Qumica

Forense

FaCENA
Laboratorio N3

Tema: Alcoholemia. Determinacin de semen

Objetivos:
- Conocer las diferentes tcnicas cualitativas y cuantitativas
para la determinacin de etanol.
- Realizar el dopaje de alcohol en diferentes muestras y ver
su correlatividad en sangre.
- Conocer las diferentes tcnicas para la determinacin de
semen.
- Aprender a correlacionar los hallazgos mdico-legales para
le elaboracin
- Interpretar los resultados de las tcnicas aplicadas.

Determinacin de semen

Pretratamiento de la muestra:

Se macerar el hisopo (o la muestra que correspondiera) con unos

mililitros de solucin fisiolgica, luego se centrifuga:
- Culot : se realiza extendido ( en caso de que ya no lo hayan
enviado) se observa en fresco y se colorea con May Grunwald
Giemsa. Se observa al MO en busca de espermatozoides.
- Sobrenadante: se realizan la determinacin de Fosfatasa cida
Prosttica y Antgeno Prosttico Especfico.

Fosfatasa Acida Prosttica (FAP)

El esperma contiene una elevada proporcin de fosfatasa cida (400 a

8000 unidades por ml) por lo cual se usa esta propiedad para
identificacin de manchas de semen.
La fosfatasa cida es cualquier enzima capaz de hidrolizar un fosfato
orgnico en medio cido. Se denomina fosfatasa cida prosttica a la
existente en el plasma seminal, que produce la hidrolisis de la fosforil
colina en cido fosfrico y colina. Esta enzima acta preferentemente
a pH 5, aunque el mismo vara de acuerdo con el ster fosforico a
hidrolizar entre 4,5 y 5.
La actividad fosfatsica se miden en base a una reaccin en la que se
liberan los productos fenlicos. El aumento de fosfatasa cida
prosttica en el suero sanguneo es patognomnico del cncer
metasttico de prstata, por lo cual el dosaje de dicha enzima en el
suero sanguneo es de suma importancia diagnstica. Se ha
demostrado que la Fosfatasa cida prosttica es inhibida por el cido
L (+) tartrico, en tanto que la sangunea no lo es.
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Entonces este mtodo se basa en dos hechos : 1- la
excepcionalmente alta actividad de la fosfatasa cida presente en el
semen humano es de origen prosttico y por lo tanto independiente
de los espermatozoides:
2- Tal enzima es
inhibida en forma prcticamente total por el L(+) tartrato 0,04 M

Reactivos:
-Buffer de citrato (pH 4,9)
Acido Ctrico Monohidratado.. 18,9 gramos
Agua destilada..500 ml
Hidrxido de Sodio 1N 180 ml
Acido Clorhdrico 0,1 N ... 100 ml
Ajustar el pH a 4,9 y llevar a 1000 ml con agua destilada.
Conservar en heladera.
-Tartrato 0,4 M
Acido L (+) Tartrico 6,004 gramos
Agua destilada 50 ml
Hidrxido de sodio 2N35 ml
Ajustar a pH a 4,9 y llevar a 100 ml con agua destilada.
Conservar en heladera.
-Reactivo I (sin tartrato)
Alfa- naftil fosfato sdico.. 50 mg
Buffer de citrato .. 50 ml
Disolver en el momento del uso
Fast Blue B. 50 mg
Disolver por fuerte agitacin.

-Reactivo II ( con tartrato)

Alfa naftil fosfato sdico.. 50 mg
Buffer de citrato . 45 ml
Tartrato 0,4 M 5 ml
Disolver. En el momento del uso de agregar:
Fast Blue B.. 50 mg
Disolver por fuerte agitacin

Procedimiento:
La prueba se puede realizar en tubo o en placa de toque. Se prepara
blanco con agua, testigo y la muestra.
En placa de toque en los dos pocillos de la primera se coloca, una
gota de agua, en la segunda hilera se coloca una gota del testigo en
cada pocillo y en la ltima hilera una gota de la muestra.
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Al blanco, testigo y la muestra de la primera fila se le coloca el
reactivo I (sin tartrato), y a todos los pocillos de la segunda fila se
coloca una gota del reactivo II ( con tartrato).
Si en la muestra con el reactivo I se produce color prpura, haba
fosfatasa cida. Si sta no se desarrolla el examen es negativo,
pudiendo descartarse la presencia de semen.
Si la muestra con el reactivo II, no desarrolla color, la fosfatasa cida
es de origen prosttico.
Si con ambos reactivos se desarrolla color prpura la fosfatasa cida
es de origen no prosttico, y se descarta la presencia de semen
humano.
Este mtodo es adecuado para el examen de manchas seminales an
en caso que se tratara de semen asprmico o de semen mezclado
con otras secreciones humanas, pues no se ha hallado otras
fosfatasas cidas de origen humano que sea inhibida por el L(+)
Tartrato. Constituye una excepcin, rarsima por otra parte, la sangre
de un hombre afectado por un tumor metasttico de prstata.

Antgeno Prosttico Especfico (PSA)

Es un inmunoensayo cromatogrfico para la rpida deteccin

semicuantitativa de PSA. Este contiene dos anticuerpos monoclonales
anti PSA como componentes activos. La sensibilidad del test es de 2
ng/ml.

Interpretacin de resultados:
- En casos que se observe un espermatozoide entero por MO no
es necesario la realizacin de las dems determinaciones.
- Cuando no se observan espermatozoides por MO, se deben
realizar las dems pruebas:
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FAP (+) y PSA (+) = Presencia de Semen
FAP(-) y PSA (-) = Ausencia de Semen

MTODO DE MICRODIFUSIN:

FUNDAMENTO DEL MTODO: Se basa en el proceso de particin, por

el cual una sustancia voltil pasa, a travs de la atmsfera generada
en un dispositivo cerrado, a un solvente puro o a un reactivo en el
cual es considerablemente ms soluble que en la muestra que lo
contiene.

Este proceso de particin puede ser favorecido y/o acelerado por el

empleo de un reactivo liberador.
El dispositivo ms comnmente utilizado para este tipo de
procedimiento es la Cpsula de Conway, la cual consta de dos
compartimientos: uno interno, ms pequeo y otro externo, ms
grande. Como norma general, en el compartimiento interno se coloca
el reactivo o el solvente puro (K 2Cr2O7) sobre el cual se disolver el
txico voltil que se investiga (CH 3CH2OH). En el compartimiento
externo se coloca la muestra sospechosa de contener el txico objeto
de nuestro estudio y el reactivo que acta como agente liberador
(K2CO3).

3 C2H5OH + 2 K2Cr2O7 + 8 H2SO4 3 CH3COOH + 2 Cr2(S04)3 + 2

K2SO4 + 11 H20

naranja verde

Las muestras que se pueden utilizar son sangre, orina, saliva y otros
fluidos biolgicos.

Las ventajas que ofrece ste mtodo son:

- Se necesita escasa cantidad de muestra para realizar el ensayo.
- No necesita procesos previos de purificacin, se trabaja
directamente con la muestra problema.
- Es un mtodo muy sencillo, econmico y rpido.
- Es un mtodo de elevada sensibilidad, lo cual acarrea falsos
positivos.
Las sustancias susceptibles de ser analizadas pueden ser liberadas de
la muestra por distintos principios fsico-qumicos, ya sea
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aprovechando la mayor solubilidad del txico en el reactivo al que se
lo enfrenta; o por reduccin de la solubilidad del txico en la muestra
que lo contiene.

MATERIALES UTILIZADOS:
- Cpsula de Conway (c/tapa).
- Grasa de siliconas.
- Pipetas graduadas Propipeta.
- Estufa
REACTIVOS UTILIZADOS:
- Dicromato de potasio 0,4N en cido sulfrico 10N.
- Solucin saturada de Carbonato de potasio.
- Testigos de concentracin conocida (T1: 1g/l; T2: 2g/l; T3: 3g/l).

PROCEDIMIENTO:
1- En el compartimiento interior se coloca 0,5ml de la solucin de
K2Cr2O7 (agente atrapante).
2- En el compartimiento externo se agrega la muestra (o agua o
testigos cuando corresponda) ms 1ml de la solucin de K 2CO3
(agente liberador).
3- Cubrir la placa con la tapa rotulada correspondientemente,
previa lubricacin con grasa de siliconas en los bordes para
evitar que los gases difundan al exterior de la cpsula. Agitar
suavemente sobre una superficie plana, con movimientos
circulares hasta homogeneizar los agregados.
4- Dejar reaccionar aprox. 2hs a 50C.

Blanco Testigo Testigo Testigo Desconoci

1 2 3 do
K2Cr2O7 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
K2CO3 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
H20 1ml - - - -
Testigo - 1ml - - -
1
Testigo - - 1ml - -
2
Testigo - - - 1ml -
3
Muestra - - - - 1ml

Una vez cumplido el perodo de difusin se observar el cambio de

color en el compartimiento interno (si la muestra contena alcohol) ya
que se produce la captacin y oxidacin del etanol hacia cido
actico. Las muestras se procesan en paralelo junto a tres testigos de
concentracin conocida de etanol (T1: 1g/l de etanol, T2: 2g/l y T3:
3g/l), ya que este mtodo se utiliza de forma cualitativa pero
comparando los colores de los compartimientos internos de las
muestras con los testigos podemos aproximarnos al valor de alcohol
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en la muestra, y ste se confirma y cuantifica con Cromatografa en
Fase Gaseosa.

Interpretacin de resultados:

Naranja: (-) negativo

Verde: (+) positivo: T1 = (+)
T2 = (++)
T3 = (+++)

CROMATOGRAFA EN FASE GASEOSA CON DETECTOR DE

IONIZACIN A LA LLAMA (CG-FID):

La cromatografa de gases es una de las tcnicas ms utilizadas

internacionalmente para el anlisis de drogas de abuso, debido a que
es muy especfica. Para llevar a cabo un anlisis cromatogrfico es
necesario que la sustancia de inters sea lo suficientemente voltil
como para que su molcula se encuentre en forma de vapor o gas a
una temperatura igual o inferior a 400C y que adems no se
descomponga a esas temperaturas. La CG-FID es una tcnica de
separacin, que se puede emplear como tcnica de deteccin, de
confirmacin y de cuantificacin.
Existen varios tipos de detectores y su eleccin depende de varios
factores como ser: precio, sensibilidad, selectividad, facilidad para
operar con l, dificultad para encontrar repuestos, etc. Este detector
(FID) es fcil de usar, barato y tiene respuesta con casi todas las
drogas de inters toxicolgico. La respuesta del FID depende del
nmero de tomos de carbono en la molcula. La mayor aplicacin de
este detector es en el anlisis de compuestos voltiles, como el
etanol.
Se utiliza como tcnica de muestreo HEADSPACE (espacio de cabeza).
Se trabaja con viales, en los cuales se coloca la muestra que se quiere
analizar (1ml) junto con 1ml del standart interno (ej: isobutanol). Se
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deja reposar 25 minutos a 70C, donde el txico se volatiliza y se
satura el aire del compuesto, etanol. Luego automticamente el
equipo aspira ese aire y se lo inyecta en el CG-FID.
El estndar interno se utiliza con el fin de poder efectuar una
determinacin cuantitativa, ya que la cantidad de analito es
proporcional a la intensidad del pico. La curva es una dependencia
entre la relacin de concentraciones y la relacin de reas
(Analito/estndar interno), el estndar garantiza una relacin
constante de reas con los analitos presentes en la muestra. Por esto
se hace necesario inicialmente evaluar la repetibilidad que presenta
el estndar interno en cuanto a sus reas y a su tiempo de retencin.
Los gases son arrastrados a travs de una columna donde se van
separando las distintas molculas en base a las diferentes afinidades
que presenten por la fase estacionaria contenida en la columna. Al
final de la columna esas molculas son captadas por un detector de
ionizacin a la llama, el cual traduce la seal obtenida de los iones
generados a un cromatograma, en el cual cada pico corresponde a un
compuesto diferente, y la respuesta es lineal a la concentracin del
mismo.

En el laboratorio del Cuerpo Medico Forense utilizamos el

Cromatgrafo Agylent 7820 A, el cual trabaja con las siguientes
temperaturas:
- Tiempo de la corrida: 3 minutos
- Temperatura de la columna: 80C
- Temperatura del inyector: 150 C
- Temperatura del detector: 250C
Este equipo se usa exclusivamente para las alcoholemias, ya que
cuenta con una columna CARBOWAX, cuyo componente es polar, por
lo cual presenta elevada afinidad por elementos polares como es el
caso de los alcoholes. El cromatgrafo fue estandarizado con una
curva de calibracin con testigos de diferentes concentraciones del
estandar interno (en nuestro caso butanol) de 1g/l, 2g/l y 3g/l, por lo
cual al hacer correr las muestras el equipo realiza directamente el
calculo de la concentracin de etanol presente en la muestra
tomando en cuenta sta curva.

MATERIALES UTILIZADOS:
- Viales de vidrio con sus correspondientes tapas.
- Sellador de tapas
- Pipetas graduadas Propipetas
- Estufa
- Cromatgrafo gaseoso

REACTIVOS UTILIZADOS:
- Solucin de isobutanol
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- Testigos de concentracin conocida (T1: 1g/l; T2: 2g/l; T3: 3g/l).

PROCEDIMIENTO:
1- Se rotula la cantidad necesaria de viales y se cargan con 1 ml
de butanol. Luego se coloca 1ml de muestra segn.
2- Se los coloca en los viales del headspace
3- Preparacin del Cromatgrafo:
- Abrir los gases (N2: carrier; H2 y aire: para generar la llama)
- Prender el equipo, headspace y la impresora.
- Cargar los datos de la nueva secuencia o muestra a
analizar..
-Procesarlos con el mtodo correspondiente, en nuestro caso
ALCOHOLEMIA.
-Guardar la secuencia con el nombre adecuado.
- Correr la secuencia y apretar START manualmente en el
Headspace.
4- El equipo procesar automticamente todas las muestras
cargadas en la secuencia a analizar con los parmetros del mtodo
cargado previamente.
5- Luego de terminada la corrida se obtendrn los cromatogramas,
con los valores de concentracin de etanol y de standart interno
correspondientes.

En caso de que la muestra no sea sangre, se deber considerar los

coeficientes que relacionan la concentracin de alcohol en los
diferentes tejidos con respecto a la alcoholemia.