PENDAHULUAN

Anggrek terestrial merupakan tumbuhan yang selama siklus hidupnya

sangat tergantung oleh cendawan mikroza. Biji anggrek berukuran sangat kecil
dan tidak memiliki cadangan makanan, sehingga membuat mereka sangat
tergantung oleh sumber nutrisi dari luar yang disediakan oleh cendawan mikoriza.
Pada tahap perkembangan awalnya, semua anggrek tergantung oleh adanya invasi
dari orchid mycorrizal fungi (OMF) untuk menyediakan sumber karbon sebagai
sumber nutrisi dan menstimulasi perkecambahannya. Salah satu anggrek terestrial
berasal dari genus Caladenia, yang merupakan anggrek endemik Australia.
Menurut Department of environment, water, land and planning (DEWLP), status
dari aggrek ini saat ini terancam punah. Caladenia merupakan jenis anggrek yang
tidak mamiliki akar, membuat mereka sangat tergantung oleh OMF. OMF akan
menyediakan sumber nutrisi berupa karbon dan nitrogen baik organik maupun
anorganik dan memberikannya pada inang mereka. Salah satu OMF yang umum
ditemukan bersimbiosis dengan Caladenia adalah Sebacinales yang termasuk
dalam Basidiomycota. OMF yang berasosiasi dengan tanaman anggrek pada
umumnya memiliki strategi hidup berupa saprofitik yang akan mendegradasi
material organik disekelilingnya. Pengetahuan mengenai ketergantungan
Caladenia terhadap cendawan mikoriza anggrek, membuat peran dari cendawan
mikoriza anggrek menjadi penting untuk diketahui.
Habitat dominan dari anggrek Caladenia yang termasuk endemik di
Australia berada pada tanaman Eucalyptus. Secara alami habitat dari anggrek
ialah dikelilingi oleh adanya sampah-sampah bahan organik seperti kayu maupun
serasah yang berasal dari tanaman. Kemampuan OMF untuk mendegradasi
substrat tersebut memberikan implikasi ekologi tersendiri terhadap inang mereka.
Karena hasil dari degradasi dinding sel tanaman akan menghasilkan gula-gula
seperti pentosa, arabinosa, xilosa, galaktosa, glukosa, dan manosa yang dapat
menjadi sumber karbon bagi inangnya. Namun, hingga saat ini belum diketahui
secara pasti sumber karbon apa yang diberikan oleh OMF pada Caladenia spp.
yang dapat menunjang pertumbuhan dan perkembangnya. Oleh karena, sangat
penting untuk mengetahui sumber nutrisi seperti apa yang diberikan oleh OMF
pada inangnya, sehingga perbanyakan dari anggrek ini menjadi lebih mudah
(berkaitan dengan statusnya).
 Penelitian ini akan mengujikan delapan OMF baik dari spesies yang
terancam punah maupun spesies yang umum. Kedelapan OMF ditumbuhkan pada
medium dengan 12 sumber karbon terlarut dan 12 sumber karbon kompleks yang
berbeda (terdapat pada Tabel 2 dalam jurnal), yaitu selulosa, xilan, pati, selobiosa,
maltosa, glukosa, manosa, fruktosa sebagai sumber karbon sederhana. Pektin,
kitin, carboxylmetylcelulosa (CMC), sukrosa, galaktosa, dan xilosa sebagai
sumber karbon disakarida serta arabinosa dan tanian sebagai sumber karbon
kompleks.
METODE
1. Isolasi OMF
Penelitian ini menggunakan 8 isolat OMF yang berbeda dimana 6
diantaranya berasal dari cultur collection dan 2 lainnya merupakan hasil isolasi
dari spesies anggrek Caladenia fulva dan Caladenia carnea. Kedelapan isolat
OMF yang digunakan terbagi menjadi empat kelompok yaitu Dilatata, Reticulata,
Patersonii, dan Finger (uraian mengenai isolat terlampir pada jurnal Tabel 1).
Untuk tahapan isolasi diawal dengan sterilisasi permukaan dengan menggunakan
0,5 % Natrium Hipoklorit selama 3 menit, untuk selanjutnya dibilas dengan Mili-
Q water dan ditanam pada medium fungal isolation medium yang sudah
ditambahkan dengan 0,05% streptomisin. Kemudian diinkubasi, untuk selanjutnya
di remajakan dengan menggunakan medium Malt extract agar (MEA).
2. Uji sumber karbon terlarut dan tidak terlarut yang digunakan oleh OMF
Dua belas sumber karbon yang digunakan dimungkin memiliki kesamaan
dengan sumber karbon yang ada di lingkungan seperti akar dan daun Eucalyptus.
Kandungan dari akar dan daun berupa komponen sumber karbon tidak terlarut
seperti selulosa dan dapat dipecah menjadi disakarida dan monosakarida.
Pengujian kemampuan tumbuh OMF pada 12 sumber karbon berbeda
dilakukan dengan menggunakan medium Low carbon-nitrogen cair yang
dimodifikasi dengan konsentrasi sumber karbon sebanyak 2 g/L. Penambahan
sumber karbon terlarut dilakukan setelah autoklaf, sedangkan penambahan sumber
karbon tidak terlarut dilakukan sebelum autoklaf. Kontrol negatif menggunakan
medium tanpa sumber karbon. Inokulasi OMF pada medium dengan
menggunakan fungal cuber berukuran 5 mm x 5 mm dan diinkubasi selama 4
minggu. Setelah masa inkubasi dilakukan pengukuran pH dan tahapan filtrasi.
Filtrasi untuk sumber karbon tidak terlarut dilakukan dengan cara miselium
dipanen dengan metode filtrasi menggunakan GF/C (glass fibre, GC-50, 25 mm)
dan dibilas dengan 20 mL Mili-Q water. Selanjutnya dilakukan freeze-dried dan
disimpan pada suhu -20 oC untuk ekstraksi ergosterol. Sedangkan untuk sumber
karbon yang larut setelah difiltrasi kemudian dikeringkan selama 24 jam pada
suhu 80 oC dan ditimbang bobotnya.
3. Kuantifikasi ergosterol
Ergosterol adalah senyawa sterol esensial spesifik pada cendawan,
beberapa alga mikroskopis dan protozoa. Pengukuran kuatifikasi ergosterol
dilakukan dengan menggunakan metode high performance liquid
chromatography (HPLC) menggunakan ultraviolet tunggal dengan absorbansi 282
nm. Selain itu pada penelitian ini dulakukan juga uji UPLC untuk pertama kalinya
untuk mengukur biomassa dari OMF. Filter freeze-dry dijaga dalam kondisi gelap
untuk selanjutnya dilakukan ekstraksi dengan menggunakan 3 mL KOH 25 %,
dan divorteks selama 1 menit. Inkubasi pada suhu 85 oC selama 1 jam. Kemudian
ditambahkan dengan 3 mL n-heptan untuk selanjutnya vorteks selama 3 menit.
Untuk mengidentifikasi peak ergosterol sampel dibandingkan dengan standar dan
dilakukan UV spectroscopy.
HASIL dan PEMBAHASAN
1. Efek sumber karbon
Cendawan memiliki kemampuan untuk menggunakan sumber karbon
terlarut maupun tidak terlarut, dengan penurunan pH sebagai hasil dari proporsis
jumlah ergosterol dan biomassa cendawan yang dihasilkan (Gambar 1 dan 2 ,
terlampir pada jurnal). Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat lima sumber
karbon terlarut yang menghasilkan biomasa tertinggi yaitu glukosa, fruktosa,
manosa, selobiosa dan maltosa. Sedangkan untuk karbon tidak terlarut jumlah
ergosterol tertinggi diperoleh pada cendawan dengan sumber karbon berupa xilan
dan pati.
OMF tidak memiliki kemampuan untuk tumbuh pada semua sumber
karbon, degradasi senyawa organik oleh OMF akan menghasilkan suatu senyawa
yang dapat dijadikan sebagai substrat sederhana untuk mikroba lain sehingga akan
terjadi kompetisi. Mungkin kompetisi antar OMF didasarkan pada perbedaan laju
pertumbuhan sebagai hasil dari proses metabolismenya. Dua dari empat
Caladenia memiliki pertumbuhan yang lebih lambat, menunjukkan bahwa
kompetisi yang lebih rendah. Kemapuan kompetisi ini yang memungkinkan
berpengaruh terhadap status keberadaan inangnya.
2. Efek cendawan
Pada sumber karbon kompleks, jumlah ergosterol tertinggi diproduksi oleh
cendawan mikroiza anggrek CMA2 (C. maritima), dan dua cendawan mikoriza
dari anggrek lainnya yaitu CC1 (C carnea var. carnea) dan KPU1D (C.
phaeoclavia) dibandingkan dengan dua cendawan anggrek yang hampir punah
yaitu B110 dari C. fulva dan R9 dari C. venusta. Untuk sumber karbon terlarut,
biomassa tertinggi diproduksi oleh OMF dari kelompok Dilatata dan Reticulata.
Kemampuan OMF untuk mendegradasi baik sumber karbon tidak terlarut
dari selulosa, kemudian selobiosa, dan glukusa memungkinkan bahwa OMF
memiliki kompleks enzim degradasi selulosa yang lengkap. Sebaliknya
kemampuan OMF untuk tumbuh baik pada xilan, tetapi tidak pada produknya
seperti xilosa, arabinosa, dan galaktosa menunjukkan bahwa kemampuan
metabolisme OMF ini terbatas. OMF tidak memiliki kemampuan tumbuh baik
pada sumber karbon berupa kitin, karena kitin merupakan komponen utama
penyusun dinding sel cendawan itu sendiri. Ketidakmampuan OMF dari anggrek
langka dalam mendegradasi sukrosa dimungkin oleh dua faktor, yaitu sedikitnya
sukrosa transporter pada membran plasma dan tidak dihasilkannya enzim
pendegradasi sukrosa. Namun, OMF yang tidak dapat memanfaatkan sukrosa ini
dapat memberikan manfaat yang lebih pada inangnya, karena kemampuannya
untuk bersaing dengan patogen tanaman inang.
3. Efek taksonomi anggrek dan statusnya
OMF dari anggrek Finger tidak mampu bersaing dengan Dilatata, dengan
OMF lainnya. Efek dari kelompok taksonomi mungkin karena kelompok Finger
memiliki proporsi yang lebih besar dibanding dengan kelompok lainnya.
Investigasi yang lebih mendalam terhadap OMF dari grup yang sama atau beda
dibutuhkan untuk melihat mengkonfirmasi spesies lainnya dari Caladenia.
Perbedaan kuantifikasi rata-rata pertumbuhan OMF dengan status
terancam punah dengan spesies yang umum dari Dilatata dan Reticulata
menunjukkan bahawa OMF dari spesies anggrek langka memiliki kemampuan
kompetitif yang lebih rendah. Perbedaan antara OMF langka dengan umum pada
Dilatata dan Reticulata menunjukan adanya tahap pembatas berupa daya saing.
Dalam hal ini, konversi ergosterol menjadi penting, karena kekurangan ergosterol
pada membran plasma dari OMF dapat memperngaruhi permeabilitasnya.
Keterbatasan dari OMF dari anggrek langka juga mungkin karena kemampuannya
yang rendah dalam menghasilkan enzim ekstraseluler yang menyebabkan
rendahnya penyerapan substrat.
4. Ergosterol: UPLC vs HPLC
Pada penelitian ini, UPLC memiliki resolusi, kecepatan dan sensitifitas
yang lebih baik dibandingkan dengan HPLC. Retensi waktu yang lebih singkat
pada UPLC menghasilkan efekstifitas yang lebih rendah karena pelarut yang
digunakan juga lebih sedikit. Belum ada laporan mengenai penggunaan UPLC
untuk mengukur ergosterol pada fungi, penelitian ini merupakan yang pertama
dilakukan. Kuantifikasi UPLC untuk ergosterol dapat digunakan untuk menduga
degradasi bahan organik yang dilakukan oleh OMF. Ergosterol umum digunakan
untuk pengukuran biomasa cendawan, karena merupakan hal yang unik pada
cendawan. Konversi antara ergosterol dan pengukuran biomassa dilakukan dengan
membandingkan pertumbuhannya pada substrat alami, sumber karbon tidak
terlarut dan sumber karbon terlarut. Faktor konversi yang digunakan adalah 4,7
mg ergosterol/g-1.
KESIMPULAN
Anggrek Caladenia baik termasuk langka dan anggrek umum mampu
menggunakan sumber karbon sederhana berupa glukosa, fruktosa, manosa,
selobiosa dan maltosa. Diketahuinya sumber karbon yang cocok untuk
pertumbuhan dari anggrek dan cendawan mikoriza anggrek memungkinkan dapat
ditambahkannya senyawa tersebut pada habitat untuk menunjang pertumbuhan
OMF dan inangnya.
 TUGAS SISTEM BIOLOGI CENDAWAN

DIFFERENCES IN CARBON SOURCE UTILISATION BY

ORCHID MYCORRHIZAL FUNGI FROM COMMON AND
ENDANGERED SPECIES OF CALADENIA (ORCHIDACEAE)
Mehra S, Morrison PD, Coates F, Lawrie AC. 2016. Mycorrhiza, 1-14. DOI
10.1007/s00572-016-0732-1.

DWI RETNOWATI
G351150301

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016