera
subcultura y an menos, slo el 0,5%, eran
exclusivos de la novena. Una mayor
variacin fue exclusiva de la 12 subcultura
(1,7%) o fue compartida por el noveno y el
12 (2,6%) o tercero, noveno y 12 (2,6%).
Tambin se analiz el comportamiento
especfico de la metil-citosina en cada locus
(Tabla 3). El cambio ms comn entre la
planta de campo y compartido por todas las
plantas in vitro fue la desmetilacin de los
objetivos de restriccin, representando el
62,7% de los cambios observados. La
desmetilacin tambin fue frecuente entre
subcultivos in vitro (43,3%).
Se aplicaron varias distancias genticas a
los datos MSAP de presencia / ausencia
(Euclidean, JukeCantor, Dice, etc.). Las
matrices de distancia mostraron que las
mayores diferencias siempre se calculaban
entre cualquiera de las muestras
subcultivadas y el testigo. Para proporcionar
una representacin visual de los datos, se
realiz el anlisis de conglomerados y
algunos de los rboles resultantes se
muestran en la Figura 2. El anlisis de clster
de los datos epigenticos produjo una
asociacin consistente, ya que se calcularon
valores de bootstrap alto para la agrupacin
(Figura 2A) . Se calcularon varias distancias
genticas para evaluar la fiabilidad de la
topologa del rbol. En todos los rboles
obtenidos, los vitroplantes se agruparon en
la misma rama principal y aparte del control
de campo. En todos los casos, se detect una
alta similitud gentica entre las muestras de
la misma subcultura, ya que se agruparon en
la misma rama e independientes de las
muestras de otros ciclos de subcultura.
Discusin
La micropropagacin de los brotes axilares
suele estar relacionada con la multiplicacin
de genotipos especficos de inters, por lo
que la recuperacin de plantas in vitro de
tipo verdadero es el objetivo clave del
proceso. Adems, la micropropagacin es, en
el lpulo, un paso obligatorio antes de aplicar
cualquier otro proceso biotecnolgico. La
posible inestabilidad gentica causada se
transmitira a todas las plantas tratadas. No
hay estudios previos que hayan evaluado la
variacin somaclonal relacionada con la
micropropagacin de esta especie, aunque
recientes informes han sealado los posibles
cambios epigenticos relacionados con la
introduccin in vitro (Peredo et al., 2008). Se
estableci y mantuvo un sistema de
micropropagacin para dos cultivares
comerciales de lpulo ('Nugget' y
'Columbus') durante un perodo de 2 aos
(12 ciclos de subcultivos), ofreciendo un
excelente sistema para evaluar la estabilidad
gentica de las plantas durante el proceso de
Vitro, as como durante varios ciclos de
micropropagacin. Se obtuvieron
regeneracin directa de las races y de las
races sin la fase del callo en ambos
cultivares ensayados, sin presencia de
factores reguladores del crecimiento en el
medio. La ausencia de una fase callosa y las
hormonas en el medio reducen el riesgo
terico de inestabilidad gentica, ya que
ambos han sido tradicionalmente definidos
como factores que influyen en la variacin
somaclonal (Brar y Jain, 1998). Sin embargo,
no se pudo reducir otras tensiones
relacionadas con el cultivo in vitro, tales
como la definicin del medio, el alto
contenido de sal, el estrs hdrico y la
deficiencia de minerales, o relacionados con
la propia tcnica, tales como dao oxidativo
por heridas.
En el presente trabajo, se aplicaron varios
mtodos de marcadores basados en ADN que
complementaban entre s para probar la
estabilidad del material recuperado despus
de la micropropagacin. El uso de varios
marcadores es importante debido a la falta
de un nico marcador perfecto y la
imposibilidad prctica de un anlisis total del
genoma. Es importante tener en cuenta que,
aun combinando varios marcadores, solo se
podra evaluar una pequea porcin del
genoma. Dos marcadores genticos
diferentes, RAPD y REMAP, fallaron en la
deteccin de cualquier variacin gentica
entre las plantas micropropagadas de ambos
cultivares en comparacin con sus
respectivos controles de campo. RAPD es un
fabricante basado en la amplificacin por
PCR entre cebadores aleatorios (Williams et
al., 1990). Se ha aplicado comnmente para
evaluar la variacin somaclonal debido a su
seleccin rpida del genoma. Cada cebador
RAPD produce tpicamente de 1 a 20 bandas
que varan en tamao de 0,2 a 3 kb. Uno de
sus principales inconvenientes es la
dificultad de producir patrones repetitivos;
Por lo tanto, precauciones tales como
pruebas de repeticin y repeticiones de las
mutaciones putativas se realizaron para
evaluar la fiabilidad de los resultados. Se han
descrito resultados similares a los descritos
para el lpulo para otras especies despus
de largos perodos de micropropagacin, p.
Pinus thunberggi Parl. (Goto et al., 1998),
Fragaria ananassa (Kumbar et al., 1999),
avellana (Nas et al., 2004), Curcuma longa
(Tyagy et al., 2007). No se detect ninguna
variacin utilizando un marcador molecular
adicional, REMAP, que permite la deteccin
rpida de los transposones. Los
retrotransposones se hicieron cada vez ms
populares como marcadores moleculares
debido a su alta abundancia en genomas de
plantas y debido a su versatilidad. La
activacin de elementos transponibles se ha
relacionado con el grado de metilacin del
genoma (Saze y Kakutani, 2007). Estudios
previos en hop detectaron el estado de
desmetilacin del genoma durante la
regeneracin adventicia in vitro, el
almacenamiento en fro y la crioconservacin
(Peredo et al., 2006, 2008). Una tcnica
especfica para la evaluacin de la
estabilidad de los transposones hop se utiliz
para detectar la posible variacin durante el
proceso de micropropagacin. Tcnicas como
el REMAP y el IRAP demostraron ser tan
confiables como el AFLP y se han utilizado
con xito para la identificacin varietal en
arroz (Branco et al., 2007). El IRAP se ha
aplicado recientemente para detectar la
variacin somaclonal en el guisante (Smy'kal
et al., 2007). Los resultados de REMAP para
el lpulo podran indicar que no se
produjeron reordenamientos macroscpicos
debido a la actividad de retransposn
durante los 2 aos de subcultivo in vitro.
Hasta donde sabemos, no hay datos previos
disponibles para el tipo y el comportamiento
de los elementos mviles para el salto. La
tcnica REMAP logr producir patrones de
bandas claras, distintivas y repetitivas en dos
cultivares de lpulo. Sin embargo, la
idoneidad de la tcnica para esta especie
debe estudiarse ms a fondo.
Las alteraciones epigenticas tambin
pueden conducir a muchas anormalidades
genticas (Smulders, 2005). Por lo tanto, el
anlisis de la estabilidad de metilacin es un
tema importante para certificar las plantas
recuperadas de tipo verdadero despus de la
micropropagacin. Los cambios epigenticos
no implican cambios en la secuencia de ADN
primaria, pero pueden modificar la expresin
gnica como resultado de alteraciones en la
metilacin del ADN o cambios en las
modificaciones de las histonas, o una
combinacin de ambos. La metilacin de la
citosina en la posicin 50 del anillo
pirimidnico es la alteracin epigentica ms
importante en los eucariotas. La presencia
de 5-mdC en los promotores de genes
especficos altera la unin de factores
transcripcionales y otras protenas al ADN,
desempeando un papel clave en la
expresin gnica y la diferenciacin tisular
(Valledor et al., 2007). Nuestros resultados
anteriores indican que la desmetilacin del
ADN es la principal causa de inestabilidad
durante los procesos in vitro. La estabilidad
del patrn de metilacin del cultivar
'Columbus' se evalu utilizando MSAP, una
tcnica ampliamente utilizada para detectar
inestabilidades epigenticas en plantas
micropropagadas (PerazaEcheverria et al.,
2001, Li et al., 2002, Smy'kal et al. , 2007).
La comparacin de plantas de campo con
microplantas permite medir los cambios
relacionados con el establecimiento in vitro,
mientras que la comparacin de vitroplantas
de diferentes subculturas nos permite medir
la variacin acumulada en el tiempo. Casi el
30% de los loci MSAP detectados (68,8% de
los loci polimrficos) presentaron diferencias
entre el campo y las plantas tratadas
independientemente del ciclo de subcultura.
Estos cambios fueron causados
principalmente por desmetilacin de la
metilcitosina en los objetivos de restriccin
(62,7% de la variacin detectada). Tambin
se ha informado de cambios en la metilacin
en tejidos de hojas de manzana sometidos a
condiciones de crecimiento tisular, lo que
sugiere que los cambios de metilacin
ocurren durante el propio tejido de cultivo,
incluso cuando los tejidos de las hojas no
experimentan sucesos de regeneracin
adventicia de los brotes (Li y col., 2002). Se
han descrito bien las alteraciones fisiolgicas
graves relacionadas con el cultivo in vitro,
tales como cambios en la estructura de las
hojas, las relaciones hdricas y el sistema de
fotosntesis. Estas alteraciones implican que
normalmente se necesita un perodo de
aclimatacin para reparar todas estas
anomalas antes de transferir las plantas in
vitro al campo (Posp'silova' et al., 1999).
Sugerimos que alguna parte de estas
alteraciones epigenticas podra estar
relacionada con el silencio / activacin del
gen y la reestructuracin de la cromatina
implicada en la respuesta a un nuevo
ambiente, no slo a la variacin somaclonal
en s. La metilacin del ADN es un
mecanismo dinmico mediante el cual la
plasticidad es inducida por seales
ambientales y / o ontogenticas
(Ramchandani et al., 1999), por lo que la
correlacin entre los cambios fisiolgicos
producidos por el crecimiento in vitro y las
alteraciones epigenticas detectadas en
todos los Vitro no es sorprendente. Los
cambios epigenticos se detectaron no slo
entre plantas de campo e in vitro, sino
tambin entre plantas micropropagadas de
diferentes subculturas. Menos del 20% de los
loci detectados fueron polimrficos y se
encontr que poca de la variacin era
repetitiva en plantas de la misma o de
diferentes subcultivos. Una proporcin
similar de loci polimrficos (18,7%) se
detect entre las plntulas micropropagadas
y germinadas a largo plazo de Pisum
(Smy'kal et al., 2007). Se han reportado
cambios relacionados con la hipermetilacin
del ADN en plantas propagadas in vitro para
Banana (Peraza-Echeverria et al., 2001).
Cabe sealar que el 7% de la variacin
detectada fue compartida por todas las
subculturas pero la primera, o compartida
por la 9 y la 12, o estuvo presente en la
12. Del mismo modo, se calcul un aumento
en la distancia gentica. Estos datos
sugieren fuertemente que la variacin
epigentica es acumulativa a travs del
tiempo y los ciclos de subcultivo, como se
refleja grficamente en el anlisis de
conglomerados (Figura 2). El resto de la
variacin (13,2% de loci total / 30,3% de loci
polimrficos) est relacionado con
singletons, cambios que aparecen o
desaparecen slo en una muestra especfica.
La cantidad de variacin relacionada con los
singuletos es muy similar a la detectada
previamente en plantas de lpulo
regeneradas de callos cvs. 'Chinook' (13,7% /
45,3%) (Peredo et al., 2006).
Los informes anteriores sobre la estabilidad
gentica de las plantas de lpulo cultivadas
en campo sugieren que el lpulo es tambin
relativamente estable cuando se reproduce
asexualmente en el campo. Slo 3 de 279
plantas de lpulo cvs. Se encontr que
Tettnang era polimrfico usando AFLPs
(Fleischer et al., 2004) y slo una present
variacin que podra estar relacionada con
un proceso de variacin somaclonal. A pesar
de las diferencias entre la propagacin
asexual en el campo y las condiciones in
vitro, los resultados presentados en nuestro
trabajo, junto con los datos del
comportamiento de campo, apuntan a una
estabilidad gentica relativamente alta del
salto asexuado. Desafortunadamente, los
estudios de campo no proporcionan datos
sobre el comportamiento de metilacin de la
planta propagada. A medida que los
microplantes transferidos al campo requieren
varios aos para alcanzar la etapa de
produccin de adultos completa en la cual el
estado de metilacin de los donantes
originales y plantas micropropagadas debe
ser equivalente, la importancia de la
variacin de metilacin detectada en las
plantas micropropagadas y relacionada con
el establecimiento in vitro no puede
Evaluarse en este punto. Se necesitan
futuros anlisis para confirmar si la variacin
presente en todas las plantas in vitro reverte
en condiciones de campo, as como para
evaluar la influencia de la variacin
epigentica detectada en los fenotipos
regenerantes. Aunque no se dispone de un
anlisis exhaustivo sobre la fenologa de las
plantas micropropagadas, los datos relativos
a plantas previamente micropropagadas
mostraron una morfologa y una tasa de
produccin idnticas a las plantas donantes
originales (comunicacin personal, SA
Fomento del Lu'pulo), lo que sugiere que no
hay alteracin importante en el fenotipo Fue
causada por la propagacin in vitro.
En conclusin, no se detectaron
alteraciones genticas en plantas de lpulo
micropropagadas despus de 2 aos de
cultivo in vitro, pero se detectaron cambios
de metilacin en todas las plantas in vitro en
comparacin con las plantas de campo. Estos
cambios podran estar relacionados con el
nuevo estado fisiolgico de las plantas in
vitro. Sin embargo, tambin se informaron
los cambios entre plantas subcultivadas.
Algunos estaban presentes en varios ciclos
de subcultura y se acumulaban a lo largo de
ellos. La mayor parte de la variacin, sin
embargo, fue causada por singletons aunque
no est claro en este punto la importancia de
la gran cantidad de singlete epigenticos
detectados.
Expresiones de gratitud
Esta investigacin fue apoyada con fondos
del Ministerio de Ciencia y Tecnologa y
FEDER (proyecto MCT-02-AGL-02472). E.L.P.
Est recibiendo una F.P.U. conceder. Todo el
material vegetal fue proporcionado por S.A.
Fomento del Lu'pulo (Leo'n, Espaa).