Pada kultur jaringan eksplan seringkali berubah

menjadi coklat (browning) atau hitam (blackening) sesaat

setelah isolasi yang selanjutnya dapat menghambat
pertumbuhan dan akhirnya menyebabkan kematian
jaringan.Beberapa macam tanaman khususnya tanaman
tropika mempunyai kandungan senyawa fenol yang
tinggi yang teroksidasi ketika sel dilukai atau terjadi
senesens (George dan Sherrington 1984). Akibatnya jaringan
yang diisolasi menjadi coklat atau kehitaman
dan gagal tumbuh. Pencoklatan jaringan terjadi karena
aktivitas enzim oksidase yang mengandung tembaga
seperti polifenol oksidase dan tirosinase (Lerch 1981)
yang dilepaskan atau disintesis dan tersedia pada kondisi
oksidatif ketika jaringan dilukai.

Penanggulangan pencoklatan pada jaringan khususnya

pada eksplan yang baru diisolasi dan pada
media tumbuh yang digunakan, menurut George dan
Sherrington (1984) seringkali dilakukan dengan menggunakan
salah satu cara dari beberapa pendekatan,
yaitu:

1. Menghilangkan senyawa fenol.

2. Modifikasi potensial redoks.
3. Penghambatan aktivasi enzim fenol oksidase.
4. Penurunan aktivitas fenolase dan ketersediaan
substrat.

Sumber

George, E.F. and P.D. Sherrington 1984. Plant Propagation

by Tissue Culture. Hand Book and Directory of
Comercial Laboratories. Eastern Press, Reading, Berks.
England. p. 9-449.

Lerch K. 1981. Tyrosinase kinetics: A semi-quantitative

model of the mechanism of oxidation of monohydric and
dihydric phenolic substrates. In Sigel, H. (Ed.). Metal
Ions in Biology System. 13 Marcel Dekker Inc., New
York, Basel. p. 143-186.

Menurut Murashige (1974 dalam Bayu, 2002), ada lima faktor yang harus
diperhatikan dalam regenerasi in vitro dari eksplan yaitu : organ yang
digunakan, umur fisiologis, umur saat diambil dari tanaman asal, ukuran
eksplan dan kualitas tanaman asal. Dalam hal ini ukuran eksplan yang paling
baik digunakan adalah antara 0,5-1 cm, namun hal ini dapat juga terjadi
(tumbuh) tergantung pada tanaman yang dipakai dan juga jenis tanamannya
(Katuuk, 1989). Selain itu ekspalan yang digunakan harus bebas kontaminan
(dengan menggunakan sterilan) sebelum ditransfer ke dalam kultur, serta
media tempat kultur ditanam harus steril dan aseptik (George & Sherrington,
1984).
Menurut Hartmann & Ketser (1983), media yang paling sering digunakan
dalam kultur jaringan adalah media MS (Murashige dan Skoog). Media
dengan formulasi MS adalah media yang paling cocok untuk perkembangan
kultur dan organogenesis (Vasil, 1985). Selain itu media ini memiliki
keistimewaan, karena mengandung nitrat, kalium, dan amonianya tinggi
(Wetter & Constabel, 1991).
Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur
jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman
yang
akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur
hara
baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber
karbohidrat,
zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa,
ekstrak buah dll, bahan pemadat: agar-agar dan gelrite dan juga
menyediakan
arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman
Senyawa organik sering ditambahkan ke dalam media sebagai sumber
pembentuk asam amino dan vitamin. Senyawa organik yang sering
ditambahkan
adalah air kelapa, ekstrak ragi, ekstrak buah, dan casein hydrolisat. Sebagai
sumber energi ditambahkan dari senyawa-senyawa yang merupakan sumber
karbohidrat, seperti sukrosa (paling baik pada tanaman umumnya), glukosa,
fruktosa, dam maltosa. Penambahan arang aktif berfungsi untuk
mengarbsorbsi
senyawa-senyawa fenolik dan untuk merangsang pertumbuhan akar.
Selain ditambahkan oleh senyawa-senyawa tersebut, media yang baik
harus selalu berada dalam PH yang optimal yaitu 5,5-5,8. selain itu, harus
dibuat
dalam tempat yang steril. Autoclave sering dipakai untuk sterilisasi dalam
pembuatan media kultur jaringan.

Browning/Pencoklatan
Pencoklatan adalah suatu keadaan munculnya warna coklat atau hitam yang
menyebabkan tidak terjadi pertumbuhan dan perkembangan atau bahkan
menyebabkan kematian pada eksplan. Pencoklatan umumnya merupakan tanda
adanya kemunduran fisiologis eksplan biasanya eksplan akan mati.

Browning terjadi akibat pengaruh akumulasi senyawa fenolik yang teroksidasi

akibat stress mekanik atau pelukaan pada eksplan. Senyawa fenol tersebut
adalah enzim polifenol eksidase dan tirosinase. Dalam kondisi oksidatif akibat
pelukaan, enzim tersebut akan secara alami disintesis oleh tanaman sebagai
bentuk pertahanan diri. Menurut Laukkanen et al. (1999) dalam Hutami (2008),
ketika sel rusak, isi dari sitoplasma dan vakuola menjadi tercampur, kemudian
senyawa fenol teroksidasi menghambat aktivitas enzim. Senyawa fenol yang
berlebihan akan bersifat racun yang merusak jaringan eksplan dan akhirnya
menyebabkan kematian eksplan (Corduk and Aki, 2011).