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CINTICA ENZIMTICA DE LA INVERTASA MEDIANTE LA DETERMINACIN


DE LA VELOCIDAD INICIAL DE REACCIN
Laura Camila Pea1-Paola Andrea Penagos2-Laura
Laura.pena0816@gmail.com

RESUMEN
En esta prctica se busca ver a accin de la invertasa por medio del clculo de la velocidad
inicial de la reaccin que cataliza. La actividad enzimtica se pone de manifiesto incubando
el sustrato juntamente con la enzima y posteriormente luego de permitir la reaccin, se
midi colorimtricamente la reduccin del DNS (acido 3,5-dinitrosalicilico), lo que nos
permiti determinar la velocidad inicial de reaccin; esto en base a que la sacarosa no
contiene tomo de carbono anomrico libre y por lo tanto no es un azcar reductor.

INTRODUCCIN
En la presente prctica se plantea realizar un estudio cintico de la actividad enzimtica de
la invertisa, mediante la determinacin de la velocidad inicial de reaccin as como
estudios del efecto de los siguientes factores en la actividad enzimtica: concentracin del
sustrato, manteniendo constante durante la practica la concentracin de la enzima; la
temperatura, con el fin de establecer el rango de valores de temperatura en el que el enzima
es activa y as determinar su temperatura ptima; logrando as la construccin del modelo
cintico que sigue este tipo de enzima.

MARCO TERICO
La invertasa es la enzima que cataliza la hidrlisis de la sacarosa, el disacrido que todos
conocemos como azcar comn, para obtener sus dos componentes, la glucosa y la
fructosa. Esta enzima recibe otros muchos nombres, siendo el ms exacto Beta-
fructofuranosidasa.

La actividad cataltica de un enzima se determina midiendo la velocidad inicial de reaccin,


que es la pendiente de la curva de progreso (curva de producto formado sustrato
transformado frente al tiempo) en el tiempo cero (Fig. 1). Inicialmente, las reacciones
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transcurren linealmente, pudindose tomar la pendiente de esta recta como la velocidad


inicial. A tiempos ms largos, el progreso de la reaccin se aparta de la linealidad. Esta
cada de la velocidad de reaccin se debe a la disminucin significativa de la concentracin
de sustrato, aunque tambin pueden influir otros factores como el aumento de la
concentracin de producto, cambios de pH, inactivacin del enzima, etc. La mxima
fiabilidad en la determinacin de la actividad de un enzima la suministra el valor de
velocidad inicial o
velocidad durante el
tramo inicial de progreso
lineal de la reaccin. [1]

Figura 1. Curva de progreso de una reaccin enzimtica. Obsrvese cmo, inicialmente, se


produce una disminucin de sustrato, o aparicin de producto, que es lineal con el tiempo
De forma general, la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente es proporcional
a la cantidad de enzima en la mezcla de ensayo, segn:
v = Vmax[S]/(Km + [S]) = k'[E0] Vmax = kcat [E0]
La actividad de un enzima se ve afectada por el pH al cual se lleva a cabo la reaccin. La
curva actividad-pH puede ser diferente para cada tipo de enzima. En el caso ms general la
curva tiene forma de campana. El valor de pH al cual la actividad es mxima se denomina
pH ptimo; dicho pH no tiene por qu coincidir con el pH intracelular. La relacin entre el
pH y la actividad depende del comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato.
Sustrato y enzima (centro activo) pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos,
siendo su grado de disociacin dependiente del pH, lo que determinar, entre otros
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aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de unin del sustrato al centro activo


del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato (kcat).[2]
La velocidad de una reaccin enzimtica vara al aumentar la temperatura de acuerdo a lo
indicado en la Fig. 3, donde se representa una tpica curva de actividad
enzimtica/temperatura. Tal dependencia refleja un doble efecto de la temperatura: positivo
a bajos valores, debido al incremento general que experimenta la velocidad de cualquier
reaccin qumica al hacerlo la temperatura, y negativo a valores altos, debido a la
desnaturalizacin trmica del enzima. Esto es, la velocidad de una reaccin enzimtica se
incrementa al aumentar la temperatura dentro de un determinado rango, alcanzando un
valor mximo a la denominada temperatura ptima. A valores superiores la actividad
disminuye debido a que el enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de
desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin. Durante la fase de incremento de la
velocidad, la relacin entre sta y la temperatura viene determinada por la ecuacin de
Arrhenius:
v = k e -Ea/RT ln v = ln k - Ea/RT

Figura 3. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimtica. El panel izquierdo


muestra la respuesta de la actividad enzimtica (velocidad de reaccin) a la temperatura y el
derecho la representacin de Arrhenius para el clculo de la energa de activacin (Ea).
En la Fig. 4 se representa el efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de una
reaccin catalizada enzimticamente. Este comportamiento cintico, conocido como curva
de saturacin hiperblica por el sustrato, constituye la norma seguida por la mayora de los
enzimas, los denominados enzimas michaelianos. Como principal desviacin, algunos
enzimas muestran curvas sigmoideas, en vez de hiperblicas, de saturacin por el sustrato
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(caso de algunos enzimas cooperativos o alostricos). El anterior modelo cintico se ajusta


a la ecuacin:
v = Vmax [S] / (Km + [S])
Donde Km es la constante de Michaelis e indica la afinidad del enzima por su sustrato, y
Vmax es la velocidad mxima e indica la capacidad cataltica.

Figura 4. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la actividad enzimtica. Curva de


saturacin hiperblica por el sustrato
Ecuacin de Linewever-Burk:
1/v = 1/Vmax + Km/Vmax 1/[S]
Ecuacin de Eadie-Hofstee:
v= Vmax Km v/[S]
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DATOS OBTENIDOS
CALCULOS Y RESULTADOS
Qu efecto tiene la temperatura sobre la actividad enzimtica?
Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reaccin hasta cierta
temperatura, la temperatura ptima. Por encima de esta temperatura, el aumento de
velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado por la prdida de
actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la actividad enzimtica decrece
rpidamente hasta anularse. Las enzimas de muchos mamferos tienen una temperatura
optima de 37C, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se destruyen.

ANALISIS
Chicas encontr que la T optima de la invertasa comercial es entre 40 y 50C, lo que no
explica por que a 90 nos dio pero bueno.
CONCLUSIONES
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BIBLIOGRAFA
1. CONGRESOS. Isomerasa [En lnea]
<http://www.smbb.com.mx/congresos
%20smbb/veracruz01/TRABAJOS/AREA_I/CI-5.pdf>
[Citado en 08 de Noviembre de 2016]

2. QUIMICA. Actividad enzimatica [En lnea]


<https://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/miembros/Web_Sofia/GRUPOS/Tema
%207.pdf/>
[Citado en 08 de Noviembre de 2016]

3. WORDPRESS. Factores que afectan la cintica enzimatica [En lnea]


< https://profesoramaribelarnes.files.wordpress.com/2012/03/lab-3-
enzimologc3ada-ii-bioq-tec-2012.pdf/>
[Citado en 08 de Noviembre de 2016]
ANEXOS

Fotos de la prctica

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