Lucrri tiinifice vol.

49, seria Agronomie

PESTICIDE DINITROFENOLICE: ACTIVITATE

BIOLOGIC, TOXICITATE I MECANISM
DE ACIUNE
Ramona MOLNAR,1 Dorina CREANG,2
A. PUI,1 Raluca RUSCANU,1 Manuela
MURARIU,3 Ctlina CIOBANU,1
M. NEICA,1 i G. DROCHIOIU1
1
Universitatea Al. I. Cuza Iai, Facultatea de
Chimie, B-dul Carol I, nr. 11, Iai-700506,
e-mail: gabidr@uaic.ro, fax: 0232201313
2
Universitatea Al. I. Cuza Iai, Facultatea
de Fizic, B-dul Carol I, nr. 11, Iai-700506,
e-mail: dorinacreanga@yahoo.com
3
Universitatea Tehnic Gh. Asachi Iai
e-mail: manuela_murariu@yahoo.com

Several dinitrophenyl ethers such as dinitroanisol, 2,4-dinitro-1-

(octadecyloxy)benzene, 3-(2,4-dinitrophenoxy)propan-1,2-diol have been
synthesized and tested within the germination experiments comparatively to
the classical dinitrophenols and dinitrophenol pesticides. Both ethers and
phenol derivatives inhibited seed germination, most probably by blocking
oxidative phosphorylation. Germination tests were carried out according to
ISTA rules. A novel mechanism of action of these pesticides was proposed,
which is concordant with Macovschis biostructural theory and not with
proton translocation hypothesis by Peter Mitchell.

Keywords: dinitrophenyl ethers, pesticide toxicity, wheat, germination,

proton translocation.

n protecia chimic a plantelor, un rol important l ocup dinitroderivaii,

n special cei aromatici [2,3], care au urmtoarea formul general:

OR2
O 2N R1

NO2
R1 = H, alchil, cicloalchil
R2 = H, alchil, acil
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Iai

Dinitroderivaii sunt substane cu multiple aciuni biologice, fiind utilizai

ca insecticide, ovicide, acaricide, fungicide i erbicide [2]. Aciunea acestora se
bazeaz pe blocarea reaciilor de fosforilare oxidativ, inhibarea formrii acidului
adenozin-trifosforic (ATP) din acid adenozin-difosforic (ADP). Deoarece datele
din literatur sunt neconcludente i nu susin un mecanism precis de aciune a
dinitroderivailor asupra organismelor vii, se impune sintetiza unor dinitrofenoli i
dinitroeteri fenolici, crora s li se studieze activitatea biologic.
De aceea, scopul acestei lucrri este prezentarea aciunii unor eteri
dinitrofenolici i compararea activitii lor biologice cu aceea a dinitrofenolilor
corespunztori. Deoarece experimentele de germinaie sunt simple, ieftine, rapide
i spectaculoase, precum i uor de realizat, testarea aciunii unor substane
cunoscute i nou sintetizate asupra organismelor vii se va face utiliznd semine de
cereale supuse germinrii.

MATERIAL I METOD
Materialul biologic. Probele de gru (Triticum aestivum), soiul Henika, au fost
procurate de la Staiunea de Cercetri Agricole Suceava i au avut masa a 1000 de
boabe egal cu 37,2 g i o umiditate rezidual de 12%.
Reactivi chimici. Reactivii folosii au fost de puritate analitic (Merck, Sigma,
Chimopar), iar soluiile i suspensiile apoase preparate cu ap bidistilat, aceton sau
alcool etilic. S-au sintetizat o serie de eteri dinitrofenolici plecnd de la
dinitroclorbenzen, cu variante ale metodelor descrise n literatur [8]. S-au sintetizat
astfel dinitroderivai, cum ar fi 2,4-dinitro-anisolul, 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-1,2-diol i
2,4-dinitro-1-(octadeciloxi)benzen.
Aparatura. Sintezele chimice s-au realizat utiliznd aparatura din laboratorul de
chimie organic a Facultii de Chimie, din cadrul Universitii Al. I. Cuza Iai.
Experimentele i determinrile de germinaie s-au fcut n cutii Petri, pe hrtie dubl de
filtru Watmann nr. 1, la temperatura laboratorului. Separarea i purificarea compuilor
obinui s-au realizat prin cromatografie n strat subire pe silicagel (Kieselgel 60 F254,
Merck) i pe coloan de silicagel, iar spectrele de infrarou au fost obinute cu un
spectrometru Jasco FT/IR 66o Plus Fourier. S-au mai determinat punctele de topire i
compoziia elemental i s-au realizat spectre de 1H-RMN (Bruker Avance DRX 400,
400 MHz) i de mas cu un spectrometru de mas Vestec 601.
Soluiile i suspensiile de tratament. S-au preparat diferite soluii i suspensii de
dinitrofenil eteri i dinitrofenoli, cu concentraiile cuprinse n intervalul 103 M 102 M.
Pentru aceasta, s-au preparat iniial soluii acetonice concentrate care au fost apoi
diluate corespunztor cu ap distilat, cnd s-au obinut soluii limpezi sau suspensii
stabile. Martorul a avut aceeai concentraie n aceton ca i soluiile de tratament.
Modul de lucru. Germinaia a fost determinat conform normelor ISTA (Seed
Science and Technology, 1993), ns s-au luat n lucru loturi de cte 50 semine, care
au fost puse la germinat pe hrtie de filtru, n cutii Petri, n trei repetiii. Prima numrare
a avut loc la 3 zile (energia germinativ, EG), iar a doua la 7 zile (facultatea
germinativ, FG). S-au numrat seminele ncolite, anormale i moarte, precum i
plantulele rezultate [1].
Durata tratamentului a fost de o or, dup care seminele au fost dispuse ct mai
unifom n cutii Petri, pe hrtie dubl de filtru, mpreun cu soluia de tratament. Semine
cu o coleoriz vizibil au fost considerate germinate. Seminele au fost udate zilnic cu
 Lucrri tiinifice vol. 49, seria Agronomie

cte 5 ml de ap bidistilat. Dup 7 zile, plantulele au fost tiate de la nivelul

seminelor, msurate i cntrite (talia, T, n cm i masa, m, n grame).
Calcule statistice. Rezultatele au fost prelucrate cu ajutorul testului Tukey [7]. S-
au mai calculat abaterea medie ptratic sx a mediei de selecie i factorul t n vederea
comparrii rezultatelor obinute sub aciunea diferitelor tratamente.

REZULTATE I DISCUII
S-au sintetizat i caracterizat 2,4-dinitro-anisolul, 2,4-dinitro-o-crezolul, 2,4-
dinitro-1-(octadeciloxi)benzenul, 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-1,2-diolul, etc., care
prezint urmtoarele structuri:
H2
OCH3 OH OC18H37 C OH
O HC OH
C
NO2 H3C NO2 NO2 H2
NO2

NO2 NO2 NO2

NO2
1-metoxi-2,4-dinitrobenzen 2-metil-4,6- 2,4-dinitro-1- 3-(2,4-dinitrofenoxi)-
(Dinitroanisol) -dinitrofenol -(octadeciloxi)benzen -propan-1,2-diol

Spectrele FT-IR (fig. 1), punctele de topire i analizele elementale ale

compuilor purificai cromatografic au confirmat structurile acestora. Astfel,
semnalele dinitroclorbenzenului de la 1962,2 cm1 i, respectiv, 1706,7 cm1 au
disprut i au aprut noi benzi n spectrul dinitroanisolului la 1280,5 cm1 i 1000,9
cm1. Dinitroanisolul este uor solubil n cloroform, acid acetic, acetat de
benzil, etanol, dar puin solubil n ap. Compusul 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-
1,2-diol, solubil n aceeai solvei organici, dar cu solubilitate mrit n ap, a dat
un semnal larg n jurul valorii de 3352 cm1, caracteristic gruprilor de OH, precum
i absorbii caracteristice la 2942,8 cm1, 1417,4 cm1, 1288,2 cm1, 1114 cm1,
1076 cm1, 943 cm1, 874 cm1, i, respectiv, 724 cm1. Dou semnale intense la
2925,5 i 2854,1 cm1, caracteristice hidrogenilor metilenici, au fost observate n
cazul 2,4-dinitro-1-(octadeciloxi)benzen. Acest compus a mai prezentat dou
semnale specifice la 1464,7 cm1 i, respectiv, 1242 cm1. Cele dou grupri nitro
ale precursorilor sau compuilor sintetizai au prezentat un semnal intens la 1530-
1540 cm1.
Gruparea OH, a 2,4-dinitro-fenolului, a fost nlocuit cu gruparea OCH3,
n cazul dinitroanisolului. Deoarece acest compus, care nu are posibilitatea
eliberrii uoare a unui proton, a fost dovedit toxic (tab. 1), mecanismul de aciune
al DNP-ului ar trebui s fie diferit de cel menionat n literatur [4,5]. S-a presupus
c dinitrofenolul disociaz cu eliberare de protoni, care ptrund n mitocondrie, n
locul celor translocai din mitocondrie n citosol, mpiedicnd formarea de ATP.
ntr-adevr, cercetri anterioare au demonstrat c n formarea ATP intervine un
gradient de pH [4,5]. Studiile noastre iau n considerare faptul c modificarea pH-
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Iai

ului ar putea fi un fenomen secundar, energia strilor tripletice putnd fi transferat

ATP-azei care o ncorporeaz n ATP, iar tranziia de la o stare excitat la una
fundamental are ca efect eliberarea sau absorbia unui proton, n funcie de
caracterul acid sau bazic al compusului aflat n stare excitat.

CH2
Transmitana (%)

CH2 CH

O OH OH
Cl
NO2
NO2

NO2 NO2

Numrul de und (cm-1)

Figura 1. Spectrul FT-IR al dinitroclorbenzenului, compusul de plecare, i al 3-(2,4-
dinitrofenoxi)propan-1,2-diolului, unul dintre dinitrofenil eterii studiai

Tratamentul cu soluii concentrate (102 M) de 2,4-dinitrofenol (DNP) i

dinitroanisol (DNA) a determinat moartea tuturor seminelor, n timp ce
concentraiile mai reduse au determinat o aciune toxic mai moderat, care a fost
nesemnificativ sub 103 M. Diferenele dintre tratamente au fost nete i statistic
asigurate. Prin splarea seminelor dup tratamentul de o or, parametrii
germinativi au prezentat valori mai mari pentru DNP i relativ nalte pentru DNA,
fenomen explicat prin solubilitile n ap diferite ale celor doi compui (fig. 2).

Tabelul 1. Aciunea dinitroanisolului comparativ cu efectul toxic al dinitrofenolului

ntr-un experiment de germinaie a seminelor de gru
nlimea
Masa
Facultatea total a Talia Masa medie
plantulelor
Tratamentul germinativ plantulelor plantulelor a plantulelor
din lot
(F.G.) din lot (T, cm) (m, mg)
(m, g)
(H, cm)
Martor, H2O 93 4 363,9 7,91 2,15 46,66
DNP, 10-2 M 21 0 0 0 0
2
DNA, 10 M 11 0 0 0 0
DNP, 10-2 M, cu
93 5 263,3 5,68 1,71 37,00
splare
DNA, 102 M, cu
79 8 45,51 1,53 0,31 10,54
splare
D = 9 39,88 cm 2,70 cm 0,47 mg 22,4 mg
 Lucrri tiinifice vol. 49, seria Agronomie

De asemenea, s-a gsit o diferen semnificativ calculat cu testul Tukey

ntre martor i proba tratat cu 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-1,2-diol cu
2
concentraia de 10 M. O alt diferen semnificativ s-a gsit ntre tratamentul cu
concentraia 5x103M i cel cu 102M 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-1,2-diol, ultima
concentraie producnd moartea tuturor plantelor cu care acest compus a venit n
contact.

H2O DNP,
DNP, DNA, DNP,
DNA, DNP, 10-2 M, DNA,
DNA, 10-2 M,
10-2 M 10 M cu splare
- 2 cu splare

Figura 2. Efectul biologic al dinitrofenolului i dinitroanisolului asupra germinaiei grului

Dat fiind durata mare de aciune a toxicului (apte zile), a fost greu s se
precizeze mecanismul precis de aciune al acestuia, plantele putnd produce
metabolizarea sa la noi compui toxici. De aceea, s-a realizat separarea
dinitrofenolilor i a dinitroanisolului prin extracie cu eter etilic din plantulele i
seminele negerminate sau cu plantule mici, mrunite n prealabil, apoi prin
cromatografie n strat subire pe silicagel. S-a constatat c dinitroanisolul a rmas
nemodificat pe toat perioada tratamentului, aadar acesta a acional i nu un
eventual dinitrofenol ce ar fi rezultat prin ndeprtarea gruprii metoxi.
2,4-Dinitrofenolii sunt decuplani ai fosforilrii oxidative de respiraie, ceea
ce are ca efect intensificarea consumului de oxigen, fr sinteza ATP-ului. n mod
specific, acetia perturb producia adenozin-trifosfatului (ATP) n mitocontriile
celulare, ATP-ul fiind molecula ce nmagazineaz i furnizeaz energie pentru
toate activitile celulare [6]. Teoriile actuale, cum ar fi teoria chemiosmotic
elaborat de P. Mitchell [4,5] susin c, spre deosebire de celelalte enzime din
lanul respirator mitocondrial, ATP-aza pompeaz protonii din spaiul
intermembranar spre matrice. Se recupereaz astfel energia pe care celelalte
enzime din lan o folosesc pentru a acumula protoni n spaiul intermembranar.
Aceast energie este necesar reaciei de fosforilare a ADP-ului cu fosfat mineral,
n prezen de Mg, reacia fiind endoterm i necesit 31Kj/mol.
Cercetrile prezente au artat c este posibil ca dinitrofenil eterii s acioneze
pe o cale nechimic, probabil prin formare de radicali i stri tripletice i c
translocaia protonilor ar putea fi un fenomen secundar n procesul fosforilrii
oxidative. Mecanismul de aciune al compuilor investigai este n concordan cu
binecunoscuta teorie biostructural elaborat de Eugen Macovschi, dar contrazice
ipoteza chemiosmotic a lui Peter Mitchell.
Universitatea de tiine Agricole i Medicin Veterinar Iai

Tabelul 2. Efectul toxic al 3-(2,4-dinitrofenoxi)propan-1,2-diolului (DNE) asupra

germinaiei seminelor de gru i dezvoltrii plantulelor obinute
Facultatea nlimea Talia Masa Masa
Tratamentul *) germinativ total plantulelor plantulelor medie
(F.G.) (H, cm) (T, cm) (m, g) (m, mg)
Martor, H2O 96 5 654,6 7,1 3,83 41,95
DNE, 103 M 93 6 574,6 6,4 3,25 36,36
DNE, 2103 M 93 8 506,9 5,7 2,73 30,74
3
DNE, 310 M 89 7 396,6 4,4 2,60 27,14
DNE, 5103 M 75 11 161,3 2,6 1,35 22,01
DNE, 102 M 11 16 0 0 0 0
D= 23 362,2 cm 0,9 cm 0,56 g 3,68 mg
*)
Media a trei valori independente.

CONCLUZII
Experimentele cu semine de gru supuse germinrii au relevat sensibilitatea
acestora la dinitrofenoli i dinitrofenil-eteri, n domeniul de concentraii 103 M
5103 M, iar efectul toxic al substanelor investigate a fost explicat prin mecanisme
de tip radicalic i prin existena unor stri tripletice i nu prin translocaia
protonilor prin membrane. S-au sintetizat i caracterizat noi derivai dinitrofenolici,
unii necunoscui n literatur, care au fost folosii pentru a nelege mecanismul
toxicitii i aciunii biologice a pesticidelor dinitrofenolice.

BIBLIOGRAFIE
1. Bewley, J.D., Black, M., 1994 - Seeds, Physiology of development and germination.
Plenum press, 2nd Ed., New York and London.
2. Comnit, E., oldea, C., Dumitrescu, E., 1986 - Chimia i tehnologia pesticidelor. Edit.
Tehnic, Bucureti.
3. Lenke, H., Knackmuss, H. J. 1996 - Initial Hydrogenation and Extensive Reduction of
Substituted 2,4-Dinitrophenols. Applied and environmental microbiology, vol. 62, p.
784-790.
4. Mitchell, P. 1961 Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a
chemi-osmotic type of mechanism. Nature, vol. 191, p. 144-148.
5. Mitchell, P., 1978 David Keilins respiratory chain concept and its chemiosmotic
consequences. Nobel Lecture.
6. Roper, W. L., 1992 - Toxicological Profile For Nitrophenols, Agency for Toxic Substances
and Disease Registry, USA.
7. Snedecor, G. W., 1994 - Statistical methods applied to experiments in agriculture and
biology. The Iowa Stat Univ. Press, U.S.A., p. 255-274.
8. Willgerodt, C., 1879 - Einwirkung alkoliscer Kaliumhydroxydlsung auf -
Dinitrochlorbenzol, gelst in derselben Alkoholart. Darstellung der -
Dinitrophenylethylther, des -Dinitropnenylallylglycerin- und
phenylethylthers. Berichte, vol. 12, p. 762-767.