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CURSO MICROBIOLOGA.
Directora Curso:
La prctica del laboratorio se realiz los das 16, 17 y 18 de Mayo del 2.015, en los
laboratorios, de la sede principal de la UNAD Jos Celestino Mutis, en la ciudad de Bogot.
3. MATERIALES Y METODOLOGA.
Composicin
Lactosa 10.0
Peptona 10.0
El mtodo del Nmero ms probable (NMP) (Most probable number - MPN - en ingls),
tambin conocido como el mtodo de los ceros de Poisson, es una forma de obtener datos
cuantitativos en concentraciones de elementos discretos a partir de datos de incidencia
positiva/negativa. Es una estrategia eficiente para estimar densidades de poblacin que se
emplea cuando una evaluacin cuantitativa de elementos individuales no es factible.
Para el presente informe se presentan los datos de los grupos 1, 2 y 3 en la siguiente tabla.
Diluci
NMP
n
10 -5 3
10 -6 3
10 -7 3
2
Dilucin NMP
-5
10 0
-6
10 0
10 -7 0
Dilucin NMP
10 -5 0
10 -6 0
10 -7 0
De acuerdo a la tabla anterior se puede observar que el grupo 1 tiene resultados positivos
para la presencia de coliformes ya que el caldo lactosado verde bilis brillante reacciona con
el grupo coliforme con la fermentacin de la lactosa (turbidez) con produccin de cido y
gas (Burbuja).
Analizando la tabla de NMP se busca el nmero 3-3-3 dado que es positivo en las tres
diluciones y aparece que es > 1100 lo cual es positivo para la presencia de coliformes dado
que la muestra estaba inculada con cepas de E. coli
Medio SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y
de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de
la familia Enterobacteriaceae.
Siembra
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin
profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe
inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad
del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice
en lnea recta.
Incubacin
Durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis.
Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.
Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de
la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de
siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o
en todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo
de Kovacs o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
MUESTRA
SIM RESULTADO RESULTADO
GRUPO INICIAL
S I M
1 E. coli - + +
2 Salmonella
+ - +
enteritidis
3 E. coli - - -
4 Enterobacter
- - +
aerogenesis
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia
y alguna cepas de Morganella spp.
2 Salmonella enteritidis -
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los
nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono
fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las
enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato
de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de
bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o
menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli -
4 Enterobacter
+
aerogenesis
Salmonella enteritidis es positiva para esta prueba dado que se
observ crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.
1 E. coli + + + - -
2 Salmonella
+ + - + +
enteritidis
3 E. coli - - - - -
4 Enterobacter
+ + + + -
aerogenesis
Agar OF
Medio de cultivo utilizado en las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana
en base al metabolismo oxidativo-fermentativo de las bacterias Gram negativas,
a la movilidad y produccin de gas.
Siembra
Inocular, por cada hidrato de carbono que se use y para cadamicroorganismo en
estudio, 2 tubos conteniendo el medio O.F. y el mismo hidrato de carbono.
Rotular un tubo con la inscripcin: Abierto y otro tubo con la inscripcin:
Cerrado (sellado).
Se debe informar: produccin de cido (A), cido con gas (AG), alcalino (K) o sin
cambio (-).
Tambin, puede informarse si el organismo es mvil, cuando crece lejos de la
lnea de inoculacin.
MUESTRA RESULTADO
GRUPO OF
INICIAL
1. E-coli +
2. Salmonella enteritidis +
3. E. coli -
4. Enterobacter aerogenesis +
El medio basal O.F., fue desarrollado por Hugh y Leifson, para evidenciar la
importancia del significado taxonmico del metabolismo oxidativo-fermentativo
de los hidratos de carbono por las bacterias Gram negativas.
Prueba de UREA.
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad
uresica.
Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la
familia Enterobacteriaceae.
Siembra
Sembrar un inculo denso a partir de un cultivo puro de 24 horas.
Incubacin
A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12,24 y 48 horas de
incubacin.
Para aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta
72 horas.
Resultados
MUESTRA RESULTADO
GRUPO UREA
INICIAL
1 E. coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
La prueba dio negativa para urea al parecer porque las bacterias de estudio son
descomponedoras de urea pero lentas ya que tericamente se recomienda
visualizar a las 72 horas y solo se revis a las 24 horas. Aunque comparado con
la muestra inicial se observan cambios en la coloracin como turbiedad y otras
que se tornan rosadas.
MR-VP Medio
Medio utilizado para la realizacin del ensayo de Rojo de Metilo y Voges
Proskauer.
Es particularmente til para la clasificacin de enterobacterias.
Siembra
Por inoculacin directa, a partir del cultivo en estudio.
Incubacin
En aerobiosis, a 35-37C por 3 das.
Resultados
Aadir 0,6 ml de alfa naftol al 5% en alcohol etlico absoluto y 0.2 ml de hidrxido de potasio
al 40% a 2.5 ml de cultivo. Agitar vigorosamente el tubo, y dejar a temperatura ambiente
durante 10-15 minutos. Observar el color de la superficie del medio.
Microorganismo Crecimiento RM VP
1 E-coli -
2 Salmonella enteritidis +
3 E. coli +
4 Enterobacter aerogenesis -
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
10 -5 -
Para esta prueba se sembr de la dilucin 10-5 del suelo y dio negativo
por lo cual se describe la ausencia de Pseudomonas aeruginosa.
1 E.coli -
2 Salmonella
+
enteritidis
3 E. coli +
4
Enterobacter -
aerogenesis
En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes
necesarios para el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de
pigmentos, la concentracin de fosfatos estimula la produccin de fluorescena e
inhibe la produccin de piocianina y piorrubina.
YDCA
indican los componentes del medio: Yeast (levadura), calcium carbonate
(carbonato de calcio), dextrosa y agar.
Resultados
GRUPO VDCA MUESTRA INICIAL RESULTADO
1 E-coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
1 E-coli -
2 Salmonella
-
enteritidis
3 E. coli -
4 Enterobacter
-
aerogenesis
Agar ENDO
Desarrollado para el recuento de coliformes totales en agua, bebidas y otras
muestras por medio de la tcnica de filtracin por membrana.
Siembra
Filtrar la muestra a analizar. El volumen que se filtra depende de la probable
contaminacin de la muestra.
- Embeber la almohadilla con el caldo m-Endo hasta la saturacin (la cantidad de
medio de cultivo depende del grado de absorcin de la misma).
- Apoyar la membrana filtrante sobre la almohadilla embebida con el medio de
cultivo.
Incubacin
Incubar las placas a 35-37 C por 24 horas. Ocasionalmente, los microorganismos
no coliformes pueden producir brillo metlico. Para confirmar las colonias
sospechosas, transferirlas a tubos con caldo verde brillante y bilis al 2%, con
campanitas de Durham. Incubar los tubos por 24-48 horas a 35-37 C. Los
coliformes habrn producido gas por fermentacin de la lactosa, al cabo de ese
perodo.
Resultados
El recuento debe realizarse en aquellas placas que contengan entre 20 y 80
colonias y no ms de 200, ya que se trata de un medio selectivo.
La concentracin microbiana debe expresarse como el nmero de
microorganismos presentes en 100 ml de muestra.
ENDO ENDO BACTERIA
ENDO ENDO 10-5
Grupo Bacteria CONOCIDA
10 E-5
Conocida
1 E-coli
+ -
2 Salmonella
enteritidis - -
3 E. coli
- -
4
Enterobacter - -
aerogenesis
Luego se introduce, por capilaridad entre la cmara y el cubre, el lquido con las clulas a
contar, generalmente tras una dilucin previa; puesto que la cmara tiene dos zonas esto
permite hacer dos recuentos simultneamente. Se observa la retcula al microscopio con el
aumento adecuado y se cuentan las clulas.
A partir del nmero de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite el
campo de la retcula, se calcula la concentracin de clulas en la muestra lquida aplicada.1
Reticulo Neubauer.jpg
En la retcula central, la cmara de Neubauer tiene un cuadrado primario que contiene
nueve cuadrados secundarios, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados
terciarios. El cuadrado secundario central contiene no 16, sino 25 cuadrados, cada uno de
ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central
se cuentan los hemates, utilizando slo los cuadrados de los bordes del terciario central y
uno de los centrales. En los secundarios de los bordes superiores e inferiores de la cmara
se hace el recuento leucocitario.
Grupo 2
Grupo 1 Cuadrcula 1
Cuadrcula 1 35 39 35 53
26 2 6 5 40 29 41 41
5 10 7 9 37 42 28 31
-- - - - 33 25 40 31
9 15 18 52
40 27 31 66 Total 580
Total 164 Cuadrcula 2
Cuadrcula 2
39 29 42 38
4 - - 9
- - - -
33 32 33 44
- - - - 28 25 31 30
9 15 18 52 27 41 42 28
16 18 28 6
Total 81 Total 537
Cuadrcula 3 Cuadrcula 3
1 15 4 3 25 37 35 33
1 - 9 - 32 27 25 25
1 1 11 9 30 30 38 29
- 5 4 1 34 32 30 30
3 21 28 4
Total 56
Cuadrcula 4
Total 492
18 13 10 16 Cuadrcula 4
6 10 7 4 35 36 37 29
5 9 26 10 34 81 29 30
2 2 4 3 29 30 35 31
31 34 47 34 32 34 28 -
Total 141
Total 513
= 164+81+56+141= 442
Promedio= 110,5 = 580+537+492+513= 2.122
UFC/gr= 110,5*6*10= 6.630
Promedio= 530.5
UFC/gr= 530.5*6*10= 31.830
Todos los hongos son organismos eucariotes y poseen al menos nucleo y membrana
nuclear, retculo endoplsmico, mitocondrias y aparato secretor. Los hongos crecen en dos
formas bsicos: levaduras y mohos. Los mohos son hongos filamentosos multicelulares
cuya forma y estructura tenida en cuenta a partir de sus caractersticas macro y
microscpicas permiten su clasificacin. Macroscopicamente se tendrn en cuenta las
caractersticas de las colonias en los medios de cultivo. Microscopicamente lo ser la
existencia y caractersticas de sus estructuras.
Su forma es filamentosa y
de tipo tubular con paredes
celulares, pudiendo
presentar tabiques (hifas
septadas) o no (hifas
aseptadas) y que contienen
en su interior citoplasma
que viene a ser una
sustancia similar a la clara
de huevo junto con
pequeas estructuras con
morfologas y funciones
determinadas denominadas
organoides.
CONCLUSIONES
Las pruebas bioqumicas sirven para hacer identificacin de familias sin embargo la
identificacin hasta especie es muy compleja.
La cmara de neubauer se usa para hallar densidad poblacional pero deben hacerse varia
repeticiones para sacar promedios ya que se observaron diferencias significativas en el
ejercicio que se hizo.
BIBLIOGRAFA.
Cerrato, R. F., & Alarcn, A. (2002). La microbiologa del suelo en la agricultura sostenible.
Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Programa Editorial Universitario.