FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

LABORATORIO BIOQUMICA

Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________

Alumno: ___________________________________________ Cdigo: _________________

Prctica 8: BOMBEO DE PROTONES EN LEVADURAS Y SUS PROCESOS INHIBITORIOS.

OBJETIVO:

Relacionar el consumo de glucosa con los cambios de pH producidos por las levaduras.

Explicar los cambios de pH por la generacin de protones.

Interpretar el efecto de los inhibidores y los desacoplantes sobre el bombeo de protones.

1. FUNDAMENTOS TERICOS.

El ser humano adulto medio genera la energa metablica suficiente para sintetizar, cada da, su
propia carga de ATP. La gluclisis y el ciclo del cido ctrico (ciclo de Krebbs) generan por s solos
una cantidad relativamente baja de energa en forma de ATP. Sin embargo, seis pasos de
deshidrogenacin (uno en la reaccin de gluclisis, otro en la reaccin de piruvato deshidrogenasa
+
y cuatro ms en el ciclo del cido ctrico) reducen en total 10 moles de NAD a NADH y 2 moles de
FAD a FADH 2 por mol de glucosa. La reoxidacin de estos transportadores electrnicos reducidos
genera la mayor parte de la energa necesaria para la sntesis de ATP.

Las clulas anaerobias mantienen un estado electrnico estacionario mediante la transferencia de

electrones desde los transportadores reducidos a los aceptores electrnicos, como en la reduccin
del piruvato a lactato en la gluclisis anaerobia. En cambio las clulas y los tejidos aerobios
transfieren los electrones en un proceso escalonado (alrededor de una docena de reacciones de
xido reduccin ligadas consecutivamente y ejecutadas por complejos multiproticos), desde los
transportadores reducidos hasta el oxgeno molecular.

El metabolismo aerobio del piruvato genera muchos ms equivalentes reductores que el

catabolismo anaerobio. En la respiracin, estos equivalentes reductores adoptan la forma de
NADH y FADH 2 , que en clulas eucariotas se reoxidan mediante las protenas de transporte
electrnico unidas y embebidas en la membrana mitocondrial interna. Estas protenas se
ensamblan en cinco complejos multiproticos denominados: I (NADH deshidrogenasa), II
(succinato-coenzima Q xidorreductasa), III (coenzima Q-citocromo c xidorreductasa), IV
(citocromo oxidasa) y V (ATP sintasa) (ver figura 1). Los complejos I y II reciben electrones del
NADH y del FADH 2 (estos ltimos provenientes del succinato) y los pasan al nico transportador
electrnico lipdico, la coenzima Q, que se desplaza libremente a travs de la membrana. El
complejo III oxida la forma reducida de la coenzima Q y reduce a su vez el citocromo c, un
transportador electrnico proteico y por ltimo, el complejo IV acopla la oxidacin del citocromo c
con la reduccin del O 2 a agua.
El transporte electrnico genera a su vez la formacin de un gradiente de protones a travs de la
membrana interna mitocondrial. Los protones se bombean desde la matriz de la mitocondria hacia
la cara citosolica de la membrana interna mitocondrial.

El espacio intermembranal de la mitocondria es 1.4 veces ms acido y 0.14 veces ms positivo que
la matriz. Este gradiente electroqumico genera a los protones una tendencia termodinmica a
volver hacia la matriz para igualar el pH a ambos lados. La energa de este gradiente protnico se
usa por la ATP sintasa (complejo V) para dirigir la sntesis endergnica de ATP a partir de ADP y
fosfato inorgnico (P i ). El paso de los protones se realiza a travs de un canal especfico en el
complejo V. El cual es una maquina molecular que orquestra la sntesis de ATP mediante cambios
conformacionales. Esta es la explicacin ms aceptada en la actualidad acerca del mecanismo
mediante el cual se transforma la energa almacenada en los alimentos en la moneda energtica
celular, el ATP. Este modelo de acoplamiento quimiosmtico fue propuesto en 1961 por el
investigador bioqumico britnico Peter Mitchell y ha sido comprobado mediante diversos
experimentos. Mitchell recibi el Premio Novel en el ao 1978.

La cadena de transporte electrnica puede ser inhibida por algunos compuestos de procedencia
exgena los cuales actan como inhibidores especficos de los distintos complejos moleculares
integrantes de la cadena. Adems, un grupo de compuestos, entre los que se encuentran el 2,4-
dinitrofenol (DNP) y la trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona (FCCP), se denominan agentes
desacoplantes, o desacopladores. Estos agentes, cuando se aaden a las mitocondrias, bloquean
la sntesis de ATP. En el caso especfico del DNP el pK a del grupo fenlico es tal que se encuentra
normalmente disociado a pH intracelular. Sin embargo, en la membrana interna mitocondrial se
+
protona debido a la alta concentracin de H el compuesto protonado puede atravesar la
membrana y al otro lado se desprotona nuevamente. Este transporte de protones elimina el
gradiente generado mediante la cadena electrnica y por ende la produccin efectiva de ATP.

DNP

Durante la prctica comprobaremos que el consumo de glucosa por la levadura deprime

progresivamente su concentracin en el medio de cultivo con el paso del tiempo, y trae como
consecuencia cambios de pH a nivel extracelular.
 2. SEGURIDAD DURANTE LA PRCTICA

2.1 Normas de seguridad

El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad.

2.2. Manejo de reactivos peligrosos:

La azida de sodio y el DNP son altamente toxicos y deben manejarse con cuidado usando
siempre guantes

2.3 Equipos de proteccin personal

Usar durante todo el desarrollo de la prctica los siguientes elementos de seguridad:

Bata de laboratorio
Guantes de nitrilo
Gafas de seguridad
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Est prohibido su
intercambio con los dems compaeros de laboratorio.

2.4 Manejo de Residuos qumicos

Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los
residuos generados en las prcticas del laboratorio de qumica en forma adecuada. Por ello el
estudiante debe:

1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los
cuales estn debidamente identificados segn el tipo de sustancia a desechar.

2. Verter nicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no

controladas y potencialmente peligrosas.

3. METODOLOGIA

3.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

ITEM Cantidad
Vaso de precipitados de 50mL. 3
Vaso de precipitados de 100mL 1
Vaso de precipitados de 250mL 1
Pipeta graduada de 1mL 2
Pipeta graduada de 10mL 1
Propipeta 1
Frasco Lavador 1
Probeta 50 mL 1
Barra agitadora 1
Beaker 500 mL 1
Varilla de vidrio 3
3.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Reactivos Cantidad
Levadura 3g
Solucin de 2,4-dinitrofenol 80 mM 200 L
Solucin de Azida de sodio 800 mM 500 L
Solucin glucosa al 10% 15 mL
Solucin para calibrar pH-metro. pH 4 y 30mL para todo el
pH 7 grupo

3.3 EQUIPOS

Tabla 3. Listado de Equipos necesarios para el desarrollo de la prctica por pareja.

Equipos Cantidad
pH-metro 1

3.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Procedimiento.

1. Prepare 15 mL de una solucin al 20 % de levadura

2. Tome 3 vasos de precipitados de 50 mL limpios y secos y rotule con los nmeros: 1, 2 y 3.

Coloque las sustancias y soluciones en el orden y las cantidades sealadas en la siguiente tabla:
(Con la ayuda de un potencimetro determine el valor de pH y registre por escrito los respectivos
valores).

Tabla 4. pH
VASO No

Reactivo 1 Control 2 (DNP) 3 Azida

Suspensin de levadura al 20% (ml) 5 5 5

Agua destilada (ml) 40 40 40

Solucin de DNP 80 mM (ml) 0.2

Solucin de azida de sodio 800 (mM) (ml) 0.5

Agite bien con la varilla y determine el pH en cada uno de los recipientes en los tiempos
indicados con el fin de obtener la lnea basal.

pH a los 0 minutos

pH despus de 5 minutos

pH despus de 10 minutos

Deje en reposo los tres recipientes durante 5 minutos y luego adicione:

Solucin de glucosa al 10% 5 5 5

Agite bien con la varilla y determine el valor de pH en cada uno de los recipientes a los
tiempos indicados
pH a los 5 minutos

pH a los 10 minutos

pH a los 20 minutos

pH a los 30 minutos

pH a los 40 minutos

4. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS.

1 Elabore en un mismo plano cartesiano las grficas de pH en funcin del tiempo correspondiente
a cada uno de los vasos de precipitados.

2 Segn el modo de accin del DNP (lea la introduccin e investigue) Es el comportamiento

observado para el pH en el vaso 2 lo esperado? Sustente su respuesta.

3. Explique basndose en el mecanismo de accin de la azida de sodio (investigue) la diferencia

en el comportamiento en el pH del vaso 3 comparado con el del vaso 2.

4. De haber obtenido resultados iguales entre el pH del vaso 2 y el 3 discuta tericamente que
debi observar, porqu y de una posible explicacin de lo sucedido para no observar diferencia.

5. Adems de los desacoplantes existen diversas molculas que actan como inhibidores de la
cadena de transporte electrnico. Investigue de donde provienen y donde actan los siguientes
inhibidores: Rotenona, amital, antimicina A, cianuro y monxido de carbono.

6. Teniendo en cuenta que debido al bombeo de protones, el espacio intermembrana de la

+
mitocondria tiene una diferencia de H de 1.4 y es 0.14 veces ms positivo con respecto a la
matriz. Calcule el valor de energa libre G (la total no la estndar) debido al gradiente de
protones generado.

7. Segn el clculo en el punto 6 cuanto ATP podra generarse a partir de ADP y Pi a partir del
gradiente de protones?