Medicin de la citotoxicidad: una nueva perspectiva sobre LC50

Abstracto. Antecedentes: La citotoxicidad en el cultivo celular se expresa tpicamente como

LC50, la concentracin de un agente dado que es letal para el 50% de las clulas. Este nmero
depende del tiempo de incubacin con el agente. Anteriormente, se ha propuesto un modelo
exponencial de dos trminos para describir el crecimiento celular despus de un evento
citotxico: y (t) = k1 * exp (-d1 * t) + k2 * exp (d2 * t). Se observ una relacin dosis-respuesta
entre el parmetro k2 en esta frmula y la concentracin del agente citotxico etopsido en las
clulas de glioma de alto grado, independientemente del tiempo de incubacin. Materiales y
Mtodos: Para probar si el modelo se puede aplicar de forma ms general, se usaron clulas de
meduloblastoma DAOY tratadas con MS275, un inhibidor de la histona desacetilasa. Resultados:
Los datos observados se ajustan bien al modelo. Conclusin: La concentracin a la que k2 se
reduce en un 50% se denomina KC50. Proporciona una descripcin mucho mejor de la
citotoxicidad de un agente en una lnea celular especfica que la LC50 tradicional.
Introduccin
Cuando se describe la toxicidad in vivo de un nuevo agente, la mayora de las personas usan la
DL50 (1, 2). Por definicin, la DL50 es la dosis que mata a la mitad de la poblacin analizada en
un modelo animal. Anlogamente, la forma ms comn de describir la citotoxicidad en cultivo
celular es la CL50, es decir, la concentracin de un frmaco que mata a la mitad de las clulas
ensayadas en cultivo (3, 4). Sin embargo, a diferencia de la DL50, la CL50 en cultivo celular
depende en gran medida del tiempo de incubacin. Por ejemplo, en algunos frmacos, el rea
bajo la curva de tiempo de incubacin (AUC) es la misma para diferentes tiempos de incubacin.
En estas circunstancias, la CL _ {50} durante un periodo de incubacin de 24 horas sera el doble
de la CL _ {50} para una incubacin de 48 horas. Sin embargo, este no es el caso de todos los
agentes quimioteraputicos (5). Para complicar an ms las cosas, la LC50 tambin depende en
gran medida del tiempo transcurrido entre el comienzo de la exposicin al frmaco y la medicin
del nmero de clulas supervivientes, a menudo denominado tiempo de recuperacin o perodo
de lavado (5, 6). Esto hace que LC50 sea mucho menos confiable de lo que se anticipa. Una gran
parte de la literatura describe la investigacin sobre la citotoxicidad de drogas con diferentes
escenarios - una bsqueda de citotoxicidad en PubMed dio lugar a 54.147 entradas a partir de
agosto de 2006. Modelado matemtico de la citotoxicidad tambin ha sido un tema de
investigacin activa (7-9). Recientemente, se propuso un modelo exponencial que describe la
citotoxicidad del frmaco en cultivo celular (10). El modelo se desarroll a partir de
experimentos que trataban la lnea celular de glioblastoma humano U87 MG con concentraciones
variables de etopsido. Los datos observados podran explicarse por una frmula simple con
cuatro parmetros que reconoce una subpoblacin celular que muere en respuesta a la exposicin
a frmacos y una segunda subpoblacin que crece a pesar de la presencia del frmaco. La
segunda subpoblacin, descrita por dos parmetros, se puede usar para calcular la eficacia de la
muerte celular de un agente citotxico en cualquier concentracin.

Se plante la hiptesis de que este modelo exponencial tambin describira la toxicidad en otros
tipos de clulas y otros tratamientos. La hiptesis se ensay usando clulas de meduloblastoma
humano DAOY y tratamiento con MS275, un inhibidor de la histona desacetilasa. Las clulas
DAOY y MS275 se eligieron porque:
(i) queramos determinar si el modelo exponencial de dos trminos descrito previamente
para los agentes citotxicos tradicionales en glioma tambin puede ser vlido para
modificadores epigenticos y otro tipo celular, en este caso meduloblastoma
(ii) los experimentos tambin fueron necesarios como parte de la evaluacin preclnica
posiblemente conduce a un estudio clnico de fase I para tratar a nios con
meduloblastoma recidivante usando MS275 junto con otros tratamientos.

En trminos ms generales, se definieron los valores de KCn, es decir, las concentraciones que
matan n porcentaje de las clulas analizadas. Adems, el KCn obtenido a partir de este enfoque
es independiente del tiempo de incubacin o del tiempo de recuperacin. As, el modelo
proporciona una Alternativa a LCn y, en particular, a CL50.
Materiales y Mtodos
Lnea celular. La lnea celular de meduloblastoma humano DAOY se obtuvo de la American
Tissue Culture Collection (Manassas, VA, EE.UU.). Esta lnea celular se estableci a partir de un
varn caucsico de 4 aos con meduloblastoma desmoplsico y crece como una monocapa,
unida como clulas poligonales, con un tiempo medio de duplicacin de 34 horas. Estas clulas
se mantuvieron en DMEM de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con suero
bovino fetal al 10% (Mediatech, Herndon, VA, EE.UU.), penicilina y estreptomicina. Las clulas
se incubaron con CO2 al 5% a 37 grados y se plaquearon en matraces de cultivo de tejidos T-75.
Las clulas adherentes se pusieron en subcultivo a una confluencia del 70% durante
aproximadamente 3-4 das.
Agente citotxico. Se disolvi MS275 (Axxora) en metanol al 70%. Se prepar una solucin
madre 100 M. Se realizaron diluciones en serie en medio de crecimiento completo para
conseguir las concentraciones deseadas.
Ensayo MTT. Cinco mil clulas por pocillo se sembraron en una placa de 96 pocillos (B.D.
Bioscience Falcon, Bedford, MA, EE.UU.). Las clulas se dejaron adherir durante 24 h a 5% de
CO _ {2} ya 37C. Se aadieron a las clulas varias concentraciones de MS275, que oscilaban
entre 0,03 \ mu M y 20 \ muM. La incubacin continu durante diferentes longitudes de tiempo
(24, 48, 72, 96 y 144 h). Las clulas de control eran clulas no tratadas. Despus de la
incubacin, se eliminaron los medios y el frmaco y se aadi 3- (4,5 dimetiltiazol - 2il) - 5- (3 -
carboximetoxifenil) - 2- (4 - sulfofenil) - 2H - tetrazolio (MTT) a 100 \ mu l por pocillo Durante
1 h a 37C, seguido de 100 \ mu l de tampn de lisis (SDS al 20%, solucin salina tamponada
con fosfato al 30% (PBS) y dimetilformamida al 50%). La absorbancia se determin por
espectrofotometra como una longitud de onda de 570 nm con un instrumento Spectramax plus
384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EE.UU.) con el software Softmax (SoftMax, San
Diego, CA, EE.UU.). Se obtuvieron curvas dosis-respuesta en diferentes momentos. Todos los
experimentos se repitieron 8 veces.
Modelado matemtico. El modelo previamente desarrollado (10) describe el nmero de clulas
postratamiento de dos procesos separados: apoptosis de la primera subpoblacin y proliferacin
celular de la segunda subpoblacin, que no se ve afectada por el tratamiento. Ambos procesos se
describen exponencialmente dependiendo del tiempo. Por consiguiente, el nmero de clulas
tumorales postratamiento se expresa mediante esta frmula:

Donde y (t) denota el nmero de clulas tumorales en el tiempo t. Los parmetros k1, k2, d1 y d2
tienen valores positivos. El parmetro k1 indica el nmero de clulas en la primera subpoblacin
(frmaco afectado) en el tiempo 0, mientras que k2 representa el nmero de clulas en la segunda
subpoblacin (frmaco no afectado) en el tiempo 0. En este modelo, el exponente negativo -d1 *
T conduce a la disminucin exponencial del nmero de clulas en la primera subpoblacin; El
exponente positivo d2 * t conduce al aumento exponencial del nmero de clulas en la segunda
subpoblacin. El proceso de ajuste de Zhang et al. Tambin se adopta aqu (10). Es decir, d1 se
determina en primer lugar, utilizando datos observados de altas concentraciones y un modelo
exponencial de un solo trmino:

El parmetro d2 se determina de forma similar usando datos observados a partir de

concentraciones bajas y un modelo exponencial de un solo trmino:

A continuacin, los valores d1 y d2 resultantes se mantienen constantes y se utilizan para ajustar

el nmero de clulas de las concentraciones intermedias de frmaco al modelo [1], donde slo se
desconocen k1 y k2.
Figura 1. Grfico del nmero de clulas en el tiempo de las clulas DAOY expuestas a
concentraciones MS275 variables. El eje vertical muestra las lecturas de densidad ptica de los
ensayos MTT que representan el nmero de clulas tumorales, y el eje horizontal muestra el
tiempo en horas de tratamiento con frmaco.
El valor de k2 mide directamente la toxicidad del frmaco. As, los valores de k2 obtenidos y las
concentraciones de frmaco se ajustan a este modelo sigmoidal:

Donde x indica concentracin de frmaco y p1, p2, p3 son parmetros positivos independientes
de las concentraciones de frmaco. El procedimiento de ajuste para cada una de las frmulas se
realiz utilizando la funcin "ajuste" proporcionada por el software MATLAB (Mathworks,
Natick, MA, EE.UU.).
Resultados y discusin
MS275 en DAOY. Las clulas de meduloblastoma humano ensayadas aqu eran sensibles a
MS275 de una manera dependiente de la dosis y del tiempo. Los efectos de diferentes
concentraciones de frmaco sobre el crecimiento celular se muestran en la Figura 1. Cuando las
concentraciones de MS275 fueron altas (por ejemplo, 2,5 M), el nmero de clulas no se
recuper en 144 h. Cuando las concentraciones eran bajas (por ejemplo, 0,32 M), el nmero
de clulas aument exponencialmente con el tiempo. Esto es consistente con los resultados de
otros que mostraron efectos citotxicos de otros inhibidores de la histona desacetilasa (12, 13) y
efectos en otras lneas celulares de meduloblastoma (14).
Figura 2. Grfico de los parmetros k1 y k2 en el
modelo [1] frente a las concentraciones de
frmaco. El eje vertical muestra los valores de k1
y k2, y el eje horizontal muestra el logaritmo
(natural) de las concentraciones de frmaco. Los
valores del parmetro k2 y las concentraciones de
frmaco se ajustan al Modelo [4]

Determinacin de los parmetros. Para calcular el valor de d1, los datos de las dos
concentraciones ms altas de MS275 (5 M y 2,5 M) se utilizaron y se ajustaron al Modelo [2].
(Los nmeros de clulas de concentraciones 10 M eran esencialmente cero, ya que casi todas
las clulas fueron sacrificadas por el frmaco). El valor calculado fue d1 = 1,918 x 10-2. Para
calcular el valor de d2, se utilizaron los datos de las dos concentraciones MS275 ms bajas (0,038
M y 0,075 M) y se ajustaron al modelo [3]. El valor calculado fue d2 = 1.208x10-2.

Utilizando los valores obtenidos para d1 y d2, los datos del nmero de clulas de todas las
concentraciones se ajustaron al modelo [1].
Los valores calculados para k1 y k2 se muestran en la Tabla I y la Figura 2. Los datos originales
podran ajustarse estrechamente al modelo como se ha descrito anteriormente. La concentracin
de MS275 se correlacion con k2, pero no con d1 o d2, lo que sugiere que la tasa de muerte
celular y la tasa de crecimiento despus del tratamiento fue independiente de la concentracin de
frmaco. Los resultados derivados de estos datos son similares a los de nuestro trabajo anterior
(10).
Por lo tanto, este trabajo presenta una mayor validacin del modelo de dos trminos [1] para el
nmero de clulas tumorales y el modelo sigmoidal [4] para la citotoxicidad, a pesar de los
diferentes tipos de clulas, los agentes citotxicos y los tiempos de exposicin utilizados. En
nuestro trabajo anterior, el frmaco etopsido se elimin despus de 24 h de tratamiento de las
clulas tumorales. En este trabajo, MS275 permaneci con las clulas tumorales durante todo el
curso de incubacin. Esto valida el modelo [1] y sugiere fuertemente que las clulas de la
subpoblacin descritas por el segundo trmino de la frmula (k2 * exp (d2 * t)) no fueron
afectadas por la presencia de drogas y continu creciendo durante la exposicin a la misma
velocidad.
Tabla I. Valores calculados para los parmetros k1 y k2 que se ajustan al modelo exponencial de
dos trminos para diferentes concentraciones de frmaco.

Determinacin de la relacin entre el parmetro k2 y la concentracin de frmaco.

Los valores de k2 y las concentraciones de frmaco se ajustaron al modelo sigmoidal [4]. Los
coeficientes son p1 = 0,127, p2 = 4,168 y p3 = 2,166. Por lo tanto, el nmero de clulas
tumorales y (t) puede ser modelado como una funcin de t como en el modelo [1].
Particularmente para concentraciones bajas de frmaco o para grandes valores de t, y (t) puede
ser aproximado por:

Donde t representa el tiempo y x indica la concentracin de frmaco. Estos resultados sugieren

una alternativa al valor tradicional de CL50. El valor de CL50 depende del punto de tiempo de
observacin: la medida de CL50 en un solo punto de tiempo puede ser mayor si las clulas
continan muriendo (medicin temprana) o ms bajas si las clulas comienzan a recuperarse
(medicin tarda). El k2 en el Modelo [1] proporciona una nueva medida de la eficacia del
frmaco, evitando as esta dificultad. Definimos el trmino KC50 como la concentracin del
frmaco probado que da como resultado un valor k2 que es 50% del valor k2 en clulas no
tratadas. En el modelo sigmoidal [4], cuando la concentracin de frmaco es cero (es decir, el
ajuste de control), k2 = p1. Por lo tanto, KC50 es la concentracin x tal que:

El concepto puede generalizarse a KCn, (100-n)% del valor k2 en clulas no tratadas, donde n es
cualquier nmero entre 0 y 100. KCn es la concentracin x tal que
Es decir,
KCn = exp {1 / p3 * log [n / (100-n) / p2)]}. El KCn obtenido de esta manera es independiente
de los tiempos de incubacin y recuperacin: el efecto de diferentes tiempos de incubacin se
elimina por p1 y el efecto de diferentes tiempos de recuperacin se ha tenido en cuenta en el
segundo trmino del Modelo [1].

Conclusin
El nmero de clulas tumorales despus de tratamiento citotxico medido aqu caben bien en el
modelo exponencial de dos trminos [1]. El parmetro k2, que mide la toxicidad de los frmacos,
puede calcularse utilizando el modelo [4]. Estos resultados indican que las tasas de crecimiento
celular (logartmico) y de muerte celular (logartmica) (es decir, los valores d1 y d2) son
independientes del tratamiento con frmaco, mientras que el efecto de muerte del frmaco (o
supervivencia celular, es decir, el valor k2 ) Tiene una relacin sigmoidal con la concentracin de
frmaco. Ms importante an, el modelo sigmoidal [4] ofrece una alternativa al concepto LC50
que es independiente de los tiempos de incubacin y recuperacin.