La causa del color verde de la polarizacin de amiloide

teido con rojo Congo.

Se sabe desde hace casi cuarenta aos que los depsitos de amiloide teidos
con rojo Congo muestran una birrefringencia ms intensa que los depsitos sin
manchas y que el amiloide rojo manchado de color rojo aparece bajo el
microscopio polarizador (DIvR: e Y FLORKIN, 1927). MISSVlAHL y HARTWIG
(1953), que estudiaron este fenmeno, concluyeron que el amiloide consiste en
micelas ordenadas y que la aposicin de partculas rojas del Congo en el
amiloide tambin ocurre de una manera ordenada.
La aparicin del color de polarizacin verde no pudo explicarse adecuadamente
por estos ni aparentemente por los trabajadores subsiguientes.
La conclusin de que el amiloide consta de elementos fibrilares ha sido
probada en estudios de microscopa electrnica por COHEN y CALKINS (1959) y
confirmada por numerosos otros trabajadores.
El presente trabajo se ocupa de algunos experimentos y observaciones que
tratan de la causa del color de polarizacin verde del amiloide teido, lo que
permiti la formulacin de una explicacin coherente del fenmeno.

Experimentos
1. Experimentos con rojo Congo puro
En una serie de experimentos Congo rojo se disolvi en etanol al 50% y la
solucin saturada se dej evaporar parcialmente a temperatura ambiente. Se
hicieron frotis de los cristales de color rojo Congo y se examinaron bajo luz
polarizada.

Figura 1
Muestra que el color de polarizacin de las fibrillas gruesas era rojo, de las ms
finas era naranja y amarillo y slo los cristales ms finos parecan verdes.
En otra serie de experimentos, se verti sobre una lmina una solucin
saturada de rojo Congo en etanol al 50% y se dej secar.
A continuacin, la superficie seca se puli en una direccin presionndola
contra una rueda de vidrio giratoria de un afilador de cuchillas de micrtomo.
El examen del frotis pulido para el dicrosmo revel que algn dicrosmo poda
detectarse en todas las reas.
El color del colorante era ms rojo cuando coincida la direccin del pulimento y
la del polarizador. Sin embargo, una transicin completa de rojo a incoloro o
casi incoloro ocurri slo en aquellas reas donde el frotis era ms delgado.
El examen de las diversas reas para el color de birrefringencia revel que slo
en aquellas reas donde el dicrosmo era ms pronunciado (incoloro a rojo), el
color de polarizacin verde apareci bajo polares cruzados.
En reas ms gruesas de los frotis (donde la diferencia dicrotica era de rojo a
rojo ms oscuro) se observ color de polarizacin amarillo, naranja y rojo bajo
polares cruzados (Fig. 2).
2. Efectos pticos de tincin roja Congo en varios
tejidos
Un nmero de biopsias de quirfano que contenan diferentes tipos de reas
hialinizadas y algunos rganos que contienen amiloide, se fijaron en formol al
10% o en una solucin de Stieve modificada (que contena 1% de HgCl2) y se
embebieron en parafina y se seccionaron a 6 - 8 Micras.
En algunos casos, los sitios marcados en las secciones se examinaron para
determinar la intensidad de la birrefringencia (con el compensador de Berek)
antes y despus de la tincin con rojo Congo. En otros casos, se examinaron
dos secciones contiguas, una sin manchas pero completamente desparafinada
durante la noche en xilol y la otra teida con rojo Congo.
Las secciones a teir con rojo Congo se sumergieron en xilol durante la noche
para asegurar una desparafinacin adecuada, se secaron e hidrataron (si era
necesario, despus del tratamiento con la solucin de Lugol).
Luego se tieron durante 5 minutos en una solucin al 0,5% de rojo Congo en
etanol al 50%, se transfirieron, se diferenciaron durante 15 - 30 segundos
(hasta que no se pudo ver ms mancha dejando la seccin) en una solucin al
0,2% de KOH en 80 % De etanol, enjuagado durante un minuto en agua
corriente, contra-teido con hemalum de Mayer, deshidratado y montado en el
blsamo de Canad.
Los diversos tejidos teidos con rojo Congo fueron examinados para la
aparicin de dicrosmo utilizando slo el polarizador del microscopio polarizador
sin el analizador.
Tambin se estudi el efecto de la tincin sobre la intensidad de la
birrefringencia.
El equipo utilizado consisti en un microscopio Leitz polarizante con un Brace-
KShler y ocasionalmente tambin los compensadores de polarizacin Berek.
Se ha encontrado que el dicrosmo se marc en amiloide y especialmente en
fibras amiloides finas. Ningn dicrosmo obvio poda ser detectado en fibras
elsticas o de colgeno o en masas de hialina que se tieron con rojo Congo.
De acuerdo con los hechos conocidos, la tincin con rojo Congo aument
notablemente la intensidad de la birrefringencia del amiloide. El efecto de la
tincin del Congo en los otros tejidos fue variable: en la mayora de los casos,
la intensidad de la birrefringencia permaneci prcticamente sin cambios. En
otros materiales hubo un ligero aumento o una ligera disminucin.

3. Efecto del espesor de los depsitos amiloides

DIEZEL y PFLEIDERER (1959) han estudiado el efecto del aumento del espesor
de las secciones de tejidos que contienen amiloide, posteriormente teidas con
el rojo del Congo, y pueden confirmarse fcilmente: con el aumento del grosor
de las secciones el amiloide rojo manchado de color rojo aparece amarillo,
naranja y finalmente Rojo bajo polares cruzados.
En los experimentos actualmente descritos se cortaron bloques de rin
amiloide y suprarrenal que se fijaron en formalina y se embebieron en parafina
a 1 - 2 micras. Las secciones se tieron a continuacin con rojo Congo como
anteriormente.
Los depsitos amiloides dbilmente birrefringentes parecan dbiles rojizos
bajo polares cruzados.

Discusin
Los experimentos realizados con cristales de color rojo Congo indican que el
color de polarizacin verde depende, al menos en parte, del grosor del
objeto.Se obtuvieron resultados de corte claro con el frotis pulido.

ZOCHER y JACOBu (1927) han propuesto y utilizado el procedimiento de pulir

los frotis secos de colorantes con el fin de obtener una disposicin ordenada de
micelas e inducir as un dicrosmo intenso y claro.
En tales frotis se hizo obvio que una disposicin perfecta de las molculas de
colorante (que se muestra por un dicrosmo rojo "limpio" a incoloro) es un
requisito previo para la aparicin del color de polarizacin verde.
Esta conclusin se basa en el hecho de que Congo-rojo es conocido por mostrar
dicrosmo de rojo, cuando las micelas se disponen paralelos a la direccin del
polarizador, a incoloro, cuando son perpendiculares al polarizador (ScHMIDT
1956).
El color amarillo y rosado del material examinado con slo el polarizador en la
direccin perpendicular indican que las molculas no estn perfectamente
alineadas y el color resultante es una mezcla de rojo e incoloro.
El estudio de secciones de tejidos que contienen amiloide teidos con rojo
Congo indica que la aparicin de color de polarizacin verde tambin depende
del espesor del objeto.
El color verde aparece slo dentro de un cierto rango de espesor, mientras que
las secciones de 1 a 2 micras de espesor, as como aquellas de 20 micras de
espesor, no muestran el fenmeno. Los resultados se pueden explicar de la
siguiente manera. En un cristal perfecto de rojo Congo, en el que todas las
molculas estn paralelas, el examen del dicrosmo mostrar la transicin del
rojo al incoloro cuando la direccin del cristal vara de la del eje del polarizador
a una posicin perpendicular a l.

Este fenmeno depende del grado de "orden", es decir, del paralelismo en la

disposicin de las molculas y no del espesor de la muestra.
Cuando un cristal casi perfecto de rojo Congo de un grosor dado es examinado
bajo polares cruzados cuando est situado en 450 al eje del polarizador, la luz
polarizada que entra en el objeto (figura 3) se divide en dos rayos, uno rojo que
se ejecuta Paralelo a la longitud del cristal ya un blanco perpendicular a l.
El componente rojo del rayo blanco tiene obviamente la misma amplitud (y por
lo tanto la intensidad) que el rayo rojo.
Al ser reunidos por el analizador los dos rayos pueden producir fenmenos de
interferencia. Siempre que el retardo del rayo lento sea igual a la mitad de la
longitud de onda (6) de la lucha roja, el rayo rojo causar la extincin completa
del componente rojo del rayo blanco.

La extincin parcial de las longitudes de onda cercanas tambin ocurrir, y esto

ser ms
Acentuada en una u otra direccin del espectro cuando el espesor del objeto
ser ligeramente ms o menos que el que es necesario para un retardo.
La extincin del rojo produce la apariencia del color complementario, - verde.
Es evidente que se necesitan dos factores para la produccin del color de
polarizacin verde: 1) una alineacin paralela casi perfecta de las molculas de
rojo Congo por un lado, y 2) un espesor adecuado del objeto para producir un
retardo 2 .

El amiloide parece diferir de otras estructuras y materiales que estn

manchados por el rojo Congo en una caracterstica.
La tincin de amiloide con rojo Congo (y posiblemente tambin con otros
colorantes dicroticos) se asocia con un grado de orden en la disposicin de las
molculas de colorante que no est presente en ningn otro material.
La alineacin perfecta podra indicar un momento dipolar ms fuerte en las
molculas de amiloide que en las otras molculas, o bien la presencia de
canales dentro de las fibrillas amiloides que no permiten ninguna inclinacin
(posibilidad que podra encontrar una contraparte morfolgica en el estudio
electrnico microscpico de GUEFT Y GmDONI (1963).
La mayor cantidad de orden y paralelismo entre las molculas de rojo Congo en
amiloide en comparacin con hialina y materiales elsticos tambin se
confirma por el hallazgo de que slo en la amiloidosis es la intensidad de la
birrefringencia marcadamente aumentada por tincin con rojo Congo.
El aumento de la birrefringencia causada por la tincin con rojo Congo es
causada por el hecho de que las molculas rojas del Congo, que son
positivamente birrefringentes y dicroticas (W, ~ LCHLI, 1945), estn
dispuestas paralelas a la longitud de las fibrillas amiloides.
Est claro que slo los depsitos amiloides que producirn retraso de
aproximadamente la mitad de la longitud de onda de la luz roja aparecern
verdes bajo polares cruzados.

La aceptacin general del color de polarizacin verde como criterio para

reconocer el amiloide se debe al hecho de que casi todos los laboratorios
utilizan secciones que tienen entre 5 y 10 micras de grosor en el trabajo de
rutina.
Con las secciones ms delgadas el amiloide aparecer un verde algo ms azul
y con ms gruesos un verde ms amarillento y solamente las secciones
gruesas que son inadecuadas para el estudio microscpico adecuado no
demostrarn el fenmeno.
El retraso de la mitad de la longitud de onda del amiloide rojo marcado con rojo
representa la suma de dos factores: la intensidad de la birrefringencia del
amiloide sin color multiplicado por el grosor del depsito ms la intensidad de
la birrefringencia del rojo Congo ordenado multiplicado por el grosor.
Si el espesor del depsito de color rojo Congo es t, la intensidad de la
birrefringencia del amiloide sin color y la intensidad de la birrefringencia del
ordenado rojo Congo no, entonces el retardo r ser: r ~ t. N a - ~ t "n c - t (n a
~ nc).

De esta frmula (ya partir del resultado del experimento anteriormente

descrito con una seccin delgada de amiloide) queda claro que los depsitos
amiloides muy pequeos (o ms bien delgados) escaparn a la deteccin entre
polares cruzados.
La intensidad de la tincin con rojo Congo de tales depsitos es tan baja que
ciertamente tambin escapar a la deteccin con luz ordinaria.
Se sugiere que el mejor procedimiento para detectar tales depsitos mnimos
de amiloide consiste en examinar para el dicrosmo (es decir, slo con el
polarizador) bajo secciones de luz ultravioleta teidas por tintes fluorescentes.
Por este medio el efecto de campo oscuro tambin se obtendr en el estudio
del dicrosmo.

Se supondr que las fibrillas que no aparecern en una direccin y que sern
fluorescentes en una direccin perpendicular representarn el amiloide,
aunque no muestren el color de polarizacin verde en las secciones manchadas
de rojo Congo.

Resumen
Los experimentos realizados con cristales rojos Congo y con depsitos de rojo
Congo pulidos en una sola direccin por una rueda de vidrio han demostrado
que la aparicin del color de polarizacin verde depende principalmente de la
alineacin paralela casi perfecta de las partculas de colorante.
El color de polarizacin verde se observ slo en los depsitos que mostraron
una clara transicin del rojo al incoloro cuando se examin el dicrosmo.
Otro factor se encontr que era el grosor del objeto, ya que el color de
polarizacin verde no estaba presente en secciones demasiado gruesas o
demasiado delgadas de tejidos que contenan amiloide teidas con rojo Congo.
Los fenmenos se pueden explicar por el supuesto de que el color de
polarizacin verde es debido a la interferencia entre el rayo rojo y el
componente rojo del rayo blanco siempre que el retardo por el objeto se
aproxime a la mitad de la longitud de onda de la luz roja.
Los hallazgos indican que el amiloide difiere de otros materiales que estn
manchados por el rojo Congo en que los depsitos amiloides se unen a las
molculas de colorante de una manera ms ordenada y paralela.
Se sugiere que las cantidades mnimas de amiloide que no son visibles en
secciones teidas de color rojo Congo con microscopa de luz ordinaria y que
no dan el color de polarizacin verde pueden ser mejor detectadas mediante el
examen de dicrosmo en luz ultravioleta despus de haber sido teidas con
colorantes fluorescentes.