Informe de Microbiologia Grupo 1 PDF

INFORME DE MICROBIOLOGA
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE
LEVADURAS Y BACTERIAS ACTICAS A
PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA
NARANJA VALENCIA
(Citrus sinensis)
Yesicka F. Sanabria
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LEVADURAS Y BACTERIAS

ACTICAS A PARTIR DEL JUGO FERMENTADO DE LA NARANJA VALENCIA
(CITRUS SINENSIS)
INTEGRANTES:
YESICKA F. SANABRIA
GRUPO: 48TGQID
INSTRUCTORA:
MAGALY SNCHEZ BENAVIDEZ
SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

QUMICA APLICADA A LA INDUSTRIA
CENTRO DE GESTIN INDUSTRIAL
BOGOT D.C.
2015
TABLA DE CONTENIDO
Pg.
INTRODUCCIN .................................................................................................... 4
1. OBJETIVOS ..................................................................................................... 5
Objetivo General ..................................................................................................... 5
Objetivos Especficos ............................................................................................. 5
3. MARCO TERICO .......................................................................................... 6
2.1 Medios de Cultivo ............................................................................................. 7
2.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters ...................................................... 7
2.3 Tincin de Gram o Coloracin de Gram ............................................................ 8
2.4 Aislamiento por Estras ..................................................................................... 9
2.5 Identificacin de Microorganismos a partir de Pruebas Bioqumicas ............... 10
3. PROCEDIMIENTOS ...................................................................................... 11
3.1 Preparacin de Medios de Cultivo................................................................... 11
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters .................................................... 13
3.3 Tincin de Gram o Coloracin de Gram .......................................................... 15
3.4 Aislamiento por Estras ................................................................................... 17
3.5.1 Fermentacin de azcares........................................................................... 19
3.5.2 Tolerancia de Etanol .................................................................................... 21
4. RESULTADOS ................................................................................................ 22
4.1 Clculos para Elaboracin de Medios de Cultivo ............................................ 22
4.2 Clculos para Aislamiento de Microorganismos de Inters ............................. 23
4.3 Caracterizacin de los medios de cultivo obtenidos ........................................ 24
4.4 Conteo de colonias ......................................................................................... 26
4.5 Identificacin de Gram+ y Gram- ..................................................................... 26
4.6 Resultados de Aislamiento por Estras ........................................................... 29
4.7 Coloracin de Gram para Verificacin de Pureza de Levaduras ..................... 30
2

4.8.1 Clculos de Fermentacin de azcares ...................................................... 31
4.8.2 Clculos de Tolerancia al Etanol ................................................................. 32
4.8.3 Resultados de Fermentacin de Azcares ................................................... 33
4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol.............................................................. 35
5. ANLISIS DE RESULTADOS....................................................................... 36
6. CONCLUSIONES .......................................................................................... 37
7. BIBLIOGRAFA .............................................................................................. 38
3
INTRODUCCIN
En este informe se abordar el aislamiento e identificacin de las bacterias

adecuadas para la obtencin de cido actico a partir del jugo fermentado de
naranja valencia (Citrus sinensis), al cual se le realizaron varios cultivos de colonias
microbianas en varios niveles de disolucin.
Con este fin se cultivaron los microrganismos en medios Agar-Agar GYC y Agar-
Agar YGC, adems de determinar la UFC (Unidades Formadoras de Colonias) de
cada uno de los cultivos obtenidos, posteriormente se identificaron los
microrganismos de algunas de las colonias a partir de tincin o coloracin de Gram,
a cada una de las disoluciones trabajadas. Para esto ltimo se examinaron las
colonias por medio de microscopio electrnico y se tomaron fotografas como
evidencia del trabajo realizado obteniendo as Gram positivas y Gram negativas.
Como ltimo procedimiento se realizaron pruebas bioqumicas: prueba de azcares

y tolerancia de etanol las cuales permitirn conocer los microorganismos obtenidos.
Todo este trabajo con las colonias de microorganismos cultivadas se realiza con el
fin de aislar los microrganismos de utilidad para el proyecto de formacin y bajo qu
condiciones se deben mantener para una mayor eficiencia y calidad en nuestro
producto final.
4
1. OBJETIVOS
Objetivo General
Conocer los procedimientos adecuados para el aislamiento e identificacin de

levaduras y bacterias acticas a partir de jugo fermentado de la naranja valencia
(Citrus sinensis).
Objetivos Especficos
Preparar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

microorganismos de inters (levaduras y bacterias acticas).
Realizar aislamiento a partir de la caracterizacin macroscpica de los

microrganismos recuperados del fermento analizado.
Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparacin de medios de

cultivo y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades
halladas en la caja de Petri.
Efectuar coloracin de Gram para identificacin de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
Aislar los microorganismos de inters a partir del mtodo de aislamiento por

estras.
Hacer pruebas Bioqumicas a los microorganismos de inters como prueba

de fermentacin de azcares y tolerancia de etanol.
5
3. MARCO TERICO
Los microorganismos como las Levaduras son organismos vivos microscpicos

unicelulares pertenecientes al reino de los hongos y al dominio eucariota, se
alimentan principalmente de azcar produciendo fundamentalmente dixido de
carbono y alcohol; su forma puede ser desde esfrica, ovoide o alargada. Las
dimensiones varan entre 2 y 4 m de ancho y 2 a 8 m de largo, se encuentran
levaduras alargadas de 10, 15 o 25 m de longitud. Poseen pared celular,
membrana fundamental, citoplasma y ncleo.
Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

cerevisiae. Tomada de google imgenes
Las levaduras son muy importantes debido a que contribuyen en la elaboracin de

procesos fermentativos, Un ejemplo claro es la Saccharomyces cerevisiae que
es empleada industrialmente en la fabricacin de pan, cerveza y vino. Se forma de
nutricin vara desde los carbohidratos hasta los aminocidos. Entre los azcares
que pueden utilizar estn los monosacridos como la glucosa, fructuosa y galactosa,
tambin puede emplear disacridos como la maltosa y la sacarosa.
Para identificar una levadura se parte de cultivos puros, y se tienen en cuenta ciertas
caractersticas
Morfolgicas: Forma, medida, reproduccin asexual

Caractersticas de reproduccin sexual
Caractersticas fisiolgicas y bioqumicas
Con lo anterior ya mencionado es necesario que los microorganismos para

reproducirse necesitan de medios de cultivo, ser aislados y a su vez identificados
por medio de pruebas de coloracin como la Gram y pruebas bioqumicas como se
mencionarn a continuacin.
6
2.1 Medios de Cultivo
Los medios de cultivo son soluciones compuestas por nutrientes especficos para
que as los microorganismos puedan desarrollarse en un laboratorio. La
composicin precisa depender de la especie que se quiera cultivar, ya que las
necesidades nutricionales varan considerablemente. Se pueden clasificar de
acuerdo a su estado, complejidad, y aplicaciones.
En cuanto al estado se encuentran medios slidos, semislidos y lquidos, los

slidos contienen una sustancia gelificante conocida como agar-agar, los
semislidos contienen una menor concentracin de agar-agar (0.5 a 0.7%) y los
lquidos no contienen agar-agar, debido a su naturaleza los medios slidos o
agares se sirven en cajas de Petri mientras que los medios lquidos o caldos de
cultivo y los semislidos se sirven en tubos de ensayo. Segn las aplicaciones de
los medios de se clasifican en enriquecidos, selectivos, diferenciales. 1
Imagen 1. Medios de cultivo slido

(Agar), tomada de google imgenes
Para la preparacin de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales tales

como la disponibilidad de nutrientes adecuados, la consistencia adecuada del
medio, presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases, condiciones adecuadas de
humedad, luz ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio.
2.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters
Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa una

gran variedad de microorganismos; algunos de ellos podran ser tiles al hombre,
mientras que otros podran ser patgenos. La separacin de cada una de estas
variedades es lo que se conoce como aislamiento de microorganismos.
1Instructivopara la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de inters

biotecnolgico prctica 1. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
7
Los microorganismos son ubicuos (pueden estar en cualquier lugar), gracias a esta
caracterstica pueden colonizar cualquier ambiente, desde un rio hasta una
escultura de hierro, esa habilidad es debido a sus procesos metablicos y sistemas
enzimticos. Para aprovechar esas caractersticas de los microorganismos, en
beneficio de la industria y el medio ambiente, es de vital importancia poder aislarlos
de su medio natural y llevarlos a medios sintticos para poder manipularlos en el
laboratorio.2
2.3 Tincin de Gram o Coloracin de Gram
La coloracin de Gram es un tipo de tincin empleado en microbiologa que permite

diferenciar dos grandes grupos de bacterias: las Gram positivas aquellas que se
visualizan en morado y las Gram negativas aquellas que se visualizan de color rosa,
rojo o grosella segn se comporten ante su tincin. El fundamento radica en la
diferente estructura de la pared celular de ambos grupos: la Gram positivas poseen
una gruesa capa de peptidoglicano mientras que las bacterias Gram negativas
poseen una capa peptidoglicano ms fina y una capa de lipopolisacardica externa.
Las bacterias Gram negativas pierden un colorante (el cristal violeta) con mayor
facilidad que las Gram positiva debido al grosor de la pared celular.
Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

positivas (color morado) y bacterias Gram
negativas (color rosa). Tomada de google
imgenes
Para realizar la coloracin de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

colorantes tales como: el cristal violeta, lugol, etanol y fucsina.
Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloracin de Gram que se

adhiere a la pared de todas las clulas bacterianas, las Gram positivas absorben
este colorante debido al grosor de su pared celular y al porcentaje mayor de cido
teicoico.
2Instructivopara la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de inters prctica

2. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
8
Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

potasio) y SI (siulterio), Cumple la funcin de fijar el colorante primario (cristal
violeta) en la preparacin.
Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloracin en este paso los

microrganismos Gram positivos no se decoloran mientras los Gram negativos si lo
hacen.
Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el ltimo compuesto que se

le adiciona a la coloracin en Gram y en el cual se puede determinar las Gram
positivas y las Gram negativas de acuerdo al color y al contraste.
2.4 Aislamiento por Estras
Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de inters, es

necesario realizar aislamientos que permitan obtener cultivos puros de los
microorganismos objeto de estudio. La tcnica de aislamiento por estra o tcnica
de siembra por agotamiento de colonias y la obtencin de cultivos axnicos (una
sola especie microbiana proveniente de una sola clula) a partir de cultivos mixtos;
esta tcnica diluye la muestra de microorganismos a partir del trazo de estras
sucesivas sobre una placa de agar permitiendo el posterior crecimiento de colonias
totalmente aisladas. 3
Consiste en cargar el asa con la muestra y hacer estras paralelas en la cuarta parte
de la superficie de la placa; se quema el asa, se enfra, se gira la placa a 90c y se
vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el rea sembrada inicialmente y cubriendo otro
cuarto de placa. Por ltimo, sin quemar el asa, se estra el resto de la superficie sin
sembrar (Ver imagen 3).
Imagen 3. Imagen de procedimiento de

aislamiento de microorganismos por estras.
Tomada de google imgenes
3
Instructivo para realizar la tcnica de aislamiento por estras prctica de laboratorio prctica 4.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
9
2.5 Identificacin de Microorganismos a partir de Pruebas Bioqumicas
La identificacin microscpica y macroscpica de los microorganismos proporciona

una idea general acerca de la identificacin de microorganismo, de hecho estas son
tcnicas preliminares que permiten seleccionar pruebas de mayor especificad como
la realizacin de pruebas bioqumicas que dejan ver las caractersticas metablicas
de los microorganismos frente a un compuesto especfico; as como por ejemplo el
caso del gnero Saccharomyces, es necesario determinar las caractersticas de
asimilacin y fermentacin de diversos azcares, as como la capacidad de
tolerancia al etanol y su reaccin frente a la urea. 4
Las pruebas bioqumicas son un conjunto de reacciones que determinan la

actividad de una va metablica de la bacteria a partir de un sustrato de que se
incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Para
ello, hay que partir de un cultivo obtenido en el aislamiento, subcultivando de una
colonia bien aislada. La identificacin de una especie requiere de estas pruebas. Es
aconsejable tener en cuenta:
Cambios que se producen

Reacciones qumicas que se producen
Enzimas que intervienen
Productos intermedios
Secuencia de las reacciones bioqumicas
Prueba de Fermentacin de azcares: En esta prueba se determina si la

bacteria es capaz de fermentar un carbohidrato particular (produccin de cidos
acompaados o no de gases). Se aplica a bacterias con metabolismo fermentador,
ensayndose por separado con diferentes carbohidratos (glucosa, lactosa,
sacarosa, entre otras).
Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

microorganismos obtenidos son resistentes al etanol y si son capaces de presentar
mayor rendimiento de este, ya que es una caracterstica de las levaduras.
4
Instructivo para la identificacin de microorganismos mediante pruebas bioqumicas prctica 5.
Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
10
3. PROCEDIMIENTOS
3.1 Preparacin de Medios de Cultivo
Observar la etiqueta de cultivo

deshidratado.
Realizar los clculos de acuerdo

a las indicaciones de la etiqueta.
Para medio slido (agar) se necesitan Para caldos de cultivo son necesarios
20mL del medio de cultivo. 10mL por tubo.
Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

medio requerida de acuerdo a los clculos
realizados.
Medir con una probeta agua

desionizada para disolver el medio.
Disolver con agua el medio de cultivo

previamente pesado para lograr una
disolucin eficaz.
Verter la mitad de agua desionizada en el

frasco de disolucin y adicionar el cultivo, Rotular frascos
agitar y terminar de adicionar el agua.
Consultar en la etiqueta del medio

deshidratado si es necesario calentar
11
Si el medio que se prepara es un caldo de

cultivo antes de llevarlo al autoclave de servir
en tapas-rosca
Con ayuda del Beaker transferir 10mL

aprox. para cada tubo de ensayo.
Llevar el medio disuelto al autoclave y

esterilizar durante 15min a 15psi y 120c
Una vez esterilizado el agar, sacar el

frasco y cerrar la tapa
Rotular cajas de Petri: nombre del medio,

fecha y grupo responsable
Servir en cajas de Petri estriles

acercando al mechero
Dejar solidificar el agar llevar a una

incubadora (37- 48 horas)
Almacenar en refrigeracin, las cajas de

Petri se deben agrupar y envolver en
papel vinipel
12
3.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters
Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a

partir de la cual se aislaran los
microorganismos de inters
Adicionar los 10g de la muestra al frasco con

los 90mL de agua peptonada al 0.1% p/v
Homogenizar durante 5min, obteniendo la

dilucin de 10-1
Realizar disoluciones seriadas a partir de la

disolucin de 10-1 (ver imagen 4)
Tomar 1mL de la disolucin de 10-1 y

suspender en 1 de los tubos con 9mL de agua
Agitar hasta homogenizar obteniendo la

disolucin 10-2
A partir de la disolucin 10-2 realizar la

disolucin 10-3 y as sucesivamente hasta
llegar a la disolucin 10-7
Sembrar 0.1mL de las disoluciones 10-4 a 10-7

sobre la superficie del agar especfico
Homogenizar los 0.1mL sobre la superficie del

agar, empleando el asa de vidrio estril
13
Homogenizar empezando por la caja donde se

sembr la mayor disolucin
Dejar secar las cajas de Petri y llevar a la

incubadora
Seleccionar las cajas que tengan entre 30 y

300 colonias y realizar el recuento de todas las
colonias
Identificar las caractersticas morfolgicas de

las colonias
Seleccionar aquellas colonias que

correspondan a las reportadas para el
microrganismo de inters
A las colonias seleccionadas realizar

identificacin microscpica o enzimtica
Imagen 4. Procedimiento de disoluciones. Imagen obtenida de google

imgenes
14
3.3 Tincin de Gram o Coloracin de Gram
Tomar una lmina limpia, seca y estril,

adicionar una gota de agua sobre esta
Con un asa esterilizada tomar un poco

del cultivo, colocarla sobre la lmina y
hacer un extendido sobre esta
Esperar a que seque a temperatura

ambiente y fijar pasando 5 veces la
llama del mechero
Adicionar 3-4 gotas de cristal violeta

sobre la lmina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 gotas de lugol sobre la

lmina y esperar un minuto
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lmina y

esperar 30 segundos
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de etanol sobre la lmina y

esperar 30 segundos
15
Enjugar con agua
Adicionar 3-4 de fucsina sobre la lmina

y esperar 1 minuto
Enjugar con agua
Esperar a que seque a temperatura

ambiente
Llevar al microscopio ptico y enfocar

primero en 4X
Adicionar una gota de aceite de

inmersin
Enfocar en 100X e identificar si son

Gram+ (moradas) o Gram-(rosa)
16
3.4 Aislamiento por Estras
Tomar los cultivos mixtos donde se

encuentran los microorganismos de inters
Ubicar las colonias previamente

identificadas de acuerdos a identificacin
microscpica y macroscpica realizada
Rotular base de la caja de Petri donde se

encuentra el medio de cultivo apto para el
crecimiento de microorganismo a aislar
Sealar el nmero de la colonia, la muestra

de donde proviene y la fecha
Esterilizar el asa recta hasta que tome un

color rojo incandescente y dejarla enfriar
Tomar una muestra de la colonia con el

asa estril y fra al lado del mechero
Colocar la muestra en un extremo de la

superficie del agar estril
Esterilizar el asa y dejarla enfriar
Realizar de 5 a 6 con el asa redonda estril

estras paralelas, consecutivas y juntas no
superpuestas
17
Realizar un primer grupo de estras en el

cuadrante 1 de la caja (ver imagen 2)
Cerrar la caja Petri y girarla 90, destapar y

empezar un segundo grupo de estras
aprox. 4 a partir de la ltima realizada

empezar un tercer grupo de estras aprox.
4 a partir de la ltima realizada

empezar un cuarto grupo de estras aprox.
4 estras realizando una especie de espiral
Llevar caja de Petri a incubar, despus de

ello realizar identificacin macro y
microscpica de las colonias aisladas
Imagen 5. Caja de Petri, aislamiento por estras tomada de gua

de prctica de laboratorio, aislamiento por estras
18
3.5.1 Fermentacin de azcares
Tubo1: Caldo Glucosa Elaborar una batera compuesta para cada

Tubo2: Caldo Sacarosa microorganismo a probar por 6 tubos de 5 mL
Tubo3: Caldo Maltosa
Tubo4: Caldo Ribosa Rotular los tubos de ensayo con la
Tubo5: Caldo Xilosa identificacin de la colonia a probar, azcar,
Tubo6: Caldo Lactosa nmero de grupo y fecha
Para preparacin de medios
ver Tabla 1.
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del
mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en el
caldo de glucosa
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tapar el tubo y agitar
Esterilizar el asa, volver a tomar de la

muestra de la misma colonia y sembrar en el
caldo de sacarosa
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada uno de los azcares a
probar
Llevar a incubar los tubos a 30C,

revisndolos a las 24, 48 y 72 horas y
reportando como fermentacin o asimilacin
Reportar las reacciones bioqumicas como

asimilacin: si hay presencia de CO2, turbidez
y cambio de pH. Comparar resultados con
Tabla 2.
19
Tabla 1. Preparacin de Medio para fermentacin de azcares (Tomada de gua

de laboratorio prctica N 4)
COMPONENTE g/L
NaCl 8.5
Peptona 5
Carbohidrato a probar 10
Rojo de fenol 1 mL
Agua destilada 1000 mL
Tabla 2. Fermentacin de azcares para Saccharomyces cerevisiae (Tomada de

gua de laboratorio prctica N 4)
Saccharomyces cerevisiae
Glucosa +
Galactosa +
Ribosa -
Arabinosa -
Sacarosa +
Maltosa +
Celobiosa -
Trehalosa +
Lactosa -
Xilosa -
Rafinosa +
Ramnosa +
20
3.5.2 Tolerancia de Etanol
Para cada microorganismo a identificar

elaborar 4 tubos en calo OGY
Tubo1: 2% de etanol
Tubo2: 4% de etanol Despus de esterilizado el medio OGY
Tubo3: 6% de etanol adicionar etanol en cada uno de los 4 tubos
Tubo4: 8% de etanol
Rotular los tubos de ensayo con la
identificacin de la colonia a probar,
concentracin de etanol, nmero de grupo y
fecha
Esterilizar el asa y dejar enfriar cerca del

mechero
Tomar una muestra de la colonia del

microorganismo seleccionado y sembrar en
tubo de ensayo con concentracin de etanol
mayor
Suspender la colonia agitando el asa dentro

del medio, tape el tubo y homogenizar
Esterilizar el asa, volver a tomar una muestra

de la misma colonia y sembrar en tubo de 8%
Repetir los 3 pasos anteriores hasta terminar

de sembrar en cada una de las
concentraciones de etanol a probar
Llevar tubos de ensayo a la incubadora a 30C

durante 5 das
Terminar el tiempo de incubacin, realizar

lectura del crecimiento en el medio de cultivo
(verificar por turbidez)
21
4. RESULTADOS
4.1 Clculos para Elaboracin de Medios de Cultivo
Agar YGC Hongos y levaduras
10 cajas de Petri
Preparar 200mL
38,1
200 ( ) = 7,62
1000
Agar GYC Bacterias acticas
10 cajas de Petri
A diferencia del agar YGC que ya viene preparado, el agar GYC necesita ser
adecuado agregando as diferentes componentes para que los microrganismos se
desarrollen, a continuacin se observan cada uno de ellos con sus
correspondientes clculos:
Glucosa 50/ 1
50
200 ( ) = 10
1000
3 5/ 1
5
200 ( ) = 1
1000
Agar-agar 20/ 1
20
200 ( ) = 4
1000
Cabe aclarar que el etanol se adiciona despus de realizar el proceso de

esterilizacin.
22
Etanol70/ 1
70
200 ( ) = 14
1000
4.2 Clculos para Aislamiento de Microorganismos de Inters
Extracto:
10
200 ( ) = 2
1000
Adicionar en agua destilada y seguir procedimiento imagen 6:
Imagen 6. Disoluciones para aislamiento de microorganismos de

inters, agua peptonada con jugo de fermento de naranja valencia
En la preparacin para el aislamiento de los microorganismos de inters se

disuelven 10mL del jugo fermentado de naranja valencia en 90mL de agua
peptonada, luego se toma 1mL de esta disolucin y se agregan en los 9mL de gua
peptonada en cada tubo de ensayo, se realiza procedimiento consecutivamente
hasta llegar a la disolucin de 10-6 como se observa en la imagen 6. Se emplean
las diluciones de 10-4 ,10-5 y 10-6 para la obtencin de los microorganismos de inters
debido a que las dems poseen gran cantidad de carga microbiana.
23
4.3 Caracterizacin de los medios de cultivo obtenidos
AGAR YGC
Tabla 1. Agar YGC 10-4
COLONIA FORMA COLOR TAMAO APARIENCIA MICROSCOPA
A Redonda Beige 2 mm Cremosa Levaduras
B Circular Beige 5 mm Cremosa Levaduras
C Borde Beige 4 mm Cremosa No se realiza

irregular
D Redonda Beige 1.5 mm Cremosa No se realiza
E Borde Beige 6 mm Cremosa No se realiza

irregular
A Forma Beige 5 mm Brillante, Levaduras

irregular cremosa ovaladas
B Redonda Beige 3 mm Lisa, brillante Levaduras
C Circular Beige 3 mm Cremosa No se realiza
D Redonda Beige 2 mm Cremosa No se realiza
E Redonda Beige 4 mm Cremosa No se realiza
A Redonda Beige 1 mm Cremosa, No se realiza

hueca
B Redonda Beige 0.5 mm Cremosa, Levaduras

hueca
24
C Redonda Beige 1 mm Cremosa No se realiza
D Redonda Beige 0.5 mm Cremosa, lisa Levaduras
AGAR GYC
Tabla 4. Agar GYC 10-4
A Redonda Crema 1 mm Cremosa, lisa No se realiza
B Redonda Crema 3 mm Cremosa, Levaduras

rugosa
C Redonda Crema 1.5 mm Cremosa, Levaduras

rugosa
D Redonda Crema 1 mm Cremosa, No se realiza

brillante
E Redonda Crema 1.5 mm Cremosa, No se realiza

opaca
A Redonda Crema 4 mm Cremosa, Levaduras

opaca ovaladas
B Redonda Crema 3.5 mm Cremosa, No se realiza

opaca
C Redonda Crema 3 mm Cremosa, No se realiza

opaca
D Redonda Crema 4 mm Cremosa, No se realiza

opaca
E Redonda Crema 4 mm Cremosa, Levaduras

opaca ovaladas
25
A Redonda Amarilla 2 mm Cremosa, Cocos Gram+

opaca
B Redonda crema 1 mm Cremosa, Levaduras

opaca
C Redonda crema 4 mm Cremosa, No se realiza

opaca
4.4 Conteo de colonias
AGAR YGC
10-4 = 6560000 = 6,56 x 106 UFC/mL

10-5 = 2000000 = 2 x 106 UFC/mL
10-6 = 500000= 5 x 105 UFC/mL2
AGAR GYC
Imagen 7. Colonias en caja de
10-4 = 6960000 = 6,96 x106 UFC/mL Petri ubicado en un contador de
colonias. Imagen tomada en
-5 7
10 = 22600000= 2,26 x 10 UFC/mL laboratorio de microbiologa, SENA
10-6 = 25000000= 2,5 x 107 UFC/mL
4.5 Identificacin de Gram+ y Gram-
A GYC 10-5
B GYC 10-4
C YGC 10-6
D YGC 10-4
E YGC 10-5
F GYC 10-6
26
IMAGEN OBSERVADA EN EL
DESCRIPCIN DE LAS COLONIAS
MICROSCOPIO PTICO
OBSERBADAS 100X
- Gram positivas (color morado intenso)

- Levaduras
- Ovaladas
- En gran cantidad dilucin de GYC 10-5
- Gram positivas (color morado no tan

intenso)
- Levaduras
- Ovaladas
- Un poco menos que la cantidad de la A
dilucin de GYC 10-4

- Levaduras
- Ovaladas
- Un poco menos que la cantidad de la B
dilucin de YGC 10-6
27

- Levaduras
- Ovaladas
- Dilucin de YGC 10-4

- Levaduras
- Ovaladas
- Dilucin de YGC 10-5

- Cocos
- Forma redonda bien definidas
- En gran cantidad dilucin GYC 10-6
28
4.6 Resultados de Aislamiento por Estras
A continuacin se observan los resultados de aislamiento por estras que se le

realizaron a los medios seleccionados en donde se encontraban los
microorganismos de inters:
A B
C D
Las anteriores imgenes son el resultado del mtodo de aislamiento por estras que
se le realizaron a las diluciones de 10-4 y 10-5. Como se puede observar solo A y B
cumplen con los requerimientos adecuados para poder realizar pruebas
bioqumicas, ya que C y D no fueron aisladas correctamente y por ende no se toman
en cuenta para poder seleccionar el microorganismo de inters.
29
4.7 Coloracin de Gram para Verificacin de Pureza de Levaduras
Para confirmar la pureza de las levaduras encontradas se toma una de las colonias
de los cada medio en este caso de A y B, los cuales fueron aislado correctamente
y por ende se procede a realizar coloracin de Gram para poder realizar pruebas
bioqumicas y confirmar la pureza de los microorganismos de inters:
COLONIA SELECCIONADA COLORACIN DE GRAM OBSERVACIONES
Segn los resultados de

coloracin de Gram que
se realiza al medio A, se
observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no estn
contaminadas.
A
Segn los resultados de

coloracin de Gram que
se realiza al medio B, se
observa que los
microorganismos
obtenidos son levaduras
y por tanto se puede
realizar pruebas
biomequimicas esta. Se
verifica que no estn
contaminadas.
B
30
A continuacin se realizan las pruebas bioqumicas de fermentacin de azcares y

tolerancia de etanol para el microorganismo de inters en este caso las levaduras
obtenidas segn la coloracin de Gram y los medios empleados que se utilizaron
para elaborar estas pruebas.
4.8.1 Clculos de Fermentacin de azcares
Se preparan 30mL para cada uno de los medios en 6 tubos de ensayo para cada
carbohidrato a probar:
NaCl 8.5 g/L
8,5
30 ( ) = 0,25
1000
Peptona 5 g/L
5
30 ( ) = 0,15
1000
Carbohidrato a probar:
(Glucosa, sacarosa, maltosa, ribosa, xilosa y latosa) 10 g/L
10
30 ( ) = 0,3
1000
El rojo de fenol es aplicado despus de haber diluido cada uno de los componentes
en la preparacin del medio.
Rojo de fenol 1mL
10
30 ( ) = 0,3
1000
31
Se toma muestra de A y B y se homogeniza en cada uno de los medios como se

ve en la figura 8.
Imagen 8. Procedimiento de fermentacin de azcares
4.8.2 Clculos de Tolerancia al Etanol
Etanol al 2%
2 100
5 ( )( ) = 0,104
1000 96
Etanol al 4%
4 100
5 ( )( ) = 0,208
1000 96
Etanol al 6%
6 100
5 ( )( ) = 0,313
1000 96
32
Etanol al 8%
8 100
5 ( )( ) = 0,417
1000 96
Se homogeniza la muestra en cada una de las concentraciones del etanol como

se visualiza en la figura 9.
Imagen 9. Procedimiento de tolerancia al etanol
4.8.3 Resultados de Fermentacin de Azcares
Maltosa Sacarosa Glucosa
33
Lactosa Xilosa Ribosa
Imagen 10. Fotos de resultados de prueba de azcares, realizada en

laboratorio de Microbiologa
Positiva +
Negativa -
Tipo de azcar Muestra A Muestra B

-5
YGC 10 YGC 10-4
Maltosa + +
Sacarosa + +
Glucosa + +
Lactosa - -
Xilosa - -
Ribosa
- -
Se observa que en esta prueba solo dan positivas la maltosa, la sacarosa y la
glucosa y las dems son negativas, estos resultado indican la posible presencia del
microorganismo de inters que en este caso es la Saccharomyces cerevisiae
segn el marco terico.
34
4.8.4 Resultados de Tolerancia al Etanol
La siguiente prueba de tolerancia de etanol se le realiza solo a la muestra A (dilucin

YGC 10-5) la cual muestra los siguientes resultados:
Imagen 11. Imagen de resultados de prueba de etanol
En la anterior imagen se observa que solo el tubo ensayo que contiene un 6% de

estanol dio positiva que a diferencia de las otra dieron negativa la siguiente foto es
evidencia de ello:
Imagen 12. Foto de resultados de prueba de tolerancia de etanol

realizada en laboratorio de Microbiologa
35
5. ANLISIS DE RESULTADOS
Al desarrollar la prctica de laboratorio se prepararon varios medios de cultivo para

el crecimiento de los microorganismos de inters en este caso levaduras y bacterias
acticas a partir del jugo obtenido de naranjas de la variedad valencia o citrus
sinensis.
Se encontraron en las diferentes colonias observadas, las cuales fueron clasificadas

a partir de las disoluciones obtenidas que por medio de mtodo de tincin de Gram,
todas dieron gram positivas. Adems se encontr que al efectuar el conteo de
unidades formadoras de colonias existentes en cada una de las muestras
realizadas, estas presentan un mayor valor en las colonias preparadas en el Agar
agar GYC que en las colonias preparadas en el agar agar YGC.
El conteo de la carga microbiana para cada una de las muestras trabajadas es el

siguiente, vara de acuerdo a la disolucin y el medio.
Disolucin al 10-4 en Agar YGC con carga microbiana de 6,56 x 106 UFC/mL.
Disolucin al 10-5 en Agar YGC con carga microbiana de 2 x 106 UFC/mL.
Disolucin al 10-6 en Agar YGC con carga microbiana de 5 x 105 UFC/mL.
Disolucin al 10-4 en Agar GYC con carga microbiana de 6,96 x 106 UFC/mL.
El resultado de aislamiento por estras es un mtodo que fue realizado a las

disoluciones 10-4 y 10-5 y como se observa, solo las muestras A y B cumplen con
los requerimientos adecuados para realizar pruebas bioqumicas ya que fueron
correctamente aislados los microorganismos de inters.
Por ultimo en los resultados de pruebas bioqumicas, en la prueba de azcares la

maltosa, la sacarosa y la glucosa dieron positivas, mientras que la lactosa, la xilosa
y la ribosa dieron negativas los cual de acuerdo a estos resultados, podemos dar
posible certeza de la presencia del microorganismo de inters Saccharomyces
cerevisiae, el cual esta bacteria actica ayudar a la elaboracin de vinagre de
Naranja Valencia. En la prueba de Tolerancia de Etanol se observan en los
resultados que solo el que posee el 6% de etanol da positivo mientras que el de
2%, 4% y 8% dan negativos lo cual nos indica que se puede dar posible certeza de
presencia del microorganismo de inters, ya que la tolerancia de etanol es una de
las caractersticas de la levadura actica.
36
6. CONCLUSIONES
Se prepararon los respectivos medios de cultivo agar-agar YGC y GYC para el

crecimiento y desarrollo del microorganismo de inters (levaduras y bacterias
acticas), realizando los respectivos clculos y adecundolos de acuerdos a lo
requerido. Para lo anterior se tuvieron en cuenta diferentes tipos de disoluciones
preparadas partiendo del agua peptonada y el fermento de la Naranja Valencia.
Se realiz aislamiento microbiano a partir de la caracterizacin macroscpica de

los cada uno de los microorganismos recuperados del fermento de Naranja valencia
(Citrus sinensis).
Se caracterizaron algunas colonias obtenidas en la preparacin de medios de cultivo

y realizar el correspondiente conteo de acuerdo a las cantidades halladas en la caja
de Petri.
Se efectu coloracin de Gram para identificacin de Gram positivas y Gram

negativas de acuerdo a las colonias ya caracterizadas.
Se aislaron los microorganismos de inters a partir del mtodo de aislamiento por

estras.
Se hicieron pruebas Bioqumicas a los microorganismos de inters como prueba de

fermentacin de azcares y tolerancia de etanol, las cuales dieron positivas de
acuerdo a lo esperado para evidenciar la presencia del microorganismo de inters.
37
7. BIBLIOGRAFA
Instructivo para la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de

microorganismos de inters biotecnolgico prctica 1. Servicio Nacional de
Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para realizar la tcnica de aislamiento por estras prctica de laboratorio

prctica 2 y 3. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014.
Instructivo para la identificacin de microorganismos mediante pruebas bioqumicas

prctica 5. Servicio Nacional de Aprendizaje. SENA, 2014
HERNANDEZ, Alicia. Microbiologa Industrial. [En lnea].

http://books.google.com.co/books?id=KFq4oEQQjdEC&printsec=frontcover&sourc
e=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=false> [Citado el 23 de julio de
2014]
38

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INFORME DE MICROBIOLOGA

AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE LEVADURAS Y BACTERIAS

MAGALY SNCHEZ BENAVIDEZ

SERVICIO NACIONAL DE APRENDIZAJE, SENA

4.8 Identificacin de Microorganismos a partir de Pruebas Bioqumicas ............... 31

En este informe se abordar el aislamiento e identificacin de las bacterias

Como ltimo procedimiento se realizaron pruebas bioqumicas: prueba de azcares

Conocer los procedimientos adecuados para el aislamiento e identificacin de

Preparar medios de cultivo para el desarrollo y crecimiento de

Realizar aislamiento a partir de la caracterizacin macroscpica de los

Caracterizar algunas colonias obtenidas en la preparacin de medios de

Efectuar coloracin de Gram para identificacin de Gram positivas y Gram

Aislar los microorganismos de inters a partir del mtodo de aislamiento por

Hacer pruebas Bioqumicas a los microorganismos de inters como prueba

Los microorganismos como las Levaduras son organismos vivos microscpicos

Imagen 1. Imagen de levadura Saccharomyces

Las levaduras son muy importantes debido a que contribuyen en la elaboracin de

Morfolgicas: Forma, medida, reproduccin asexual

Con lo anterior ya mencionado es necesario que los microorganismos para

2.1 Medios de Cultivo

En cuanto al estado se encuentran medios slidos, semislidos y lquidos, los

Imagen 1. Medios de cultivo slido

Para la preparacin de cultivos se requieren de ciertas condiciones generales tales

2.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters

Cuando se examina en el microscopio una gota de agua de lluvia, se observa una

1Instructivopara la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de inters

2.3 Tincin de Gram o Coloracin de Gram

La coloracin de Gram es un tipo de tincin empleado en microbiologa que permite

Imagen 2. Imagen de bacterias Gram

Para realizar la coloracin de Gram son necesarios el uso de ciertos reactivos y

Cristal violeta: Es un colorante primario de la coloracin de Gram que se

2Instructivopara la elaboracin de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos de inters prctica

Lugol: Es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de

Alcohol-cetona: Funciona para realizar la decoloracin en este paso los

Fucsina: Funciona como colorante de contraste, es el ltimo compuesto que se

2.4 Aislamiento por Estras

Una vez aislados los microorganismos e identificadas las colonias de inters, es

Imagen 3. Imagen de procedimiento de

2.5 Identificacin de Microorganismos a partir de Pruebas Bioqumicas

La identificacin microscpica y macroscpica de los microorganismos proporciona

Las pruebas bioqumicas son un conjunto de reacciones que determinan la

Cambios que se producen

Prueba de Fermentacin de azcares: En esta prueba se determina si la

Prueba de Tolerancia al Etanol: En este tipo de ensayo se determina si los

3.1 Preparacin de Medios de Cultivo

Observar la etiqueta de cultivo

Realizar los clculos de acuerdo

Pesar en un vidrio de reloj la cantidad de

Medir con una probeta agua

Disolver con agua el medio de cultivo

Verter la mitad de agua desionizada en el

Consultar en la etiqueta del medio

Si el medio que se prepara es un caldo de

Con ayuda del Beaker transferir 10mL

Llevar el medio disuelto al autoclave y

Una vez esterilizado el agar, sacar el

Rotular cajas de Petri: nombre del medio,

Servir en cajas de Petri estriles

Dejar solidificar el agar llevar a una

Almacenar en refrigeracin, las cajas de

3.2 Aislamiento de Microorganismos de Inters

Pesar en un reloj de vidrio 10g de la muestra a

Adicionar los 10g de la muestra al frasco con