Facultad de Ciencias Naturales

Laboratorio de Microbiologa

Alumno: _______________________________________________ Cdigo: ___________

Alumno: _______________________________________________ Cdigo: ___________

Laboratorio 9: Anlisis Microbiolgico de Materias

Primas y Productos Farmacuticos No Estriles
OBJETIVOS

El objetivo de esta prctica es que los estudiantes:

1. Valoren aspectos importantes de la ecologa de los microorganismos en la

industria farmacutica y determinen sus efectos en los procesos de produccin.
2. Apliquen algunas tcnicas de anlisis microbiolgico dirigidas a evaluar
la calidad microbiolgica de materias primas y productos farmacuticos
no estriles
3. Estimen la concentracin de algunos grupos de microorganismos
relevantes en el control de calidad y determinen a partir de los resultados
obtenidos si el producto analizado es apto para su uso

Las siguientes preguntas buscan poner en contexto a los estudiantes respecto al tema a abordar
en la prctica (construir la INTRODUCCIN y el MARCO TEORICO de la gua). Realizar
una revisin bibliogrfica y responder, con sus palabras:

Son los medicamentos productos susceptibles de contaminacin microbiolgica, por qu?

Cules son las posibles vas de contaminacin de un medicamento?
Cules son los posibles riesgos que trae para la poblacin la circulacin de medicamentos
contaminados microbiolgicamente?
El anlisis o control microbiolgico de materias primas y de productos farmacuticos no
estriles permite determinar si estos cumplen con una especificacin establecida de
calidad microbiolgica. Cules son los parmetros de calidad microbiolgica exigidos en
Colombia para las materias primas y los productos farmacuticos no estriles?

MATERIALES Y REACTIVOS POR GRUPO DE DOS PERSONAS:

Equipos Cantidad
Vortex 1 unidades por
saln de clase
Incubadora 37C 1 unidad por saln
de clase
Balanza 100g 4 unidades por
saln de clase

Reactivos Cantidad
Etanol al 70% (spray) 20 ml por saln de
clase
Cajas con agar Nutritivo 6 unidades
Cajas con agar Sabouraud 4 unidades
Tubos con agua peptona esteril 4 unidades
Materia prima para la 10 g
elaboracin de medicamentos
pancreatina, almidn de maz
Jarabe para la gripa 10 ml

Insumos Cantidad
Pipetas de 10 ml Estriles 3 unidades
Propipeteador para pipeta de 1 unidad
10 ml
Micropipetas 100-1000 l 1 unidad
Puntas Azules para 15 unidades
Micropipetas 100-1000 l
Estriles
Pesasales medianos 1 unidad
Esptula Estril 1 unidad
Mechero de Alcohol 2 unidades
Recipiente para descartar 1 unidad
Material Contaminado
Botellas Schott 250 ml Estriles 2 unidades

ACTIVIDAD 1: Preparacin de la Muestra

Durante la prctica de laboratorio se evaluar la calidad microbiolgica de:

a. Materia prima ( ).
b. Producto farmacutico no estril ( ).

Para cada una de los productos, realizar el siguiente procedimiento:

Preparar una dilucin 1:10 en Botellas estriles de 250mL as: pesar y agregar 10g o ml de la
muestra y llevar a volumen 100 ml del diluyente preparado (solucin salina peptonada, caldo
nutritivo). La muestra se prepara de acuerdo a su naturaleza, para productos lquidos y polvos,
se tomara lo indicado anteriormente, para productos grasos y no grasos, el diluyente deber
ser calentado previamente a 40 45C y mezclado hasta formar una emulsin.

A partir de la dilucin 1:10, realizar

diluciones 1:100 y 1:1000 como se indica en la
figura:

Procedimiento diluciones

ACTIVIDAD 2: Siembra de Aerobios

Mesfilos, Mohos y Levaduras

Se realizaran siembras por duplicado de cada dilucin: 2 cajas de la dilucin 1:10, 2 cajas
de la dilucin 1:100 y 2 cajas de la dilucin 1:1000. En total se sembraran 6 cajas de cada
medio (NA y SDA) por muestra.

El procedimiento de siembra es el siguiente:

1. Transferir 1ml de la dilucin de la muestra preparada a cajas de petri estriles

previamente marcadas con el cdigo de la muestra, fecha de siembra y nombre del
medio de cultivo (Agar AN y SDA).
2. Verter en estas cajas de 15ml a 20 ml de Agar AN y SDA fundido estril y mantenido
a 40 45 C.
3. Mezclar el inoculo en el medio fundido mediante movimientos de rotacin hasta que
la muestra quede homognea en el Agar.
4. Verter en una caja de petri estril, medio y diluyente sin inocular como control
negativo.
5. Dejar solidificar el Agar.
6. Sembrar por duplicado.
7. Para microorganismos aerobios mesfilos (AN) invertir las cajas de petri inoculadas e
incubar a 37 C durante 18 72 horas. Para mohos y levaduras las cajas de petri que
contienen SDA se llevan a incubar a 25 durante 5 - 7 das.
8. Transcurrido este tiempo realizar las lecturas de las cajas de petri con ayuda de un
cuenta colonias. Contar todas las colonias de la caja de petri y multiplicarlo por el
factor de diluciones correspondiente para obtener el nmero de bacterias aerobias
mesfilas y mohos y levadura por gramo o milmetro de la muestra.
 9. En caso de crecimiento de levadura realizar coloracin de Gram, se deben observar
levaduras puede ser desde esfrica a ovoide, en forma de limn, piriforme, cilndrica,
triangular, e incluso alargada formando un verdadero micelio o un falso micelio.
Tambin se diferencian en cuanto a su tamao, miden de 1 10 um ancho por 2 -3 um
de longitud
10. Incubar la dilucin inicial a 30 35C durante 18 24 horas.

ACTIVIDAD 3: Resultados

Recuento Aerobios Mesfilos:

Para calcular el nmero de microorganismos viables que contiene la muestra, expresado

como unidades formadoras de colonias por mL o g (u.f.c./mL o g), contar las colonias de
las placas que presentan un nmero entre 30 y 300, un nmero menor de 30 colonias por
placa puede suponer la presencia de errores debido a fluctuaciones estadsticas. Por otro
lado, un nmero mayor de 300 colonias puede ser excesivo para poder contarlas
exactamente.

Nmero. Pr omedio.de.colonias * Factor.Inverso.de.la.Dilucion

UFC / g mL =
Volumen.o.gramos.de.muestra.inoculado

Al final sumar todas las lecturas parciales y promediar. El recuento bacteriano final se
debe expresar con 2 dgitos y el resto en potencias de base 10. Como no siempre el conteo
de colonias produce valores como por ejemplo 10-40-70-100-300 etc., es necesario aplicar
algunas correcciones con la finalidad de convertir el nmero hallado en uno con 2 dgitos.

Ejemplos:

Si el recuento se realiz en la dilucin 10-3 y fue de 147 colonias, el tercer digito por
ser mayor que 5 permite adicionar 1 unidad al 2 o sea que el recuento seria 150.000 =
15x104.

Si el recuento fue de 113 por ser el 3er. Digito menor que 5 se anula y se expresa
110.000 = 11x104. (ver ms ejemplos en anexo 1).

Registrar los clculos y resultados obtenidos para cada una de las muestras:
RECUENTO MOHOS Y LEVADURAS:

Para calcular el nmero de mohos y levaduras viables que contiene la muestra, expresado
como unidades formadoras de colonias por mL o g (u.f.c./mL o g), contar las colonias de las
placas que presentan un nmero entre 20 y 200, un nmero menor de 20 colonias por placa
puede suponer la presencia de errores debido a fluctuaciones estadsticas. Por otro lado, un
nmero mayor de 200 colonias puede ser excesivo para poder contarlas exactamente.

Emplear la formula y las reglas suministradas para determinar el nmero de ufc / g o mL de

aerobios mesfilos.

Registrar los clculos y resultados obtenidos para cada una de las muestras:

Qu conclusiones tiene de los resultados obtenidos?. Mencionar modificaciones o alteraciones

a los procedimientos descritos en caso de haber sido realizadas.

Bibliografa consultada.

Citar despus de cada pregunta la bibliografa consultada

LIBROS DE REFERENCIA:

Johnson TR, Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. Eighth Edition.

Pearson, 2007.
Morello J, Mizer H, Granato P. Laboratory Manual and workbook in Microbiology. 7th
Edition. 2002.
Valencia HA. Manual de Prcticas de Microbiologa Bsica. Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia. 1 Edicin, 2004.
Toro D. Manual para la Introduccin al Laboratorio de Microbiologa. Universidad de
Caldas. 1 Edicin, 2005.
Manual de Laboratorio de Microbiologa Ambiental. Escuela de los Recursos
Naturales y del Ambiente EIDENAR, Universidad del Valle 2003.
Cabeza H. Enrique. Guas de laboratorio Microbiologa General. Universidad de
Pamplona 2000.
Madigan M. T., Martinko. J. M., Parker. J. Brock. Biologa de los Microorganismos.
10Ed, 2004.
 ANEXO 1.

Normas para interpretar y reportar el recuento estndar en placa

REFERENCIAS

Johnson TR, Case CL. Laboratory Experiments in Microbiology. Eighth Edition. Pearson,
2007.
Morello J, Mizer H, Granato P. Laboratory Manual and workbook in Microbiology. 7th
Edition. 2002.
Denyer Stephen P, Hodges Norman A, Gorman Sean P. Hugo and Russells:
Pharmaceutical Microbiology. 7th Edition. 2004
USP NF. 2009. Farmacopea de los Estados Unidos de Amrica, Formulario Nacional.
United Book Press, Baltimore, Maryland, USA.

Fecha: Julio de 2011