TRAVAUX PRATIQUES

DE BIOCHIMIE

Licence de Biologie - Biochimie

L2 S4B0700
Remarques d'ordre gnral

Ces travaux pratiques illustrent les cours de Biochimie de la 1re et de la 2me anne de la Licence BB. Le cot lev
de certains appareils nous oblige adopter une organisation par manipulations tournantes. Pour pallier le dphasage
invitable de certains TP avec le cours, un bref expos thorique vous donne ou vous rappelle les connaissances ncessaires
la comprhension de votre manipulation.

I - Conseils pour la pratique des manipulations de Biochimie

I-1 Oprez avec soin et avec mthode tout en se protgeant

- Vrifiez la propret de la verrerie. Si le matriel semble souill, il faut le laver et le rincer l'eau et faire un
dernier rinage leau distille distille.
- La paillasse devra toujours tre propre et dans tous les cas range et nettoye parfaitement la fin de la
manipulation ainsi que la verrerie. Toute trace de produit accidentellement renvers sur la paillasse sera
rapidement enleve.
- Le port de la blouse est obligatoire
- Le port des lunettes de scurit est obligatoire pour toute manipulation de produits dangereux (acides et
bases (mme dilus), solvants, manipulation sous hotte ou devant une flamme).
- Les ractifs seront toujours rangs et les flacons rebouchs aprs usage.
-
I-2 Utilisez correctement vos rsultats exprimentaux

- Prsentez et interprtez l'ensemble des rsultats de faon logique.

- Notez les observations au fur et mesure de la manipulation.

II - Droulement de la sance et rdaction des rsultats de la manipulation

Pour toutes les sances, vous devez disposer dune blouse, trousse, rgle, calculatrice, papier brouillon et millimtr.
Les sacs et vtements devront tre dposs lentre de la salle ou dans les salles annexes.
Les fiches de rsultats rendre en fin de sance vous seront donnes le jour du TP.
A la fin de la manipulation, vous devrez rendre une fiche de rsultats par binme.
Pour tirer profit de ces TP, lisez avec attention le protocole et revoyez les notions ncessaires pour la comprhension des
manipulations avant la sance.

III Rattrapage de sance de TP

Il est possible de changer de groupe de TP (et non pas le binme) pour une sance si la justification est
acceptable. Il faudra justifier ce changement auprs de votre enseignant et lui indiquer dans quel groupe et quelle date vous
rattraperez la sance. Vous rendrez alors une fiche de rsultats (avec votre nom, n de groupe, date et n de groupe de la
sance de rattrapage) qui sera transmise par l'enseignant responsable de la sance votre enseignant habituel pour
correction.
Quelques rappels importants suite aux erreurs rencontres le plus frquemment dans les fiches de rsultats et copies
dexamen.

Units
Dune faon gnrale, il faut adapter lunit aux grandeurs exprimentales. Ainsi, une concentration de
6 10-7 g/L sera donne en g/L (0,6g/L). Il ne faut pas utiliser les puissances 10-1 ou 101.
Conventions dcriture :
Quantits en moles mol, mmol, mol, nmol, pmol
Concentrations molaires
Moles/litre : mol/L ou M ("molaire")
Millimoles/litre : mmol/L ou mM ("millimolaire")
Micromoles/litre : mol/L ou M ("micromolaire")
Nanomoles/litre : nmol/L ou nM ("nanomolaire")

Unit internationale d'usage des vitesses initiales (vi) de ractions enzymatiques

UI : mol/min
Remarque: l'unit internationale retenue par les instances internationales de Biochimie est en ralit le katal (mol/s),
mais cette unit peu pratique n'est pratiquement jamais utilise.

Remarque : les rsultats sans unit nont aucune valeur.

Graphiques
Les graphes que vous aurez reprsenter obissent des quations mathmatiques. Ces graphes sont des rgressions linaires
(dosages colorimtriques, Lineweaver-Burk ) ou non linaires (Michaelis-Menten, ...). Il ne faudra donc pas ncessairement
relier tous les points exprimentaux entre eux mais plutt dessiner la meilleure droite ou courbe (selon lexpression
mathmatique de la relation tudie), cest dire celle qui passe au plus prs de ces points.

Exemple pour une relation linaire (dosage colorimtrique)

25 25
20 20
15 15
10 10
5 5
0 0
0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 12

Reprsentation graphique correcte Reprsentation graphique incorrecte

Exemple pour une relation non linaire (Michaelis Menten)

20 20

15 15

10 10

5 5

0 0
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10

Reprsentation graphique correcte Reprsentation graphique incorrecte

Spectrophotomtrie

Rglages des spectrophotomtres

Spectronic 20
- zro lectrique en mode transmission avec un porte cuve vide, rgler la valeur affiche 0 avec le bouton de
gauche. Ce rglage effectu en dbut de sance reste valable quelle que soit la longueur d'onde de travail.
- zro de DO en mode absorbance avec le tube tmoin en place dans le porte-cuve, rgler la valeur affiche 0 avec
le bouton de droite. Ce rglage doit tre effectu chaque changement de la longueur d'onde de travail.

Spectronic Genesys 20
- zro lectrique ce rglage est effectu automatiquement par lappareil au moment de sa mise en marche.
- zro de DO en mode absorbance avec le tube tmoin en place dans le porte-cuve, appuyer sur le bouton 0 ABS .
La valeur affiche doit alors se stabiliser sur la valeur DO = O.

Loi de Beer Lambert

Les dosages colorimtriques s'appuient sur la loi de Beer Lambert qui indique que la densit optique (DO) ou absorbance d'un
produit en solution est proportionnelle sa concentration DO = . c . l
: coefficient d'extinction molaire du produit color unit: M-1. cm-1
c : concentration molaire du produit color unit: M
l : longueur du trajet optique unit: cm

Dosages colorimtriques
La gamme d'talonnage permet de raliser un graphe o les DO sont exprimes en fonction de la quantit (et non de la
concentration) de produit par tube de gamme (en mg, g, mol ... selon le cas).

Les tapes de calculs sont les suivantes :

1- mesurer des DO des tubes inconnus
2- dterminer les quantits de produit doser contenues dans ces tubes
3- calculer la concentration correspondante du produit dans 1ml de la solution inconnue contenue dans ces tubes.
4- Faire la moyenne des rsultats obtenus pour un chantillon donn. Attention : vous ne pouvez faire la moyenne
que si les rsultats obtenus sont proches (moins de 20% dcart environ). Si les rsultats divergent trop, il faut
les traiter sparment jusquau rsultat final. On aura dans ce cas deux valeurs de concentrations pour un
chantillon.
5- Appliquer le cas chant le facteur de dilution.
6- Exprimer le rsultat final en utilisant lunit demande.
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 SB4070 TP I pH, lectrophorse

T.P. I. PROPRIETES IONIQUES DES ACIDES AMINES

Rappels
En solution aqueuse, les acides amins chane latrale non ionisable neutres peuvent exister sous trois formes ioniques
diffrentes selon la valeur du pH de la solution:
NH3+ H+ + H+ NH2
NH3
R CH R CH R CH
- + -
COOH COO
K1 H+ COO K2 H
Forme acide cationique A+ Zwitterion A Forme basique anionique A-
Fig. 1: Equilibre entre les trois formes ioniques des acides amins en fonction du pH de la solution.

Si la chane latrale est ionisable, une quatrime forme ionique peut exister. Les fonctions ionisables des chanes latrales des
acides amins et leurs pKa sont rappeles ci-dessous (les formules des acides amins doivent tre connues ainsi que l'ordre de
grandeur des pKa des fonctions acides et basiques).

Fonctions ionisables des chaines latrales des acides amins pKa

Forme acide conjugu Forme base conjugue
Fonctions prsentes
(ordres de
dans les a. amins:
grandeur)
O O
R C R C -
4 ASP (D) et GLU (E)
OH O
Acide carboxylique carboxylate
R R
+ NH N 6 HIS (H)
NH HN
Imidazolium Imidazole
R SH R S - 8 CYS (C)
Sulfhydrile ou Thiol Thiolate
OH O-
10 TYR (Y)
R R
Phnol Phnolate
R NH3+ R NH2
10 LYS (K)
Amonium Amine primaire
H 2N + H2N
CH NH2 C NH
12 ARG (R)
R NH R NH
Guanidinium Guanidine

Remarque: les valeurs approximatives des pKa donnes dans ce tableau peuvent varier de faon importante pour une fonction
donne d'un acide amin au sein d'une structure protique, en particulier selon le caractre plus ou moins hydrophobe du
micro-environnement dans lequel se trouve le rsidu.
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I TITRATION D'UN ACIDE AMINE PAR PH-METRIE

But et principe

Le cation d'acide amin A+ qui est la forme prpondrante en milieu acide peut tre considr comme un diacide. Lorsque le
pH augmente, ce diacide perd un premier proton en se transformant en ion mixte (forme zwitterion), puis un deuxime proton
quand l'ion mixte se transforme en anion (Voir Fig. 1).

Ces transformations sont rversibles et la proportion de l'une ou de l'autre forme, dfinie par les lois gnrales des quilibres
chimiques, peut tre dtermine par le calcul des constantes de dissociation K1 et K2 :

[H+] [A] [H+] [A-]

K1 = K2 =
[A+] [A]

Remarque : quand l'acide amin porte un 3me groupe ionisable, il y a lieu de considrer une 3me constante de dissociation.
Le but de cette manipulation est de dterminer par titrage acido-basique les pKa et pHi de deux acides amins en solution et de
dterminer leur concentration.
On dtermine dans un premier temps les points dquivalence graphiquement par la mthode des tangentes parallles. Lun de
ces points sera le pHi de lacide amin. Dans un deuxime temps, il faut dterminer les pKa correspondants aux constantes de
dissociation. Ces points se situent dans des zones de faible variation de pH. Lacide amin joue un rle tampon dans les zones
de pH voisines de ses pKa.
Cette mthode permet aussi de doser un acide amin en solution. Pour cela, il faut dterminer les volumes dquivalence :
attention, ces volumes ne peuvent pas tre lus directement sur les graphes mais doivent tre calculs entre deux points
dquivalence dtermins graphiquement. (voir exemple ci-dessous)

Titrage d'un acide amin chane latrale non ionisable par la soude
point d'quivalence 2
pH 14

12

pKa210

8 point d'quivalence 1
6
Volume d'quivalence Veq
4

pKa1 Volume de demi- Volume de demi- Volume de demi-

2
quivalence V1/2eq quivalence V1/2eq quivalence V1/2eq
0
0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 20 22,5 25 27,5 30
NaOH 1M (mL)

PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE pour toutes les manipulations avec NaOH et HCl

MANIPULATION
1. Courbe de titration de la glycine
Dans un bcher de 250 ml , verser 100 ml d'eau distille et 10 ml de glycine. Placer la solution sous agitation et ajuster le pH
2 en ajoutant goutte goutte HCl 2M avec une pipette (environ 5 ml ).
Etablir ensuite la courbe de titration de la solution de la glycine l'aide de la solution de soude 1M en traant la courbe du pH
en fonction du nombre de ml de soude ajouts (0,5 ml par 0,5 ml ) de pH 2 jusqu'au plateau pH basique (environ pH 12
13). Tracer la courbe directement sur le papier millimtr (chelle abscisses 1 mL = 1 cm).
MM glycine = 75 g/mol.
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 SB4070 TP I pH, lectrophorse

2. Courbe de titration de la glycine en prsence de formaldhyde

Pour le principe de la raction des acides amins avec le formol : voir chapitre II, dosage de Srensen.
Verser dans un bcher 90 ml d'eau distille et 10 ml de glycine. Ajouter alors 10 ml de formaldhyde (formol) et 4 gouttes de
phnolphtaline et ajuster le pH 2 avec HCl 2M.
Etablir la courbe de titration de la solution de glycine en prsence de formol de pH 2 jusqu'au plateau pH basique (environ
pH 12 13) avec NaOH 1M. Tracer la courbe directement sur le papier millimtr (chelle abscisses 1 mL = 1 cm).
Noter prcisment les valeurs de pH correspondant l'apparition de la teinte rose ple et de la teinte rose fonc invariable au
cours du titrage. Ralisez le graphe sans faire de tableau de valeurs.

3. Courbe de titration de l'histidine

Rappel thorique
Quand un acide amin comme l'histidine possde d'autres groupements ionisables que ceux ports par le carbone la courbe
de titration fait apparatre la dissociation de ces groupements supplmentaires.
Dans le cas de l'histidine, le pK du groupement imidazole port par la chaine latrale peut tre dtermin
- -
OOC OOC
H+
CH CH
+ NH + N
H3N HN + H3N HN
C K H+ C
H H
++ - +-
A A

Fig. 2 Formes ioniques du groupement imidazole de l'histidine

Manipulation
Dans un bcher de 250 ml, verser 40 ml d'eau distille puis ajouter 5 ml de la solution d'histidine.
Etablir la courbe de titration de l'histidine comme prcdemment pour la glycine sans formol mais en titrant avec une
solution de soude 0,1M par fractions de 0,5 ml.
MM chlorhydrate dhistidine 209,6 g/mol.
Remarque : la valeur du pKa1 de lhistidine dtermine par cette mthode est approximative car elle est proche de 2.

II. DOSAGE DE L'AZOTE AMINE PAR LA METHODE DE SRENSEN

But et principe
La mthode de Srensen permet de doser rapidement les groupements amine primaire des acides amins neutres. En prsence
d'un grand excs de formaldhyde, il est possible de titrer un acide amin neutre par la soude en prsence de phnolphtaline.
-
On dmarre la raction un pH auquel la forme A+ est largement majoritaire. La solution contient cependant une faible
- -
proportion de la forme A . Le formol ragit avec lamine dprotonne NH2 de la forme A pour former le driv
dihydroxymthyl N(CH2OH)2 de lacide amin initial. Au cours de la raction, la disparition de lacide amin de dpart au
- - -
profit de son driv provoque le dplacement de l'quilibre A+ A vers la formation de A (Fig. 1). La raction est totale (le
formaldhyde est en excs) et rapide. A la fin de la raction, l'acide amin initial se trouve sous sa forme de driv
dihydroxymthyl et lamine primaire sest transforme en une amine tertiaire moins basique (donc de pKa plus faible). En
outre, le milieu s'est acidifi par libration d'un nombre de mole de H+ quivalent au nombre de mole de -NH3+ (et donc de A+
-
) qui se trouvait dans la solution de dpart. Le titrage par la soude de ces protons permet donc le dosage des amines primaires
prsentes dans la solution initiale. On peut alors calculer la concentration de cette solution en acide amin et en azote. Il faut
corriger la concentration en azote si lacide amin contient plus dun atome dazote.
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 SB4070 TP I pH, lectrophorse

H
C O CH2OH
+ H+
NH3 NH2 H N
R CH R CH R CH CH2OH

COO- H+ COO- COO-

Raction du formol (en excs) avec la fonction amine (dprotonne) des acides amins et consquence sur l'quilibre entre les
formes zwittrionique (largement majoritaire) et anionique de l'acide amin.

MANIPULATION
Neutralisation du formaldhyde
Mettre 25 ml de formaldhyde dans un bcher et ajouter 8 gouttes de phnolphtaline.
Ajouter lentement de la soude 0,1 M sous agitation douce jusqu' obtention d'une teinte rose.

Tmoin
Dans un bcher, on mlange 10 ml de formaldhyde neutralis, 20 ml d'eau distille et 8 gouttes de phnolphtaline.
Ajouter 0,5 ml de soude 0,1 M et noter la couleur obtenue.

Essai
Dans un bcher, on mlange: 20 ml de glycine Srensen (IIIa, IIIb ou IIIc), 8 gouttes de phnolphtaline. On amne
avec la soude 0,1 M jusqu' la teinte rose ple.
On ajoute alors 10 ml de formaldhyde neutralis et on titre par la soude 0,1 M jusqu' obtention d'une teinte semblable
celle du tmoin. Noter le volume de soude ajout.

III ELECTROPHORESE DES ACIDES AMINES

But et principe
Les acides amins possdent au moins deux groupements ionisables: le groupe -carboxylique et le groupe -amin. La
chaine latrale R peut galement porter une fonction ionisable.
Dans un champ lectrique, une substance charge ngativement migre vers l'anode (+) et une substance charge positivement
migre vers la cathode (-). C'est le principe de l'lectrophorse qui permet de sparer les constituants d'un mlange suivant leur
charge. En consquence, dans un champ lectrique uniforme, des acides amins peuvent tre spars en fonction de leur point
isolectrique.
Le but de cette manipulation est de sparer par lectrophorse quatre acides amins de pHi diffrents.

Valeurs des pKa des differentes fonctions ionisables des acides amins utiliss dans ce TP:
-COOH -NH2 R Chaine latrale
Acide glutamique 2,19 9,67 4,25
Cystine 1,71 10,78 8,33
Proline 1,99 10,66
Arginine 2,17 9,04 12,48
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 SB4070 TP I pH, lectrophorse

MANIPULATION
Manipuler avec soin et viter de saisir la feuille de papier lectrophorse avec les doigts.
Attention: la feuille de papier lectrophorse mouille avec le tampon est trs fragile.
Sur la feuille de papier lectrophorse sche, tracer au crayon de bois une ligne transversale dans le sens de la largeur puis
sur cette ligne 4 croix qui correspondront aux dpts des 4 chantillons. Reprer la polarit en indiquant par les signes + et
- sur la feuille encore sche la position des deux lectrodes.
Tremper la feuille dans une cuvette contenant un peu de tampon Tris (2-(hydroxymthyl)-2-amino-1,3-propanediol) 10 mM
pH 8,9 EDTA 7 mM (Chlateur de Ca2+), puis l'essorer sur du papier filtre.
Dposer une goutte de chaque chantillon au niveau des croix.
Placer la feuille dans la cuve lectrophorse, le trait de crayon au milieu.
Verser du tampon dans les deux bacs. Les extrmits de la feuille de papier doivent plonger de
5 mm au moins dans le tampon.
Refermer le couvercle et connecter la cuve au gnrateur en respectant la polarit.
Bien vrifier le contact entre les bornes et les lectrodes (le couvercle doit tre bien ferm).
Programmer le gnrateur (220 V - 1,5 ou 0,7 heure selon le type de cuve) en utilisant la touche "SET" et dmarrer en
actionnant la touche "RUN". L'appareil sonne losque le temps de migration programm est coul
A la fin de l'lectrophorse, teindre le gnrateur puis retirer la feuille de papier et la faire scher l'tuve.
Vaporiser sous la hotte la solution de ninhydrine (2 mg/ml dans l'actone) puis remettre l'tuve 5 minutes 105C pour
rvler la coloration.
Manipulation SOUS HOTTE - PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 S4B0700 TP II Spectrophotomtrie

T.P. II SPECTROPHOTOMETRIE

I. SPECTRE D'ABSORPTION UV-vis ET DETERMINATION DU COEFFICIENT D'EXTINCTION

MOLAIRE DU 4-NITROPHENOL

But et principe
Les structures atomiques des molcules sont capables dabsorber lnergie photonique (lumire visible ou UV). Les maxima
dabsorption varient selon les fonctions prsentes (liaison amide, double liaison, noyau aromatique, phnol, phnolate). Le
but de cette manipulation est de calculer le coefficient d'extinction molaire du groupement phnolate son maximum
dabsorption dans la lumire visible.

PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE pour toutes les manipulations avec NaOH

MANIPILATION
Prparer 50 mL d'une solution de p-Nitrophnol 10-3 M dans NaOH 10mM. (pNP : 139.11g/mol)
A partir de cette solution mre, prparer 10 ml de solution 10-4 M puis les solutions suivantes (5.10-5 M - 2,5.10-5 M - 10-5 M
- 5.10-6 M ) par dilutions en cascade en utilisant la soude 10mM .

I. 1. Spectre d'absorption
Raliser le spectre d'absorption de la solution de concentration 2,5.10-5 M entre 370nm et 440 nm de longueur d'onde par pas
de 5 nm. La solution NaOH 10mM sera utilise pour faire le zro en absorbance chaque changement de longueur d'onde.

I. 2. Coefficient d'extinction molaire

Mesurer la DO de chacune des 5 solutions (5.10-6 M 10-4 M) la longueur d'onde correspondant au maximum d'absorption
"contre" la solution NaOH 10mM.

II. DOSAGE COLORIMETRIQUE DUNE SOLUTION DE CONCENTRATION INCONNUE OBTENUE APRES

DIALYSE A LEQUILIBRE.

But et principe
La dialyse est une technique qui permet de sparer des substances en utilisant leur capacit respective franchir les pores
d'une membrane appele membrane de dialyse. Ce phnomne ne doit pas tre confondu celui de l'osmose dans lequel c'est
l'eau qui traverse la membrane vers le compartiment le plus concentr.
Il est important de noter que ces deux phnomnes se superposent lorsque l'on ralise la dialyse d'une solution contre un
tampon d'osmolarit plus faible, ce qui est le cas le plus frquent.

MANIPULATION
Prparation du sac de dialyse: Mouiller le tube de cellophane sous un mince filet d'eau en le frottant entre les doigts jusqu'
son ouverture puis fermer le tube l'une de ses extrmits par une pince. Rincer l'eau distille.
Remplir le sac avec 5 ml dune solution de concentration 5 10-4M .
Refermer le sac de dialyse avec l'autre pince en mnageant une bulle d'air dans le sac pour viter son clatement cause du
phnomne d'osmose.

Mettre le sac de dialyse dans un bcher contenant 45 ml deau distille additionns de 4 gouttes de HCl 0,5M. (= liquide de
contre-dialyse). Agiter doucement sur un agitateur magntique.
Aprs 1 H dagitation modre, prlever 1 ml du liquide de contre-dialyse et verser ce volume dans un tube essai contenant
4 ml de NaOH 10mM.
Mesurer la DO de cette solution "contre" la solution NaOH 10mM.

Laver soigneusement le sac de dialyse et le faire scher.

RAPPEL : PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE pour toutes les manipulations avec NaOH
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 S4B0700 TP II Spectrophotomtrie

III. DOSAGE COLORIMETRIQUE DE LA METHIONINE

Introduction
But : ralisation dun dosage colorimtrique dune solution inconnue de mthionine.
Principe : la raction de la mthionine avec le nitroprussiate en milieu alcalin provoque l'apparition d'une coloration jaune qui
passe au rouge en milieu acide. La concentration en mthionine d'une solution inconnue sera dtermine par rfrence une
gamme dtalonnage ralise partir dune solution de concentration connue en mthionine. Ce dosage est un exemple
dapplication de la loi de Beer-Lambert.

MANIPULATION
Gamme d'talonnage : Dans 6 tubes, prparer une gamme d'talonnage allant de 0 (blanc de dosage) 3 mg de mthionine par
tube partir de la solution mre de mthionine (2 g/l). Chaque tube devra contenir la mthionine dans un volume final de
1.5mL deau distille.
Essais : Prparer 4 ml d'une dilution au 1/5me de la solution inconnue.
Dans deux tubes, verser respectivement 1 et 1,5 ml de la solution inconnue dilue et complter 1,5mL avec de l'eau distille.
Ajouter successivement dans chacun des 8 tubes :
- 3 ml de NaOH 10%. Agiter au vortex.
- 0,2 ml de la solution de nitroprussiate. Agiter au vortex. Attendre 10 mn.
- 2 ml d'acide chlorhydrique concentr. Agiter.

(TRAVAIL SOUS HOTTE AVEC LUNETTES DE PROTECTION)

Les tubes sont alors plongs dans un bain-marie 30C et incubs 10 mn.
Lire les DO au spectrophotomtre 535 nm en faisant le zro de DO sur le tube tmoin ne contenant pas de mthionine.
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 S4B0700 TP. III. Chromatographie sur rsine changeuse dions

T.P. III. CHROMATOGRAPHIE SUR RESINE ECHANGEUSE D'IONS

But et principe
La phase stationnaire est constitue par une substance poreuse portant des groupes ionisables acides ou basiques. La
phase mobile est une solution aqueuse de sels neutres, ou de sels pouvoir tampon ou d'acides ou de bases. Les substances
ionisables soumises la chromatographie se rpartissent entre les 2 phases selon les lois des quilibres ioniques.

Les rsines changeuses d'ions

Un changeur d'ions est une matire insoluble rticule qui contient des groupes chargs fixes et des contre-ions mobiles. Ces
derniers peuvent tre changs de manire rversible contre d'autres ions de mme charge contenus dans la solution dans
laquelle ils sont sans aucune modification physique de la matrice insoluble.
Si l'ion changeable des groupements actifs d'un changeur est :
. un cation, la rsine est dite changeuse de cations
. un anion, la rsine est dite changeuse d'anions.

Les rsines changeuses d'ions sont soit sous forme acide ou base libre, soit sous forme salifie. Par exemple, on dira qu'une
rsine (R) changeuse de cations est :
-
. sous forme acide (R H+) si elle est protone (et peut donc librer des H+)
-
. sous forme basique (R Na+) si elle est associe son contre ion (ici le cation Na+)
Cette rsine changeuse de cations, sous sa forme acide reprsente HR sera neutralise par la soude en donnant le sel de
-
sodium Na+R :
- - -
H+R + Na+OH Na+R + H2O

La rsine sous sa forme base conjugue peut tre reconvertie en sa forme acide avec un acide fort (HCl) :
- - - -
Na+R + H+Cl H+R + Na+Cl

Cette raction est rversible. Soit plus gnralement dans le cas d'changes de cations :
BR + A+ AR + B+

1 - Les ractions d'change d'ions sont stoechiomtriques: quand une mole de l'ion A+ est fixe par la rsine, une mole de
l'ion B+ est libre dans la solution.
2 - Les changes d'ions sont rversibles et on s'approchera d'une fixation complte de A+ si la rsine adsorbe A+ beaucoup
plus fortement que B+, ou s'il y a un trs grand excs de A+ par rapport B+, ou si les ions B+ sont soustraits du systme par
formation de complexes au fur et mesure de leur libration dans la solution.
3 - La composition ionique d'une rsine en quilibre avec une solution donne est toujours la mme, indpendamment de la
direction dans laquelle l'quilibre est approch.
4 - Tous les groupes acides ou basiques d'une rsine sont accessibles aux petits ions.

La capacit totale de la rsine est dtermine simplement par le nombre de groupes ioniss par unit de masse ou par unit de
volume. (R- dans lexemple ci-dessus dune rsine changeuse de cations).

Le but de ce TP est de sparer deux produits sur une rsine changeuse de cations et de dterminer le rendement de la
chromatographie en dosant lun des produits dans la solution avant et aprs passage sur la colonne.

I. CHROMATOGRAPHIE SUR PERMUTITE C 50

On utilise la Permutite C50 sous forme acide qui est une rsine "polystyrne sulfon" changeuse forte de cations dont le
groupe actif sulfonique est SO3-H+. On la schmatisera par la forme Res-SO3-,H+. On schmatisera l'acide amin sous la
forme RNH3+,Cl-.

PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE pour toutes les manipulations avec NaOH et HCl
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 S4B0700 TP. III. Chromatographie sur rsine changeuse dions

MANIPULATION
Chromatographie du mlange arabinose + arginine
La colonne ne doit jamais tre assche au cours de la chromatographie.
Le dbit d'lution doit tre lent: approximativement 1 goutte toutes les 5 secondes.

a) Dposer trs exactement 1 ml du mlange chromatographier la surface de la rsine l'aide d'une pipette en prenant
soin de ne pas perturber la partie suprieure de la rsine. Faire pntrer le mlange.

b) Laver la colonne avec 30 ml d'eau distille. Pour cela, verser sur la rsine comme prcdemment
5 ml d'eau distille avec une pipette sans remettre en suspension la rsine.
Faire passer le reste l'aide de l'ampoule dcanter. Ajuster les dbits la sortie de la colonne et de l'ampoule dcanter
pour viter le dbordement ou l'asschement de la colonne.
Recueillir la sortie de la colonne des fractions successives de 4 ml environ dans des tubes hmolyse (tubes gradus de
5mL).
Mettre en vidence l'aide de tests caractristiques les produits lus qui n'ont pas t fixs par la rsine (voir II).

c) Continuer le dveloppement du chromatogramme en luant avec 60 ml de NaOH M.

Recueillir dans un bcher cet luat basique.
Le conserver pour effectuer le dosage colorimtrique de l'arginine (voir III).

d) Laver la colonne avec 80 ml d'eau distille, puis la rgnrer avec 50 ml d'HCl M.

II. TESTS COLORES SUR L'ELUAT ACIDE

Prlever 0,5 ml de chacune des fractions et effectuer le test de Tollens sur ces fractions (Mise en vidence des pentoses).

Manipulation SOUS HOTTE - PORT DES LUNETTES OBLIGATOIRE

Ajouter 1 ml de la solution d'orcine chlorhydrique chaque fraction.

Chauffer le tube.
La prsence de pentose est dcele par une coloration violace pouvant varier au vert.

III. DOSAGE COLORIMETRIQUE DE L'ARGININE SUR L'ELUAT BASIQUE

Ce dosage est bas sur la raction des acides amins avec la ninhydrine pH 5,5 qui produit une coloration violette. Le dosage
colorimtrique s'appuie sur la loi de Beer-Lambert
Pour cette manipulation, prparer l'ensemble des tubes de dosage sans le ractif (gamme et essais) l'avance, ce qui permet de
dmarrer le dosage ds la fin de l'lution de la colonne par la soude. On ajoutera le ractif dans tous les tubes en mme temps.
 TP de BIOCHIMIE Licence BB L2 S4B0700 TP. III. Chromatographie sur rsine changeuse dions

MANIPULATION
Rincer plusieurs fois la verrerie l'eau du robinet puis une fois l'eau distille.
La gamme talon sera effectue dans des tubes essais (grands tubes en verre).
Ne pas confondre les deux tampons actate pH5,5 : 4M (prparation du ractif) 0,5M (prparation des chantillons).

Prparation du ractif la ninhydrine ( effectuer l'avance)

Dissoudre compltement 0,3 g ninhydrine dans 8 ml de mthylcellosolve (ne pas gaspiller ce produit trs coteux) puis
d'ajouter 0,06 g dhydrindantine. Lorsque l'hydrindantine est entirement dissoute, ajouter 3 ml de tampon actate 4 M
pH 5,5.

Gamme talon
Prparer dans un bcher 5 ml d'une dilution au 1/10me de la solution mre d'arginine 0,2 g/l dans le tampon actate 0,5 M
pH 5,5. Bien mlanger.
Prparer 6 tubes essais pour la gamme contenant 0 (blanc de dosage),4 ,8, 12, 16, 20 g d'arginine

Echantillons
Solution chromatographier:
pipetter trs exactement 1ml du mlange chromatographier, complter 10 ml avec le tampon actate 0,5 M pH 5,5. Bien
mlanger. Mettre 1 ml de cette solution dans une fiole jauge de 50 ml et complter avec du tampon actate 0,5 M pH 5,5.
Bien mlanger.
Eluat basique dilu:
prparer dans un bcher 10 ml d'une solution d'luat basique dilu au 1/5 me dans le tampon actate 0,5M pH 5,5.

Ces chantillons dilus sont rpartis dans 4 tubes :

Tube A: 0.5 mL de la solution chromatographier dilue
Tube B: 1 mL de la solution chromatographier dilue
Tube C: 0.5 mL d'luat basique dilu
Tube D: 1 mL d'luat basique dilu

Tous les tubes (gamme et chantillons) doivent tre complts 1 ml en tampon actate 0.5 M avant l'ajout du ractif
color

Dosage
Ajouter 1 ml de ractif dans tous ces tubes et bien agiter au vortex.
Recouvrir tous les tubes de petits morceaux de papier d'aluminium et les mettre ensemble dans un bain-marie bouillant
pendant 15 minutes.
Refroidir les tubes sous l'eau du robinet et y ajouter 5 ml d'un mlange thanol-eau 1:1 (v/v) prparer extemporanment (en
prparer 60 ml ). Bien vortexer les tubes.

Lire les DO au colorimtre 530 nm . Le tube O sert faire le rglage du zro de DO (blanc du dosage).
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en chromatographie dexclusion-diffusion
TP. IV. SEPARATION ET FRACTIONNEMENT DE BIOMOLECULES EN
CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION-DIFFUSION

I. LA DIALYSE A L'EQUILIBRE
But et principe
La dialyse est une technique qui permet de sparer des substances en utilisant leur capacit respective franchir les pores
d'une membrane appele membrane de dialyse. Ce phnomne ne doit pas tre confondu celui de l'osmose dans lequel c'est
l'eau qui traverse la membrane vers le compartiment le plus concentr.
Il est important de noter que ces deux phnomnes se superposent lorsque l'on ralise la dialyse d'une solution contre un
tampon d'osmolarit plus faible, ce qui est le cas le plus frquent.

MANIPULATION
Prparation du sac de dialyse: Mouiller le tube de cellophane sous un mince filet d'eau en le frottant entre les doigts jusqu'
son ouverture puis fermer le tube l'une de ses extrmits par une pince. Rincer l'eau distille.
Remplir le sac avec le lait (solution dialyser).
Refermer le sac de dialyse avec l'autre pince en mnageant une bulle d'air dans le sac pour viter son clatement cause du
phnomne d'osmose.
Ne pas oublier de garder 1 ml de lait pour la suite de la manipulation.
Mettre le sac de dialyse dans un bcher contenant un volume minimal d'eau distille (liquide de contre-dialyse).
Agiter doucement sur un agitateur magntique.
Aprs environ 1 H 30, faire les tests (liqueur de Fehling et biuret) sur 1 ml de la solution dialyse et de la solution de contre-
dialyse.
Laver soigneusement le sac de dialyse et le faire scher.

Tests raliser
a. Test du biuret
Ajouter dans chaque demi-fraction 0,5 ml de soude 40 % puis goutte goutte du sulfate de cuivre 1 % en agitant.
Une coloration rouge caractrise la prsence de liaisons peptidiques. Cette couleur rouge peut tre modifie selon les
conditions en une coloration bleue due la formation au niveau des groupes amins libres d'amino-complexes cuivriques
bleus. Lorsque les deux espces de composs cuivriques sont prsents, la coloration est violette.
b. Test la liqueur de Fehling
Prparation de la liqueur de Fehling (dans un tube essai)
- 2 ml de CuSO4 2,5 %
- 2 ml de tartrate sodico-potassique 10 %
- 2 ml de soude 5 %
Raction: ajouter chaque demi-fraction 0,5 ml de la liqueur de Fehling frachement prpare et amener bullition
(attention aux projections: retirer le tube ds le dbut de l'bullition puis recommencer 2 ou 3 fois). L'apparition d'un
prcipit rouge indique une raction positive.

II. CHROMATOGRAPHIE D'EXCLUSION DIFFUSION

But et principe
Sephadex (marque dpose par Pharmacia Fine Chemicals) est un dextran modifi. Les macromolcules de dextran sont
rticules pour former un rseau tri-dimensionnel de chanes de polyosides. Sephadex se prsente sous forme de petites perles
qui gonflent considrablement dans les solutions aqueuses.
Sphadex est disponible en grains de grosseurs diffrentes. Les grains trs fins (qualit superfine) sont recommands pour
chromatographier des produits en colonne avec une haute rsolution. Les grains moyens et gros permettent d'obtenir un dbit
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en chromatographie dexclusion-diffusion
lev sous une faible pression et sont parfaitement adapts la chromatographie prparative pour laquelle une rsolution trs
fine n'est pas exige.

Exemples de qualits diffrentes de Sephadex.

Quantit d'eau
Qualit Diamtre des grains absorbe en ml/mg Domaine de fractionnement (M)
de Sephadex sec M = masse molculaire

Peptides et protines Dextrans

globulaires
Sephadex G25 Fine 20-80 2,5 0,2 1000-5000 100-5000
Sephadex G25 10-40 2,5 0,2 1000-5000 100-5000
Superfine
Sephadex G100 10-40 10,0 1,0 4000-150 000 100-100 000
Superfine

Le choix de la qualit du Sephadex dpend de la taille des molcules et des proprits chimiques des substances sparer.
Les gels sont stables dans l'eau, les solutions salines, de nombreux solvants organiques, les solutions alcalines et
faiblement acides.
Les utilisations de ces gels sont trs nombreuses:
- Analyse de produits contenant plusieurs substances - Dessalage des solutions de macromolcules
- Purification de biomolcules - Dtermination de masses molculaires
- Possibilit d'utiliser Sephadex comme support d'lectrophorse

II. 1. Caractrisation du comportement d'un solut

Pour caractriser le comportement d'un solut dans la filtration sur gel, on mesure son volume d'lution Ve et son coefficient
de distribution Kd.
Ve - Vo
Kd = V
s
- Vo : volume mort, ou volume vide de la colonne (volume de liquide situ entre les grains du gel). Vo correspond au volume
d'lution de trs grosses molcules qui sont totalement exclues du gel.
- Vs reprsente le volume de la phase stationnaire. Il quivaut la diffrence entre le volume d'lution de trs petites
molcules (on prend souvent des ions radioactifs) et du volume mort.

Souvent, il est plus pratique de remplacer Vs par Vt - Vo. On obtient alors:

Ve - Vo
Kav = V - V
t o
- Vt reprsente le volume total de gel.
- Kav reprsente la fraction du volume de gel stationnaire o diffuse une molcule donne. Il dfinit donc le comportement
d'un solut indpendamment des dimensions du lit de gel ou du remplissage de la colonne. Les rapports Ve/Vt et Ve/Vo sont
galement utiliss, mais ils dpendent de la qualit de remplissage de la colonne.
Pour les molcules de densit et de forme identiques, il existe une relation linaire entre le Kav et le logarithme de la masse
molculaire.

Les facteurs de dilution peuvent se dduire de l'quation :

volume total du produit lu (ml)
Fd = volume de l'chantillon appliqu sur la colonne (ml)

II. 2. MANIPULATION
II. 2. 1. Dtermination du volume vide (Vo) et du Kav d'une colonne de Sephadex G 25
On utilisera pour talonner la colonne une solution contenant du bleu dextran (3 g/l ; Masse molculaire 2.106), de la vitamine
B12 (0,1 g/l ; Masse molaire 1357g/mol).
Le diamtre interne de la colonne est de 0,70 cm.
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en chromatographie dexclusion-diffusion
Application de l'chantillon
Retirer, par aspiration, la plus grande partie de l'luant qui se trouve au dessus du gel. Sinon, laisser luer jusqu' ce que
l'luant affleure le haut du gel. Refermer la colonne puis dposer dlicatement 0,5 ml du mlange dextran bleu/ vitamine-B12
sur la surface du gel sans le remettre en suspension. Disposer l'prouvette de 10 ml sous la colonne pour recueillir l'eluant.
Laisser pntrer l'chantillon compltement dans le gel.
Elution
Rincer alors la paroi de la colonne avec une faible quantit d'luant (NaCl 0,9 %) sans remettre le gel en suspension.
Remplir ensuite la colonne d'luant et la relier au rservoir luant.
Bien s'assurer que le systme d'alimentation en luant de la colonne n'est pas dsamorc: le gel ne doit pas s'asscher.
Mesurer le dbit de la colonne et lire sur l'prouvette les volumes suivants (les produits sont reprs par leur couleur):
V1: sortie du bleu dextran V2: fin de l'lution du bleu dextran
V3: sortie de la vitamine B12 (rouge) V4: fin de l'lution de la vitamine B12

EXEMPLE DE PROFIL D'ELUTION

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0
0 2 4 6 8 10 ml d'luant
Ve 1 Ve 2
V1 V2 V3 V4

En fin de manipulation, rincer la colonne avec 10 ml d'luant.

II. 2. 2. Sparation des protines et des glucides du lait crm.

Application de l'chantillon et lution
Echantillon: prparer 1 ml de lait crm dilu au quart avec de l'eau distille.
Utiliser la colonne marque "lait".
Procder comme prcdemment, en luant avec la solution NaCl 0.9%.
Recueil des fractions
Disposer un portoir de 10 tubes sous la colonne et recueillir 10 fractions de 1 ml.
Traitement des fractions
Noter l'apparence des fractions
Pour chacune des 10 fractions, raliser un test de Biuret et un test de Fehling. Utiliser 0,5 mL dchantillon pour chaque test.
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T. P. V. DETERMINATION DES PARAMETRES CINETIQUES D'UNE ENZYME

MICHAELIENNE : LA PHOSPHATASE ACIDE

But et principe
L'quation de Michaelis-Menten. Expression du Km
Les lois gnrales de la cintique enzymatique reposent sur l'hypothse de la formation d'un complexe
intermdiaire entre l'enzyme et son substrat. Ce complexe strospcifique implique une complmentarit de
structure entre les deux molcules. On peut donc schmatiser une raction enzymatique de la faon suivante :
k1 k2
E + S ES E + P
k -1
E : Enzyme libre; S : Substrat; ES : Complexe Enzyme-Substrat; P : Produit; Et : Enzyme totale.

Vo : vitesse initiale de la raction Vo = k2[ES]

Vm : vitesse maximale de la raction Vm = k2[Et]
V1 : vitesse de formation de ES V1 = k1[E][S]
V-1 : vitesse de dissociation de ES V-1 = k-1[ES] + k2[ES]
k-1 [E][S]
Ks : constante de l'quilibre 1 Ks = k = [ES]
1
A l'quilibre V1 = V-1
k1 [E][S] = k-1[ES] + k2[ES]
[E][S] k-1 + k2
[ES] = k1 = Km Constante de Michaelis-Menten
A tout moment de la raction [Et] = [E] + [ES]
k2[E][S]
V0 k2[ES] V0 Km
[Et] = [E] + [ES] [Et] = [E][S]
[E] + Km
k2[E][S]
V0 Km V0 k2[S]
[Et] = [S] [Et] = Km + [S]
[E](1 + Km)
k2[Et][S] Vm[S]
V0 = Km + [S] V0 = Km + [S] Equation de Michaelis-Menten

Cette courbe V0 = f([S]) a une allure hyperbolique

*Si Km = [S] V0 = Vm/2
Vm
*Si [S] est trs faible V0 = Km [S] V0 = k[S]
Cintique ractionnelle d'ordre 1.
*Si [S] est trs forte V0 = Vm V0 = k
Cintique ractionnelle d'ordre 0.
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L'quation de Lineweaver-Burk
L'quation de Michaelis-Menten peut tre transforme en d'autres relations, d'utilisation plus aise dans
l'exploitation des rsultats exprimentaux. L'une des transformations les plus utilises consiste prendre l'inverse
des deux membres de l'quation dmontre ci-aprs :

1 1 Km
V0 =V + V [S]
m m

Courbe de Lineweaver-Burk

Cette courbe 1/Vi = f(1/[S]) est une droite de pente Km/Vm

1/vi

1/Vm

- 1/Km 1/[S]

Les dterminations graphiques de Vm et Km sont donc possibles.

Km est, dans la plupart des cas, une fonction complexe de toutes les constantes de vitesse de la raction
enzymatique:
k-1 + k2
Km = k1 .

[E][S] k-1 1
Dans le cas particulier, et seulement dans ce cas, o k2 << k-1 Km = Ks = [ES] = k , Km peut-tre
1
considre comme la constante d'association du complexe ES qui reprsente une mesure de l'affinit de
l'enzyme pour son substrat.
Les enzymes sont sensibles divers types d'inhibiteurs : comptitifs, non comptitifs, incomptitifs.
Graphiquement, la reprsentation de Lineweaver-Burk permet de les caractriser.

Un inhibiteur comptitif augmente le Km apparent de l'enzyme sans affecter la Vm de la raction. Un

inhibiteur non comptitif diminue la Vm apparente de la raction sans affecter le Km. Un inhibiteur
incomptitif augmente le Km apparent de l'enzyme et diminue la Vm apparente de la raction.

Inhibiteur non comptitif

1/Vi Inhibiteur comptitif

Inhibiteur incomptitif
1/Vm
Sans inhibiteur

1/V m

-1/K m 1/[S]
-1/Km
Expression du Km dans le cas de l'inhibition comptitive
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k1 k2
E+S ES E+P
k-1

k3
E+I EI
k-3
k-3 [E][I]
I : Inhibiteur libre; EI : Complexe Enzyme-Inhibiteur; Ki k = [EI]
3
A tout moment de la raction [Et] = [E] + [ES] + [EI]

k2[E][S]
V0 k2[ES] V0 Km
[Et] = [E] + [ES] + [EI] [Et] = [E][S] [E][I]
[E] + Km + K
i

V0 k2[S] V0 k2[S]
[Et] = [I]Km [Et] = [I]
Km + [S] + K Km (1 + K ) + [S]
i i

k2[S][Et] Vm[S]
V0 = = [I] V0 = [I]
Km (1 + K ) + [S] Km (1 + K )+ [S]
i i
Equation de Michaelis-Menten
[I]
avec K'm = Km apparent = Km (1 + K ) Constante de Michaelis-Menten
i

Exemple de la phosphatase acide

Cette enzyme de la famille des hydrolases est trs abondante dans de nombreux tissus vgtaux et animaux. Son pH
optimum d'action est acide et elle est compltement inhibe en milieu basique. Elle est capable d'hydrolyser tout type de
substrat phosphoryl. Une faon simple de doser cette activit consiste fournir l'enzyme une molcule phosphoryle dont
la dphosphorylation modifie profondment les proprits d'absorption. Ce phnomne est mesurable par spectrophotomtrie.
Le substrat utilis dans le cadre de la manipulation est le paranitrophnylphosphate dont le driv dphosphoryl,
le paranitrophnol, se transforme pH basique en ion paranitrophnolate fortement color en jaune.

O- O-
H2 O pH5
O2N O P OH O2N OH + HO P OH
Phosphatase
O acide O
4-nitrophnylphosphate p-nitrophnol ion phosphate

+ NaOH

O2N O-

ion p-nitrophnolate
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MANIPULATION
Les manipulations d'enzymologie sont dlicates. Il faut donc observer imprativement plusieurs prcautions. Les
peses, les solutions, les dilutions doivent tre effectues avec une grande prcision. Les temps d'incubation doivent tre
strictement respects et enfin toute la verrerie utilise doit tre systmatiquement lave l'eau du robinet, rince l'eau
distille et goutte.

1) Prparation des solutions

Tampon pH 5 : 5ml acide citrique 1M + 30ml H2O. Amener pH 5 avec NaOH 1M. Complter 50ml.
Solution enzymatique : solution denzyme prte l'emploi 0,2 g/L.
Solution de paranitrophnylphosphate (M= 371,12 g/mol) : prparer 25 ml de solution aqueuse de
paranitrophnyphosphate 3 mM. Prparer ensuite par dilution dans l'eau distille 5ml de chacune des concentrations suivantes
: 0,6 - 0,9 - 1,2 - 1,5 - 1,8 - 2,1 - 2,4 mM. Faire trs attention l'exactitude de ces dilutions car elles vont intervenir dans la
qualit des rsultats.
Solution de -glycrophosphate (inhibiteur): solution 50 mM prte l'emploi.

2) Cintique de la phosphatase acide

Les dterminations de l'activit enzymatique pour chacune des concentrations de substrat seront toutes effectues de
manire ce que la vitesse mesure soit la vitesse initiale, c'est dire que l'on se situe dans la partie rectiligne de la
reprsentation DO = f(t). On choisira comme temps d'incubation 4 minutes. Les diffrentes vitesses initiales vont tre
mesures pour diffrentes concentrations de substrat.

NB. Vous avez intrt prparer l'ensemble des 16 tubes pour les incuber tous les uns la suite des autres

Introduire dans 8 tubes essais bien propres, numrots de 1 8 :

- 1ml de tampon pH 5
- 0,5ml de chacune des dilutions de substrats prpares prcdemment, soit :
0,6 - 0,9 - 1,2 - 1,5 -1,8 - 2,1 - 2,4 - 3 mM.
Mettre ces 8 tubes au bain-marie 37C pendant 5 minutes. Mettre simultanment la solution enzymatique 37C.
Cette opration a pour but d'amener tous les tubes la mme temprature.

Prparer galement un tube tmoin avec :

- 1ml de tampon pH 5
- 0,5ml de substrat 0,6 mM
Dclencher le chronomtre et simultanment la raction enzymatique en ajoutant 0,5ml d'enzyme dans le tube 1. Bien
vortexer et replacer le tube dans le bain-marie.

Au bout d'une minute, dclencher la raction enzymatique en ajoutant 0,5ml d'enzyme dans le
tube 2.
Procder de la mme manire toutes les minutes pour les 6 tubes restants.
Au bout de 4 minutes dincubation du tube 1, arrter lincubation en ajoutant 1 ml de soude 2,5M dans ce tube puis 1
ml de soude 2,5M dans chacun des autres tubes toutes les minutes.

Pour le tube tmoin, introduire 1ml de soude 2,5 M, et ensuite les 0,5ml d'enzyme. De cette faon l'enzyme est
inactive.

Lire l'absorbance des tubes 1 8 405 nm "contre" le tube tmoin.

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3) Cintique de la phosphatase acide en prsence de -glycrophosphate

Les conditions opratoires sont les mmes que prcdemment, mais on aura pralablement ajout la solution de -
glycrophosphate dans chacun des tubes numrots de 1 8. Les tubes contiendront donc:
- 0,5ml de tampon pH 5
- 0,5ml de solution de -glycrophosphate
- 0,5ml de chacune des dilutions de substrats prpars prcdemment soit :
0,6 - 0,9 - 1,2 - 1,5 -1,8 - 2,1 - 2,4 - 3 mM.
Lire l'absorbance des tubes 405 nm "contre" le mme tube tmoin que prcedemment.
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T.P. VI ANALYSE DE LIPIDES

But : le lipide inconnu analyser est soit un acide gras, soit un triglycride contenant trois fois le mme acide gras. Lanalyse
est ralise successivement par CCM puis par dtermination des trois indices Ia, Is et Ii. Il faudra veiller prendre le mme
lipide inconnu pour lensemble des manipulations. Ce lipide est en solution dilue dans le chloroforme (pour la CCM) ou pur
(pour les indices).

I. CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM) DE GEL DE SILICE

La chromatographie sur gel de silice permet de sparer les diffrents composs d'un mlange. On peut utiliser le gel de silice
dans une colonne pour la purification de produits ou en couche mince sur divers supports (verre, aluminium ). La sparation
des produits est ralise grce la diffrence de leur vitesse d'lution sur la phase fixe (couche de silice ici) par la phase
mobile (un mlange de solvants polaires et apolaires) : c'est le principe d'une chromatographie de partage. Le partage entre
la phase mobile et la phase fixe est bas sur la diffrence d'adsorption des constituants du mlange sur la phase fixe. Les
substances se sparent selon leur coefficient de partage. La silice contient des groupements silanols polaires du type Si-OH et
constitue donc une phase fixe trs polaire qui retiendra bien les molcules polaires. Des solvants apolaires pourront entrainer
des composs apolaires mais la polarit de la phase mobile devra augmenter pour entrainer (luer) des composs polaires
fortement adsorbs.

On appelle "rfrence frontale" ou Rf le rapport :

Le Rf est caractristique de chaque constituant pour un solvant et
Rf = une phase fixe donns et dpendant du pouvoir luotrope du solvant
et dans une moindre mesure de la concentration des constituants du
mlange.
MANIPULATION
Prparation des plaques

limite de migration Tracer sur la plaque 0,5-1 cm du bord infrieur un trait

du solvant lger au crayon de bois en vitant de faire des traces de
ligne de dpt des chantillons doigts sur le gel. Tracer de mme un autre trait 1 mm
niveau limite du solvant environ du bord oppos.
Reprer les emplacements des 4 dpts par des croix traces au crayon et espaces de 0,5 cm environ.

Dpt des chantillons

Faire, au niveau de ces emplacements, les diffrents dpts correspondant aux solutions d'chantillons proposes l'aide de
cnes jaunes. Les 4 chantillons sont des solutions dans le chloroforme (CHCl3) des lipides suivants: acide gras, triglycride,
cholestrol, lipide analyser.
Bien scher entre chaque addition en soufflant sur le dpt. La surface de chaque dpt doit tre la plus petite possible: plus
le dpt est diffus, moins le Rf des produits qu'il contient sera lisible.

Elution Le solvant d'lution correspond au mlange (ther de ptrole / dithylther / acide actique) dans les proportions
(80:20:1 en volume).
Ces solvants doivent tre manipuls SOUS LA HOTTE.
Verser ce solvant dans un becher (environ 2 mm de hauteur de solvant) et recouvrir aussitt avec un verre de montre.
Placer la plaque dans le becher. Laisser migrer le front de solvant jusqu'au trait suprieur exactement. Retirer la plaque.
Laisser scher l'air sous la hotte pendant environ 10 min.
En fin de manipulation, reverser le solvant de migration dans le flacon
"RECUPERATION DES SOLVANTS".
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Rvlations Manipulation sous hotte

1- Vapeurs d'iode: introduire la plaque dans une cuve dans laquelle existe un quilibre solide-vapeur d'iode (sublimation).
Les molcules contenant des double-liaisons sont rapidement visualises.
Remarque: on obtient galement une couleur brune avec les lipides saturs contenant de l'azote et avec les esters d'acides
gras.
Reprer les taches et les entourer au crayon.
2- Rvlation du cholestrol: vaporiser le mlange H2SO4-CH3COOH (1:1 v/v) sans excs sur la plaque sous la hotte.

PORT DE LUNETTES OBLIGATOIRE

Chauffer 90 dans l'tuve pendant environ 15 mn. Les spots violacs correspondent aux strols.

II. ANALYSE D'UN LIPIDE

POUR CETTE PARTIE, PRENEZ LES VALEURS DE CONCENTRATION DES
SOLUTIONS (HCl, KOH) INDIQUEES SUR LES ETIQUETTES DES FLACONS
1. Indice d'iode
Les liaisons thylniques et actylniques des acides gras sont susceptibles de fixer l'iode ou ses drivs halogns (chlorure
ou bromure d'iode) ce qui permet de mesurer l'insaturation des corps gras.
L'indice d'iode est le nombre de grammes d'iode fixs par 100g de corps gras.
On utilise un excs d'halognure d'iode pour obtenir une addition quantitative:
H H H H
C C + ICl C C
I Cl
Aprs la raction l'excs de chlorure d'iode est transform en iode par addition d'une solution aqueuse d'iodure de potassium:
ICl + I- I2 + Cl-

L'iode libr est ensuite titr par le thiosulfate en prsence d'empois d'amidon:

I2 + 2 S2O 32- 2 I- + S4O 62-

MANIPULATION
Peser, au mg prs, 2 gouttes du lipide pur analyser dans un erlenmeyer de 100 ml bouchon vis. Solubiliser dans 5 ml
de CCl4 (ttrachlorure de carbone). Simultanment, prparer un flacon tmoin sans le lipide.
jouter 10 ml de ractif de WIJS dans chaque erlenmeyer.
SOUS LA HOTTE.
Boucher les erlenmeyers.
Agiter lgrement et placer l'abri de la lumire pendant 1 H 30. (dans un placard, sous la paillasse)
Ajouter ensuite dans les deux erlenmeyers 5 ml de la solution d'iodure de potassium 2 %.

Ajouter une goutte d'empois d'amidon et titrer l'iode molculaire I2 l'aide du thiosulfate de sodium
0,1 M jusqu' dcoloration. Terminer le titrage en agitant nergiquement: l'iode dissous dans le CCl4 repasse dans solution
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aqueuse (phase suprieure ici) et peut ainsi tre totalement dos. Ajouter une goutte d'empois d'amidon pour vrifier que la
totalit de l'iode I2 a bien t dose. Poursuivre le titrage si l'empois d'amidon se colore.

2. Indice de saponification
L'indice de saponification dpend de la teneur du corps gras en produits insaponifiables (strols, Vit E, etc...), en acides gras
libres et de la proportion de mono, di ou triglycrides.

L'indice de saponification est la quantit (en milligrammes) de potasse ncessaire pour saponifier 1 g de matire
grasse.
On saponifie chaud, en prsence d'un excs connu de KOH alcoolique une prise d'essai de corps gras. L'excs de ractif est
titr par une solution acide en prsence de phnolphtaline (dosage en retour).

MANIPULATION
Peser prcisment environ 2 g du lipide pur analyser dans un ballon col rod de 100 ml. Ajouter 25 ml de KOH
alcoolique 0,5 M. Agiter doucement.
Ajouter deux ou trois morceaux de pierre ponce (pour adoucir l'bullition) puis adapter un rfrigrant reflux et porter
l'bullition au chauffe-ballon pendant 30 mn.
Retirer le ballon du chauffe-ballon, laisser refroidir quelques minutes et doser l'excs de potasse avec HCl en prsence de
phnolphtaline.
Faire un essai tmoin, sans chauffer et sans lipide pour titrer la solution de potasse.

3. L'indice d'acide
Les matires grasses fraiches contiennent peu d'acides gras libres. Elles s'altrent par vieillissement en donnant naissance par
hydrolyse des acides gras libres et du glycrol. La mesure de l'acidit d'un corps gras est une mthode trs utilise dans
l'industrie agro-alimentaire pour dterminer son altration par hydrolyse. Elle revt une grande importance pour l'estimation
de la valeur commerciale d'un corps gras.

L'indice d'acide est la quantit (en milligrammes) de potasse (KOH) ncessaire pour neutraliser l'acidit libre d'un
gramme de matire grasse sche et purifie.

On dosera par une solution alcaline titre l'acidit du corps gras dshydrat et dissous dans un mlange thanol-ther
pralablement neutralis.

MANIPULATION
Neutralisation du mlange ther-alcool: ajouter quelques gouttes de phnolphtaline 50 ml de mlange volume gal
d'thanol 95 et d'ther thylique.
Verser goutte goutte, la solution de KOH alcoolique (environ 0,1 M) jusqu' virage.

Dosage acidimtrique: peser prcisment environ 1 g du lipide pur analyser dans un erlenmeyer de 100 ml. Dissoudre la
prise d'essai dans 50 ml du mlange alcool-ther neutralis. Ajouter 2 gouttes de phnolphtaline. Titrer l'acidit libre par la
potasse alcoolique (concentration indique sur la bouteille) jusqu' ce que la coloration rose persiste au moins 20 secondes.
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REMARQUES:
Les acides gras avec la potasse forment des savons. La coloration rose de la phnolphtaline ne peut tre stable ; en
effet, au bout de quelques secondes, une hydrolyse partielle de la matire grasse aboutit la libration d'acides gras.
Ordre de grandeur de l'indice d'acide pour un triglycride : 0 10
Ordre de grandeur de l'indice d'acide pour un acide gras : 100 300
Ces valeurs ne sont que des ordres de grandeur et dpendent fortement de la masse molaire des produits et de leur degr de
puret.
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TP N1 : Acides amins
Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________ N des solutions utilises: ___________________

Titrage des acides amins - Joindre uniquement les graphiques pH = f (vol NaOH)

1- Indiquer sur les graphes :

a- les valeurs des pKa et pHi. Les constructions graphiques doivent tre parfaitement claires .
b- les formules ionises des acides amins sous la forme simplifie de type A+, A-, A, A0 pHi et aux diffrents
pKa.

2- Formule dveloppe pH 12 de la glycine aprs raction avec le formol :

3- Titrages
Volume de soude 1M pour titrer une des fonctions ionisables de la glycine = _____ cm3
Concentration en glycine = ____ M, _______ g/l (expliquez vos calculs)

Volume moyen de soude 0,1M pour titrer une des fonctions ionisables de lhistidine : ____ cm3
Concentration de lhistidine = _______ M, _______ g/l (expliquez vos calculs)

Dosage de Srensen
Titrage Glycine / formol : pH teinte rose ple : ______ pH teinte rose fonc : ______

Pourquoi ajoute-t-on de la phnolphtalne ?

A ce pH, la fonction amine de la glycine est majoritairement sous la forme (complter) :

R-N
A la fin de la raction, la fonction amine de la glycine est entirement sous la forme (complter) :
R-N
Volume de soude 0,1M ajout = _______
Concentration en glycine (M 75g/mol) = _______ M, _______ g/l Concentration en azote = _______ M, ______ g/l
Dtailler les calculs au verso

Electrophorse (joindre llectrophorgramme)

Identifiez les 4 dpots : 1:_____ 2:_______ 3:_______ 4:_______

Ecrire au verso la formule ionise majoritaire pH = 8.9 de ces acides amins et justifier leur sens de migration. Ces acides
amins et leurs pKa sont les suivants:
CYS (1.7; 8.3; 10.8) PRO (2.0; 10.6) - GLU (2.2; 4.25; 9.7) - ARG (2.2; 9.0; 12.5).
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TP N2 Spectrophotomtrie
Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________ N de la solution de mthionine utilise: ________

1- Dtermination du coefficient d'extinction molaire maximal max du p-nitrophnol (joindre les deux graphes)
Remarque : Trajets optiques : 1 cm

- Formule de la loi de Beer Lambert avec les units:

- Principe de dtermination de max :

- Dterminez graphiquement max et max du pNP (indiquez les valeurs sur les graphes). Dtaillez le calcul de max sur
le graphe correspondant.
max = .. max=
- Dterminer, en dtaillant le calcul, la concentration en mole. L-1 de PNP dans le liquide de contre-dialyse. En dduire le
pourcentage de PNP dans chaque compartiment de dialyse.

2- Dosage de la mthionine (joindre la courbe DO = f (mg mthionine) )

Compltez le tableau suivant:
Solution inconnue
N des tubes n.. dilue au
0 1 2 3 4 5 1/5me
A B
Vol chantillon (cm3) 1ml 1.5ml

DO535nm

mg mthionine par tube

Concentration de la solution inconnue de mthionine (MM=149,2 g/mol) en g/L et en M:

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TP N3 : Rsine changeuses dions

Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________ N de la solution darginine utilise: __________

Quel compos dosez-vous dans lluat acide ? Pourquoi ?

La coloration dans la fraction N _____ est la plus intense, trouvez une explication

Quel compos dosez-vous dans lluat basique ? Pourquoi ?

Remplissez le tableau suivant (joindre la courbe DO = f (g arginine) :

Solution
chromatographier Eluat basique dilu
N de tube 0 1 2 3 4 5
dilue
A (0,5ml) B (1ml) C (0,5ml) D (1ml)

DO530nm

g d'arginine par
tube

Concentration en arginine (M : 174 g/mol):

solution chromatographier dilue ____________ g/L ___________M
solution chromatographier non dilue ____________ g/L ___________M
luat basique dilu ____________ g/L ___________M
luat basique non ilu ____________ g/L ___________M

Calculs : au verso

Quantit darginine dans :

Le volume de solution chromatographier dpos sur la colonne ____________ mg
Le volume total de l'luat basique ____________ mg
Calculs : au verso

Rendement de la chromatographie (%) =

Calcul
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TP N4 Gel d'exclusion-diffusion et dialyse

Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________

1)Gel d'exclusion (Dtaillez les calculs des volumes dlution (Ve) au verso de la feuille)
Colonne 1 : Eluant = Volume total du gel = ml Dbit = _________ ml/min

Bleu Dextran : Premire goutte bleue V1 = ___________ml, dernire goutte V2 = ___________ml,

Vit B12 : Premire goutte rouge V3 = ___________ml, dernire goutte V4 = ___________ml,

Volumes d'lution: Ve BD = ___________ml Ve vitB12 = ___________ml Vo = ___________ml (volume mort)

Kav vit B12 (dfinition, formule, valeur numrique)

Volume dluant contenant : le bleu dextran : _________ml et la vit B12 : __________ml

Calculer les facteurs de dilution dus la chromatographie, respectivement pour le bleu dextran et pour la vitamine B12 :
Bleu dextran :

VitB12 :
Le domaine de fractionnement du gel utilis est compris entre les masses 100 et 5000. Justifiez les volumes dlution du bleu
dextran et de la vitamine B12 :

Colonne 2 : Eluant = Volume total du gel =__________ ml

Test la liqueur de Fehling :
N des fractions positives
Test du Biuret :
N des fractions positives
Justifier les volumes dlution des composs du lait en utilisant les rsultats obtenus avec la colonne 1.

2) Dialyse
Composs prsents lintrieur du sac aprs 1h30 =

Composs prsents lextrieur du sac aprs 1h30 =

Justifiez ce rsultat
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TP N5 La Phosphatase acide
Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________

1) Prparation du substrat 3 mM et dilutions :

p-nitrophnyl-phosphate (pNPP) (MM = ________g/mol) concentration massique correspondante : ________mg/50cm3
Compltez le tableau suivant
Tubes 1 2 3 4 5 6 7 8

Concentration finale en pNPP (mM) 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 3

Volume solution mre de pNPP (cm3)

H2O (cm3)

2) Cintique : complter le tableau suivant

Tubes sans inhibiteur 1 2 3 4 5 6 7 8

[pNPP] finale (M) dans le milieu

ractionnel
1/[pNPP] (unit =_______)

DO

Vi (DO/min)

1/Vi ((DO/min)-1)

Tubes avec inhibiteur 1 2 3 4 5 6 7 8

[Inhibiteur] finale (mM) dans le

milieu ractionnel
DO

Vi (DO/min)

1/Vi ((DO/min)-1)

3) Graphes
Tracez sur la mme feuille vi (DO/min) = f([S]), avec et sans inhibiteur.
Tracez sur la mme feuille les courbes 1/vi ((DO/min)-1) = f(1/[S]), avec et sans inhibiteur
Indiquer sur ce graphe les valeurs de Km (mM) et de Vm (DO/min).
Nature de l'inhibiteur = comptitif non comptititif incomptitif (entourez la bonne rponse)

4) Exploitation des rsultats (dtaillez les calculs au verso ; noubliez pas les units)

a) Calculer : Vm = __________ M.min-1 ( du pNP = 18500 M-1.cm-1 405 nm et pH = 10)

b) Exprimer Vm en mol/min (=UI) pour 1 ml de milieu ractionnel : UI/mL = _____________

c) Ki du -glycrophosphate : Ki = _____________

d) Dterminer lactivit spcifique de lenzyme : AS = _____________

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TP N6 Les Lipides
Noms :_________________________________________________________
Date : _______________
Groupe : _____________ N du lipide analys = ______

Remarque : le lipide analyser est soit un acide gras soit un triglycride homogne (glycrol estrifi
par trois AG identiques)

1) Chromatographie sur gel de silice

Identification des dpts :
Nde lchantillon Rf Produit Evaluation de la polarit des La silice est (entourez la
composs * bonne rponse)
1 Polaire

2 Apolaire

Lipide inconnu n

* Polarit dun compos : trs polaire : +++, Polaire ++, peu polaire +

Un compos polaire va migrer (entourez la bonne rponse) : peu beaucoup sur la silice.
Expliquez pourquoi :

2) Indice dacide Masse exacte de lipide =

Volume de potasse alcoolique ([KOH] =_____M ) ajout :_________cm3
Nombre de moles de potasse correspondant (dtaillez le calcul)
(KOH, MM=56)

Indice dacide (dtaillez le calcul) =

Vous tes en prsence (entourez la bonne rponse): dun acide gras dun triglycride
Si votre lipide est un acide gras, calculez sa masse molaire :
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3) Indice de saponification Masse exacte de lipide :

Volume dHCl (solution ____M) ajout :
- dans le tmoin Vo =________cm3
- dans lessai V1 =________ cm3 } V = _________ cm3

Nombre de moles de KOH alcoolique ncessaires la saponification du lipide (dtaillez le calcul):

Nombre de moles de lipide saponifi (dtaillez le calcul) =

Masse molaire du lipide (dtaillez le calcul) =

Si votre lipide est un acide gras, recalculer sa masse molaire.

Indice de saponification (dtaillez le calcul) =

4) Indice diode Masse exacte de lipide =

Volume de thiosulfate (solution _____M) ajout :
- dans le tmoin Vo =________cm3
- dans lessai V1 =________ cm3
} V = _________ cm3

Calculer le nombre de moles d I2 quivalent la quantit (moles) de ICl ayant ragi sur les doubles liaisons (dtaillez le
calcul)

Nombre de doubles liaisons dans le lipide tudi :

Indice diode (dtaillez le calcul ; MM de I2 : 254) =