SENSIBILIDAD O LINEALIDAD FOTOMTRICA

Es la capacidad de respuesta lineal de un espectrofotmetro a concentraciones crecientes o

decrecientes de una sustancia que cumpla la Ley de Beer a distintas longitudes de onda.

La Ley de Lambert-Beer establece que la absorbancia (A) de una sustancia en solucin es

directamente proporcional a la concentracin (C) de dicha solucin y dicha
proporcionalidad est dada por el coeficiente de absorcin molar () de la sustancia y por el
camino ptico (b) que recorre la luz al atravesar la solucin :

A = . b. C

La capacidad de un espectrofotmetro de dar respuestas lineales a cambios crecientes o

decrecientes en la concentracin de una sustancia que cumple la Ley de Lambert Beer se
denomina LINEALIDAD FOTOMTRICA. Esta propiedad permitre conocer el rango de
absorbancias dentro del cual un espectrofotmetro produce respuestas proporcionales a los
cambios de concentracin de una sustancia.
Una de las causas importantes que pueden originar prdida de linealidad fotomtrica, es la
presencia de LUZ PARASITA.
El propsito es correlacionar el estudio de linealidad fotomtrica con la presencia de luz
parsita y establecer el grado de influencia de sta en los casos en que se detecte prdida de
linealidad.

CONTROL DE LA LINEALIDAD FOTOMTRICA

El mtodo mas prctico consiste en preparar diluciones de determinadas sustancias y ver la

respuesta del instrumento. Se recomienda medir la linealidad a ms de una longitud de
onda, sobre todo de aquellas sustancias utilizadas en los mtodos de deteccin de Qumica
Clnica.
Para el control se usan soluciones de concentraciones crecientes :
a) dicromato de potasio cido a 340 nm
b) p nitrofenol a 405 nm
c) nitrato de cobalto a 510 nm
d) cianmetahemoglobina 540 nm
a) b)

c) d)

a) recta ideal
b) buena linealidad. Diferencia de exactitud de la absorbancia
c) linealidad aceptable hasta aproximadamente 1000 UA, luego disminuye
d) mala linealidad en todo el rango de absorbancia ( mala sensibilidad : no
registra cambios significativos de absorbancia al cambiar la concentracin )

VALORES PTIMOS : error pendiente menor o igual al 2 %

VALORES ACEPTABLES : error pendiente menor o igual al 3 %

LECTURA DE LAS 4 SOLUCIONES DE DICROMATO DE POTASIO (A,B,C,D)

- Tener encendido el equipo el tiempo que indique el fabricante antes de

realizar la experiencia.
- Elegir una cubeta limpia y sin rayaduras y ajustar el cero de
absorbancia con agua destilada a la longitud de onda de trabajo (340,
350 o 366 nm). Si no puede llevar a cero de absorbancia a dicha
longitud de onda, eso es ndice de mal funcionamiento del
espectrofotmetro por lo que recomendamos llamar al servicio tcnico
de su instrumento para solucionar el problema.
- Medir la absorbancia de la solucin A y registrar el resultado. Volcar la
solucin, volver a cargar la solucin A, medirla y registrar el resultado.
Calcular la absorbancia promedio de las dos medidas.
- Proceder con las soluciones B, C y D de la misma forma que se realiz
con A, realizando las lecturas por duplicado y calculando las
absorbancias promedio.

LECTURA DE LAS 4 SOLUCIONES DE P-NITROFENOL A 405 nm

Espectrofotmetros manuales :

- Tener encendido el equipo el tiempo que indique el fabricante antes de

realizar la experiencia.
- Llevar el selector de longitud de onda a 405 nm y seleccionar la
temperatura de trabajo (25, 30 o 37 C)
- Elegir una cubeta limpia y sin rayaduras y ajustar el cero de
absorbancia con agua destilada.
- Medir la absorbancia de la solucin C1 y registrar el resultado. Volcar la
solucin, volver a cargar la solucin C1, medirla y registrar el resultado.
Calcular la absorbancia promedio de las dos medidas.
- Proceder con las soluciones C2, C3 y C4 de la misma forma que se
realiz con la solucin C1.

Espectrofotmetros con bomba de aspiracin :

Para los puntos 1 y 2 realizar las medidas por duplicado de la siguiente manera :
- Seleccionar la temperatura de trabajo (25, 30 o 37 C)
- Llevar a cero de absorbancia a 405 nm con agua destilada. Aspirar aire.
- Aspirar la solucin a medir y registrar el valor. Aspirar aire y repetir la
operacin con la misma solucin. Calcular la absorbancia promedio y
registrarla en la planilla de resultados correspondientes.
- Aspirar aire y pasar a medir la siguiente solucin.

Autoanalizadores y equipos automticos :

Consultar el manual del fabricante para seleccionar la funcin o test que permita
medir absorbancias absolutas. Seleccionar la temperatura de trabajo (25, 30 o
37C). Seleccionar la longitud de onda de 405 nm. Realizar un blanco con agua
destilada y proceder a la medicin de las absorbancias de todas las soluciones por
duplicado.
En caso que el camino ptico de la celda de medicin no sea de 1 cm, realizar la
correccin que corresponda para normalizar la absorbancia a 1 cm de paso de luz.
El factor a utilizar en dichos casos ser :
1 cm
Abs. Normalizada = Abs. leda x ------------------------------------------------
Camino ptico de la celda en cm

Si tiene alguna duda de cmo realizar estas mediciones con cu equipo automtico,
le aconsejamos se comunique con el servicio tcnico de su fabricante.

LUZ PARASITA
Es toda radiacin electromangntica de longitud de onda distinta a la seleccionada
por el monocramador que alcanza el detector y por lo tanto queda registrada por el
instrumento. O sea, es la radiacin que alcanza el detector sin haber pasato a
travs de la muestra.

CONTROL DE LUZ PARASITA

Se puede medir introduciendo en el aparato una muestra que tenga una

transmitancia del 0 %, por lo tanto, cualquier radiacin detectada e indicada en el
lector corresponder a luz espuria.

Ajustar cuidadosamente el 100 % T con agua destilada a 340 nm. Luego medir la
transmitancia aparente de una solucin de NO2Na (50g/l). El valor mximo
admisible o aceptable de T es de 1.0 % y el valor ptimo de T es menor o igual al
0,5 %.

Una de las causas importantes que pueden originar prdida de linealidad

fotomtrica es la presencia de luz parsita. Esta puede estar originada en
filtraciones o goteras en el compartimento de medida que permiten que la
radiacin del exterior llegue al detector, como as tambin por dispersin de la luz
incidente por suciedad o imperfecciones en las superficies de las piezas del
circuito ptico. Entonces la presencia luz parsita produce un aumento de
transmitancia y disminucin de absorbancia, esto adquiere ms peso en
absorbancias altas, por lo que se traduce en una prdida de la linealidad a medida
que aumenta la absorbancia.

Lectura de la solucin de nitrito de sodio (solucin control luz parsita)

- llevar a cero de absorbancia con agua destilada a 340 nm.

- si el espectrofotmetro permite hacer mediciones de transmitancia, colocar el
selector de modo transmitancia y medir el % de T de la solucin control.
Realizar la experiencia por duplicado y registrar el valor promedio en la casilla
indicada como % T.
- Si el espectrofotmetro no permite hacer mediciones de transmitancia, medir la
absorbancia de la solucin. Realizar la medicin por duplicado y registrar el
valor promedio en la casilla indicada como Abs. En el caso que la
absorbancia supere la capacidad de lectura del instrumento, consultar el
manual del fabricante para saber cual es la mxima absorbancia que puede
detectar el equipo e indicar el resultado como : mayor que dicho valor. Por
ejemplo hay instrumentos que no pueden leer absorbancias mayores de 2.000
UA. Si la lectura de esta solucin supera dicho valor, informar como mayor de
2.000.

Nota 1 : Espectrofotmetros con bomba de aspiracin

- llevar a cero de absorbancia con agua destilada a 340 nm
- aspirar aire
- aspirar la solucin control y registrar el valor. Aispirar aire y repetir la operacin
con la misma solucin. Calcular la absorbancia promedio y registrarla en la
pantalla de resultados correspondiente.

Nota 2 : Autoanalizadores y equipos automticos

Consultar el manual del fabricante para seleccionar la funcin que le permite medir
absorbancias absolutas. Seleccionar la longitud de onda de 340 nm. Realizar un
blanco con agua destilada y medir las absorbancias de la solucin por duplicado.
En caso caso que el camino ptico de la celda de medicin no sea de 1 cm
realizar la correccin que corresponda para normalizar la absorbancia a 1 cm de
paso de luz. El factor a utilizar en dichos casos ser :

1 cm
Abs normalizada = Abs leda x ----------------------------------------------------
Camino ptico de la celda (en cm)