INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Departamento de Bioqumica
Dr. Guillermo Carvajal Sandoval

LABORATORIO DE MTODOS DE ANLISIS

REPORTE DE PRCTICA
SEPARACIN DE UNA MEZCLA DE DOS AMINOACIDOS
POR CROMATOGRAFA POR INTERCABIO INICO.

Profesora: Acua Gonzlez Carolina.

Alumna: Del Razo Mndez Adriana Joselly.
Grupo: 5QM2
Seccin: 2

OBJETIVOS
Emplear la tcnica de intercambio inico para la separacin de aminocidos.
Comprobar la separacin mediante una reaccin colorida y perfil de elucin.
 FUNDAMENTO
La cromatografa de intercambio inico se lleva a cabo con empaques de columna que tiene
grupos funcionales cargados unidos a una matriz polimrica. Los grupos funcionales enlazados
permanentemente y asociados con contra-iones de carga opuesta. El mecanismo de retencin
ms comn es el intercambio simple de los iones de la muestra y de la fase mvil con el grupo
cargado de la fase estacionaria.
En el caso de empaques cargados negativamente sirven para intercambiar especies catinicas.
Los ms comunes son los sulfnicos, los cuales son fuertemente cidos y tiene las
propiedades de los cidos fuertes cuando est en la forma H. los empaques cargados
positivamente se utilizan para el intercambio con especies aninicas. Los ms comunes son las
aminas cuaternarias, las cuales son fuertemente bsicas y en su forma OH presentan las
propiedades de una base fuerte. Ambos grupos funcionales estn totalmente disociados. As,
sus propiedades de intercambio son independientes del pH de la fase mvil.
El proceso primario en la cromatografa de intercambio inico involucra la adsorcin/desorcin
de materiales inicos cargados en la fase mvil con una fase estacionara permanentemente
cargadas (de signo contrario). Ejemplo, una resina ionizada, inicialmente en forma H, en
contacto con una solucin que contiene iones K+, existe un equilibrio:
Resina, H + K+ resina, K++ H+

RESULTADOS
Tabla 1. Separacin de Prolina e Histidina.

Volumen de Volumen de Volumen de

A400 A570 A570
elucin (mL) elucin (mL) elucin (mL)
3 0,108 48 0,639 93 -0,013

Laboratorio de Mtodos Analticos. Separacin de una mezcla de dos aminocidos por cromatografa por intercambio inico.

2
 6 0,066 51 0,587 96 -0,020
9 0,077 54 0,522 99 -0,009
12 0,094 57 0,443 102 -0,026
15 0,107 60 0,360 105 -0.036
18 0,161 63 0,258
21 0,395 66 0,187
24 0,557 69 0,068
27 0,699 72 -0,031
30 0,744 75 -0,030
33 0,711 78 -0,003
36 0,418 81 -0,046
39 0,896 84 0,013
42 0,791 87 -0,041
45 0,755 90 -0,027

1
0.9
0.8
0.7
0.6

A 400 y 570 (nm) 0.5

0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 9 18 27 36 45 54 63 72 81 90 99 108 117

Volumen de elucin (mL)

Fig. 1 Perfil de elucin de los aminocidos Prolina e Histidina. El punto 12 marcado con un
asterisco, indica que la separacin de los aminocidos no fue realizada de
manera adecuada.

a) Cul de los aminocidos eluy primero? Explique porqu.

El primero de los aminocidos en eluir por la columna fue la prolina, esto se debe a que
la histidina posee dos cargas, tanto el anillo de imidazol y el grupo amino, los cuales

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 tienen ms posibilidades de unirse a la resina, a diferencia de la prolina que slo cuenta
con una carga en su cadena lateral.

b) Cul es la importancia de regular la velocidad de elucin, qu pasa a altas y a

bajas velocidades?
La importancia que tiene la regulacin de la velocidad en la elucin es la obtencin de la
separacin correcta de los dos aminocidos, ya que a altas velocidades la separacin
adecuada de los aminocidos no se efecta, y las bajas velocidades no permiten una
buena recoleccin de la elucin.

c) Empleando las frmulas de los aminocidos y del grupo funcional del

intercambiador, haga un esquema de cmo se produjo la separacin. Considere el
cambio de pH en el medio.

DISCUSIN
La cromatografa por intercambio inico como sabemos, se basa en la separacin de muestras
por la carga que poseen. Para la separacin de los aminocidos prolina e histidina se emple

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 una resina catinica, es decir una resina que presenta un ion fijo aninico (COO -) y un ion mvil
positivo (H+) permitiendo separar a los aminocidos que poseen grupos catinicos.
Para poder empaquetar la columna, la resina fue previamente resuspendida con la primera
fase mvil que fue el regulador de citratos a pH 5.25, lo cual permite que esta se hinche y el ion
mvil que presenta fuera cambiado por el Na + para posteriormente empaquetar la columna.
Una vez empaquetada la columna y regulada la velocidad con la primer fase mvil, se coloc la
mezcla de aminocidos, a la cual se le hicieron tres lavados lo cual permite que la muestra
entre a la resina y as comenzar la elucin.
El primer aminocido en eluir fue la prolina debido a que la histidina posee en su cadena latera
una carga positiva en el anillo imidazol y otro en su grupo amino, lo cual provoca que aumente
su unin a la resina. Esto tambin se debe a los pKa que presentan estos dos grupos que aun
valor de pH menor a 6 estn cargados positivamente, a diferencia de la prolina que solo posee
un grupo con carga que es el amino con un pKa de 10.6; la diferencia entre los pKas de los
aminocidos, permite que la prolina no se una a la resina y la histidina se quede fija al anin. Al
cambiar la fase mvil por una de menor pH aumentamos la concentracin de H + lo que genera
el desplazamiento o separacin de la histidina permitiendo que se eluya.
Al ser una separacin incolora, para la determinacin de los aminocidos se emple en cada
tubo una reaccin colorida revelando con ninhidrina al 0.2%. Los colores que forman la
reaccin son violetas y amarillos, este ltimo color es caracterstico de la prolina al ser revelada
con este reactivo. Posteriormente de ser colocados por 20 minutos en el bao, se emple el
mtodo espectrofotomtrico, donde los primeros 15 volmenes de eluciones se leyeron a
400nm y los restantes a 570nm (Tabla 1).
Por ultimo al obtener la absorbancia de cada tubo, se construy el perfil de elucin el cual nos
permite observar que tan buena fue la separacin de estos dos aminocidos. En esta prctica
la separacin de estos aminocidos no fue bien realizada, aunque se observa que la prolina a
400nm presenta su mxima absorbancia al igual que la histidina a 570nm, el punto 12 (Fig. 1)
confirma que se tiene una pequea resolucin, y esto pudo deberse a muchos factores, por
ejemplo al empaquetamiento de la columna, la velocidad de elucin, la mala aplicacin de la
muestra as como recoleccin de la misma. Estos factores son muy importantes para una
buena separacin los cuales como mencionamos se ven reflejados en el perfil de elucin o
cromatograma.

CONCLUSIONES
Se obtuvo la separacin de prolina e histidina por medio de una cromatografa por
intercambio inico de acuerdo a la carga con la que cuentan y a sus grupos ionizable.
Se comprob la separacin por medio de la reaccin colorida con ninhidrina.

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 Por medio del perfil de elucin se observa que la separacin no fue realizada
correctamente.

REFERENCIAS
Harper; Bioqumica Ilustrada; (2003); China; 29 Edicin, Editorial Mc Graw Hill.

Lehninger A.L. Bioqumica. Las bases moleculares de la estructura y funcin celular. (1991);
Ediciones Omega S.A.

Olsen E., Mtodos pticos de anlisis. 2da Edicin, Barcelona (1990). REVERT. Pp (414-416).

Skoog. D., West D., Holler J. Fundamentos de Qumica Analtica. 4ta Edicin, Barcelona
(2001). REVERT, Pp (604-608).

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