ANALISIS DENGAN SPEKTROFOTOMETER

I. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat membuat kurva kalibrasi.
2. Mahasiswa mampu menganalisis sampel dengan mengggunakan alat
spektrofotometer.

II. Dasar Teori

Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang didasarkan pada pengukuran

serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang
yang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector
vakum phototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer,
yaitu suatu alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa secara kualitatif maupun
kuantitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu senyawa sebagai
fungsi konsentrasi. Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari
tingkat energi yang rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Pada spektrofotometri ini
yang digunakan sebagi sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible
termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang
gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat
dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, atau warna apapun. Selama ia dapat
dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (Khopkar 2003).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
tungsen. Tungsen yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan
symbol W dan nomor atom 74. Tungsen mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 oC)
dibanding logam lainnya, karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanyalah sample yang memiliki warna. Hal
ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu,
untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dahulu dibuat berwarna dengan
menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang
digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa.
Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Metode
analisisnya didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu laju
larutan berwarna pada panjang gelombang spesifik (Setiono dan Dewi 2013).
Serapan dinyatakan dengan nilai intensitas absorbansi pada panjang gelombang
maksimal. Pengukuran konsentrasi cuplikan didasarkan pada hukum Lambert Beer, yang
menyatakan hubungan antara banyaknya sinar yang diserap sebanding dengan konsentrasi
unsur dalam cuplikan, dengan rumus sebagai berikut :
A = log I/Io atau A = a.b.c
dengan :
A = absorbansi
a = koefisien serapan molar
b = tebal media cuplikan yang dilewati sinar
c = konsentrasi unsur dalam larutan cuplikan
Io = intensitas sinar mula-mula
I = intensitas sinar yang diteruskan
Aplikasi rumusan tersebut dalam pengukuran kuantitaf dilaksanakan dengan cara
komparatif menggunakan kurva kalibrasi dari hubungan konsentrasi deret larutan standar
dengan nilai absorbansinya. Konsentrasi cuplikan ditentukan dengan substitusi nilai
absorban cuplikan ke dalam persamaan regresi dari kurva kalibrasi (Fatimah 2009).
Spektrofotometer UV berbeda dengan spektrofotometri visible, pada spektrofotometri
UV berdasarkan interaksi sample dengan UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-
380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga
heavy hydrogen. Dia merupakan isotop hydrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di
laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron. Nama
deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros yang berarti dua. Mengacu pada intinya
yang memiliki dua partikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka
senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak
memliliki warna, bening dan transparan. Spektrofotometri UV memang lebih simple dan
mudah disbanding spektrofotometri visible, karena banyak kemungkinan terjadi
interferensi dari senyawa lain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV.
Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa (Khopkar, 1990).
 Gambar 6.1. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotmeter UV-VIS, spektrofotometri ini merupakan gabungan antara

spektrofotometri UV dan Visible. Menggunaka dua buah sumber cahaya berbeda. Sumber
cahaya UV dan sumber cahaya Visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah
menggunakan satu sumber sinar sebagai sumber UV dan VIS, yaitu Photodiode yang
dilengkapi dengan monokromator. Untuk system spektrofotometri UV-VIS paling banyak
tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan
baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Khopkar, 1990).
Larutan blanko merupakan larutan yang tidak mengandung analat untuk dianalisis
(Basset, 1994). Larutan blanko digunakan sebagai kontrol dalam suatu percobaan sebagai
nilai 100% transmitans. Kurva standart merupakan standart dari sample tertentu yang dapat
digunakan sebagai pedoman atau acuan untuk sample tersebut pada percobaan. Pembuatan
kurva standart bertujuan untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi larutan dengan
nilai absorbansinya, sehingga konsentrasi sample dapat diketahui. Terdapat dua metode
untuk membuat kurva standart yakni dengan metode grafik dan metode least square
(Underwood, 1990).
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau
absorban suatu sample sebagai fungsi panjang gelombang. Tiap media akan menyerap
cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk.
Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari empat bagian penting yaitu :

a. Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang
stabil dan intensitasnya tinggi. Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah
tampak, ultraviolet dekat dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan
kawat rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola lampu
pijar biasa. Daerah panjang gelombang (I) adalah 350-2200 nm.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan cahaya polikromatis
menjadi beberapa komponen panjang gelombang tertentu (monokromatis) yang
berbeda (terdispersi).

c. Kuvet
Kuvet adalah alat yang digunakan sebagai tempat cuplikan yang akan dianalisis.
Kuvet biasanya terbuat dari kuarsa, plexiglass, kaca, plastik dengan bentuk tabung
persegi empat, panjang 1x1 cm dan tinggi 5 cm. pada pengukuran di daerah UV
dipakai kuvet kuarsa atau plexiglass, sedangkan kuvet dari kaca tidak dapat dipakai
sebab kaca mengabsorbsi sinar UV. Semua macam kuvet dapat dipakai untuk
pengukuran di daerah sinar tampak (visible).

d. Detector
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian
diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan
dalam bentuk angka-angka pada reader (komputer).
Terdapat beberapa jenis detector pada spektrofotometer :

Tabel 6.1. Jenis detector pada spektrofotometer

Jenis detector range (nm) Sifat pengukuran Penggunaan

Phototube 150 1000 arus listrik UV
Photomultiplier 150 1000 arus listrik UV/Vis
Thermocouple 600 20.000 arus listrik IR
Thermistor 600 20.000 hambatan listrik IR
 Secara sederhana instrument spektrofotometri yang disebut spektrofotometer terdiri dari
: sumber cahaya monokromator sel sampel detector read out (pembaca).

Gambar 6.2. Bagan optis instrumentasi UV-Visible

Proses absorbsi cahaya pada spektrofotometri adalah ketika cahaya dengan berbagai
panjang gelombang (cahaya polikromatis) mengenahi suatu zat, maka cahaya dengan
panjang gelombang tertentu saja yang akan diserap. Di dalam suatu molekul yang
memegang peran penting adalan elektron valensi dari setiap atom yang ada sehingga
terbentuk suatu materi. Elektron-elektron yang dimiliki oleh suatu molekul dapat berpindah
(eksitasi), berputar (rotasi), dan bergetar (vibrasi) jika dikenai suatu energi. Jika zat
menyerap cahaya tampak dan UV maka akan terjadi perpindahaan elektron dari keadaan
dasar menuju ke keadaan tereksitasi. Perpindahan elektron ini disebut transisielektronik.
Apabila cahaya yang diserap adalah cahaya inframerah maka electron yang ada dalam atom
atau elektron ikatan pada suatu molekul dapat hanya akan bergetar (vibrasi). Sedangkan
gerakan berputar elektron terjadi pada energi yang lebih rendah lagi misalnya pada
gelombang radio.
Atas dasar inilah spektrofotometri dirancang untuk mengukur konsentrasi larutan yang
ada dalam suatu sampel. Dimana zat yang ada di dalam sel sampel disinari dengan cahaya
yang memiliki panjang gelombang tertentu. Ketika cahaya mengenahi sample sebagian
akan diserap, sebgian akan dihamburkan dan sebagian lagi akan diteruskan. Pada
spektrofotometri, cahaya datang atau cahaya masuk atau cahaya yang mengenahi
permukaan zat dan cahaya setelah melewati zat tidak dapat diukur, yang dapat diukur
adalah It/Io atau Io/It (perbandingan cahaya dating dengan cahaya setelah melewati materi
(sampel).
 Proses penyerapan cahaya oleh suatu zat dapat digambarkan sebagai berikut :

Gambar 6.3. Proses penyerapan cahaya oleh zat dalam sel sampel

Pengenceran adalah menurunkan atau memperkecil konsentrasi larutan dengan

menambahkan pelarut pada proses pengenceran. volume dan molaritas berubah sedangkan
jumlah molarnya tetap, oleh karena itu berlaku rumus :
V 1 . M1 = V 2 . M2

Keterangan :

M1 = Molaritas larutan sebelum pelarutan

V1 = Volume larutan seblum pelarutan
M2 = Molaritas larutan setelah pelarutan
V2 = volume larutan setelah pelarutan

Pengenceran yaitu suatu cara atau metode yang diterapkan pada suatu senyawa dengan
jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral. Larutan dipakai yaitu aquades dalam
jumlah tertentuan. penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya
kadar kepekatan atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang di larutkan diencerkan.

Metode yang digunakan dalam analisis kuantitatif

a) Metode satu standar

Pengukurannya berdasarkan hokum Beer, namun standar yang dipaki hanya satu.
Jika tidak bias didapatkan suatu grafik yang lebih atau sesuai kelemahan system
ini. Jika standar salah maka hasil analisa yang dilakukan semua akan salah.
Rumus pada larutan standar , As = .b.Cs
Rumus pada larutan sampel, Ax = .b.Cx

Jadi, Cx = x Cs

Keterangan :
Cx = Konsentrasi sampel
As = Absorbansi larutan standar
Ax = Absorbansi sampel
Cs = Konsentrasi larutan standar

b) Metode kurva Kalibrasi

Metode kurva kalibrasi standar yaitu dengan membuat kurva antara konsentrasi
larutan standar (sebagai absis) lawan absorbansi (sebagai ordinat) di mana kurva
tersebut berupa garis lurus . Kemudian dengan cara menginterpolasikan absorbansi
larutan sampel ke dalam kurva standar tersebut dan akan diperoleh konsentrasi
sampel.

Absorbansi
sampel

Absorbansi
larutan Konsentrasi
standar sampel

Konsentrasi larutan

Gambar 6.4 Kurva Kalibrasi

A = a + bC
Keterangan :
A = Absorbansi
a = Intersep
b = Slope
C = Konsentrasi
III. Alat dan Bhan
1. Alat
a) Beker gelas
b) Pipet ukur 1 ml
c) Pipet ukur 25 ml
d) Pipet ukur 10 ml
e) Ball filler
f) Labu takar
g) Spektrofotometer genesys 10 UV
h) Pipet tetes
i) Kuvet
2. Bahan
a) Sampel ( dari teknisi )
b) Larutan KMnO4 0,05M
c) Aquades
IV. Skema Kerja
1. Pengenceran larutan KMnO4

Larutan KMnO4 0,05 M Aquades 24,5 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 10.10-4 M Aquades 5 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 8.10-4 M Aquades 7 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 5,76.10-4 M Aquades 10 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 3,45.10-4 M Aquades 16 ml

diencerkan

Larutan KMnO4 1,25.10-4 M

Gambar 6.5. Skema kerja pengenceran larutan KmnO4

2. Mengukur absorbansi untuk mencari panjang gelombang maksimum

Larutan baku KMnO4 10.10-4 M

Diukur absorbansinya pada 500-560 nm

Didapatkan hasil maksimum dari absorbansi tertinggi

Gambar 6.6. Skema kerja pengukuran absorbansi untuk mencari maksimum

3. Pengukuran absorbansi larutan dan membuat kurva kalibrasi

Mengukur absorbansi masing masing larutan hasil

pengenceran pada maksimum (525 nm)

Diperoleh data absorbansi masing masing konsentrasi

Membuat kurva kalibrasi dari hasil pengukuran

konsentrasi dengan absorbansinya

Gambar 6.7. Skema kerja pengukuran absorbansi larutan

4. Pengukran absorbansi larutan sampel

Larutan sampel

Di ukur pada maksimum (525 nm)

Diperoleh nilai absorbansi

Gambar 6.8. Skema kerja pengukuran absorbansi larutan

V. Analisis data dan Pembahasan
1. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 0,05 M = 25 ml . 10.10-4 M
V1 = 0,5 ml

2. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 10.10-4 M = 25 ml . 8.10-4 M
V1 = 20 ml

3. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 8.10-4 M = 25 ml . 5,76.10-4 M
V1 = 18 ml

4. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 5,76.10-4 M = 25 ml . 3,45.10-4 M
V1 = 15 ml

5. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 3,45.10-4 M = 25 ml . 1,25. 10-4 M
V1 = 9 ml

Tabel 6.1 Data Perhitungan Analisis

Kuvet Konsentrasi V1 M1 V2 M2
1 10.10-4 M 0,5 ml 0,05 M 25 ml 1.10-3 M
2 8.10-4 M 20 ml 10.10-4 M 25 ml 8.10-4 M
3 5,76.10-4 M 18 ml 8.10-4 M 25 ml 5,76.10-4 M
4 3,45.10-4 M 15 ml 5,76.10-4 M 25 ml 3,45.10-4 M
5 1,25.10-4 M 9 ml 3,45.10-4 M 25 ml 1,25.10-4 M
Tabel 6.3. Penentuan panjangan gelombang maksimal

No Panjang gelombang (nm) Absorbansi (A) Keterangan

1 500 0,715 -
2 505 0,820 -
3 510 0,845 -
4 515 0,855 -
5 520 0,945 -
6 525 1,038 max
7 530 0,996 -
8 535 0,916 -
9 540 0,958 -
10 545 1,002 -
11 550 0,943 -
12 555 0,771 -
13 560 0,664 -

Tabel 6.4. Pengukuran absorbansi larutan dengan max = 525 nm

No Konsentrasi (M) Absorbansi (A)

1 0,0001 1,038
2 0,0008 0,828
3 0,000576 0,601
4 0,000345 0,361
5 0,000125 0,143
6 Sampel 1,139
 Dari kurva kalibrasi larutan KMn04 dapat di buat berdasarkan data konsentrasi dan
absorbansi tersebut yakni sebagai berikut :

Kuva Kalibrasi
1,2

1 y = 1023,5x + 0,0116

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,0002 0,0004 0,0006 0,0008 0,001 0,0012

Gambar 6.9. Kurva Kalibrasi

Berdasarkan persamaan kalibrasi yang telah didapatkan,maka dapat mengetahui nilai

absorbansi dari larutan sampel yang telah disediakan pada maksimum yaitu 525 nm,
didapatkan nilai absorbansi larutan sampel sebsar 1.139 A. Sehingga konsentrasi larutan
sampel dapat dihitung berdasarkan nilai absorbansinya melalui persamaan kurva kalibrasi,
dimana Y adalah nilai absorbansi .

Y = 1023,5 X + 0,0116

1,139 = 1023,5 X + 0,0116

1023,5 X = 1, 139 0,0116

1023,5 X = 1,1274

X = 1,1015 x 10-3

Jadi nilai konsentrasi larutan sampel tersebut adalah 1,1015 x 10-3

VI. Kesimpulan dan Saran

Simpulan
1. Persamaan kurva kalibrasi didapatkan berdasarkan hubungan antara konsentrasi
larutan dengan nilai absorbansinya.
2. Pengukuran konsentrasi sampel yang belum teridentifikasi dapat diketahui dengan
perhitungan menggunakan persamaan kurva kalibrasi.

Saran
1. Diperlukan ketelitian dalam melakukan pengenceran zat yang digunakan (KMnO4)
untuk mendapatkan kurva kalibrasi yang baik.
2. Diperlukan kecermatan dalam menggunakan atat-alat yang terbuat dari kaca,
terutama spektrofotometer.
 DAFTAR PUSTAKA

Cairns,D. 2009. Intisari Kimia Farmasi. Edisi 2. Jakarta : Penerbit Buku Kedokteran EGC.
Fatimah S.2009.Pengaruh uranium terhadap analisis menggunakan spektrofotometer UV-
VIS.[Seminar Nasional].Serpong(ID) BATAN
Khasana,nisa.N,Nia,prillizya,steephanny,dan desy.2015.Studi Aplikasi Metode
Spektrofotometri pada Penentuan Kandungan Logam Besi dalamSampel Air).Bandung.
jurnal analitik spektrofotometri UV-vis.
Khopkar. 1990. Konsep Dasar Analitik. Jakarta : UI Press.
Khopkar SM. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta (ID): UI Press.
Setiono M dan Dewi avriliana. 2013. Penentuan jenis solven dan pH optimum pada analisis
senyawa delphinidin dalam kelopak bunga rosela dengan metode spektrofotometri UV-
VIS. Jurnal Teknologi Kimia dan Industri 2(2):91-96.