Bacillus thuringiensis: caractersticas gerais e fermentao

Bacillus thuringiensis: general characteristics and fermentation

Elisangela Andrade Angelo1*; Gislayne Trindade Vilas-Bas2;

Ral Jorge Hernan Castro-Gmez3

Resumo
O controle de insetos realizado, em sua maioria, por produtos qumicos; cujos efeitos cumulativos
ocasionam grandes prejuzos ambientais e sade humana, destacando-se ainda a rpida seleo de
insetos resistentes. O controle biolgico por entomopatgenos uma alternativa eficiente, principalmente
devido a sua alta especificidade, ausncia de resistncia nos insetos alvos e baixo efeito residual no
ambiente. Bacillus thuringiensis uma bactria Gram-positiva esporulante, produtora de cristais
proticos com atividade inseticida. Apesar do amplo uso B. thuringiensis no controle biolgico, h
poucos trabalhos publicados quanto a sua multiplicao, esporulao e produo de cristais, visto que
muitas informaes so segredos industriais. Esta reviso teve por objetivo reunir informaes gerais
sobre B. thuringiensis, bem como quanto sua produo em meios de cultivo.
Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, entomopatgeno, bioinseticida, controle biolgico,
fermentao

Abstract
The insect control is carried out mostly by chemical products, whose cumulative effects cause serious
losses to environmental and human health, highlighting rapid selection of resistant insects. Biological
control by entomopathogenic bacteria is an efficient alternative, mainly due to high specificity, absence
of resistance in the target insects and low environment residual effect. Bacillus thuringiensis is a Gram-
positive spore-forming bacterium that produces a parasporal crystal protein toxic for many insect
species. Despite the widespread use of B. thuringiensis based products in biological control of insects,
there are little studies about its multiplication, sporulation and crystal production, as so many trade
secrets information. This revision was aimed at gathering general information about B. thuringiensis, as
well as its production in culture media.
Key words: Bacillus thuringiensis, entomopathogenic bacterium, bioinsecticide, biological control,
fermentation

1
Mestre em Cincia de Alimentos, Departamento Cincia e Tecnologia de Alimentos DCTA-CCA, Universidade Estadual de
Londrina UEL. E-mail: zanele77@gmail.com.br
2
Professora Doutora do Departamento de Biologia Geral, Universidade Estadual de Londrina, UEL. E-mail: gvboas@uel.br
3
Professor Doutor do Departamento Cincia e Tecnologia de Alimentos, Universidade Estadual de Londrina, UEL/CCA. E-mail:
rcastro@yahoo.com
*
Autor para correspondncia
Recebido para publicao 26/01/09 Aprovado em 07/04/10
945
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
 Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.

Introduo A comercializao de bioinseticidas corresponde

a cerca de 5% do mercado mundial de pesticidas.
Estima-se que existam cerca de 2,5 milhes de
Porm, o uso destes produtos vem crescendo dez
espcies de insetos, das quais 10% causam danos ao
vezes mais do que o uso de inseticidas qumicos
ser humano ou perdas econmicas na pecuria ou
(BRAR et al., 2006). As bactrias destacam-se
na agricultura (ALVES, 1998). Muitas doenas de
como promissoras no controle biolgico. Entre
interesse da sade pblica, como malria, dengue,
estes microrganismos, Bacillus thuringiensis (Bt)
febre amarela, filariose e doena de Chagas so
o mais utilizado. Estima-se que os produtos
transmitidas por insetos vetores. Em geral, os pases
base dessa bactria correspondam a cerca de 90%
mais atingidos por estas doenas so os tropicais
do mercado mundial de bioinseticidas (VILAS-
e subtropicais, devido principalmente s suas
BAS; PERUCA; ARANTES, 2007). Os maiores
caractersticas climticas favorveis proliferao
produtores de produtos base de B. thuringiensis
de insetos. O crescente aquecimento global demanda
so Estados Unidos e Canad, que respondem por
preocupao especial, estendendo s reas propcias
cerca de 50% da produo mundial (TAMEZ-
a esta proliferao tambm a regies atualmente
GUERRA et al., 2001).
com clima temperado (ABDEL-HAMEED, 2001;
BECKER; MARGALIT, 1993; TALUIL, 2002). O Brasil um pas de clima tropical cuja economia
bastante ligada agricultura, onde insetos causam
O controle atual da populao de insetos
perdas substanciais na produo alimentar, alm de
realizado, principalmente, por inseticidas qumicos,
serem vetores de uma variedade de doenas como
cujo uso indiscriminado e massivo causa danos
dengue, malria e febre amarela (FORATTINI et
ambientais e sade humana. Produtos qumicos
al., 1995; SERUFO et al., 1993; TALUIL, 2002).
com alta toxicidade, porm com baixa especificidade
Na sua maioria, o controle efetivo de insetos tem
e alto efeito residual, prejudicam o meio ambiente,
sido feito com inseticidas sintticos, sendo pouco
alm de contriburem para a existncia de
utilizados produtos base de B. thuringiensis, uma
considervel nmero de espcies de insetos com
vez que, no Brasil existe apenas uma nica empresa
populaes resistentes, inviabilizando a aplicao
que produz e comercializa formulaes nacionais
de tais produtos (ALVES, 1998; ARANTES et al.,
base desta bactria.
2002).
A maioria dos produtos base de B. thuringiensis
Uma alternativa aos inseticidas qumicos o
encontrados no mercado nacional importada, o
controle biolgico, que pode ser feito com o uso
que causa aumento no preo final ao consumidor
racional de entomopatgenos, que constituem os
e conseqente diminuio da competitividade
componentes ativos dos bioinseticidas ou inseticidas
destes produtos em relao a inseticidas sintticos.
biolgicos. Entre as vantagens dos bioinseticidas
Este quadro demonstra a necessidade de produo
destacam-se: alta especificidade, menor risco
nacional de formulaes base de B. thuringiensis,
ambiental e sade humana, menor freqncia de
os quais poderiam ser empregados em programas
resistncia nos insetos alvo e a possibilidade do
locais de controle de insetos, como sugerido por
entomopatgeno se multiplicar no ambiente e, com
vrios autores (COUCH; ROSS 1980; SALAMA;
isso, aumentar sua permanncia. Como desvantagem
MARGALIT, 1993; ALVES et al., 1997; MORRIS;
principal destaca-se maior suscetibilidade s
KANAGARATNAM; CONVERSE, 1997; VORA;
condies ambientais, o que pode ser atenuado com
SHETHNA, 1999; POOPATHI; KUMAR, 2003;
o uso de boas formulaes e estudos para aplicao
PRABAKARAN; BALARAMAN, 2006).
dos produtos, a fim de torn-los mais resistentes
s condies ambientais e com maior tempo de A produo de formulaes base de B.
prateleira (ALVES, 1998). thuringiensis passa por diversas fases como a
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escolha de uma linhagem geneticamente estvel,
altamente txica aos insetos alvo e que no apresente
necessidades nutricionais exigentes para a sua
produo em meio de cultivo, o que pode encarecer
a produo. Aps a seleo, feito um estudo sobre
sua produo em escala menor e posteriormente
em grande escala. Concomitante a esses estudos
ou aps a otimizao da produo, faz-se o estudo
da formulao, a qual tem por objetivo aumentar
a permanncia do produto no ambiente onde ser
aplicado e facilitar sua aplicao. So feitos tambm
testes da toxicidade do produto, tanto em condies
de laboratrio como em condies de campo
(COUCH, 2000). Muitas informaes referentes a
esses estudos no so divulgadas, por serem segredos
industriais dos produtores de bioinseticidas.
O objetivo desta reviso apresentar aspectos
gerais da biologia de B. thuringiensis, bem como de
aspectos relacionados sua produo.
A base da entomopatogenicidade de Bacillus
thuringiensis
Bacillus thuringiensis foi descrito em 1915
na Alemanha, isolado a partir de traa de farinha
(Anagasta kuehniella). Anteriormente, em 1902,
no Japo, o pesquisador Ishiwata j havia isolado
uma bactria a partir de Bombyx mori, que
posteriormente se soube ser tambm uma subspcie
de B. thuringiensis. A comercializao do primeiro
produto base de B. thuringiensis foi iniciada
em 1938 na Frana, com o nome de Sporeine
(BRAR et al., 2006; CAPALBO; VILAS-BAS;
ARANTES, 2004).
Pertencente famlia Bacillaceae, a qual engloba
a maioria das espcies formadoras de esporos, B.
thuringiensis um bastonete Gram-positivo, com
clula vegetativa de 1,0 a 1,2 m de largura por 3,0
a 5,0 m de comprimento, geralmente mveis. O
esporo dessa bactria possui formato elipsoidal e
localiza-se na regio central ou paracentral quando
no interior da clula-me. A espcie aerbia no
estrita com faixa de temperatura de crescimento
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entre 10 e 45 C. B. thuringiensis apresenta um
amplo complexo enzimtico, o que lhe permite
utilizar uma variedade de substratos. A principal
caracterstica que distingue a espcie das outras do
mesmo gnero a presena intracelular de um cristal
protico, cuja produo foi descoberta somente em
1953 por Hannay (GLARE; OCALLAGHAN,
2000; HABIB; ANDRADE, 1998; MORAES;
CAPALBO; ARRUDA, 2001; VILAS-BAS;
PERUCA; ARANTES, 2007).
A produo de cristais proticos representa
uma caracterstica tpica de B. thuringiensis e,
em geral, ocorre durante a esporulao. Estes
cristais apresentam atividade entomopatognica
para vrias espcies de insetos, destacando-se as
Ordens dos lepidpteros, dpteros e colepteros.
Porm, h subespcies de B. thuringiensis que
apresentam cristais txicos contra insetos das
Ordens Himenoptera, Hemiptera, Orthoptera,
Phthraphera e tambm para alguns nematides,
protozorios e caros (BRAR et al., 2006; GLARE;
OCALLAGHAN, 2000; SCHNEPF et al., 1998).
Os cristais de B. thuringiensis so formados
principalmente por protenas denominadas Cristal
(Cry), antigamente conhecidas como -endotoxinas
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007). Ao final da
esporulao, o cristal protico corresponde a cerca
de 20% a 30% do peso seco da clula, sendo liberado
no momento da lise celular (ARANTES et al., 2002;
GLARE; OCALLAGHAN, 2000).
Protenas Cry
As protenas Cry so consideradas como os
principais constituintes dos cristais que caracterizam
B. thuringiensis, so codificadas por genes que
geralmente se localizam em plasmdios e, com
menor freqncia, no cromossomo bacteriano.
Atualmente esto descritas 436 protenas Cry, sendo
que a cada ano novas protenas so descobertas.
Somente no ano de 2008 foram descritas 42 novas
protenas (CRICKMORE et al., 2008). Existe um
banco de dados on-line que, periodicamente, atualiza
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a classificao e nomenclatura das protenas Cry
(CRICKMORE et al., 1998, 2008). De acordo com
a definio mais aceita, uma protena considerada
Cry, quando forma uma incluso paraesporal
(cristal) em B. thuringiensis, exibe algum grau de
toxicidade a insetos alvos, ou apresente seqncia de
aminocidos similar a uma protena Cry j descrita
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007; SCHNEPF,
et al, 1998).
As protenas Cry so sintetizadas na forma de
protoxinas. Desta forma, sua ao depende de
processos de ativao, que ocorrem no interior
do aparelho digestrio do inseto. Atualmente, h
dois modelos, baseados em dados experimentais,
que explicam o modo de ao das toxinas Cry.
As primeiras etapas desses dois modelos so
idnticas: aps a ingesto dos cristais, esses so
solubilizados no intestino do inseto, local com pH
alcalino, liberando as protoxinas que so clivadas
por proteases do prprio inseto, resultando em
toxinas ativas, com cerca de 60 a 70% do tamanho
da protoxina. A toxina ativa capaz de ligar-se a
receptores especficos presentes nas microvilosidades
das clulas intestinais do inseto (BRAVO; GILLB;
SOBERN, 2007; SCHNEPF, et al., 1998).
O modelo de ao denominado formao de
poros o mais antigo e parece ser o mais comum
entre as diferentes ordens de insetos (Dpteros,
Lepidpteros e Colepteros). Segundo esse modelo,
a ligao da toxina com receptores especficos levaria
a formao de oligmeros de toxinas, os quais se
ligariam a receptores secundrios da membrana
da clula intestinal. Como resultado dessa ligao,
ocorreria a insero da toxina oligomrica na
membrana da clula epitelial intestinal, resultando
em poros nesse epitlio (BRAVO; GILLB;
SOBERN, 2007; BRAVO; SOBERN, 2008;
HABIB; ANDRADE, 1986).
Outro modelo, recentemente publicado,
denominado transduo de sinal e foi estudado
em apenas poucos insetos-alvos. De acordo com
esse modelo, a ligao da protena Cry com
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receptores especficos, induziria uma srie de
reaes intracelulares, que envolvem a protena
G e a adenilato ciclase, resultando no aumento da
concentrao de adenosina monofosfato cclico
(AMPc) intracelular e ativao da protena quinase
A. Todas essas conseqncias provocariam
um desequilbrio da presso interna celular,
danificando-a (BRAVO; SOBERN, 2008).
A ao das toxinas, seja por qualquer um dos
modelos, resulta na paralisia do aparelho digestrio,
ocasionando morte por inanio, paralisia geral
dos msculos e septicemia (BRAVO; GILLB;
SOBERN, 2007; BRAVO; SOBERN, 2008;
HABIB; ANDRADE, 1986; VALLETE-GELY;
LEMAITRE; BOCCARD, 2008).
A formao de protenas Cry determinada por
genes denominados cry e uma mesma linhagem de
B. thuringiensis pode conter um nico gene cry ou
vrias cpias de um mesmo gene, ou mesmo vrios
genes cry diferentes, determinando a formao
de diferentes protenas Cry, que podem compor
um ou mais cristais intracelulares. Grande parte
dos genes cry localiza-se em plasmdeos grandes,
freqentemente conjugativos, o que pode possibilitar
a passagem destes plasmdeos de uma linhagem
para outra, resultando na formao de linhagens
com uma grande diversidade de perfis de toxicidade
(CAPALBO; VILAS-BAS; ARANTES, 2004;
LERECLUS; DELCLUSE; LECADET, 1993).
A transcrio da maioria dos genes cry
dependente do fator sigma, produzido durante o
processo de esporulao, por isso a maior parte
das protenas que compem o cristal produzida
durante essa etapa. Apenas uma pequena parcela
dos genes cry regulada independentemente da
esporulao, sendo, portanto, expressos tambm
durante o crescimento vegetativo. Em ambos
os casos, a protena Cry fruto do metabolismo
secundrio (ARANTES et al., 2002; LERECLUS;
DELCLUSE; LECADET, 1993).
A massa molecular das protenas Cry varia
entre 40 e 140 KDa. A molcula destas protenas
 Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao

globular, formada por trs domnios estruturais Cyt1B, Cyt1C, Cyt2A e Cyt2B. O mesmo comit
ligados entre si por pequenas pontes. At o responsvel pela classificao das protenas Cry,
momento, seis protenas Cry tiveram suas estruturas tambm gerencia a classificao e nomenclatura das
bem determinadas por cristalografia por raios-X protenas Cyt (CRICKMORE et al., 2008).
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007). Estas
Assim como as protenas Cry, as Cyt tambm
protenas apresentam alto grau de similaridade entre
so sintetizadas na forma de protoxinas. No interior
seus domnios, indicando modo de ao similar. O
do inseto, as protenas Cyt sofrem quebras, onde
domnio I, composto pela extremidade N-terminal
suas pores C-terminal e N-terminal so clivadas,
das protenas, formado por cadeias polipeptdicas
liberando a toxina ativa. Ao contrrio das protenas
com estrutura em -hlice, sendo uma central
Cry, Cyt no se liga a receptores especficos da
(hidrofbica), cercada por 6 cadeias marginais. O
membrana celular, e sim, diretamente aos lipdios
domnio II composto por trs cadeias polipeptdicas
da membrana. Aps sua ligao, as protenas
antiparalelas com estrutura folha pregueada,
Cyt induzem a formao de poros ou agem
enquanto que o domnio III apresenta estrutura tipo
desestruturando a bicamada lipdica das membranas
sanduche (BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007).
(BRAVO; GILLB; SOBERN, 2007).
Embora estudos atuais indiquem que vrias
Vrios estudos tm demonstrado ocorrer um
pores dos diferentes domnios da protena se
efeito sinergstico entre as protenas Cry e entre
insiram na membrana no momento de formao dos
estas e as protenas Cyt, ou seja, a maior toxicidade
poros, acredita-se que o domnio I seja o principal
devida interao das protenas, onde uma
responsvel pela insero (NAIR; DEAN, 2008).
potencializa o efeito da outra (BRAVO; GILLB;
Os domnios II e III apresentam similaridades
SOBERN, 2007; SKAN et al., 2003).
estruturais com cadeias polipeptdicas que se ligam
a carboidratos e estariam envolvidos principalmente
no reconhecimento de receptores presentes na Outras toxinas produzidas por B.
membrana das clulas dos insetos-alvo (BRAVO; thuringiensis
GILLB; SOBERN, 2007).
Alm das protenas Cry e Cyt, B. thuringiensis
sintetiza outras toxinas que podem contribuir
Protenas Cyt para a ao entomopatognica. Em 1967 Heimpel
sugeriu o nome de -exotoxina para uma substncia
As protenas Cyt so definidas como protenas
termoestvel e txica para alguns insetos. Devido
com atividade hemoltica que compem uma
a sua estrutura qumica o nome -exotoxina vem
incluso paraesporal de B. thuringiensis, ou alguma
sendo substitudo por thuringiensina. Essas protenas
protena que apresente seqncia de aminocidos
possuem baixo peso molecular, a sua toxicidade
altamente similar s protenas Cyt j descritas.
relaciona-se a inibio da RNA polimerase, pois
Estas protenas apresentam uma similaridade
anloga a nucleotdeos. Embora no possua
estrutural com a valvatoxina, produzida pelo fungo
especificidade, a ao de thuringiensina contribui
Volvariella volvacea. As protenas Cyt so formadas
para a toxidade global das linhagens que a expressam
por apenas um domnio, composto por duas cadeias
(GLARE; OCALLAGHAN, 2000; HABIB;
externas em forma de -hlice, e uma cadeia interna
ANDRADE, 1998; LERECLUS; DELCLUSE;
em forma de -folha pregueada. Atualmente so
LECADET, 1993). Alguns trabalhos citam a
conhecidas 27 protenas Cyt (BRAVO; GILLB;
importncia dessa toxina no controle de besouros
SOBERN, 2007; CRICKMORE et al., 1998,
e algumas espcies de caros (WU et al., 2002). No
2008), classificadas em grupos principais: Cyt1A,
entanto, as linhagens comerciais de B. thuringiensis
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no devem produzir esta toxina, pois ela poderia
ocasionar efeitos adversos em organismos no
alvos.
Muitos sorotipos de B. thuringiensis produzem
protenas denominadas Vip (vegetative insecticidal
proteins), as quais so sintetizadas na etapa
vegetativa do crescimento. Essas protenas foram
descritas por Estruch et al. em 1996. Apesar de no
integrarem o cristal protico, elas contribuem para a
toxicidade global das linhagens que as apresentam
e possuem forma de intoxicao similar s das
protenas Cry (CRICKMORE et al., 2008; GLARE;
OCALLAGHAN, 2000). Alguns trabalhos relatam
a importncia das protenas Vip na ao inseticida
contra colepteras (Vip1 and Vip2) e lepidpteras
(Vip3), as quais parecem intensificar a ao das
protenas Cry (ESTRUCH et al., 1996; CHEN;
HONG; WU., 2003; SHI et al., 2004). Os estudos
de Yu et al. (1997) indicam que o principal modo de
ao das protenas Vip resulta na ruptura das clulas
do intestino, sendo essa a forma de ao primria
dessas toxinas.
No mesmo site onde se encontra a classificao
das protenas Cry e Cyt, pode ser encontrada
tambm a classificao e nomenclatura das protenas
Vip (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_
Crickmore/Bt/vip.html).
Em acrscimo s protenas Cry, Cyt e Vip, no
ano 2000, Mizuki et al. descreveram uma nova
toxina em uma linhagem de B. thuringiensis a
qual passou a ser denominada Parasporina. Este
termo definido como uma protena paraesporal
de B. thuringiensis e bactrias relacionadas, sem
atividade hemoltica e que apresentam a capacidade
de atacar clulas cancergenas em geral (OHBA et
al., 2008). Atualmente existem 14 paraesporinas
diferentes, classificadas em quatro grupos PS1A
a PS4A. A nomenclatura destas protenas segue
os mesmos critrios adotados para as protenas
Cry e Cyt e um comit fundado no ano de 2006
determina a classificao e a nomenclatura de novas
parasporinas (http://parasporin.fitc.pref.fukuoka.jp/
index.html).
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Alm das toxinas, o esporo de B. thuringiensis
tambm contribui para sua toxicidade, pois estes
podem germinar no interior do inseto-alvo,
ocasionando septicemia; ou potencializando o efeito
das toxinas em uma ao sinergstica (GLARE;
OCALLAGHAN, 2000; RAYMOND et al., 2008).
Produo de B. thuringiensis
Etapas da produo
Embora a produo de B. thuringiensis seja
bem estudada, h poucos dados na literatura a
esse respeito, visto que muitas informaes so
segredos industriais. Em geral, os produtos base
de B. thuringiensis so compostos por uma mistura
de cristais, esporos, poucas clulas vegetativas
e ingredientes secundrios da formulao
(CAPALBO; VILAS-BAS; ARANTES, 2004).
As principais etapas para a produo de B.
thuringiensis so: seleo da linhagem, estocagem,
processo fermentativo, recuperao do princpio
ativo (esporos e cristais), formulao do produto
e anlise da qualidade (MORAES; CAPALBO; F;
ARRUDA, 2001; COUCH, 2000).
Segundo Couch (2000) os principais critrios
para seleo de uma subespcie bacteriana para
produo de bioinseticidas so: espectro de
ao, potncia por unidade de volume da cultura,
requerimentos nutricionais, facilidade de produo,
estabilidade gentica e facilidade de estocagem.
A estocagem apropriada de grande importncia,
pois a linhagem deve conservar seu potencial
txico e velocidade de crescimento. No caso de
B. thuringiensis, as trocas de plasmdios ocorrem
com certa freqncia e h relatos de perda de
toxicidade aps sucessivas fermentaes, sendo
essencial a constante busca por novas linhagens e o
monitoramento durante o processo de fermentao
(COUCH, 2000; BIZARRI et al., 2008).
A forma mais comum de produo de B.
thuringiensis por fermentao submersa (lquida)
descontnua, tambm conhecida como processo
 Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao
em batelada. Nesta fermentao, um recipiente
contendo meio de cultura lquido inoculado com o
microrganismo, no havendo acrscimo ou retirada
significativa do meio fermentado. Portanto, ocorre
todo o desenvolvimento da cultura, sendo retirado
o produto apenas no final do processo. Em geral,
as protenas Cry de B. thuringiensis so formadas
no fim da fermentao, quando as condies do
meio se tornam desfavorveis, sendo o processo em
batelada satisfatrio para tal produo (MORAES;
CAPALBO; ARRUDA, 2001).
Alguns pesquisadores tm estudando as
fermentaes slida, contnua e em batelada
alimentada, porm at o momento, o mais vivel para
produo de protenas Cry ainda o processo em
batelada submersa (ADAMS; EITENAN; HANEL,
2002; CHEN; HONG; WU, 2003, MORAES;
CAPALBO; ARRUDA, 2001; VALLEJO et al.,
1999).
Na fermentao industrial os passos a serem
seguidos so: pr inculo, geralmente feito em
frascos pequenos, pr fermentador, comumente com
1/5 do volume da fermentao e o fermentador final.
Durante todas as etapas deve-se analisar a cultura
quanto contaminao, caractersticas morfolgicas
e potencial entomopatognico. Em geral, os reatores
utilizados permitem o controle das condies
principais de cultivo, as quais so: temperatura, pH,
aerao e agitao. O pr-inoculo, pr-fermentador
e o fermentador em volumes crescentes so feitos a
fim de diminuir o tempo da fase lag, ou seja, o perodo
de adaptao do microrganismo s condies de
cultivo. Em geral, pr fermentadores e fermentador
possuem os mesmos ingredientes no meio de
cultivo. importante limitar o nmero de passos no
processo de produo a fim de evitar contaminaes
e mudanas indesejveis no comportamento da
bactria (COUCH, 2000; MORAES; CAPALBO;
ARRUDA, 2001).
Ao final da fermentao, a cultura de B.
thuringiensis apresenta em mdia 6 a 8% de slidos,
sendo que os esporos e cristais podem corresponder
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
at a metade deste total. H vrios mtodos que
podem ser utilizados para a recuperao destes
cristais e esporos, sendo a centrifugao e a micro-
filtrao os mais comuns. importante ressaltar
que tais processos permitem a recuperao
principalmente das protenas Cry. Muitas outras
toxinas que podem contribuir para a toxicidade final
do produto so perdidas. Atualmente novas tcnicas
de recuperao e/ou concentrao do produto esto
sendo desenvolvidas para complementar as mais
utilizadas, destacando-se: a liofilizao e a flotao
(BRAR et al., 2006; COUCH, 2000).
Aps a recuperao dos metablitos de
interesse, os produtos so formulados. No caso
dos bioinseticidas, a formulao tem trs objetivos
principais: conferir estabilidade ao produto durante
a estocagem e aplicao, facilitar a aplicao do
produto e proteger o microrganismo e os cristais das
condies adversas do ambiente (BRAR et al., 2006;
COUCH, 2000). Embora sejam segredos industriais,
os produtos formulados geralmente contam com
uma combinao de aditivos reconhecidos pela
USA/FDA (Food and Drug Administration) ou
pelo rgo competente do pas. comum o uso de
dispersantes, protetores e surfactantes (GLARE;
OCALLAGHAN, 2000; BRAR et al., 2006).
Antes de ser comercializado, o produto formulado
deve passar por testes de anlise de qualidade
que atestem principalmente sua potncia txica.
Para B. thuringiensis, a toxicidade geralmente
analisada por meio de bioensaio com o inseto-alvo
(COUCH, 2000). Alm dos testes de toxicidade, os
bioinseticidas comercializados devem passar por
uma srie de testes que assegurem sua segurana
ambiental e sade humana. Em geral, so feitos
testes com mamferos sadios e imune-suprimidos,
os quais so submetidos exposio drmica,
ocular, inoculao intraperitoneal e subcutnea. Em
relao inocuidade ambiental, so feitos testes
para avaliar a toxicidade dos produtos sobre aves,
vertebrados aquticos, invertebrados, incluindo
insetos no-alvo, vegetais e at mel de abelhas. Estes
ensaios de toxicidade no devem indicar efeitos
951
 Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.

adversos significativos nos organismos testados,
o que garante a segurana ambiental dos produtos
(VILAS-BAS; PERUCA; ARANTES, 2007). Nos
Estados Unidos, esses testes so regulamentados
pela Agncia de Proteo Ambiental (US-EPA)
e departamento de agricultura dos estados, os
quais exigem uma licena para que o produto seja
comercializado. No Brasil, essa licena expedida
pela ANVISA (Agncia Nacional de Vigilncia
Sanitria), a qual tambm exige testes padres para
liberao da comercializao do produto.
Meios de cultura
A escolha do meio de cultivo adequado
extremamente importante para o sucesso de um
produto. Esta escolha deve proporcionar a mxima
produo com o mnimo custo (COUCH, 2000). Os
meios de cultivo para B. thuringiensis geralmente
possuem uma fonte de nitrognio, outra de carbono
e sais minerais. Algumas vezes se adicionam ao
meio alguns tampes e anti-espumantes a fim de
facilitar o processo. A fonte de carbono, alm de
fornecer matria prima para muitos compostos
celulares, serve como fonte de energia. O nitrognio
requerido principalmente para sntese de protenas
e cidos nuclicos. Os sais minerais atuam como
co-fatores, sendo tambm importantes no controle
da osmolaridade celular.
Couch (2000) cita os principais componentes
e suas concentraes utilizadas no cultivo de B.
thuringiensis na Amrica do Norte (Tabela 1).
Apesar das indstrias no revelarem a composio
de seus meios, sabe-se que estes geralmente so
resultantes da combinao dos produtos listados.
Muitos dos produtos utilizados so componentes
indefinidos, porm no devem apresentar muita
variao de um lote para outro.

Tabela 1. Principais ingredientes utilizados em meios de cultivo de bactrias entomopatognicas e suas

concentraes.

Ingrediente Concentrao (g/L)

Farinha de soja 20-40
Farinha da semente do algodo 14-30
Protena de batata 15-40
Licor de milho ou slidos derivados de milho 15-30
Glicose 10-30
Peptona 2-5
Xarope de milho 20-45
Melao 1.0-18.6
Glicerol 2.0-10
Amido de milho 10-15
Extrato de levedura 2.0
KH2PO4 1.0
K2HPO4 1.0
FeSO4 0.02
FeSO4.7H2O 0.0005-0.02
MgSO4. 7H2O 0.3
MnSO4. H2O 0.02
ZnSO4.7H2O 0.02
(NH4)2SO4 2
CuSO4.5H2O 0.005
CaCO3 1.0-1.5
Fonte: Couch, 2000.

952
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
 Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao
Meios alternativos vm sendo estudados a fim
de baratear o produto final, principalmente nas
produes regionais e em escala piloto. Vrios
autores obtiveram resultados satisfatrios com meios
de cultivo empregando componentes alternativos:
Poopathi et al. (2002) em cultivos em meio base
de batata, Vora e Shethna (1999) estudaram um
meio contendo extrato de soja suplementado com
cistina, e Prabakaran et al. (2008) desenvolveram
um meio de cultivo base de gua de coco.
No Brasil, a possibilidade de se utilizar meios
alternativos apresenta um amplo potencial tendo
em vista a diversidade natural e variabilidade da
agroindstria.
Vrios estudos tm sido feitos utilizando-se
como meio de cultivo para B. thuringiensis guas
residuais de indstrias e de estaes de tratamento
de gua, tais trabalhos tm apresentado bons
resultados, e muitas produes em escala piloto em
vrias regies do mundo j utilizam tais resduos
(LACHHAB; TYAGI;VALRO, 2002; MONTIEL;
TYAGI; VALERO, 2001; VIDYARTHI et al., 2002;
YEZZA et al., 2005, 2006; CHANG et al., 2008).
A fonte de carbono para cultivo de B. thuringiensis
varia muito conforme o objetivo da fermentao,
bem como qual linhagem est sendo cultivada. A
maioria dos trabalhos revela que a melhor fonte para
crescimento vegetativo no corresponde melhor
fonte para esporulao e formao dos cristais
proticos (IGEN; IGEN; ZCENGIZ, 2002b;
SKAN et al., 2003).
Os estudos de Igen, Igen e zcengiz (2002b)
indicam um efeito inibidor de altas concentraes de
glicose durante a sntese da -endotoxina. De acordo
com este trabalho, as melhores fontes de carbono
para produo dos cristais txicos e esporulao so
lactose, sacarose e inulina.
Segundo de skan et al. (2003), glicose, amido
e melao inibem a produo de protenas Cry, em
particular da protena Cry4B (134KDa). Este estudo
foi feito com B. thuringiensis subsp. israelensis e
ressalta o efeito repressor da glicose, a qual agiria em
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
etapas de fosforilao da protena quinase Calfostina
C, responsvel pela produo das protoxinas Cry.
Segundo os autores, as melhores fontes de carbono
para biossntese da -endotoxina seriam dextrina,
aveia, maltose, lactose, inulina, glicerol e sacarose,
sendo a dextrina a mais promissora de todas quanto
esporulao e produo de toxina.
Resultados conflitantes aos deste trabalho foram
obtidos por Vora e Shethna (1999) e Prabagaran et
al. (2004), os quais indicam o melao-de-cana como
uma boa fonte de carbono para produo de toxina.
Todos estes estudos, entre outros, comprovam que
necessrio otimizar um meio para cada sorotipo, ou
mesmo para cada linhagem, pois os resultados de
estudos com um determinado sorotipo muitas vezes
no podem ser extrapolados para outros.
As fontes de nitrognio podem ser tanto orgnicas
quanto inorgnicas, sendo comum a utilizao
conjunta das duas formas. Os estudos de Arcas,
Yantoro e Ertola (1984), Igen, Igen e zcengiz
(2002b), skan et al. (2003) e Zouari e Jaoua (1999)
indicam que o uso de apenas nitrognio inorgnico
no aconselhvel para o cultivo de B. thuringiensis,
pois h diminuio de crescimento, esporulao e
biossntese, em relao aos meios com nitrognio
orgnico e inorgnico. Dentre as mais promissoras
fontes de nitrognio inorgnico apontadas por estes
autores, destacam-se os fosfatos [NH4H2PO4 e
(NH4)2HPO4], isto , fosfato de amnia monobsico
e dibsico, respectivamente, e sulfato de amnia por
otimizarem esporulao e muitas vezes a produo
de toxinas.
Entre as fontes orgnicas de nitrognio, o
extrato de levedura bastante utilizado no cultivo
de B. thuringiensis, porm peptona e derivados de
soja apresentam resultados satisfatrios (VORA;
SHETNA, 1999; IGEN; IGEN; ZCENGIZ,
2002b; MORRIS; DEAN, 1997). Como fontes
alternativas, vm se destacando farinhas derivadas
de protena animal (farinha de peixe e de crislida) e
alguns cereais (cevada e trigo) (ALVES et al., 1997;
DEVI; RAVINDER; JAIDEV, 2005; GHRIBI;
953
 Angelo, E. A.; Vilas-Bas, G. T.; Castro-Gmez, R. J. H.
ZOUARI; JAOUA, 2005; MORRIS; DEAN, 1997;
PRABAKARAN; BALAMARAN, 2006; ZOUARI;
JAOUA, 1999).
A concentrao de sais no meio de cultivo
influencia diretamente a osmolaridade do mesmo.
Entretanto, no h consenso sobre qual porcentagem
de sais mais adequada, bem como quais os sais
que devem ser adicionados (ARCAS; YANTORO;
ERTOLA, 1987; IGEN; IGEN; ZCENGIZ,
2002a; SKAN; IGEN; ZCENGIZ, 2003).
Arcas Yantoro e Ertola (1987) obtiveram uma
boa produo de toxina com um meio contendo
osmolaridade de 808 miliosmol, tal trabalho
experimento clssico que resultou em um meio
bastante adotado para crescimento e produo de B.
thuringiensis. importante ressaltar que embora os
sais ajam como um todo na osmolaridade, cada on
fornecido pelos sais pode ter um efeito diferente.
Muitas vezes, produo e crescimento no esto
associados e a presena de alguns ons melhora um
parmetro e prejudica ou neutra para outro.
Os estudos de skan et al. (2003) e Igen, Igen
e zcengiz, (2002a) revelaram que o mangans
crtico para a diferenciao celular, sendo requerido
para esporulao e formao do cristal. Os melhores
resultados aparecem quando a concentrao de
mangans varia entre 10-6 e 10-4M, sendo que valores
maiores que estes se tornam txicos para todos os
processos celulares.
Assim como mangans, o magnsio influencia
o metabolismo secundrio, portanto, com efeito na
produo das protenas Cry. Sua concentrao ideal
em torno de 10-3 M. O clcio bastante importante no
processo de esporulao, promovendo a estabilidade
do cristal protico. A concentrao de 10-3 M de
clcio estimula a esporulao, porm inibidora
para o crescimento vegetativo e sntese protica. Ao
que parece, o clcio no essencial para a sntese
das protenas Cry. Desta forma, diversos estudos
recomendam o uso de concentraes menores
que 10-3 M de clcio, a fim de no comprometer
a formao das protenas Cry (IGEN; IGEN;
954
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
ZCENGIZ, 2002a; SKAN et al., 2003).
Metais como zinco, cobre e ferro apresentam
resultados negativos para o crescimento, esporulao
e produo de toxina Cry mesmo em concentraes
pequenas como 10-7 M (IGEN; IGEN;
ZCENGIZ, 2002a; SKAN et al., 2003).
Tendo em vista a influncia de diferentes
variveis, o desenvolvimento de meios de cultivo
para a produo de B. thuringiensis bastante
complexo. Alm disso, h uma variao muito
grande de uma linhagem para outra, o que, muitas
vezes, dificulta a extrapolao dos resultados de um
trabalho. Ressalta-se nesse sentido, a necessidade de
utilizao de mtodos de planejamento e otimizao
eficazes, como a metodologia de superfcie de
resposta, a qual leva em considerao vrios fatores
que influenciam em uma produo.
Parmetros fsicos durante a fermentao
Geralmente, os parmetros monitorados durante
o processo de fermentao so: temperatura, pH
e taxa de oxignio dissolvido. Sendo este ltimo
influenciado, principalmente, pelas taxas de aerao
e agitao (COUCH, 2000).
O cultivo de B. thuringiensis feito com
temperaturas em torno de 30C, sendo que
temperaturas superiores podem induzir a supresso
da formao de protenas Cry e conseqente
diminuio do rendimento. Da mesma forma,
temperaturas inferiores desaceleram o ciclo de
multiplicao celular, o que causa aumento no
tempo e conseqente custo da produo (MORAES;
CAPALBO; ARRUDA, 2001; COUCH, 2000).
O pH do processo fermentativo pode ser
monitorado por eletrodos sensveis a variaes, os
quais acionam reservatrios de cidos ou bases a fim
de manter o pH constante. Uma opo comumente
empregada para inibir variaes de valores de pH o
uso de solues tampo. No entanto, h controvrsias,
pois alguns estudos apontam que variaes na faixa
de pH podem proporcionar melhorias na produo,
 Bacillus thuringiensis: caracteristicas gerais e fermentao
enquanto outros consideram estas variaes
prejudiciais (IGEN; IGEN; ZCENGIZ, 2002a).
Essas variaes nos valores de pH durante o cultivo
de linhagens de B. thuringiensis em diferentes meios
de cultivo j foi demonstrada anteriormente, como
no estudo de Abdel-Hameed (2001), com o meio
TYG-agar, base de triptona, extrato de levedura e
glicose e com pH inicialmente neutro. Neste estudo
sem controle de pH, a cultura apresentou reduo
nos valores de pH para valores cidos no incio
da esporulao, seguindo-se de valores alcalinos
no final do processo de fermentao (ABDEL-
HAMEED, 2001).
A quantidade de oxignio dissolvido no meio
de cultura dependente de diversos fatores como
osmolaridade do meio, taxa de aerao e agitao
(COUCH, 2000). Este um fator bastante crtico para
biossntese das protenas Cry por B. thuringiensis e
deve ser bem analisado, pois em grandes volumes
de fermentao o suprimento adequado de oxignio
torna-se ainda mais difcil e oneroso.
Segundo o estudo de Wu et al. (2002) a morfologia
das clulas de B. thuringiensis ao microscpio
ptico pode variar conforme as mudanas nos
parmetros de cultivo, com especial destaque para
o suprimento de oxignio, sendo que o excesso de
aerao pode provocar uma desacelerao no ciclo
de produo das protenas Cry, por estender demais
a fase de crescimento. Os estudos de Maldonado-
Blanco, Romero e Galn-Wong (2003) indicam
uma melhor produo de protenas Cry quando o
oxignio dissolvido est em torno de 26%. Este
valor conseguido com uma agitao de 300 rpm
e aerao de 1vvm ou 500 rpm e 0.6vvm, para
B. thuringiensis subespcie israelensis em um
fermentador de 5 litros.
Embora muitos estudos sejam feitos analisando-
se os parmetros individuais, o cultivo deve ser visto
e estudado como um todo. Neste sentido destaca-
se o mtodo de superfcie de resposta que permite
uma anlise mais ampla dos parmetros, bem como
o estudo da combinao destes fatores (HSU; WU,
2002).
Semina: Cincias Agrrias, Londrina, v. 31, n. 4, p. 945-958, out./dez. 2010
Concluses
Devido s caractersticas biolgicas, B.
thuringiensis destaca-se como a principal
bactria utilizada no controle biolgico. No
entanto, a utilizao de produtos derivados desse
entomopatgeno menos difundida no Brasil
que em pases desenvolvidos, sendo necessria
a divulgao de produtos, implementao de
produes regionais, as quais diminuem o custo e o
estabelecimento de incentivos para implantao de
programas de manejo integrado de insetos (MIPs).
Apoio financeiro: Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPq)
por meio de concesso de bolsa de mestrado.
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