Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
RESUMEN
Palabras clave: memoria espacial, estrs agudo, restriccin calrica, laberinto de Barnes.
ABSTRACT
The purpose of the present study was to describe the effects of caloric restriction on spatial learning
and recovery in the Barnes maze in animals experimentally stressed before recovery of the spatial
task. Male Wistar rats were exposed for two months to one of two conditions: ad libitum (AL) or
intermittent fasting (IF). Both groups were exposed then to an experimental form of acute stress,
induced by movement restriction for 4 hours. IF subjects had better performance in learning tasks
during the acquisition trials but required more time to complete the task after the stressor was
applied. These results are discussed in light of previous data reported in the literature emphasizing
differences in the instruments used to evaluate spatial learning and its interaction with experimentally
induced stress.
Key words: spatial memory, acute stress, caloric restriction, Barnes maze
produjo mejoras en los procesos de aprendizaje y mal alojados en cajas de plexigls en grupos de
recuperacin, as como en la eficiencia sinptica cuatro animales, distribuidos en dos condiciones:
y la expresin de la sub-unidad NR2B del recep- alimentacin Ad libitum (AL) y Ayuno Intermitente
tor NMDA para glutamato (Fontan-Lozano, Lopez- (AI). El procedimiento de ayuno intermitente se ini-
Lluch, Delgado-Garcia, Navas & Carrion, 2008; ci inmediatamente despus de la llegada de los
Fontan-Lozano et al., 2007). Estos y otros traba- animales, hasta que el peso de las ratas alimenta-
jos reportados en la literatura en los que se busca das ad libitum alcanz los 300g (20) aproximada-
evaluar los efectos de la restriccin calrica en el mente dos meses despus. Durante su permanencia
aprendizaje se centran en la reversin del deterio- en el laboratorio, las ratas fueron expuestas a un
ro cognitivo relacionado con la edad (Halagappa ciclo de luz /oscuridad de 12 horas (con las luces
et al., 2007) por lo que poco se sabe de los efectos encendidas a las 7:00 a.m.). Las sesiones experi-
de la restriccin calrica en el aprendizaje en su- mentales se realizaron durante el ciclo de luz, entre
jetos adultos jvenes. Hasta donde sabemos, tam- las 7:00 y las 13:00 horas.
poco se ha evaluado la forma en la cual la
restriccin calrica puede alterar los efectos ya APARATOS
descritos del estrs en el aprendizaje. Por lo ante-
rior, el propsito del presente estudio es evaluar el
efecto de la restriccin calrica en la recuperacin Laberinto Circular de Barnes
de una tarea espacial en ratas adultas que han sido Para estudiar el aprendizaje de la tarea espacial se
expuestas a un estresor antes de su evaluacin. utiliz un laberinto circular de Barnes. Este ins-
Como estresor se emple el procedimiento de res-
trumento consiste en una plataforma circular de
triccin de movimientos durante cuatro horas, el
1.22 cm de dimetro elevada 90 cm del piso ela-
cual ha mostrado producir una prolongada eleva-
borada en acrlico negro opaco. En la periferia de
cin de los niveles plasmticos de corticosterona
dicha plataforma se encuentran ubicados diecio-
en ratas (Acosta, 2007) as como dficits en la re-
cho agujeros circulares de 9 cm de dimetro espa-
cuperacin de tareas de memoria espacial en el
ciados entre s por 20 de arco. En la cara inferior
laberinto circular de Barnes (Torres Berro, 2006).
de la plataforma en comunicacin con cada agu-
La restriccin calrica, por su parte, fue inducida
jero, puede adosarse una caja de escape removible
a travs del procedimiento de ayuno intermiten-
(caja meta) de 24 cm. de largo x 10 cm. de altura
te. Los efectos de estos protocolos fueron evalua-
dos en una tarea de aprendizaje espacial utilizando y 8.75 cm. de ancho. Una caja de forma circular
para ello el laberinto circular de Barnes. (caja de inicio) es localizada en el centro de la pla-
taforma al inicio de cada sesin cubriendo al ani-
mal y retirada con un sistema de poleas. El
MTODO laberinto se encuentra localizado en una habita-
cin iluminada por una luz roja de 60W y dos lm-
paras reflectoras de 150W ubicadas a dos metros
SUJETOS
del suelo. Adicionalmente, una fuente de sonido
Se utilizaron 17 ratas Wistar macho con un peso blanco de 90dB ubicada 150 cm por encima de la
de 95.5g. (30) y aproximadamente 30 das de edad plataforma proporciona un estmulo sonoro de alta
provenientes del Bioterio Central de la Facultad de intensidad. En las paredes de la sala experimen-
Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional de tal se localizan estmulos visuales que no cambian
Colombia - Sede Bogot. Una vez recibidos, los a lo largo del entrenamiento y que han sido suge-
animales permanecieron en las instalaciones del ridos como pistas contextuales que ayudan en la
Laboratorio de Aprendizaje y Comportamiento Ani- orientacin del sujeto.
Diseo Experimental
Figura 1. Diseo experimental. Grupos experimentales: Ad libitum (AL) y Ayuno Intermitente (AI).
Abreviaturas: Adap: Adaptacin (A1-A4: Da de adaptacin 1 al 4); E1-E8: Ensayos de entrenamiento
del 1 al 8; E: Induccin de estrs por restriccin motora; PCC: Prueba con caja; PSC: Prueba sin
caja; IEA: Intervalo entre A1, A2, A3, A4 y H1; IEE: Intervalo inter-ensayo.
acceso a agua y comida para ambos grupos du- dos cuatro minutos la rata no ingresa a la caja
rante cuatro das (A1 a A4), al cabo de los cuales, meta, se introduce gentilmente en ella a travs del
se inici el aprendizaje de la tarea espacial. agujero y se deja all por un minuto.
Veinticuatro horas despus de la ltima sesin
Restriccin Motora de entrenamiento se lleva a cabo la fase de prueba
del aprendizaje, la cual consiste en una prueba
Los animales de los dos grupos fueron expuestos al
con caja (un ensayo idntico a los ensayos de en-
procedimiento de restriccin motora el da de las
trenamiento) y una prueba sin caja consistente en
pruebas de aprendizaje, para lo cual cada rata fue
un ensayo de cuatro minutos en el cual la caja
introducida en el restrictor entre las 7:00 y las 11:00
meta es retirada del laberinto.
a.m. Una vez finalizado este periodo, cada animal
fue llevado a su caja hogar donde permaneci 30
VARIABLES EVALUADAS
minutos antes de iniciar las pruebas.
En la fase de adquisicin se observ: a) latencia de
Laberinto de Barnes escape, tiempo en segundos que emplea el animal
para encontrar la caja meta, b) errores de agujero,
El entrenamiento en el Laberinto de Barnes fue
correspondiente al nmero de exploraciones por
dividido en tres fases: habituacin, adquisicin y
medio de golpes de la nariz o de deflexiones de la
recuperacin. La primera fase consiste en una se-
cabeza en agujeros diferentes al agujero meta o en
sin de habituacin al laberinto y a la sala de ex-
ste sin ingresar, c) distancia recorrida, distancia
perimentacin, la cual es realizada entre las 10:00
relativa en centmetros entre la exploracin de
y 10:30 de la maana. La organizacin de la se-
reas, periferia y agujeros y d) velocidad del reco-
sin es la siguiente: a) el sujeto es introducido en
rrido.
la caja meta no emplazada en el laberinto durante
En la prueba con caja se estimaron los mis-
dos minutos al cabo de los cuales se devuelve a la
mos parmetros que en la adquisicin. Para la
caja de consolidacin por un minuto, b) el ani-
prueba sin caja, se midieron las siguientes varia-
mal es introducido de nuevo en la caja meta, esta
bles: a) latencia de exploracin del agujero meta y
vez emplazada en el laberinto por un periodo de
b) porcentaje de frecuencia de exploracin del agu-
dos minutos, al cabo de los cuales es llevado a la
jero meta y de los otros agujeros en relacin con
caja de consolidacin por un minuto, c) finalmen-
su posicin con respecto al meta.
te el animal se introduce en la caja de salida du-
rante dos minutos. La fase de aprendizaje consisti
ANLISIS ESTADSTICO
en una sesin de ocho ensayos. Cada ensayo ini-
cia cuando el animal es introducido en la caja de El promedio y error estndar de cada variable fue
inicio por un periodo de 30 segundos. Al finalizar estimado y graficado en el programa Microsoft Office
dicho intervalo se encienden los reflectores y la Excel. Los anlisis inferenciales se realizaron por
fuente de sonido, se levanta la caja de inicio y se medio del paquete estadstico SIGMA STAT 3.1, apli-
le permite a la rata explorar el laberinto por un cando pruebas de inferencia paramtrica a las me-
perodo mximo de cuatro minutos o hasta que didas que cumplieron con el criterio de normalidad
encuentre la caja meta e introduzca las tres cuar- e igualdad de varianza. Como prueba post hoc para
tas partes anteriores de su cuerpo. Despus de cada la determinacin de las diferencias entre ms de dos
ingreso, el animal permanece en la caja meta por grupos se utiliz el mtodo de comparaciones ml-
un minuto, al cabo del cual, se retira del laberinto tiples Holm Sidak. El nivel de significancia fue esta-
y se deja en una caja plstica por cinco minutos blecido en una probabilidad menor o igual a 0.05
antes de seguir con el siguiente ensayo. Si pasa- en todos los casos.
Adicionalmente, la comparacin entre el ltimo F (7,71)= 4,610; p <0,001 para el grupo AI. Para
ensayo de entrenamiento y la prueba sin caja no ambos grupos, el anlisis pos hoc mostr diferen-
mostr diferencias significativas para ninguno de los cias significativas entre los ensayos 1 y 8. Una
grupos (t7 = -0,130; p= 0,900 para el grupo AL; t8 prueba t comparando las latencias de los grupos
= -1,102; p = 0,302 para el grupo AI). AL y AI en el ensayo 1 no mostr diferencias signi-
En la figura 3 se pueden observar los errores ficativas (t 13 = 1,536; p = 0,148).
de exploracin de agujeros durante la sesin de Adicionalmente, la comparacin entre el ltimo
entrenamiento. El anlisis de varianza para medi- ensayo de entrenamiento y la prueba sin caja no
das repetidas mostr reducciones en el nmero de mostr diferencias significativas para ninguno de los
errores a lo largo de los ensayos para ambos gru- grupos (t 7 = -0,837; p= 0,430 para el grupo AL; t 8
pos, F (7,61)= 7,740; p < 0,001 para el grupo AL y = 0.000; p = 1,000 para el grupo AI).
Figura 3. Promedio ( SEM) de errores de agujero durante la fase de entrenamiento y prueba con
caja. Smbolos: () Diferente significativamente del ensayo 1 para los dos grupos. (p<0.05).
Para la distancia recorrida en centmetros du- ciones planeadas no muestran diferencias signifi-
rante la sesin de entrenamiento el ANOVA de una cativas entre los grupos en ningn ensayo.
va para medidas repetidas refleja disminuciones Por otro lado, un ANOVA realizado con las ve-
significativas para el grupo Ad libitum (Kruskal- locidades de recorrido para cada grupo no mostr
Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks), diferencias significativas entre los ensayos para el
H(7) = 29,104; p = <0,001, a lo largo de las ocho grupo Ad libitum F (7,62) = 1,873: p = 0,092 ni
sesiones de entrenamiento, as como para el gru- para los animales del grupo AI F (7,71) = 1,168; p
po AI (Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance = 0,333. Comparaciones planeadas entre los gru-
on Ranks), H(7) = 22,401 ; p = 0,002. Compara- pos en cada ensayo solo mostraron un incremento
en la velocidad de recorrido para los animales del Finalmente, se compar el porcentaje de explora-
grupo AI en el segundo ensayo de entrenamiento cin del agujero meta en relacin con el porcen-
(t15 = -2,916; p = 0,011). taje de exploracin de los dems agujeros. En el
grupo AL se observan diferencias significativas
EVALUACIN (PRUEBA SIN CAJA) entre el porcentaje de exploracin de los agujeros
(Friedman; Chi-square (17) = 55.888, p = <0.001).
En el segundo ensayo de evaluacin, cuando la caja
Las comparaciones post hoc indican diferencias
fue retirada, los anlisis estadsticos presentados en
significativas entre la exploracin del agujero
la Figura 4 muestran que la latencia de exploracin
meta y agujeros opuestos (5,6,7,8,9; ver Figura
del agujero meta fue diferente para los dos grupos
5)(p <0.05).
(Mann-Whitney ; U = 49.000 p= 0.050).
Figura 4. Promedio ( SEM) de la latencia de exploracin de agujero meta durante la prueba sin
caja. Smbolo: (*) Diferencias significativas entre grupos. (p<0.05).
Figura 5. Promedio ( SEM) del porcentaje del porcentaje de exploracin de cada agujero durante
la prueba sin caja. 0 corresponde al agujero meta en la fase de entrenamiento.
En el grupo AI el anlisis estadstico muestra como Wu y Fitting reportan que la restriccin re-
diferencias entre agujeros (Friedman; Chi-square vierte el deterioro cognitivo producto de la edad
(17) = 41.117, p = <0.001) sin embargo la prueba (Fitting et al., 2008; Wu, Sun & Liu, 2003). Sin
post hoc indica que no existen diferencias signifi- embargo, este mismo autor observ una mejora
cativas entre el porcentaje de exploracin del agu- en el aprendizaje de una tarea espacial en ratas de
jero meta y el porcentaje de exploracin de otros seis meses de edad expuestas al mismo rgimen
agujeros. Comparaciones entre los grupos en la de restriccin calrica, mostrando que este efecto
exploracin de cada agujero no muestran diferen- no slo revierte los cambio cognitivos relaciona-
cias significativas entre los grupos. dos con la edad sino que tiene efecto en sujetos
adultos (Fitting et al., 2008). Como una explica-
cin a este fenmeno, el autor sugiere que los efec-
DISCUSIN tos observados podran ser atribuidos a un efecto
motor, relacionado con la condicin de restriccin
El presente estudio tuvo como objetivo evaluar los
calrica. Sin embargo, en nuestro estudio no se
efectos del acceso diferencial al alimento durante
observaron diferencias entre los grupos para la
el desarrollo posnatal sobre el aprendizaje de una
velocidad de recorrido, ni siquiera en el primer
tarea de aprendizaje espacial en animales expues-
ensayo en el que claramente se observan diferen-
tos a estrs agudo antes de la prueba de recupera-
cias en la latencia para encontrar el agujero meta.
cin de la tarea. Concretamente se busc responder
Nuestros resultados apuntan ms al uso de
a los siguientes interrogantes 1. Una historia de
estrategias diferentes para encontrar la caja meta
restriccin calrica temprana modifica la forma
en los animales expuestos a la restriccin calri-
en que un organismo aprende una tarea espacial?,
ca, pues una vez parecen emplear una estrategia
2. La restriccin calrica temprana modifica la
espacial que consiste en ejecutar mximo un error
forma en que animales expuestos a un estresor
de agujero, mientras que en los ensayos subsi-
antes de la evaluacin recuperan una tarea espa-
guiente exploran de manera indiscriminada agu-
cial previamente aprendida?
jeros distantes al meta. En la literatura consultada
La restriccin alimenticia cambia la forma en
no se encontraron estudios interesados en evaluar
que los animales adquieren una tarea espacial en
el tipo de estrategias de aprendizaje empleadas
el laberinto de Barnes: Los resultados presenta-
por los sujetos expuestos a una condicin de res-
dos muestran que los dos grupos aprendieron. Sin
triccin calrica y slo a partir de la observacin
embargo, los animales expuestos a la condicin
de ayuno intermitente presentan un nivel ms bajo del recorrido no es posible concluir qu tipo de
para las medidas de latencia y errores de agujero, estrategia usan los animales pero este puede ser el
mostrando adems latencias en general ms bajas inicio de un anlisis mas detallado y de una posi-
durante la sesin. Los sujetos al momento de la ble medicin del fenmeno.
evaluacin comportamental llevaban cuatro das Los animales expuestos a restriccin calrica
en condiciones de alimentacin ad libitum por lo durante la edad temprana no tienen una mejora
tanto esta diferencia es producto de la historia de en la recuperacin de la tarea de aprendizaje es-
restriccin calrica en edad temprana y no un fac- pacial al ser expuestos a un estresor agudo antes
tor motivacional primario, de la forma en que es de la evaluacin. A diferencia de lo observado en
utilizado en otros paradigmas como el laberinto la fase de adquisicin, no se encontraron diferen-
radial o el condicionamiento operante. cias significativas en el comportamiento de los
Como ya se mencion, la mayora de los estu- animales expuestos al ayuno intermitente con re-
dios en los que se manipula el rgimen alimentario lacin a los animales control en la fase de recupe-
evalan sus efectos en el envejecimiento. Es as racin de la tarea espacial. Aparentemente, la
historia de restriccin calrica no afect la res- diante la persistencia en la exploracin del aguje-
puesta de estos animales ante el estresor en esta ro meta. En el paradigma de Morris slo se reali-
tarea espacial. El da siguiente al entrenamiento za una prueba sin la plataforma que evala la
los animales de los dos grupos retienen la tarea de preferencia espacial (de Quervain, Roozendaal &
aprendizaje espacial, pues no se observan diferen- McGaugh, 1998; Morris, 1981). En este estudio
cias significativas para la latencia de llegada al observamos que una historia de ayuno intermi-
agujero meta ni para los errores de agujero en la tente desde la edad temprana cambia la forma en
prueba con caja. En el segundo ensayo de evalua- que los animales retienen la ejecucin en una ta-
cin, esta vez sin la caja meta emplazada en el rea espacial pero no la retencin de una preferen-
agujero, se observan diferencias entre los grupos, cia espacial. En este estudio vemos cmo una
siendo que los animales expuestos a la condicin historia de restriccin alimenticia desde la edad
de ayuno intermitente emplearon ms tiempo en temprana puede cambiar la forma en que los suje-
encontrar el agujero meta en comparacin con los tos responden a un estresor, ya que la restriccin
animales control. Por otro lado, no se encontraron de movimiento durante cuatro horas no alter la
diferencias significativas en el porcentaje de ex- recuperacin de la tarea espacial. En otros estu-
ploracin del agujero meta ni en la exploracin dios en los que se utilizan paradigmas distintos
general de los agujeros. Estos resultados concuer- de aprendizaje espacial (laberinto acutico de
dan parcialmente con lo descrito por otros auto- Morris o laberinto radial), se ha observado que en
res, quienes han descr ito que en tareas de la restriccin calrica el estrs puede generar un
aprendizaje espacial y no espacial los animales deterioro en la retencin de la ejecucin de la ta-
expuestos a restriccin calrica mejoran la adqui- rea espacial. Esta discrepancia puede ser explica-
sicin de la tarea aun cuando su desempeo es da por las caractersticas mismas del instrumento
similar al grupo Ad libitum en la evaluacin (Fit- utilizado. Ha sido descrito que los niveles de estrs
ting et al., 2008; Wu et al., 2003). Por ejemplo, inducidos por el laberinto circular de Barnes son
Lukoyanov y colaboradores observaron que la res- significativamente inferiores a los inducidos por
triccin calrica durante 3 meses mejora el apren- el laberinto acutico de Morris, en el cual las ma-
dizaje tiempo-lugar en el laberinto acutico de nipulaciones realizadas con distintos tipos de
Morris aunque durante la prueba sin la platafor- estresores pueden sumarse al carcter aversivo de
ma los animales de los grupos Ad libitum y res- esta tarea (Coburn-Litvak, Pothakos, Tata,
triccin se comportan igual (Lukoyanov, Pereira, McCloskey & Anderson, 2003; McLay, Freeman &
Mesquita & Andrade, 2002). En estudios con ani- Zadina, 1998; Williams et al., 2003). Un estudio
males de avanzada edad se ha observado algo si- reciente evalu empricamente la diferencia en las
milar, siendo que la restriccin calrica mejora la concentraciones de corticosterona liberadas a partir
adquisicin de la tarea pero parece afectar el des- de la experiencia en el laberinto acutico de Morris
empeo en las pruebas de retencin en el laberin- y en el laberinto de Barnes, encontrando no solo
to de Morris (Fitting et al., 2008). Ha sido descrito que el primero induce una mayor liberacin de
que el laberinto circular de Barnes tiene una ven- corticosterona, sino adems, un efecto acumulativo
taja frente al Laberinto Acutico de Morris en la de dicha liberacin cuando se suma a un paradig-
fase de evaluacin, pues permite estudiar la reten- ma de induccin experimental de estrs por res-
cin del aprendizaje espacial mediante dos ensa- triccin motora (Harrison, Hosseini & McDonald,
yos por separado: uno con caja (PCC) que muestra 2009). De esta forma, es posible que los efectos
la retencin de la ejecucin una vez finalizado el observados tras la experiencia de restriccin cal-
entrenamiento y otro sin caja (PSC) que seala la rica en los trabajos reportados en la literatura se
retencin de la ubicacin espacial de la meta me- deban a un efecto acumulativo del estrs y de la
tarea de aprendizaje espacial en el laberinto acu- Fontan-Lozano, A., Saez-Cassanelli, J. L., Inda, M. C., de los
Santos-Arteaga, M., Sierra-Dominguez, S. A., Lopez-Lluch,
tico de Morris. Debido a que, hasta donde sabe- G., et al. (2007). Caloric restriction increases learning
mos no existen trabajos en los que se haya utilizado consolidation and facilitates synaptic plasticity through
mechanisms dependent on NR2B subunits of the NMDA
el laberinto circular de Barnes para evaluar los efec-
receptor. The Journal of Neuroscience, 27(38), 10185-10195.
tos de la historia de restriccin calrica y el estrs,
Halagappa, V. K., Guo, Z., Pearson, M., Matsuoka, Y., Cutler, R. G.,
no es posible llegar a conclusiones ms definiti- Laferla, F. M., et al. (2007). Intermittent fasting and caloric
vas. Igualmente, se hace necesario comparar estos restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the
triple-transgenic mouse model of Alzheimers disease.
resultados con grupos expuestos a la situacin de Neurobiology of Disease, 26(1), 212-220.
aprendizaje bajo condiciones de ayuno intermiten- Harrison, F. E., Hosseini, A. H. & McDonald, M. P. (2009).
te y ad libitum sin presencia del estresor. Endogenous anxiety and stress responses in water maze
and Barnes maze spatial memory tasks. Behavioural Brain
Estudios posteriores sern necesarios para al-
Research, 198(1), 247-251.
canzar una mejor comprensin de la interaccin
Lukoyanov, N. V., Pereira, P. A., Mesquita, R. M. & Andrade, J. P.
entre estos dos fenmenos aplicados antes de las (2002). Restricted feeding facilitates time-place learning in
pruebas de recuperacin en el laberinto circular adult rats. Behavioural Brain Research, 134(1-2), 283-290.
Brain research. Developmental Brain Research, 147(1-2), 163- Wu, A., Sun, X. & Liu, Y. (2003). Effects of caloric restriction on
175. cognition and behavior in developing mice. Neuroscience
Letters, 339(2), 166-168.
Witte, A. V., Fobker, M., Gellner, R., Knecht, S. & Floel, A. (2009).
Caloric restriction improves memory in elderly humans.
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 106(4),
1255-1260.