Laboratorio N5: Produccin de

etanol a partir de
Sacharomyces cerevisiae
inmovilizada en alginato de
calcio.
1 1
Paula Camila Baron Tovar , Pamela Mariduea Muoz
1
DEPARTAMENTO DE INGENIERA QUMICA, UNIVERSIDAD DE LA SABANA.

1. Resumen: obtener el nmero de clulas por unidad de

En esta prctica de laboratorio se llev a cabo, volumen ( 3, 28 x 106clulas /mL )
produccin de etanol, con un rendimiento del
1,4 % a partir de la fermentacin de glucosa 1.1 Abstract:
usando Sacharomyces cerevisiae inmovilizada In this lab it was performed, ethanol production,
en alginato de calcio. with a yield of 1.4% from glucose fermentation,
La inmovilizacin celular se realiz mediante using Saccharomyces cerevisiae immobilized in
atrapamiento, (los organismos se colocan en calcium alginate.
matrices polimricas, con el fin de que la Cell immobilization by entrapment was carried,
fermentacin no requiere una etapa de (the organisms are placed in polymeric matrices,
centrifugacin o filtracin para remover la so that the fermentation does not require a filtration
biomasa, (este procedimiento permitir la or centrifugation step to remove the biomass, (This
reutilizacin de la biomasa);dicho proceso de procedure will allow the reuse of biomass), said
inmovilizacin se realiza goteando una immobilization process is performed by dripping a
solucin de alginato de calcio al 3% p/v, que solution of calcium alginate 3% w / v, containing
contiene levaduras (Sacharomyces cerevisiae) yeast (Saccharomyces cerevisiae) in a cooled
en una solucin refrigerada de cloruro de solution of 0.1 M calcium chloride and pH 4.5 for
calcio 0,1 M y un pH de 4,5 para un optimal growth of yeast. Alginate forms small areas
crecimiento ptimo de la levadura. El alginato where traps the yeast.
forma pequeas esferas en las que atrapa a On the other hand mechanisms used in practice
las levaduras. for measuring the progress of the reaction were:
Por otra parte los mecanismos utilizado en la determination of sugars using DNS (with this test,
prctica para la medicin del avance de la a reducing sugar concentration between 2.604 and
reaccin fueron: la determinacin de azcares 0.027 is obtained according to time) and a curve
por medio de DNS, (con dicha prueba se calibration using the refractive index to calculate
obtuvo una concentracin de azcares the concentration of ethanol produced (4.5% v / v).
reductores entre 2 ,604 y 0,027 segn el tiempo ) y Finally took place a process of cell counting
una curva de calibracin mediante el ndice de chamber Neubauer in a liquid medium, all in order
refraccin para calcular la concentracin de to obtain the number of cells per unit volume (
etanol producido (4,5 %v/v). 3, 28 x 106cell /mL )
Por ltimo se llev a cabo un proceso de
conteo celular en la cmara de Neubauer en Aunque las clulas inmovilizadas pueden sufrir
un medio lquido, todo con la finalidad de algunas limitaciones en necesario escoger una
concentracin adecuada del polmero de
Key words: Yeast cell, calcium alginate, inmovilizacin para prevenir que las clulas no se
Neubauer chamber, immobilization, ethanol, escapen a travs de la red de alginato de calcio.
fermentation, Saccharomyces cerevisiae, (Franca, Lopes, & Vasconcelos, 2004).
biomass, entrapping. En la industria de alimentos, el uso de clulas
enteras inmovilizadas, ha ganado considerable
Palabras claves: Levadura, clula, alginato atencin en los procesos industriales con el paso
de calcio, cmara de Neubauer, del tiempo. Algunos de los sistemas celulares
inmovilizacin, etanol, fermentacin, inmovilizados que ahora se utilizan industrialmente
Sacharomyces cerevisiae, biomasa, son para la produccin u elaboracin de bebidas
atrapamiento. fermentadas, produccin de jarabes de fructosa a
partir de la glucosa y la produccin de
2. Introduccin: aminocidos estereo especificados. Esto es
Las levaduras son los microorganismos debido a que estn dentro de una amplia gama de
caracterizados por ser los responsables de los inters en la rama de la industria, por sus ventajas
procesos fermentativos, como lo son el vino, tcnicas, econmicas y biolgicas que lleva
pan, cerveza, etc. Encontrndose las consigo. (Williams & Munnecke).
levaduras dentro de los hongos unicelulares. Este mtodo, de hacer uso de las clulas
Hay que tener en cuenta que las levaduras no inmovilizadas, se ha considerado un mtodo
intervienen directamente en el proceso importante ya que permite el alto nivel de
fermentativo, sino que estos microorganismos elaboracin de metabolismos por parte de las
segregan enzimas que actan sobre el azcar, clulas, as mismo, permite el uso de las clulas
para la produccin de etanol y dixido de por largos periodos de tiempo, aumentando la
carbono (Plans, 2015). duracin de estas. (Matiz, Torres, & Poutou,
2002).
La etapa de fermentacin es central en el
proceso general de produccin de etanol de Actualmente, se est investigando cada da ms
combustible ya que representa la acerca de la produccin de productos qumicos y
transformacin real de las materias primas la produccin de combustibles, a travs de
acondicionadas en el producto principal, el procesos microbianos, debido a la escasez de
alcohol etlico, utilizando bioagentes tales petrleo y el aumento de costo de este mismo. Es
como levadura u otro microorganismo por eso que se evala y se desarrolla un sistema
productor de etanol (Cardona, Sanchez, & para la produccin de etanol como fuente de
Gutirrez, 2010). Los microorganismos de combustible utilizando un proceso de clulas
mayor inters para la produccin de etanol en enteras inmovilizadas. (Williams & Munnecke).
la industria son, Saccharomyces spp,
Zymomonas mobilis (Zm) y La dilucin de una suspensin de clulas, en el
Kkluyveromyces spp, los cuales han caso de este laboratorio, el uso Saccharomyces
despertado inters por su consumo rpido de cerevisiae es un procedimiento que permitir
glucosa en procesos de fermentacin y bajas disminuir la carga de clulas en un intervalo que
de pH en el medio en que se encuentran. se pueda contar en la cmara de Neubauer de
(Matiz, Torres, & Poutou, 2002) manera cmoda y lograr reportar de manera
factible el nmero de clulas que se encuentran en
Para un mejor beneficio de las levaduras, se dicha suspensin celular. Esta tcnica de conteo
lleva a cabo el proceso de inmovilizacin por celular permitir el recuento de las clulas
atrapamiento en diferentes matrices encontradas en el campo y poder determinar el
polimricas como por ejemplo, la de alginato promedio de clulas contenidas en la suspensin
de calcio, con el fin de eliminar la inhibicin de alginato y su concentracin (Marcos, 2013)
causada por altas concentraciones de sustrato
y la posibilidad de reutilizarlas con clulas en
varios ciclos sin necesidad de recuperarlas.
3. Materiales y metodologa: coloca en horno a 60C para luego determinar la
cantidad de carbonato de calcio y posteriormente
Se prepara una solucin de 50 mL de alginato por estequiometra el dixido de carbono.
de sodio al 3% p/v, mezclando el alginato hasta
que est solubilizado. Debe agregarse Determinacin de azcares reductores por
lentamente el alginato al agua, para evitar la medio de cido dinitrosaliclico (DNS)
formacin de grumos. A partir de esto, se realiza Para la determinacin de azcares reductores por
una esterilizacin por 20 min, mediante medio de cido dinitrosaliclico, se debi
calentamiento a bao Mara (92C), este se deja preparar una curva estndar de la siguiente forma:
reposar a temperatura ambiente hasta que Se colocan en 6 tubos de ensayo las disoluciones
alcance una temperatura de 40C. que se encuentran en la siguiente tabla.
Se pesa 1,5g de levadura, se suspende en 25
mL de agua destilada estril y se mezcla con la
solucin de alginato antes preparada. Todo esto
se realiza al lado de un mechero para evitar
contaminacin en la mezcla. Se coloca la
suspensin en una jeringa estril y se descarga
de manera lenta (gota gota) la suspensin en la
solucin de cloruro de calcio 0,1 M en agitacin.
Se depositan 10 gotas de alginato de sodio en
10 mL de solucin salina isotnica estril, lo
Tabla N1: volmenes usados en la
transferimos a un baln aforado de 25 mL y se
preparacin para la curva estndar para
lleva al aforo con solucin salina; con esta se
determinar los azcares reductores por medio
lleva a cabo el conteo celular en cmara de
de cido dinitrosaliclico.
Neubauer.
Cuando se forman las esferas, se espera unos
Se toman 50l de la solucin y son colocados en
60 minutos hasta que endurezcan, se procede a
tubos de ensayo, luego se adiciona 450l de agua
retirarlas de la solucin de cloruro de calcio,
destilada.
hacindolas pasar por un colador al lado del
A todos los tubos, incluyendo los de la curva de
mechero; se llevan a un Erlenmeyer con
calibracin se le adicionan 500l de DNS
desprendimiento, que contenga 100 mL de
(Solucin A), despus llevamos los tubos a
medio de cultivo estril (Glucosa: 100 g/L,
ebullicin durante 5 minutos e inmediatamente se
KH2PO4: g/L, MgSO4*7H2O: 1 g/L, ajustar el pH a
pasan a agua-hielo.
4,5.
Adicionar 5ml de agua destilada, se agita y se
El medio se esteriliza a 15 psi por 15 minutos)
deja en reposo durante 15 minutos, por ltimo se
con agitacin, el cual se conecta a una
procedi a medir la absorbancia de cada muestra
manguera que burbujea solucin de hidrxido de
a 540 nm.
calcio (0,1%p/v). Se coloca el Erlenmeyer en un
agitador orbital a 200 rpm y 30C.
Curva de calibracin de etanol mediante
Tomamos una muestra de 1 mL cada dos horas
determinacin de ndice de refraccin.
para medir azcares reductores y concentracin
de etanol. Dejamos fermentar 17 horas y al
Para la cuantificacin del etanol, se debi preparar
terminar este tiempo, tomamos la solucin de
una curva de calibracin a partir de las siguientes
hidrxido de calcio y filtramos el precipitado. Se
disoluciones.
 todos los cuadros. En la cmara se visualizan 25
cuadros, de los cuales se cuentan las clulas
presentes en 5 campos, generalmente se cuentan
los cuadros de las esquinas y el central, lo que
garantiza un conteo aleatorio.
Nota N 2: Se recomienda realizar el conteo
siguiendo las flechas para evitar que se cuenten
las clulas dos veces o no que no se cuenten.

4. Resultados y anlisis de resultados:

En primera instancia se procede a calcular la
Tabla N2: volmenes usados para la concentracin de etanol presente en las
preparacin de la curva de calibracin. diferentes muestras de laboratorio, las cuales
fueron tomadas a diferentes horas desde que la
Cmara de Neubauer fermentacin dio inicio (Tiempo cero, 4:30 pm del
Usamos esta cmara para conteo celular, para viernes, 8:30 am, 9:00 am del sbado y 7:20 am
esto debemos tener en cuenta:
del dia lunes );para calcular dicha concentracin
- Limpiar la cmara y la laminilla de cuarzo
se emplea una curva de calibracin de etanol
suavemente con alcohol.
mediante determinacin del ndice de refraccin.
- Revisar la laminilla de cuarzo que no
Los datos obtenidos de los ndices de refraccin
debe estar desbordada o quebrada.
para la curva de calibracin del etanol, son
- Colocar la laminilla de cuarzo sobre la
reportados a continuacin:
cmara en forma vertical, esta debe
quedar centrada.
- Proceder a llenar la cmara. Se Soluci concentraci Indice de
n N n (%v/v) refraccion.
recomienda llenarla con micropipeta
pequea o con una jeringa ya que la 1 0 1,3330
cmara se llena con una gota. El llenado
debe ser continuo en un solo intento. 2 2 1,3337
Nota N 1: la cmara no puede quedar seca 3 4 1,3344
esto se detecta porque en las esquinas del
recuadro de llenado se ven porciones secas. 4 6 1,3351
Tampoco se debe inundar, la apariencia en la
5 8 1,3357
cmara es de lquido abundante en las
terminaciones del recuadro. 6 10 1,3366
Conteo: para realizar el conteo, las clulas se
cuentan cuadro por cuadro y se hace un total. 7 12 1,3391
Se pasa al ocular de 40X, donde se visualiza
8 14 1,3413
cada uno de los campos y con ayuda del carro
del microscopio se desplaza la cuadrcula hasta 9 16 1,3427
contar en
 Y 1,3323
x= 0,0006 (2)
10 18 1,3439 Mediante esta expresin se puede calcular la
concentracin de etanol, en las muestras a
11 20 1,3442 travs del tiempo.
Tabla N3: Reporte de resultados de ndice de refraccin Se debe tener en cuenta que los ndices de
para la curva de calibracin de etanol. refraccin reportados en la tabla N4 para las
Los resultados reportados en la tabla N3 son graficados primeras mediciones, hacen referencia a la
a continuacin: concentracin de azcares reductores
presentes en la muestra.
Por tanto no puede hablarse de una
concentracin de etanol en el tiempo cero, ya
que en este tiempo la fermentacin no haba
iniciado.
Nuestra Tiempo Indice de Concentracin
N (h) refraccion. (%v/v)

1 0 1,3465 23,6667

2 1/2 1,3442 19,8333

3 16 1,3366 7,1667

4 17 1,3366 7,1667
Grfica N1: Curva de calibracin de etanol (ndice de
refraccin vs concentracin) 5 63,20 1,3350 4,5000

Tabla N4: Reporte de resultados de

El ndice de refraccin medido para las muestras en el concentracin (azcares reductores o etanol)
tiempos es reportado a continuacin: para muestra fermentada, en el tiempo.
La concentracin determinada para la
Nuestra Tiempo Indice de refraccion. primera muestra, en el tiempo cero, es de
N (h) 23,6667 %v/v, este dato hace referencia a la
concentracin de azcares reductores, ya
1 0 1,3465 que en el tiempo cero la fermentacin no ha
tenido inicio ; en contraste si se analiza la
2 1/2 1,3442
concentracin obtenida para la ltima
3 16 1,3366 muestra (la cual fue tomada el lunes de la
semana posterior al inicio de la fermentacin,
4 17 1,3366 63 horas y 20 minutos desde el inicio) que es
de 4,5 %v/v, se puede analizar que este valor
5 c 1,3350 muy posiblemente hace referencia a la
Tabla N4 : Reporte de resultados de ndice de refraccin concentracin de etanol obtenido en la
para muestra fermentada, en el tiempo. fermentacin, ya que despus del tiempo
cero la actividad fermentativa inicia; por otra
Con la curva de calibracin se obtiene la siguiente parte una concentracin 4,5 % v/v no afecta
ecuacin Y = 0.0006 x + 1, 3323(1) , donde x representa la la actividad fermentativa de la levadura, por lo
concentracin de etanol y Y el ndice de refraccin, por cual la misma, (con un suministro de
tanto si se despeja x (concentracin), se obtiene la azcares) podra continuar con la produccin
siguiente expresin: de alcohol.
En la literatura se reporta que a una azcares reductores.
concentracin de 3,15 g de sacarosa/L se Con los datos reportados en la tabla N5 se procede a
alcanza una concentracin de etanol despus realizar el grfico de absorbancia vs concentracin,
de 30 horas de 0,47% (v/v). (curva de calibracin).
(Sossa-Urrego, 2008).
Por tanto se puede realizar una comparacin
simple con 100 g/ L se debi obtener una
concentracin de 15%v/v en 30 horas, y se
obtuvo 4,5 %v/v en 63 y 20 minutos, esta
concentracin puede variar por la naturaleza
de la levadura (si esta modifica o no), por la
concentracin del sustrato ya que el mismo
es el precursor de la reaccin, es decir si el
sustrato se agota la produccin de etanol se
detendr, el pH puesto que a pHs muy bajos
la fermentacin ser detenida y la aireacin,
debido a que para la produccin de etanol se
Grfica N2: Curva de calibracin para determinacin
requiere un medio anaerobio, la presencia de
de azcares reductores (Glucosa).
oxgeno pudo haber influido en la
concentracin de etanol obtenida.
Haciendo uso de la ecuacin obtenida en el grfico
Determinacion de azucares reductores por
N2 Y = 1, 0793 x 0, 016(3) se procede a calcular la
medio de cido dinitrosaliclico (DNS):
La cuantificacin de azcares reductores se concentracin de azcares reductores, despejando la
basa en la reaccin de los mismos con el variable x, los resultados obtenidos se muestran a
cido 3,5-dinitrosalicilico para generar continuacin:
3-amino-5-nitrosaliclico, (de coloracin
marrn). Nuestra Tiempo Absorbancia Concentracin
Para esta determinacin ,se prepara una N (h) (nm) (mg/ml)

curva patrn a la cual se le ley la 1 0 2,795 2,604

absorbancia a 540 nm, obteniendo los
siguiente resultados: 2 1/2 2,66 2,479

3 16 0,015 0,029
Solucin concentracin Absorbancia
N (mg/ml) (nm)
4 17 0,015 0,029

B - - 5 c 0,013 0,027

1 0,2 0,258 Tabla N6: Reporte de resultados de concentracin

azcares reductores.
2 0,4 0,425
Analizando los resultados reportados en la tabla N6
3 0,6 0,705 podemos ver una disminucin en la concentracin de
azcares reductores; esta disminucin en la
4 0,8 0,854 concentracin era esperada ya que el sustrato
(glucosa) se consume para la generacin del producto
5 1,0 1,102
(etanol), adicionalmente se debe tener en cuenta que
6 1,2 1,331 no haba ninguna otra fuente de hidratos de carbono,
que permitiera la regeneracin de los azcares
Tabla N5: Resultados de absorbancia- curva reductores.
de calibracin para determinacin de
Uno de los objetivos primordiales de la prctica, cantidad de carbonato de calcio obtenido.
era la determinacin del rendimiento en la C aCO3 obtenido = (50, 8465 0, 7448 0, 7473
produccin de etanol. 49, 2575) g = 0, 0959 g

Teniendo en cuenta que: Una vez se calcula los gramos de carbonato de

calcio obtenidos, se procede a efectuar una relacin
RENDIMIENTO REAL
% Rendimiento = RENDIMIENTO TERICO x 100(4) estequiomtrica, lo cual permite calcular la cantidad
de dixido de carbono producido:
1 mol CaCO3 1 mol CO
Primero se procede a calcular el rendimiento 0, 0959 g de CaCO3x x 1 mol CaCO2 3
100,0869 g
terico, para este clculo se tiene en cuenta que
La produccion de dioxido de carbono se relaciona
en la prctica se hizo uso de un cultivo estril que
directamente con la produccin de etanol, (segn la
contena 100 g/l de glucosa y que la produccin de
reaccin de produccin del mismo a partir de
etanol ocurre mediante la siguiente reaccin:
glucosa), por lo tanto:
C 6H 12O6 2C 2H 5OH + 2CO2 + ENERGA
2 mol de C2H5OH
= 9, 582 x 104mol de CO2x 2 mol CO2
Por tanto:

100 g glucosa 1 mol de glucosa 2 mol C H OH = 9, 582 x 104mol de C 2H 5OH

L x 180,1559 g x1 mol de2glucosa
5

1 L solucin
Con calculados los rendimientos reales y tericos
= 1, 11015 mol de etanol /L x 1000 ml x 60 ml se procede a calcular el rendimiento de la reaccin:
= 0, 066609 moles de etanol
9,582 x 104mol de etanol
% Rendimiento = x 100
0,066609 moles de etanol
El rendimiento real es calculado gracias a la
determinacin por peso de la cantidad de
carbonato de calcio obtenido; mediante la siguiente
reaccin de descomposicin a partir de calor: % Rendimiento = 1, 44%

C aCO3 CO2 + C aO Tericamente se reporta que por cada gramo de
glucosa transformada se obtiene
Material Peso (g) estequiomtricamente de 0.511 g de etanol y 0.489
g de dixido de carbono y adicionalmente que el
Vidrio de reloj 49,2575 rendimiento experimental vara entre el 90 y el 95 %
del terico, y en la industria vara del 87 al 93 % del
Papel de filtro 1 0,7473
terico (Vzquez y Dacosta, 2007).
Papel de filtro 2 0,7448
Comparando lo que es descrito en la literatura con
vidrio de reloj + papel de 50,8465 lo que se obtuvo en la prctica, se obtuvieron 0,044
filtro 1 y 2 + CaCO3 g de etanol y 0,042 g de dixido de carbono, este
resultado se debe a que el rendimiento de la
Tabla N7: Pesos de material y carbonato de
reaccin fue de 1,44%, por tanto la diferencia entre
calcio.
Entonces:
A partir de la tabla N7 podemos determinar la clulas /mL = 164 * 10000 6
1/10* # 5 = 3, 28 x10 Clulas /mL
los gramos experimentales y los gramos tericos
es muy grande.
Con este resultado se puede analizar que por cada
mL de solucin el alginato de calcio inmovilizo
Por otra parte el rendimiento de la reaccin pudo
3, 28 x106Clulas , el conteo de clulas no debera
ser afectado como ya antes se ha dicho, por el
aireamiento del proceso,y errores sistemticos cambiar a travs del tiempo y la biomasa podra ser
cometidos durante este. reutilizada.
Conteo celular en cmara de Neubauer:
Con el fin de calcular la cantidad de biomasa
(clulas) atrapada por el alginato de calcio se 5. Conclusiones:
realiza un conteo celular en la cmara de
Neubauer, se obtuvieron los siguientes resultados: 5.1) De acuerdo a la teora, la produccin u
Cuadrante N Nmero de
clulas
contadas
1 45
2 39
3 16
4 30
5 34
Tabla N8: Nmero de clulas por cuadrante,
conteo cmara de Neubauer.
Imagen N 1 : Cuadrantes en los que se realiz el
conteo de celular.
El nmero de clulas por unidad de volumen es
calculado con la siguiente frmula:
# CLULAS CONTADAS * 10000
clulas /mL = FD (5)
* # DE CUADROS CONTADOS
obtencin de etanol es mayor, cuando en el proceso
de fermentacin se usan clulas inmovilizadas; esto
se debi, a que la inmovilizacin de la levadura con
perlas de alginato de calcio permiti cambios en la
composicin de las clulas por la interaccin con el
soporte del alginato, ya que este funciona como un
catalizador activo que acelera la velocidad de la
fermentacin.
5.2) La produccin de etanol puede ser obtenida a
partir de diferentes tipos de fermentacin puesto
que el etanol es un producto metablico como
resultado de la hidrolizacin de diferentes sustratos
que contengan alto nivel de carbohidratos (Estrada
& Camacho, 2007). Se realiz la fermentacin de la
levadura Sacharomyces ya que esta presenta una
ventaja por su bajo costo para la obtencin de
etanol.
5.3) Al determinar el rendimiento experimental para
la obtencin de etanol a partir de la fermentacin de
la levadura Sacharomyces cerevisiae se obtuvo
1,44%, de acuerdo a la teora el rendimiento
experimental vara entre el 90 y el 95 % del terico,
y en la industria vara del 87 al 93 % del terico
(Vzquez y Dacosta, 2007).
5.4) Hay varias variables que afectan en la
inmovilizacin de las levaduras para la produccin
de etanol; la concentracin, temperatura de
fermentacin, tipo de azcar y sistema de cultivo.
De acuerdo a la teora, nos presenta que altas
concentraciones de glucosa muestran un efecto de
inhibicin en la produccin de etanol, es por eso,
que el rendimiento obtenido fue mucho menor al
esperado (Jimenez, Zarkovic, Villena, & Correa,
2011).
5.5) La cmara de Neubauer nos permiti el clculo
de la concentracin de las clulas para lograr
reportar de manera confiable el nmero de clulas
que se encuentran en dicha suspensin celular.
Dicho conteo, nos ayud a determinar las clulas
por cada mL de solucin de alginato de calcio.
6. Bibliografa:

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