UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR

DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES

COORDINACIN DE BIOLOGA

Caracterizacin de aislados de dos linajes de T. cruzi I y IV en un modelo

experimental in vivo

Por:
Br. Grecia Carolina Da Silva Lugo

PROYECTO DE GRADO
Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar
como requisito parcial para optar al ttulo de
Licenciado en Biologa

Sartenejas, Febrero de 2016

 UNIVERSIDAD SIMN BOLVAR
DECANATO DE ESTUDIOS PROFESIONALES
COORDINACIN DE BIOLOGA

Caracterizacin de aislados de dos linajes de T. cruzi I y IV en un modelo

experimental in vivo

Por:

Grecia Carolina Da Silva Lugo

Realizado con la asesora de

Dr. Hctor Rodrguez
Dra. Maritza Calabokis

PROYECTO DE GRADO
Presentado ante la Ilustre Universidad Simn Bolvar
como requisito parcial para optar al ttulo de
Licenciado en Biologa

Sartenejas, Febrero de 2016

 RESUMEN

La enfermedad de Chagas es causada por el parsito protozoario Trypanosoma cruzi, la cual es

una de las afecciones endmicas ms importantes en Latinoamrica. Durante la fase aguda se
genera una fuerte respuesta inmunolgica, la cual es capaz de controlar la multiplicacin del
parsito pero no lo elimina por completo. Los macrfagos juegan un papel importante en este
proceso y la expresin de la citoquina proinflamatoria TNF- est involucrada con el desarrollo
de la enfermedad. T. cruzi posee una alta diversidad gentica y se clasifica en seis Discrete
Typing Units (DTUs) reportadas desde TcI TcVI. Estos DTUs se correlacionan ampliamente
con diversas caractersticas epidemiolgicas y difieren en patogenicidad, virulencia e
histiotropismo. Es por esto que en este trabajo se plante como objetivo comparar el efecto de la
infeccin de dos aislados silvestres de T. cruzi P1 (TcI) y P2 (TcIV) obtenidos en una poblacin
rural del Estado Miranda en un modelo experimental in vivo. Para esto se evalu la presencia del
parsito en un modelo murino (Balb/c) mediante la carga parasitaria e histopatologa de tejido
cardaco por tincin con Hematoxilina-Eosina durante la fase aguda de infeccin, se compar la
tasa de activacin de macrfagos (CD68+) y su expresin de TNF- mediante
inmunofluorescencia indirecta, as como la capacidad proliferativa y celularidad de esplenocitos
en 3 grupos de ratones: control (n= 10), infectados con P1 (n= 30), infectados con P2 (n=30). Se
observ una mayor patogenicidad y virulencia en P1 en comparacin a P2, el estudio
histopatolgico mostr la presencia de un infiltrado leucocitario correspondiente a una
miocarditis aguda en ambos aislados, mientras que P1 produjo un mayor nmero de
pseudoquistes, as como una mayor tasa de clulas TNF-+/CD68+ y de clulas apoptticas, en
contraste, P2 produjo una mayor cantidad de clulas TNF-+/CD68-. En ambos aislados se
observ una reduccin en la celularidad de esplenocitos, junto con una marcada esplenomegalia
en el caso de P1, el cual a su vez ocasion una ligera disminucin en la tasa de proliferacin de
clulas T esplenocticas por estimulacin con ConA, caso que no se apreci con P2. En
conclusin P2 result ser un aislado de baja virulencia y patogenicidad en comparacin a P1, los
patrones de miocarditis, el infiltrado inflamatorio en el corazn, la activacin de macrfagos y
proliferacin de esplenocitos, se relacionan con la capacidad del aislado de parasitar el tejido y
son dependientes del tipo de DTU y finalmente, en P1 existe una correlacin positiva entre la
apoptosis celular y la presencia de clulas TNF-+/CD68+ indicando una distintiva respuesta
inmunolgica en comparacin a los patrones observados en P2.

Palabras clave: T. cruzi, TcI, TcIV, miocarditis, TNF-.

iv
 AGRADECIMIENTOS

Este trabajo no se hubiese podido elaborar sin la tutora del Dr. Hctor Rodrguez, que con
su paciencia de santo me gui desde el principio en la elaboracin de los experimentos, siempre
lo recordar con cario y con gran admiracin por su total dedicacin al trabajo y sus locas ideas
de genio. Agradezco tambin a la Dra. Maritza Calabokis quien nos apoyaba desde la universidad
y nos ense a tenerle paciencia al mundo, ignorar las dificultades y seguir adelante con un buen
espritu y una buena actitud.

Como siempre en una buena obra hay grandes actores tras bastidores sin los cuales la
misma perdera todo sentido, y mis grandes actores del IVIC fueron los que me ayudaron a
estructurar este trabajo: Lic. Yolyver Higuerey de la Unidad de Cultivo de Clulas y Tejidos por
su apoyo tcnico-cientfico, que con sus excelentes habilidades me enseaba cada uno de los
aspectos bioqumicos y celulares que tuve que aprender para desenvolverme en el laboratorio,
con su instinto maternal siempre me protegi y gui cuando mi tutor se ocupaba de otros 10
proyectos simultneos, por siempre la solidaridad uesebista. Al Lic. Vctor Salazar del Servicio
de Microscopa, que con sus grandes historias y enseanzas me acompa en muchos
experimentos y ense tcnicas que valorar en todo mi trayecto como bilogo. Todos los
investigadores del Laboratorio de Fisiologa de Parsitos, que de alguna u otra forma siempre
estuvieron para responder mis dudas y ayudarme: Meyerling, Romel, Nereida, Adriana,
Evangelina y por supuesto a nuestro jefe, Alfredo Mijares, por aceptarme como estudiante y
permitirme usar los recursos del laboratorio. No poda faltar mi querida compaera tesista: Wila,
sin ti jams hubiese conocido a todas esas maravillosas personas, no hubiese podido
desarrollarme como investigadora en una institucin de ese calibre y nuestras vidas habran
tomado caminos divergentes. Gracias por haberme elegido y por todo lo que hemos pasado
juntas.

A mis profesores de Biologa en la USB, que siempre sirvieron de inspiracin y modelos a

seguir: Emilio Herrera, Deisy Perdomo, Beatriz Siegert, Yusbelly Daz, Alberto Martn, Juan
Posada, Jos Bubis, gracias por tener mentes tan brillantes e impartirnos sus conocimientos.
Tambin quiero agradecer a todos mis amigos de la USB que me han acompaado desde el
principio en mi carrera, y los que me siguieron animando hasta el final: Astrid, MariT, Luis

v
Eduardo, Artu, Kaede, Jo, a mis chicos de AniUSB, UbikUSB y Ares, gracias a los cuales tengo
un lugar donde s que pertenezco. Y tambin gracias a las que estuvieron desde un principio, y
siempre estarn: Pao y Tephy. Finalmente a Alejandro Pumpido, no existen palabras que puedan
describir todo lo agradecida que estoy por el apoyo incondicional que me has dado, me enseaste
a ser ms fuerte y a explorar nuevos horizontes, a luchar, a defenderme y a no subestimarme. A
todos, gracias.

Por ltimo, pero no menos importante, agradezco a mi familia, a mis padres Agustin y
Lenys y a mi hermano Joseto, por todo el cario y la aceptacin que me han brindado a lo largo
de mi carrera, yo no sera nada sin ustedes y sin todo lo que me han dado. Ahora me toca a m
retribuirles, espero que siempre estn orgullosos.

vi
 NDICE GENERAL

AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................................... v

NDICE GENERAL ............................................................................................................................ vii

NDICE DE FIGURAS ......................................................................................................................... ix

LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................................................. xi

1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 1

1.1 Enfermedad de Chagas .......................................................................................................... 1

1.2 Vector de la enfermedad ........................................................................................................ 1

1.2 Ciclo de vida del parsito ....................................................................................................... 2

1.4 Otras formas de infeccin....................................................................................................... 4

1.5 DTUs ..................................................................................................................................... 5

1.6 Sintomatologa clnica............................................................................................................ 7

1.7 Efectos de la infeccin con T. cruzi en el corazn ................................................................... 9

1.8 Efectos de la infeccin con T. cruzi en el bazo...................................................................... 10

1.9 Respuesta inmune a T. cruzi ................................................................................................. 11

1.10 Papel de los macrfagos del sistema fagoctico ................................................................... 12

1.11 Las citoquinas y el papel del TNF- en la respuesta inflamatoria ........................................ 14

1.12 Importancia de la apoptosis como mecanismo de regulacin inmune .................................. 15

1.13 Modelos experimentales de ratn ....................................................................................... 16

HIPTESIS ........................................................................................................................................ 17

2. OBJETIVOS ............................................................................................................................ 18
3. METODOLOGA .................................................................................................................. 19

3.1 Obtencin de cultivos parasitarios ........................................................................................ 19

3.2 Obtencin de los parsitos de cultivos de clulas Vero ......................................................... 19

vii
 3.3 Cuidado de los animales ....................................................................................................... 20

3.4 Infeccin de ratones ............................................................................................................. 20

3.5 Obtencin de material biolgico ........................................................................................... 20

3.6 Tratamiento de tejido cardaco ............................................................................................. 21

3.7 Anlisis histolgicos por tincin con hematoxilina-eosina .................................................... 22

3.8 Aislamiento de esplenocitos ................................................................................................. 23

3.9 Ensayo de proliferacin de esplenocitos ............................................................................... 23

3.10 Extraccin de macrfagos .................................................................................................. 24

3.11 Prueba de apoptosis ............................................................................................................ 24

3.12 Ensayos de inmunofluorescencia ........................................................................................ 24

3.13 Hematocritos...................................................................................................................... 25

3.14 Tratamiento de imgenes.................................................................................................... 25

3.15 Anlisis de resultados ......................................................................................................... 26

4. RESULTADOS........................................................................................................................ 27

4.1. Carga parasitaria y mortalidad ............................................................................................. 27

4.2. Evaluacin histopatolgica .................................................................................................. 29

4.3. Evaluacin de la actividad de macrfagos y expresin de TNF- ......................................... 37

4.4. Evaluacin del efecto de la infeccin en bazo ...................................................................... 42

5. DISCUSIN ............................................................................................................................ 47

CONCLUSIONES ............................................................................................................................... 64

RECOMENDACIONES ...................................................................................................................... 65

BIBLIOGRAFA ................................................................................................................................. 66

viii
 NDICE DE FIGURAS

Figura 1.1 Rhodnius prolixus ............................................................................................................... 2

Figura 1.2 Ciclo de vida de T. cruzi ..................................................................................................... 3

Figura 4.1 Carga parasitaria presente en ratones infectados con P1 y P2. ..................................... 28

Figura 4.2. Porcentaje de supervivencia de ratones infectados con P1 y P2. ................................. 29

Figura 4.3. Cortes histolgicos de tejido cardaco teido con HE .................................................. 30

Figura 4.4 Nmero de pseudoquistes presentes en tejido cardaco. ................................................ 33

Figura 4.5 Tamao de los nidos en tejido cardaco. ......................................................................... 34

Figura 4.6 Nmero de clulas correspondientes al infiltrado celular. ............................................ 35

Figura 4.7 Tamao promedio celular del infiltrado inflamatorio. ................................................... 36

Figura 4.8 Tincin (AO/EB) en la zona de infeccin. ..................................................................... 38

Figura 4.9 Prueba de apoptosis en la zona de infeccin el da 14 pi ............................................... 39

Figura 4.10 Ensayo de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti CD68 y anti TNF-.40

Figura 4.11 Clulas que expresaron CD68+ y TNF-+ mediante inmunofluorescencia. ............. 41

Figura 4.12 Anlisis de correlacin entre la presencia de clulas TNF-+/CD68+ y el % de

apoptosis. ............................................................................................................................................ 42

Figura 4.13 Proporcin del peso hmedo de los bazos en comparacin al peso neto del ratn. .. 43

Figura 4.14 Nmero de esplenocitos presentes en el bazo. ............................................................. 44

Figura 4.15 Hematocritos. ................................................................................................................. 45

Figura 4.15 Proliferacin de esplenocitos ......................................................................................... 46

ix
 LISTA DE ABREVIATURAS

AICD: Activation Induced Cell Death RPMI: (Medio de cultivo) Roswell Park
AO/EB: Naranja de Acridina y Bromuro de Memorial Institute
Etidio por sus siglas en ingls: acridine orange TCA: cido tricloroactico
& ethidium bromide Th: clulas T colaboradoras
APC: Clulas presentadoras de antgeno TNF-: Factor de necrosis tumoral alfa.
CAs: clulas apoptticas tmTNF-: forma transmembrana del TNF-
CCC: Cardiomiopata chagsica crnica sTNF-: forma soluble del TNF-
ConA: Concanavalina A OMS: Organizacin Mundial de la Salud.
DCs: Clulas dendrticas VPG: volumen del paquete globular
DMEM: Dulbeccos Modified Eagle Medium
DTU: Discrete typing units
FasL: ligando anti Fas
iNOS: xido ntrico sintetasa inducible
IP: intraperitoneal
M1: macrfagos clsicamente activados
M2: macrfagos alternadamente activados
MDSCs: clulas supresoras del sistema
mieloide
MEM: Mininum Essential Medium
NO: xido ntrico
NOS: enzima xido nitrico sintetasa
NK: clulas Natural killer
P1: aislado silvestre perteneciente a TcI
P2: aislado silvestre perteneciente a TcIV
PALS: vaina linfoide periarteriolar
Pi: post-infeccin

x
 1. INTRODUCCIN

1.2 Enfermedad de Chagas

Trypanosoma cruzi, es el agente etiolgico de la Enfermedad de Chagas o Tripanosomiasis

Americana, es un parsito protozoo flagelado de la clase Kinetoplastida, familia
Trypanosomatidae, (Telleria & Tibayrenc, 2010). Esta enfermedad, afecta aproximadamente 8
millones de personas en el mundo, con 56.000 nuevos casos anuales por todas las formas de
transmisin, cerca de 100 millones de personas estn en riesgo de infectarse motivando 12.000
muertes anuales (OMS, 2015).

No fue sino hasta el ao 1909 cuando Carlos das Chagas (Chagas, 1909) realiz la
descripcin clnica de la enfermedad, que hasta el momento no exista en la literatura cientfica.
Chagas (gracias a su descubrimiento la enfermedad lleva su nombre) realiz la conexin entre la
infeccin aguda del parsito y las manifestaciones clnicas, la cual es comnmente transmitida
por vectores triatominos hematfagos, aunque tambin puede ocurrir por transfusin de sangre o
trasplante de rganos procedentes de individuos infectados, por transmisin vertical de madre a
hijo durante el embarazo o por va oral (Schmunis, 2007).

Actualmente, la enfermedad de Chagas est reconocida por la Organizacin Mundial de la

Salud como una de las 17 enfermedades tropicales olvidadas o desatendidas (OMS, 2015)
encontrndose mayormente asociada a reas rurales, especialmente entre zonas de pobreza, donde
el tipo y uso de la vivienda humana pueda favorecer la entrada y el riesgo potencial de
colonizacin de los triatominos (Lorenzo et al., 2000).

1.2 Vector de la enfermedad

T. cruzi desarrolla su ciclo de vida en nueve rdenes de mamferos y en ms de 140

especies de insectos estrictamente hematfagos (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) la mayora
 2

de los cuales actan como vectores, siendo Triatoma, Panstrongylus y Rhodnius (Figura 1.2) los
gneros de mayor importancia epidemiolgica (Barretto, 1979; Dias, 2000). Casi la mitad de las
especies reconocidas de Triatominae han sido capaces de infectarse de modo natural o
experimental con T. cruzi y se sospecha que todos poseen esta capacidad (Telleria & Tibayrenc,
2010).

Figura 1.1. Rhodnius prolixus alimentndose de

un humano y defecando en la misma zona. Fuente:
OMS, Programa de Investigacin de enfermedades
tropicales.

Un total de 180 especies de mamferos pertenecientes a los siguientes ordenes:

Didelphidomorphia, Lagomorpha, Chiroptera, Rodentia, Pilosa, Cingulata, Carnivora, Primata,
Perisodactyla, se han encontrado naturalmente infectados por T. cruzi, incluyendo al hombre, el
cual adems de padecer de la enfermedad acta como reservorio (Herrera, 2010).

En Caracas, el crecimiento poblacional y el desarrollo urbano que ha invadido los bosques

que rodean a la ciudad, han facilitado la interaccin de asentamientos humanos con los ciclos
silvestres de transmisin del parsito, involucrando esencialmente triatominos selvticos de
especies tales como Panstrongylus geniculatus (Feliciangeli, 2009). Carrasco et al., (2014)
reportaron que la mayora de especies recolectadas en el Distrito Metropolitano pertenecan a P.
geniculatus (98,96%), seguido de Triatoma nigromaculata (0.59%), Triatoma maculata (0.39%)
y Rhodnius prolixus (0.06%), de estas 4 especies en total se encontr que 75,2% estaban
naturalmente infectados con T. cruzi y 48,7% se haban alimentado de sangre.

1.3 Ciclo de vida del parsito

La transmisin vectorial es la principal va de contagio y forma parte del ciclo de vida del
parsito, que presenta etapas tanto en hospedadores vertebrados como en invertebrados (Figura
1.2). Los insectos se infectan mediante la ingesta de sangre que contiene tripomastigotes, los
cuales se someten a repetidas fisiones longitudinales durante su paso a travs del tracto digestivo
del insecto. Para el momento en el que alcanzan el intestino posterior, ya han realizado
 3

metamorfosis al estado de epimastigote. Seguidamente mientras se siguen replicando, el

epimastigote se sujeta mediante su flagelo al epitelio de la glndula rectal, mientras que sucede la
transformacin a la forma metacclica del tripomastigote, la fijacin flagelar-epitelial se pierde.
Para el dcimo da luego de la ingestin, el tripomastigote metacclico con capacidad para
infectar aparece en el intestino posterior del insecto hematfago. Las formas metacclicas se
transmiten en las heces del insecto, usualmente mientras se alimenta de la sangre de un
hospedador vertebrado, y la infeccin ocurre cuando la materia fecal se frota en la picada, ojos o
membranas mucosas (Bogitsh et al., 2005).

Figura 1.2 Ciclo de vida de T. cruzi.

Fuente: adaptado del Centro de control y prevencin de enfermedades (CDC)

Al entrar en el torrente sanguneo del hospedador vertebrado, los tripomastigotes son

fagocitados por una variedad de clulas, invadiendo inmediatamente las clulas del sistema
fagoctico mononuclear, y rpidamente se transforman en la forma amastigote (la forma
replicativa intracelular). Los amastigotes se replican en el interior de la clula por fisin binaria
 4

cada 16-18 horas y tras varias generaciones se transforman en tripomastigotes sanguneos

circulantes, los cuales rompen la membrana plasmtica y salen a los espacios intersticiales donde
pueden infectar clulas vecinas o diseminarse por el torrente sanguneo y linftico e invadir
nuevos tejidos. Los rganos ms vulnerables a la infeccin son el bazo, el hgado, los ganglios
linfticos, fibras musculares estriadas (tanto cardacas como esquelticas), las fibras musculares
lisas (donde en ambos casos se origina una lesin denominada pseudoquiste); clulas nerviosas y
las clulas del sistema fagoctico mononuclear, otras regiones como las clulas del sistema
reproductivo, adems de los intestinos y mdula sea que tambin pueden ser invadidos (Bogitsh
et al., 2005; Teixeira et al., 2011).

1.4 Otras formas de infeccin

La persistencia de la Enfermedad de Chagas se basa en los varios mecanismos de

transmisin de T. cruzi. Un nuevo escenario epidemiolgico en trminos de transmisin no
vectorial (ruta congnita) ocurre en pases no endmicos debido a la migracin (Gascn et al.,
2010, Rassi et al., 2010). Esta misma causa fue el origen de otra forma de transmisin: va
transfusiones de sangre, por lo que en la mayora de pases Latinoamericanos es obligatorio
realizar un despistaje antes de donar sangre.

En Latinoamrica, han ocurrido numerosos brotes de la enfermedad producto de una

infeccin oral, siendo reportados desde 1968. Se han propuesto varios mecanismos posibles para
la infeccin va oral (i) contaminacin de comidas, bebidas, frutas y jugos con heces de
triatominos infectados preparados en reas donde los humanos han invadido el nicho ecolgico
del insecto, (ii) consumo directo de vectores infectados con T. cruzi (iii) consumo de comida
contaminada con orine de marsupiales, (iv) ingestin de carne de caza cruda o mal cocinada, (v)
consumo de la sangre de animales salvajes durante rituales religiosos, (vi) lactancia materna
(Alarcon de Noya et al., 2015).

Desde el ao 2007 hasta la actualidad, se han reportado brotes agudos asociados a

infecciones orales causadas por aislados virulentos silvestres en Venezuela, de manera notable
75% de los individuos afectados eran sintomticos. La sintomatologa clnica predominante
(fiebre, dolores de cabeza y mialgias) eran inespecficas, aunado a esto se encontr la presencia
de organomegalia, dolores abdominales y alteraciones cardiovasculares y sistmicas durante la
fase aguda, asociados a altos niveles de parasitemia (Alarcon de Noya et al., 2010), en la mayora
 5

de los casos el principal vector causante de estos brotes fue Panstrongylus geniculatus, y todos
los aislados de parsitos envueltos en los brotes orales fueron identificados como
correspondientes al DTU TcI (Muoz-Caldern et al., 2013), el cual es el linaje ms comn en
Venezuela (Carrasco et al., 2012). Hasta ahora, se han descrito dos tipos de infecciones orales
con T. cruzi en Venezuela, los que han ocurrido en escuelas los cuales fueron identificados como
microepidemias, ya que el nmero de individuos afectados fue alto (103 infectados en el 2007, 89
en el 2009); y brotes de pequeos grupos (familias). Se han descrito en la literatura cientfica un
total de 10 casos de infeccin oral, 2 de los cuales se consideraron microepidemias (Alarcon de
Noya et al., 2015).

1.5 DTUs

Distintos estudios han demostrado que T. cruzi es genticamente heterogneo, debido a su

naturaleza clonal, lo cual ha permitido la utilizacin de marcadores bioqumicos y moleculares
para agrupar fenotipos y genotipos del parsito que pueden mostrar diversidad biolgica,
bioqumica y molecular, sean atribuidos o no en una misma rea geogrfica (Gaunt & Miles,
2000; Lisboa et al., 2004; Yeo et al., 2005; Zingales et al., 2009), Se ha llegado a un consenso de
la existencia de seis poblaciones o Discrete Typing Units (DTUs), nombradas desde TcI a TcVI
(Brisse, et al., 2000), a saber:

T. cruzi I (Tc I, Z1, DTU I), subpoblacin homognea, considerada ms antigua, asociado
primariamente a ambientes silvestres y sinantrpicos, especialmente a mamferos didlfidos. Es
el grupo de mayor frecuencia desde la cuenca amaznica hacia el norte de Suramrica y Centro
Amrica, aun en ambientes domsticos.

T. cruzi II (Tc II, Z2, DTU IIb), subpoblacin ms heterognea a la cual se le han
atribuido hasta cinco variantes genticamente segregadas; siendo la subpoblacin de parsitos de
gran abundancia en el Cono Sur. Se le ha asociado primariamente a desdentados en su aparicin
ms antigua en el Continente Americano (65 millones de aos) y ms recientemente a roedores
caviomorfos y primates. Se presenta frecuentemente en el ciclo domstico, aun cuando hay
registros de su presencia en reservas de primates poco intervenidas.

T. cruzi III (Z3, Z1 ASATd, Z3-A, DTU IIc), subpoblacin asociada tradicionalmente a la
transmisin enzotica, es considerada el tercer clado ancestral. Se le ha encontrado en mamferos
 6

terrestres y cavadores, aun cuando algunos casos humanos han sido atribuidos a este genotipo. A
pesar de que su origen en la separacin de subpoblaciones no est del todo dilucidado, se le ha
atribuido su aparicin a eventos de hibridacin.

T. cruzi IV (Z3, Z3-B, DTU IIa): Subpoblacin tambin asociada a enzootias, con
registros en cnidos silvestres y ocasionalmente en casos humanos. Su origen se le ha atribuido a
eventos de hibridacin.

T. cruzi V (Cepa Boliviana Z2, rDNA , clonet 39, DTU IId): Subpoblacin asociada a
ciclos de transmisin domsticos con un origen probable en la hibridacin de subpoblaciones
domsticas y silvestres. Presentes en casos humanos y en los triatominos de mayor abundancia
del Cono Sur.

T. cruzi VI (Cepa Paraguaya Z2, Zymodema B, DTU IIe): Subpoblaciones asociadas a

casos humanos y al igual que Tc V, frecuentemente asociada a triatominos domiciliados del cono
Sur. Su origen se atribuye al menos a dos procesos de hibridacin.

A pesar de que se ha propuesto que la diversidad en las manifestaciones patolgicas de la

enfermedad se debe al fondo gentico del hospedador (Andrade et al., 2002; del Puerto et al.,
2012) tambin existen evidencias indirectas de que esta podra ser debida a la variabilidad
gentica de T. cruzi (Zingales et al., 2012). Sin embargo, an no se ha llevado a cabo una
correlacin directa, bien caracterizada, entre la diversidad gentica de T. cruzi y las distintas
manifestaciones de la enfermedad.

En la Amazonia Brasilera, Venezuela, Colombia, Amrica central y del Norte, TcI es el

DTU predominante y la mayor causa del mal de Chagas (Monteiro et al., 2013), no solamente
esto, sino que la predominancia de TcI en la poblacin de seres humanos en Venezuela (Aez et
al., 2004) y la de TcII en hospedadores de Brasil, ha sido representativa (ya que se ha demostrado
que TcI predomina en pases al norte del Amazonas, y TcII y TcIV hacia el sur). Esta
informacin resulta relevante dado que hay diferencias clnicas distintivas entre los pacientes
presentando la enfermedad en estas dos regiones geogrficas (Miles et al., 2009).

A pesar de que en Venezuela el DTU predominante es TcI, tambin se han reportado casos
de la presencia de TcII en pacientes humanos (Aez et al., 2009). En el 2014, Carrasco et al.,
genotipificaron 778 aislados venezolanos y obtuvieron que 94,1% de estos pertenecan al grupo
 7

TcI, 3,1% a TcIV y 2.8% a TcIII. De los aislados provenientes de infecciones en humanos 79,0%
pertenecan a TcI y 21,0% a TcIV. A pesar de esto, el DTU TcIV es el linaje menos caracterizado
de T. cruzi aunque sea la segunda causa del Mal de Chagas en Venezuela, y solo algunas cepas
han sido aisladas de seres humanos, (Carrasco et al., 2014). Estos datos reafirman la importancia
de estudiar aislados que pertenezcan a estos grupos y su efecto en la patologa de la Enfermedad
de Chagas en casos venezolanos, es por esto que en este estudio empleamos aislados silvestres
provenientes de especmenes de P. geniculatus obtenidos en una comunidad rural del Estado
Miranda, los cuales pertenecen a los DTU TcI (P1) y TcIV (P2) (caracterizados por Rodrguez et
al., datos por publicar).

1.6 Sintomatologa clnica.

En la enfermedad de Chagas se pueden distinguir dos fases: la aguda y la crnica la cual a

su vez puede ser asintomtica (indeterminada) o sintomtica. En la fase aguda, pocos das luego
de la picadura del insecto aparece una hinchazn local en el sitio de infeccin denominada
chagoma donde los parsitos han invadido los macrfagos del tejido subcutneo. Cuando los
tripomastigotes alcanzan el torrente sanguneo ocurre la diseminacin del parsito por el cuerpo y
los tripomastigotes sanguneos se pueden observar fcilmente al microscopio. Aproximadamente
de 1 a 3 semanas luego de la infeccin, la fiebre es una de las caractersticas principales, tambin
se presentan dolores de cabeza, malestares, un alargamiento de ndulos linfticos, hepatomegalia,
esplenomegalia, y edemas subcutneos. El alargamiento de los ndulos linfticos es frecuente,
pueden ser de ligera o moderada intensidad. La hepatomegalia (alargamiento del hgado) y la
esplenomegalia (alargamiento del bazo) poseen caractersticas similares a las de los ndulos
linfticos. El edema, cuyo mecanismo exacto es desconocido, puede ser generalizado o
restringido a la cara (signo de Romaa) o extremidades inferiores. La meningoencefalitis
(especialmente en pacientes inmunoinsuprimidos) y la miocarditis (algunas veces asociada a
pericarditis) son las manifestaciones neurolgicas y cardiolgicas ms severas (Bogitsh et al.,
2005; Telleria & Tibayrenc, 2010). Tambin se presentan a diversas alteraciones hematolgicas
como anemia, trombocitopenia y leucopenia, que podran contribuir a la mortalidad durante la
fase aguda de la infeccin (Cardoso & Brener, 1980).

Alrededor de un 5% de los individuos infectados desarrollan sntomas de afeccin cardiaca

que se refleja en una miocarditis severa que puede conducir a un fallo cardaco, responsable de
las pocas muertes que ocurren en la fase aguda, adems tambin puede presentarse
 8

cardiomegalia, e insuficiencia cardaca (Kirchhoff, 1996) que junto con las arritmias son un
indicativo de un mal pronstico para la enfermedad (Parada et al., 1997). La miocarditis es una
inflamacin del miocardio (Huber, 2010) y aproximadamente 20% de los pacientes con una
evidencia histolgica de miocarditis pueden desarrollar en el futuro una cardiomiopata dilatada
(Feldman & McNamara, 2000). No obstante, normalmente la fase aguda muestra sntomas leves
e inespecficos con lo cual la infeccin suele pasar desapercibida, tal es el caso que alrededor de
70% de los individuos infectados nunca desarrollarn sntomas, entrando en la fase indeterminada
de la Enfermedad de Chagas.

El 30% de los pacientes restantes, dcadas despus de la infeccin por el parsito, entran en
lo que se conoce como la fase crnica sintomtica, desarrollando las patologas ms severas de la
enfermedad. Durante esta fase, los parsitos circulantes no se detectan en sangre, pero se produce
dao progresivo de los tejidos afectados producto de una respuesta inmune exacerbada (Marin-
Neto et al., 2007). La enfermedad puede evolucionar a diferentes patologas: cardiaca
(miocarditis dilatada), digestiva (megaesfago y megacolon) o cardiodigestiva, tambin afecta el
sistema reticuloendotelial incluyendo el hgado, el bazo y la mdula espinal (Bouzahzah et al.,
2006). En las afecciones cardiacas frecuentemente se desarrollan cardiomiopatas (lo que se
conoce comnmente como cardiomiopata chagsica crnica (CCC)), siendo la insuficiencia
cardaca la causa ms comn de muerte de stos pacientes (Machado et al., 2012; Rassi et al.,
2012; Rassi et al., 2010). La CCC se puede presentar insidiosamente como insuficiencia cardaca
o de manera abrupta con arritmias y/o eventos tromboemblicos. La miocardiomiopata dilatada
es una manifestacin importante en la CCC que tpicamente ocurre aos e incluso dcadas luego
de que una persona se ha infectado con el parsito. Adems, la ocurrencia de aneurismas apicales
del ventrculo izquierdo es una de las marcas ms caractersticas de la CCC, observados en
resonancias cardacas y autopsias. Tambin se pueden observar reas focales o difusas de
hipertrofia miocelular, inclusive en ausencia de infiltrados inflamatorios (Tanowitz et al., 2009).

Dos frmacos (benznidazol y nifurtimox) estn disponibles para el tratamiento de la fase

aguda de la enfermedad, sin embargo, adems de tener un porcentaje muy alto de efectos
secundarios, no est claro que sean tiles para la fase crnica. Hasta la fecha, sigue faltando una
inmunoterapia efectiva o una vacuna (Rassi et al., 2010).
 9

1.7 Efectos de la infeccin con T. cruzi en el corazn

Los tripomastigotes circulantes ganan acceso a los miocitos cardacos invadiendo en

primera instancia las clulas endoteliales, clulas de msculo liso vascular y las reas
intersticiales de la vasculatura y el miocardio. Probablemente enzimas derivadas de los parsitos
son las que contribuyen a la degradacin de la matriz extracelular y a la subsecuente invasin por
parte del mismo. Durante la fase aguda, hay una intensa reaccin inflamatoria que consiste
principalmente en leucocitos, incluyendo eosinfilos y macrfagos, acompaados por un
incremento en la expresin de mediadores inflamatorios como citoquinas, quimioquinas y la
enzima xido ntrico sintetasa (NOS) (Machado et al., 2008). Se puede observar la presencia de
pseudoquistes de parsitos, los cuales son clulas del hospedador que han sido invadidas y
albergan nidos de amastigotes (Tanowitz et al., 2009).

La cardiomiopata aguda presente en la Enfermedad de Chagas podra considerarse como

una enfermedad isqumica; de hecho, patrones del movimiento de las paredes anormales y un
realzamiento tardo de las mismas resulta similar a las cardiomiopatas isqumicas, con una
especial predileccin por los segmentos apicales e inferolaterales del ventrculo izquierdo del
corazn (Regueiro et al., 2011) .

En el corazn, hay tres capas de miocitos cardacos que estn orientados oblicuamente entre
s y se renen en el pice. Debido a la isquemia, inflamacin y/o necrosis, hay una degradacin
de la matriz extracelular, la cual produce un deslizamiento de las capas ventriculares originando
un adelgazamiento de las paredes y formacin de aneurismas apicales. Daos en esta rea del
miocardio es comn en la CCC. El proceso de remodelaje del corazn conlleva cambios
estructurales asociados con la inflamacin, necrosis, hipertrofia, y dilatacin ventricular.
Consecuentemente, bandas de tejido fibroso reemplazaran a los miocitos cardacos, tenindose
que una de las caractersticas importantes de la Enfermedad de Chagas es la acumulacin de
colgeno extracelular que encierran fibras o grupos de fibras. Cualquier parte del corazn puede
ser comprometida, incluyendo las vas de conduccin. La microvasculatura tambin est
involucrada y se manifiesta por un engrosamiento de la membrana basal, estos cambios resultan
irreversibles y producen alteraciones estructurales y funcionales (Machado et al., 2012, Higuchi,
et al., 1997).
 10

Todava no se ha determinado por qu algunos pacientes en la fase indeterminada de la

infeccin por T. cruzi desarrollan CCC mientras que otros no. Parecera que el tipo de aislado
que produce la infeccin, la capacidad inmune y factores de salud del hospedador podran dictar
el desarrollo final de la enfermedad, pero an no se definen parmetros predictivos especficos,
sin embargo, la medicin de factores anatmicos, electrocardiogrficos, radiolgicos y
funcionales en pacientes que han desarrollado en cierta medida CCC se han mostrado como tiles
para predecir la mortalidad (Rassi et al., 2006). Adems, es posible que exista un tropismo
diferencial de T. cruzi por los diferentes tipos celulares involucrados en la infeccin, lo que
podra explicar las diferencias observadas en la virulencia de los pacientes chagsicos y en
modelos experimentales (Rodrguez et al., 2014).

1.8 Efectos de la infeccin con T. cruzi en el bazo

El bazo es el segundo rgano linfoide de mayor tamao perteneciente al sistema inmune,

conteniendo cerca de un cuarto de los linfocitos del cuerpo y responsable de iniciar la respuesta
inmune ante antgenos encontrados en la sangre (Balogh et al., 2004) y de filtrar la sangre de
materiales forneos. Estas funciones son desempeadas por los dos compartimientos principales
del bazo, la pulpa blanca (incluyendo la zona marginal) y la pulpa roja, ambas secciones son
diferentes en su arquitectura, organizacin vascular y composicin celular (Cesta, 2006).

La pulpa roja funciona como un filtro para la sangre de alta actividad fagoctica que
remueve material forneo y glbulos rojos decadentes y daados. Tambin sirve como almacn
de hierro, eritrocitos y plaquetas, donde adems se pueden encontrar granulocitos y clulas
mononucleares circulantes. En roedores es un sitio de hematopoyesis, particularmente en
animales fetales y neonatales (Cesta, 2006). Por otro lado, la pulpa blanca est compuesta de tres
subcompartimientos: la vaina linfoide periarteriolar (PALS, por sus siglas en ingls), los folculos
y la zona marginal; en general est compuesta de linfocitos (B y T), macrfagos, clulas
dendrticas (DCs), clulas plasmticas, y clulas reticulares; (Van Rees et al., 1996).

Existen pocos reportes sobre el papel del bazo en pacientes con la Enfermedad de Chagas y
hay que acotar que humanos los anlisis de dicho rgano estn basados en autopsias de pacientes
crnicos (de Meis et al., 2009). Se sabe que la infeccin con T. cruzi promueve la esplenomegalia
en ratones y humanos. En ratones, la esplenomegalia se observa tanto en la fase aguda como en la
crnica. Se ha demostrado que los esplenocitos son clulas importantes involucradas en la
 11

respuesta inmune del hospedador, ya que una esplenectoma (extirpacin del bazo) previa a la
infeccin aumenta la susceptibilidad del animal a la enfermedad, lo que se puede notar en el
nmero de parsitos circulantes. Adems, la infeccin con T. cruzi promueve la activacin y
expansin de linfocitos B y T as como un marcado incremento en el nmero total de clulas B
esplnicas. Inclusive, dos semanas posteriores a la infeccin con los parsitos, la mayora de las
clulas en el bazo y los ndulos linfticos se encuentran alargadas y ms de la mitad se estn
dividiendo. (de Meis et al., 2009, Minoprio et al., 1986). Esto sucede debido a que en una
respuesta tpica ante una protena fornea, las clulas B comienzan a proliferar y diferenciarse en
clulas secretoras de anticuerpos (Maclennan et al., 2003) lo que resulta fundamental en la
respuesta inmune contra el parsito.

1.9 Respuesta inmune a T. cruzi

La infeccin por T. cruzi desencadena una respuesta inmune compleja poco conocida, en la
cual diferentes tipos celulares reconocen al parsito y reaccionan de maneras distintas para
controlar la infeccin. Se conoce poco acerca de la posible diversidad de respuestas inmunes
frente los diferentes linajes del parsito (Carbajosa, 2014).

En lo que respecta a la patognesis de la enfermedad de Chagas, se han propuesto dos

hiptesis principales. Una basada en la persistencia del parsito y la otra basada en respuestas
inmunes adversas por parte del hospedador frente a la infeccin, originando un efecto
autoinmune (Dutra et al., 2009). En la fase aguda de la enfermedad, la mayora de los individuos
generan una respuesta inmune efectiva, controlan al parsito y se vuelven asintomticos. el
hospedador es capaz de controlar la infeccin en tres formas distintas pero complementarias: (i)
Deteccin y destruccin directa del parsito por macrfagos y clulas dendrticas, (ii) activacin
de clulas dendrticas y macrfagos que presentan una estimulacin antignica para la activacin
de respuestas inmunes antgeno-especficas y (iii) deteccin de la infeccin por clulas no
hematopoyticas, las cuales son el objetivo principal en la invasin por T. cruzi. (Tarleton, 2007).

En casos crnicos, raramente se observan tripomastigotes en la sangre dado que pueden ser
efectivamente destruidos por anticuerpos circulantes. A diferencia de los tripomastigotes
salivares T. cruzi parece incapaz de producir antgenos de superficie variables. Esto, en cambio,
aparentemente protege a los amastigotes en varias clulas hospedadoras de reacciones de
anticuerpos (Bogitsh et al., 2005). Los antgenos que son producidos por la respuesta inmune son
 12

mediados por clulas T, las cuales juegan un papel importante en la progresin de la enfermedad.
Estudios en nios con la forma indeterminada han mostrado una alta frecuencia de monocitos
pro-inflamatorios y clulas regulatorias en comparacin con sujetos sanos (Vitelli-Avelar, et al.,
2006). Por lo que se cree que la expresin de citoquinas y su cintica son factores claves
importantes influenciando el desarrollo y progresin de la enfermedad (Poveda, et al., 2014).

1.10 Papel de los macrfagos del sistema fagoctico

Los macrfagos son probablemente las clulas ms estudiadas en las infecciones por T.
cruzi ya que actan simultneamente como clulas hospedadoras (conteniendo la multiplicacin
de los parsitos y participando en su control cuando estn activadas), (Telleria & Tibayrenc,
2010). Estas clulas estn ampliamente distribuidas a lo largo del cuerpo y presentan una gran
heterogeneidad funcional y estructural en reflejo a las condiciones a las que estn sometidos en su
ambiente. Los macrfagos tisulares son fagocitos profesionales y clulas presentadoras de
antgeno (APC), provienen de clulas del sistema fagoctico mononuclear, y se producen por la
diferenciacin de los monocitos circulantes perifricos (Murray & Wynn, 2011a). Estn
envueltos en numerosas funciones inmunes, siendo la ms significativa la fagocitosis de material
forneo y necrtico y el procesamiento y presentacin de antgenos (Gordon et al., 1992).

Los macrfagos activados pertenecientes a los diferentes fenotipos se han clasificado

rutinariamente como macrfagos M1 y M2. Los macrfagos clsicamente activados comprenden
clulas inmunoefectoras con un fenotipo inflamatorio agudo, son altamente agresivas en contra
de bacterias y producen grandes cantidades de linfoquinas. La forma alternadamente activada
M2, comprenden macrfagos antiinflamatorios que pueden ser separados en al menos tres
subgrupos, los cuales tienen diferentes funciones, incluyendo la regulacin de la respuesta
inmune, mantenimiento de la tolerancia y reparacin de tejidos (Murray & Wynn, 2011a, Murray
& Wynn, 2011b). De hecho, clulas del linaje monocito/macrfago exhiben una plasticidad
extraordinaria en respuesta a estmulos tanto endgenos como exgenos, lo que permite reescribir
el proceso inicial de repolarizacin M1/M2 (Murray & Wynn, 2011b), por ejemplo macrfagos
M2 pueden convertirse al estado activado M1 bajo ciertas circunstancias.

Aun as, el fenotipo de la superficie de los fagocitos mononucleares est escasamente

definido por anticuerpos monoclonales especficos en comparacin con otras lneas
hematopoyticas. La mayora de los antgenos que definen el linaje de fagocitos mononucleares
 13

est, de hecho, ausente de macrfagos tisulares (McMichael et al., 1987). Sin embargo,
anticuerpos anti CD68 reconocen una glicoprotena de 110 kDa en macrfagos tisulares y
monocitos sanguneos (Knapp, et al., 1991) la cual ha sido localizada en estructuras del
endosoma o lisosoma (Saito, et al., 1991). Un amplio rango de macrfagos tisulares es capaz de
ser reconocido por este anticuerpo, incluyendo macrfagos de centros germinales, alveolares, de
amgdalas humanas, de la pulpa roja esplnica, de tejido conectivo en la dermis, clulas Kupffer
del hgado y monocitos sanguneos circulantes (Smith et al., 1991) por lo que un marcador
comnmente aceptado para macrfagos maduros M1 y M2 es el anticuerpo anti CD68.

Durante la infeccin con T. cruzi, los macrfagos son uno de los tipos celulares ms
importantes capaces de luchar contra el parsito. Estas clulas metabolizan L-arginina mediante 2
vas. La primera involucra la iNOS, la cual es responsable de la produccin de NO. Esta va est
controlada por las citoquinas de las clulas T colaboradoras (Th) 1, conocidas por inducir la
expresin de iNOS y la activacin clsica de los macrfagos (M1), la cual es esencial para el
control temprano de la infeccin en ratones, sin embargo, una produccin excesiva de NO
tambin puede tener efectos citotxicos en el hospedador y dar paso a una inmunosupresin de
clulas T (Goi et al., 2002). La segunda va involucra a la arginasa, la cual es inducida durante
la activacin alternativa de los macrfagos (M2), principalmente por citoquinas Th2 (Corraliza et
al., 1995). La arginasa cataliza la conversin de la L-arginina a urea y L-ornitina, la cual es
requerida para la sntesis de poliaminas, que en cambio, son esenciales para el crecimiento de las
clulas y los parsitos. (Cuervo, et al., 2008). Se ha observado que la IL-17 podra regular el
reclutamiento de clulas inflamatorias y la diferenciacin de Th1 en tejido cardaco (da Matta et
al., 2010). Por lo que para la resolucin de la infeccin con T. cruzi se necesita un balance entre
la respuesta inmune mediada por Th1 y Th2.

En todas las formas clnicas de la Enfermedad de Chagas, la inmunidad mediada por las
clulas resulta de gran importancia. Anticuerpos especficos y la activacin de fagocitos por IFN-
son los principales elementos de respuesta del sistema inmune, durante la fase aguda existe un
incremento en la produccin de IL-12 por los macrfagos infectados, as como de la actividad de
las clulas NK (Natural Killer por sus siglas en ingls) (Bogitsh et al., 2005) previo a la
expansin de los linfocitos T (Brener & Gazzinelli, 1997). El IFN- juega un papel crucial en la
activacin de los macrfagos, ya que induce en ellos la produccin de TNF-. e IL-12. En
conjunto, estas citoquinas actan sinrgicamente sobre los macrfagos donde inducen la
 14

expresin de la enzima xido ntrico sintetasa inducible (iNOS) (Munoz-Fernandez et al., 1992).
Y de este modo los macrfagos producen xido ntrico (NO) que participa en la destruccin
intracelular de los parsitos (Camargo et al., 1997).

1.11 Las citoquinas y el papel del TNF- en la respuesta inflamatoria

Las citoquinas producidas en el tejido cardaco de individuos infectados con T. cruzi

durante la fase inicial de la respuesta inmune, pueden influenciar las reacciones inmunes
subsecuentes y el resultado clnico de la Enfermedad de Chagas. El TNF- es una citoquina
producida principalmente por macrfagos, linfocitos B y T, pero tambin puede producirse en
otras lneas celulares, tales como clulas endoteliales, neuronas y cardiomiocitos en respuesta a
estmulos inflamatorios e infecciosos (Kollias & Sfikakis, 2010). TNF- juega un papel
importante en la patofisiologa de las enfermedades transmisibles, particularmente, en la
infeccin por T. cruzi y el aumento dicha citoquina est relacionada con el progreso de la
enfermedad (Rodrguez-Angulo et al. 2013, Sanoja et al., 2013, Basso, 2013).

El TNF- existe en dos formas biolgicamente activas, la transmembrana (tmTNF-) y la

forma soluble (sTNF-), en primera instancia la citoquina es sintetizada como una molcula
transmembrana de 26 kDa que luego puede ser clivada por la enzima convertidora de TNF-
(TACE o ADAM17), liberando una citoquina soluble de 17 kDa. En general, el TNF- ejecuta
sus efectos biolgicos a travs de dos receptores distintos, TNFR1 (p55/p60) y TNFR2
(p75/p80). Aunque tmTNF- y sTNF- se unen al mismo TNFR, sus diferentes efectos
biolgicos indican que ambas formas de la citoquina disparan vas de sealizacin distintivas
(Chen et al., 2011). Se ha propuesto que la excesiva produccin de mediadores proinflamatorios,
como NO o citoquinas como TNF, podra provocar la destruccin celular causante de las
citopenias que se presentan durante la fase aguda (Malvezi et al., 2004; Stijlemans et al., 2010),
sin embargo, estas tambin podran ser debidas a alteraciones en la hematopoyesis producidas
durante la infeccin (Marcondes et al., 2000) que junto con los fenmenos de inmunosupresin,
podran ser causantes de las alteraciones en rganos primarios y secundarios del sistema inmune.

Se ha sugerido que la supresin de la hematopoyesis provocada por infecciones ocurre va

induccin de citoquinas inflamatorias. Alteraciones en la mdula sea mediadas por endotoxinas
asociadas con infecciones bacterianas gram-negativas estn involucradas con la liberacin de
factores estimuladores de colonias, TNF- e IL1. Estos factores se conocen por promover la
 15

produccin de granulocitos e inhibir la linfopoyesis, adems de que podran aumentar la

inmunidad innata (MacNamara et al., 2009). Diferentes mecanismos parecen mediar la
proteccin dependiendo del modelo de ratn y el aislado de T. cruzi empleados para la infeccin
(Sanoja, et al., 2013).

1.12 Importancia de la apoptosis como mecanismo de regulacin inmune.

La muerte celular programada mediante apoptosis comprende una respuesta biolgica

relevante para el desarrollo, renovacin de tejido y homestasis del sistema inmune. Defectos en
dicho sistema puede ocasionar enfermedades (Rudin & Thompson, 1997). Adems de esto, la
apoptosis puede ser inducida por parsitos unicelulares incluyendo T. cruzi (Ameisen et al., 1995,
Piacenza et al., 2001). Una vez producida la infeccin con parsitos, la apoptosis de leucocitos
del hospedador juega un papel importante en la regulacin inmune (DosReis et al., 2007).

Se ha demostrado que una reestimulacin de clulas T CD4+ de ratones infectados con T.

cruzi result en una formacin de grandes clusters celulares in vitro donde la mayora de los
linfocitos mora, las clulas que estaban excluidas del cluster permanecan viables, sugiriendo un
mecanismo de muerte celular inducida por activacin (AICD, por sus siglas en ingls Activation
Induced Cell Death) (DosReis, et al., 2009). AICD en las infecciones por T. cruzi est mediada,
al menos en parte por la va Fas, ya que este proceso puede ser bloqueado al neutralizar
anticuerpos para el ligando anti-Fas (FasL) y no ocurre en ratones deficientes de FasL (Lopes et
al., 1999). Estudios empleando aislados ms virulentos sugieren que la supresin de las
respuestas de clulas T tambin puede resultar en apoptosis inducida por el exceso de produccin
de NO (Martins, et al., 1998).

En general, se ha establecido que durante la infeccin por T. cruzi, la apoptosis puede ser
inducida a travs de al menos tres vas distintas: (i) ligandos extrnsecos solubles o acoplados a
membrana para receptores de muerte celular (como Fas), (ii) granzimas liberadas por clulas
citotxicas y (iii) la va intrnseca mitocondrial. Aunque, inicialmente se haba publicado que el
sistema perforina/granzima no era necesario para mediar la muerte del parsito (Kumar &
Tarleton, 1998), estudios posteriores demostraron que las clulas T CD8 +, a travs del sistema
perforina/granzima y/o por apoptosis mediada por FAS, eran importantes para el control de la
infeccin intracelular (Martin & Tarleton, 2004; Muller et al., 2003).
 16

1.13 Modelos experimentales de ratn

Se han empleado ampliamente modelos experimentales de ratn para estudiar varios

aspectos de la infeccin con T. cruzi, y la vasta mayora del conocimiento sobre la biologa de la
enfermedad fue desarrollada en primera instancia en el modelo experimental de ratn (de Meis et
al., 2009). Estos modelos reproducen gran cantidad de caractersticas: presencia de fases aguda y
crnica de la enfermedad, activacin policlonal, anticuerpos especficos, una patologa
inflamatoria en diferentes tejidos y rganos, parasitemia, entre otras, por lo que estudiarlas resulta
en una herramienta til para la caracterizacin del comportamiento biolgico de los diferentes
aislados de T. cruzi, teniendo en cuenta que estos inducen diversos efectos en los individuos. A
pesar de esto el modelo en ratones no est totalmente relacionado con la enfermedad en humanos,
pero puede ser bastante til para formular hiptesis relevantes para la misma (Telleria &
Tibayrenc, 2010). Es por esto que en este estudio plantea observar y comparar el efecto de la
infeccin de dos aislados: P1 y P2 en un modelo murino, se observar y clasificar la virulencia
de cada uno mediante factores como mortalidad, carga parasitaria, presencia del parsito y de
infiltrados inflamatorios en tejido cardaco, se evaluar una posible relacin entre el TNF- y la
susceptibilidad de los ratones a la infeccin y el efecto de la misma en uno de los rganos
linfoides ms importantes: el bazo.
 17

HIPTESIS

Los aislados de T. cruzi P1 y P2 al ser genticamente distintos, inducirn diferentes efectos

patolgicos en el sistema inmune de un modelo murino, durante la fase aguda de infeccin.
 18

2. OBJETIVOS

Estudios experimentales han demostrado que T. cruzi posee una amplia variabilidad biolgica y
una diversidad gentica. Como se mencion previamente, se reconocen seis DTUs, nombradas
TcI hasta TcVI y existe la hiptesis de que las diferencias biolgicas entre las mismas son
proporcionales a la divergencia evolucionaria entre los genotipos. La localizacin geogrfica y el
DTU de T. cruzi puede influenciar la patognesis de la enfermedad de Chagas. Es por eso que en
este trabajo se plantea la interrogante: Cules son las diferencias sintomatolgicas que se pueden
encontrar en dos aislados silvestres de T. cruzi correspondientes a los DTU TcI y TcIV en ratones
Balb/c infectados experimentalmente? Dado la escasa cantidad de datos de las caractersticas
biolgicas de los aislados de TcIV y se conoce poco sobre la virulencia de dichos aislados, este
estudio tiene se propuso los siguientes objetivos:

Generales

Comparar el efecto de la infeccin de dos aislados silvestres de T. cruzi en un modelo

experimental in vivo.

Especficos

1. Evaluar efectos histopatolgicos presentes en tejido cardaco durante la fase aguda

de la infeccin por los aislados P1 y P2.
2. Evaluar mediante inmunofluorescencia la presencia de la citoquina proinflamatoria
TNF- en macrfagos peritoneales.
3. Evaluar la celularidad y proliferacin de esplenocitos provenientes de ratones
infectados.
 3. METODOLOGA

3.1 Obtencin de cultivos parasitarios

Los parsitos empleados en este estudio forman parte de la Coleccin de Hemoparsitos del
Laboratorio de Fisiologa de Parsitos, del centro de Biofsica y Bioqumica perteneciente al
IVIC, los cuales fueron aislados salvajes nombrados Biodiven 028-P1 (DTU TcI, de ahora en
adelante P1) y Biodiven 028-P2 (DTU TcIV, P2), estos se obtuvieron de especmenes de P.
geniculatus en una comunidad rural del estado de Miranda llamada Potrerito (1020'38.5"N,
6659'51.0"O), y fueron mantenidas por cultivos de clulas Vero. Actualmente, Rodrguez-
Angulo et al., estn caracterizando a nivel molecular estos aislados (datos por publicar).
La cuantificacin de nmero de parsitos se llev a cabo en una cmara Neubauer,
aadiendo 10 L de la solucin de cultivo, se observ en el microscopio marca Leica con
aumento de 400X en un total de 64 campos.

3.2 Obtencin de los parsitos de cultivos de clulas Vero

Los cultivos de clulas Vero fueron preparados en la unidad de cultivo celular (IVIC). En
frascos Easy Flask T-25 cm2 y fueron mantenidas en incubadora Binder a 37C y una
concentracin de 5% de CO2 posteriormente fueron trasladadas a un subcultivo con 24 horas de
antelacin previa a la infeccin con parsitos. Para la infeccin se inocularon los parsitos
previamente congelados y almacenados a -80C a una concentracin de 106 parsitos/mL. Cada
T-25 con las clulas infectadas se guard en una incubadora Binder a 37C y una concentracin
de 5% de CO2. El medio de cultivo se cambi cada 3 das por medio nuevo, se utiliz DMEM
(0,5 mM glicina, 1,8 mM cloruro de calcio, 25 mM D-glucosa, rojo fenol y aminocidos
esenciales, suplementado con 10% v/v de suero fetal bovino) o medio mnimo esencial (MEM:
1,8 mM cloruro de calcio, 0,81 mM sulfato de magnesio, 5.33 mM cloruro de potasio, 117,24
mM cloruro de sodio, 1.01 mM fosfato de sodio monobsico, 5,56 mM D-glucosa, ms L-
 20

glutamina, rojo fenol y aminocidos esenciales) si la confluencia de las clulas era mayor al 75%.
Para realizar el cambio se calent medio a 37C, el proveniente del frasco de cultivo se retir
para ser descartado o para almacenar los parsitos presentes y se aadi medio fresco,
posteriormente se guard de nuevo el cultivo en la incubadora.
Para la extraccin de parsitos frescos provenientes del cultivo se procedi a extraer en
condiciones aspticas el medio de cultivo y trasladarlo a un tubo Falcon para luego centrifugarlo
a 3000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente, se descart el sobrenadante y el pellet fue
resuspendido en 1 mL de MEM y luego se cuantific la concentracin de los tripomastigotes en
cmara de Neubauer aadiendo 10 L de muestra. Los parsitos que no se emplearon en el
momento fueron resuspendidos en 1 mL de medio de congelacin (10% glicerol, 20 % suero fetal
bovino en MEM) y almacenados a -80C.

3.3 Cuidado de los animales

Se emplearon un total de 70 ratones machos Balb/c, adultos (20-25 g), los cuales fueron
alojados en cajas (5 por caja) y divididos en grupos segn el tratamiento (30 infectados con P1,
30 infectados con P2 y 10 ratones control), en una habitacin con temperatura y humedad
controladas, mantenidos en un ciclo de 12 horas de luz y oscuridad. Todos los ratones tuvieron
libre acceso a comida, agua y fueron habituados a estas condiciones durante al menos una
semana. Los animales se pesaron una vez a la semana (das 0, 7, 14, 21 post infeccin) en una
balanza Electronic Balance RS2320.

3.4 Infeccin de ratones

En el da 0 de infeccin se inyect va intraperitoneal (ip) a razn de 0,1 mL/ratn con una
jeringa hipodrmica un aproximado de 1000 tripomastigotes por ratn (procedentes de cultivos
en clulas Vero). Posteriormente se evalu la carga parasitaria semanalmente, mediante muestras
de fluido peritoneal (50-100 L) de los ratones sobrevivientes (Rodrguez-Angulo et al., 2013)
los parsitos fueron observados en un microscopio Leica con aumento de 400X en un total de 50
campos.

3.5 Obtencin de material biolgico

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo al Manual de cuidado y
uso de animales de laboratorio publicado por el Instituto Nacional de Salud de Estados Unidos
 21

(publicacin NIH N 85-23, revisado 1996). La extraccin de tejido (corazn y bazo) y sangre se
realiz suministrando intraperitonealmente dosis de 200 mg/Kg de tiopental sdico para
anestesiar los especmenes, se comprob ausencia de reflejos por punzamiento de la almohadilla
dactilar de la pata trasera y luego se sujet al animal en una cmara de diseccin y se realiz un
corte en forma de Y para exponer la caja torcica, seguido de otro corte debajo del cartlago
xifoide de forma diagonal hacia los hombros para exponer el corazn. Posteriormente se cort
longitudinalmente a lo largo del peritoneo para exponer los intestinos y de este modo extraer el
bazo.
La extraccin de sangre se hizo por puncin cardaca y se guardaron en tubos Vacutainer .
Cada instrumento de diseccin fue esterilizado previo a la extraccin de los rganos. Los
corazones fueron lavados con 1 cc de PBS, 10 veces cada uno, luego fueron cortados
longitudinalmente por la mitad y almacenados en 3 mL de formaldehido en un tubo Falcon a
temperatura ambiente. Por otro lado, los bazos fueron sumergidos en 20 mL RPMI 1640 (5%
suero fetal bovino, 2 mM L-glutamina, penincilina (100 U/mL) y streptomicina (100 ng/mL)
pesados en una balanza y conservados en hielo para su uso inmediato.

3.6 Tratamiento de tejido cardaco

Pasado un lapso no mayor a 48 horas los tubos Falcon conteniendo las porciones de
corazn provenientes de los ratones infectados fueron descartados y los corazones cambiados a
un medio de alcohol 70% en frascos de vidrio y almacenados a temperatura ambiente hasta su
posterior uso. Se siguieron los siguientes pasos para preparar el tejido, todos los pasos siguientes
se realizaron bajo campana:
Deshidratacin: el alcohol 70% fue sustituido por alcohol 80% por un lapso de 24 horas,
seguidamente se reemplaz sta solucin por una de alcohol 95% durante 1 hora y luego dicha
solucin fue descartada.
Paso intermedio: inmediatamente se aadi acetona durante 1 hora y posterior a esto se
hicieron dos lavados con acetona nueva en lapsos de 30 minutos para evitar la saturacin de la
misma, finalmente se descartaron las soluciones usadas y se reemplazaron con acetona absoluta
durante 30 minutos.
Parafinacin: luego de descartar la acetona el corazn se sumergi en un frasco con
parafina lquida la cual fue previamente calentada en un dispensador, luego cada frasco se guard
en una estufa a 54C por 24 horas.
 22

Armado de los bloques: los frascos con las muestran se calentaron sobre un mechero hasta
llevar la parafina a un estado lquido, de igual modo se calentaron todos los instrumentos
necesarios para manipular el tejido, en un molde cbico de plstico se dispens parafina caliente
y con pinzas se traslad el corazn del frasco al bloque acomodndolo para su posterior corte, el
bloque fue colocado sobre hielo para asegurar la integridad del tejido y evitar su expansin por el
calor.
Corte del tejido: previo a los cortes se prepararon las lminas portaobjetos cubrindolas
con un frotis de dos capas de gelatina de cromo a modo de pegamento y los bloques de parafina
con el tejido se enfriaron en hielo. Se calent un bao de agua a 40 C y con un micrtomo se
efectuaron los cortes de cada corazn con un grosor de 5 micras. El tejido cortado se traslad al
bao de agua para permitir su expansin y luego se coloc en los portaobjetos con el pegamento.
Las lminas con los cortes se guardaron en estufa a 54C por 24 horas para fijar y sellar la
parafina.

3.7 Anlisis histolgicos por tincin con hematoxilina-eosina

-Desparafinado: Cada lmina portaobjetos conteniendo el tejido se calent por 15 minutos a
60C o hasta que se derritiera la parafina. Luego se sumergieron las lminas en un frasco
conteniendo xilol (I), se cambi a otro frasco conteniendo xilol (II) y se repiti una tercera vez en
otro frasco conteniendo una solucin nueva de xilol (III), cada paso se hizo en un lapso de 3
minutos por frasco.
-Deshidratacin: seguidamente las lminas se trasladaron a un contenedor de alcohol puro
(I) 95% por 3 minutos, se cambi a un frasco de alcohol (II) 90% por 3 minutos y luego a un
frasco conteniendo alcohol (III) 80% por 3 minutos. Por ltimo en esa fase, se sumergieron las
lminas en otro frasco con alcohol 70% por 3 minutos.
-Lavado: posteriormente se hicieron 3 lavados con agua destilada
-Hematoxilina: las lminas fueron sumergidas en un contenedor de hematoxilina y se
dejaron reposar por un lapso de 10 minutos en solucin.
-Lavado: la hematoxilina fue retirada primero haciendo un lavado con agua corriente para
retirar el exceso y luego con un lavado de agua destilada.
-Pasos intermedios: las lminas se sumergieron en alcohol cido por 4 segundos y luego se
lavaron con agua destilada, seguidamente se sumergieron en agua amoniacada hasta que el tejido
cambiara su coloracin de marrn a azul y de nuevo se lav con agua destilada.
 23

-Eosina: previo a este paso las lminas se sumergieron en alcohol 80% por 3 minutos y
luego se traspasaron a un frasco de eosina 1% en alcohol 80% por 1 minuto, pasado este lapso de
tiempo las lminas se sacaron con papel absorbente para retirar el exceso de colorante.
-Deshidratacin: luego de secadas las lminas se sumergieron en alcohol (III), (II) y (I), por
3 minutos c/u.
-Aclarado: las lminas se secaron en papel absorbente para secarlas, luego se sumergieron
en xilol (I) por 3 segundos agitando vigorosamente, se cambiaron a xilol (II) por 3 minutos
mientras se agitaba el frasco de forma rtmica, lo mismo se realiz para los frascos de xilol (III) y
(IV), en ste ltimo se dejaron reposando por 24 horas.
-Montaje: al momento de realizar el montaje se agreg 1 gota de medio de montaje sobre
cada corte de corazn y se coloc cuidadosamente una lmina cubre objetos sobre los mismos.

3.8 Aislamiento de esplenocitos

Los bazos fueron extrados de los ratones el da 21 post-infeccin en condiciones de
esterilidad. Luego de ser pesados fueron disgregados de forma mecnica en un homogeneizador,
una vez disgregado la mayor cantidad de tejido se devolvi al Falcon. Todas las muestras se
mantuvieron en hielo. En una centrfuga marca 5810R versin 15 Amp por Eppendorf, se
centrifugaron los Falcon con las muestras de bazo durante 10 minutos, 3000 rpm a 4 C. Se
descart el sobrenadante y se resuspendi en 2 mL de buffer de lisis (155 mM NH4Cl, 12 mL
NaHCO3, 0,1 mL EDTA) a los tubos Falcon conteniendo bazos infectados y en 1 mL de buffer de
lisis para los controles, luego se incubaron por 10 minutos. Seguidamente se centrifug igual que
en el paso anterior, se descart el sobrenadante y se resuspendi en 10 mL de RPMI en cada una
de las muestras, finalmente se contaron en el microscopio el nmero de clulas en cmara de
Neubauer, con aumento de 400X total.

3.9 Ensayo de proliferacin de esplenocitos

Para este ensayo se esterilizaron 2 placas ELISA de 96 pozos (base plana), una de ellas
correspondera al tiempo T= 0 h y la otra a T= 12 h. Se sembraron las muestras provenientes del
aislado de bazos a razn de 20000 clulas en 100 L/ pozo y se aadi 25 L/pozo de TCA al
10% por 1 hora a 4C en la placa T=0, luego se centrifug la placa a 3000 rpm por 5 minutos a
4C dos veces y se dej secar. A la placa T=12 luego de agregar las muestras de aislado de bazo,
se le coloc 10 g/pozo de Concanavalina A (Con A) en RPMI, se dej incubando a 37C en una
 24

incubadora marca Binder por un lapso de 12 horas, pasado este tiempo se aadi 25 L/pozo de
TCA al 10% por 1 hora a 4C. Luego se centrifug la placa a 3000 rpm por 5 minutos a 4C dos
veces y se dej secar. Seguidamente en ambas placas se colocaron 50L/pozo de sulforodamina
0,04% por 30 minutos a temperatura ambiente y luego se lavaron con cido actico 1%
agregando 200 L/pozo un total de 5 veces. Finalmente se solubiliz con Trizma base 10 nM
agregando 200 L/pozo y se emple un lector de ELISA a 490 nm.

3.10 Extraccin de macrfagos

Extraccin del material biolgico: el da 14 post-infeccin se procedi a anestesiar
subcutneamente en la espalda del ratn 0,3 mL de tiopental sdico. Una vez anestesiados los
ratones se procedi a inyectar va IP 2 mL de MEM con una jeringa hipodrmica y se masaje
suavemente la zona durante 1 minuto, pasado este tiempo se extrajo el lquido asctico mezclado
con la solucin de MEM con una nueva jeringa hipodrmica. En una cpsula de Petri se
colocaron portaobjetos sobre unas bases de papel absorbente humedecido con agua destilada,
sobre stos se colocaron 3 gotas del lquido extrado, la muestra se extendi para cubrir la mayor
cantidad de rea posible y se dej asentar por un lapso de 10 minutos. Seguidamente se
efectuaron lavados con 1 mL de MEM, un total de 3 veces. Los portaobjetos con las muestras
fueron trasladados a una cmara de formaldehdo para su fijacin durante 2 minutos, luego se
sumergieron en acetona en hielo, por 3 minutos. Finalmente se dejaron secar y se guardaron a -
20C hasta su posterior uso.

3.11 Prueba de apoptosis

Se colocaron 3 gotas del lquido ip extrado en una lmina portaobjetos, la muestra se
extendi para cubrir la mayor cantidad de rea posible y se dej asentar por un lapso de 10
minutos. Pasado este tiempo se aadi 10 L de los colorantes que posean una concentracin de
100 g/L. Se emple una tincin con Naranja de Acridina y Bromuro de Etidio (AO/EB por sus
siglas en ingls). Dejndose reposar por 5 minutos y luego se procedi a tomar las fotos en un
microscopio de epifluorescencia en total oscuridad.

3.12 Ensayos de inmunofluorescencia

Todas las soluciones fueron preparadas en PBS pH 7,4; Glicina 10 mM; Tritn x100 al
0,1%; solucin de bloqueo (Suero de caballo 1% + Tritn x100 0,1%).
 25

-Apagado Quenching: se sumergen los cubreobjetos en glicina 10 nM por 10 minutos y

luego se hacen tres lavados con PBS.
-Permeabilizacin: se sumergen los cubreobjetos en tritn x100 al 0,1% por 10 minutos y
luego se hacen tres lavados con PBS.
-Bloqueo: se sumergen los cubreobjetos en solucin de bloqueo por 15 minutos.
-Anticuerpo primario: a cada muestra, menos a las muestras control, se le aadieron 50 L
del anticuerpo anti-CD68 (Goat polyclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:500 y 50
L anti-TNF- (Mouse IgG1, Santa Cruz Biotechnology) diluido 1:500 (preparados en solucin
de bloqueo) por 1 hora, seguido de tres lavados con PBS
-Anticuerpo secundario: luego de los lavados se le aadieron a las muestras 50 L del
anticuerpo donkey anti goat IgG marcado con CFL488 (Santa Cruz Biotechnology), y 50 L de
goat anti mouse IgG1 marcado con un fluorforo de rodamina (preparados en PBS). Durante un
lapso de 30-40 minutos en oscuridad, finalmente se hicieron 3 lavados con PBS.
-Montaje: a cada muestra se le aadi 10 L de una mezcla de Dabco 1% y Dapi 1 g/mL
y fueron observadas en un microscopio de epifluorescencia. Luego se tomaron fotografas
correspondientes a cada muestra, en un total de 5 campos por muestra y se procedieron a
contabilizar los tipos celulares observados.

3.13 Hematocritos
Se tomaron muestras de sangre el da 0 de infeccin mediante un corte en la cola de cada
ratn para tener valores de referencia, posteriormente el da 21 post-infeccin se tom sangre por
puncin cardaca para la realizacin de la prueba. Se emplearon tubos capilares para la
determinacin de microhematocritos con punta de heparina, de una longitud de 75 mm y una
capacidad volumtrica de 80 L, una vez extrada la sangre se dejaron reposar. Seguidamente se
centrifugaron por 5 minutos a 13.300g a temperatura ambiente, en una centrfuga MicroCL17 por
Thermo Electron Corporation. El valor obtenido se expres como el porcentaje de eritrocitos en
relacin al volumen total de sangre utilizando una tabla de hematocrito comercial Criptocap

3.14 Tratamiento de imgenes

Las fotografas de las muestras fueron tomadas en el Servicio de Microscopa del IVIC. Las
imgenes fueron procesadas con el programa de anlisis ImageJ versin 1.6.0_20 (Schneider, et
al., 2012). La determinacin del nmero de clulas en los cortes de tejido cardaco se llev a cabo
 26

mediante la herramienta de anlisis de partculas de ImageJ (Ver Anexo 1)

3.15 Anlisis de resultados

Todos los datos se muestran como medias SEM (error estndar de la media), n indica el
nmero de ratones empleados. Para los anlisis estadsticos cada jaula se consider una poblacin
que represent una distribucin probabilstica normal, por lo cual se aplic estadstica
paramtrica. Para obtener el nivel de significancia, se utiliz el anlisis de varianza (ANOVA)
cuando los grupos de muestras se evaluaban a diferentes tiempos y a su vez cuando se
comparaban ms de 2 grupos, pruebas T de Student cuando se comparaban dos grupos y se
determinaron las diferencias de las medias aritmticas de las variables estudiadas de los grupos
experimentales en comparacin con su respectivo control dentro de su misma cepa de ratones.
Todos los datos se procesaron en GraphPad Prism versin 5.03 para Windows (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA).
 4. RESULTADOS

Se lograron cultivar los parsitos de ambos aislados en un medio con clulas Vero, aunque
los tiempos de recoleccin y eclosin de los nidos de tripomastigotes variaron dependiendo del
aislado, en el caso de los cultivos de P1 se recogieron parsitos pasada 1 semana de incubacin
pero los cultivos de P2 tardaban 4 semanas en presentar parsitos visibles en el medio. Una vez
asegurada la presencia de parsitos frescos para ambos aislados, se procedi a infectar a los
ratones. A continuacin se presentan los parmetros evaluados:

4.1 Carga parasitaria y mortalidad

Durante la fase aguda de la infeccin en los ratones experimentalmente infectados con los
dos aislados de T. cruzi, se observ presencia de cargas parasitarias en lquido asctico entre los 7
y 21 das pi respectivamente (Figura 4.1) con altos niveles de parsitos en el grupo infectado con
P1 en contraste con los bajos niveles encontrados con P2. Fue aqu donde se encontraron las
primeras diferencias entre los aislados, donde P1 present un parasitismo significativamente
mayor al encontrado con P2, este factor se vio evidenciado en los posteriores experimentos por la
fragilidad general presentada en los grupos infectados con P1 y la dificultad para que alcanzaran
vivos el da 21 pi.

Ahora bien, dado que en el da 14 fue donde se observaron tripomastigotes en lquido

asctico en el grupo de ratones infectados con P2, se tom ese da como base para realizar los
ensayos posteriores y de esta forma asegurar que los parsitos lograron infectar al ratn.
 28

500

N parsitos/50 campos
400
P1
300 ** P2

200

100

2 *
0

14

21
7
a

a
D

D
Tiempo

Figura 4.1 Carga parasitaria presente en ratones infectados con P1 y P2. Para la
cuantificacin se extrajo 50-100 L de fluido peritoneal y se contaron 50 campos en un microscopio con
aumento de 400X. Se observa cmo el conteo de parsitos aumenta progresivamente para los ratones
infectados con P1 (n=33) pero se mantiene bajo en los ratones infectados con P2 (n=30). Se muestran las
medias +/- SEM obtenidas por ratn. Para el anlisis estadstico se realiz una prueba T de Student que
arroj una diferencia significativa (**) entre el da 7 y 21 (p-valor: 0,002) para el aislado de P1;
sucediendo lo mismo en el caso de P2 (*), (p-valor: 0,034). Un anlisis de varianza (ANOVA) evidencia
una diferencia significativa entre ambos aislados (p-valor: 0,0049).

Respecto a la mortalidad, los ratones infectados con P1 presentaron mortalidades

acumuladas de 29,4 %, a partir del da 14 pi siendo mayor el da 21 pi (Figura 4.2) por lo que se
puede decir que el aislado se comport como de moderada virulencia; por otro lado, P2 se actu
como una cepa de escasa o poca virulencia con 0% de mortalidad hasta el da 21 pi en el cual
concluy el tiempo de estudio empleado en este trabajo. stos resultados concuerdan con la carga
parasitaria encontrada en los grupos de estudio, dado que a mayor nmero de parsitos
encontrados mayor es la virulencia y por lo tanto la tasa de mortalidad.
 29

100

% de superviviencia 75
P1
P2

50

25

0
0 7 14 21

Tiempo (das)

Figura 4.2. Porcentaje de supervivencia de ratones infectados con P1 y P2. El estudio

estadstico se realiz con un Log-rank (Mantel-Cox) Test que arroj curvas significativamente distintas (*)
(p-valor: 0,0347). El menor porcentaje de supervivencia fue obtenido en los ratones infectados con P1 con
un 72,5 % en el da 21 pi.

4.2. Evaluacin histopatolgica

El estudio histopatolgico de los corazones de ratones infectados con ambos aislados,

sacrificados durante los 14 y 21 das pi, revel de manera general el establecimiento de una
miocarditis aguda de variable intensidad y se pudo observar una evolucin progresiva del proceso
infeccioso producido por ambos aislados (Figura 4.3). Las zonas estudiadas comprendieron
principalmente el ventrculo izquierdo y derecho, ya que en estas regiones es donde mayormente
se observaban los efectos de la infeccin. A partir del da 14 pi, se observ la presencia de un
exudado entre las fibras musculares, caracterizado como un proceso inflamatorio agudo, adems
se apreci la presencia de un infiltrado leucocitario. Para el anlisis cualitativo, la presencia de 10
o ms clulas leucocitarias fueron necesarias para considerar la presencia del infiltrado y se
clasific de la siguiente manera: (-) ausente (sin presencia del mnimo de clulas inflamatorias,
(+) medio (10-25 clulas); (++) moderado (26-50 clulas) e intenso (+++) (>50 clulas).
 30

a b

c d

e f
 31

Figura 4.3. Cortes histolgicos de tejido cardaco teido con HE Se muestran secciones de
corazn de ratones infectados con los aislados P1 y P2 el da 21 pi; tomado con un aumento de 400X. Se
observan las diferencias entre el tamao de los nidos de amastigotes y presencia y extensin del infiltrado
inflamatorio. (a): presencia de un infiltrado difuso de moderada extensin en tejido infectado con P1;
(b):se observan numerosos nidos de amastigotes en tejido infectado con P1; (c):foco de pequea extensin
presente en el epicardio de un corazn infectado con P2; (d): foco de moderada extensin y presencia de
infiltrado en tejido adiposo en corazones infectados con P2; (e): nido de amastigotes (flecha)
correspondiente a la infeccin con P1; (f): nido de amastigotes (flecha) de P2 el cual se desarrolla dentro
de un macrfago.

El infiltrado inflamatorio fue de naturaleza principalmente mononuclear (Tabla 4.1),

compuesto en gran parte por linfocitos y en menor medida por macrfagos siendo stos
raramente observados en tejido infectado con P2. En lo que se refiere a la localizacin del
infiltrado, es decir, si las clulas se concentraban o no en un foco definido, hubo variaciones
presentes segn el da en el que se evalu este parmetro. En el caso de P1 se observaron
pequeos focos de moderada y baja intensidad y en algunos casos infiltrados difusos de forma
moderada en el da 14 pi, esto cambi para el da 21 pi donde el infiltrado fue de alta intensidad y
predominantemente difuso. Por otro lado, en el caso de P2 el infiltrado fue predominantemente
focal y de baja intensidad en el da 14 pi y moderadamente focal/difuso en el da 21 pi. Estas
observaciones permitieron apreciar el avance progresivo de la miocarditis chagsica producida
por los aislados P1 y P2 adems de mostrar una reaccin inflamatoria ms agresiva en el caso de
los corazones infectados con P1.

Tabla 4.1. Clasificacin del tipo de infiltrado inflamatorio presente en tejido cardaco

Localizacin del
Tipo de clulas Presencia del infiltrado
infiltrado
Aislado Da pi
Mononuclear
Focal Difuso Medio Moderado Intenso
Linfocitos Macrfagos
14 +++ + + ++ ++ ++ -
P1
21 +++ + - +++ + ++ +++
14 +++ + +++ + +++ + -
P2
21 +++ + ++ ++ + +++ +

La localizacin del infiltrado fue clasificada como: +: pequea; ++: moderada; +++: grande segn
el rea que ocupara en la seccin del corte. La presencia del infiltrado y el tipo celular fueron clasificados
 32

como: +: raramente observado; ++: observado con frecuencia; +++: predominante; -: no observado. Se
observaron cortes histolgicos para ambos aislados P1 y P2 (n=6, 100 campos c/u)

Adems de esto se evalu la presencia y/o ausencia del infiltrado inflamatorio por regiones
y en estructuras especiales (Tabla 4.2). Encontrndose que el infiltrado celular en el tejido
infectado con P1 estuvo presente en todas las zonas del corazn, principalmente en el epicardio y
miocardio a diferencia del infiltrado presente en tejido infectado con P2 el cual fue
predominantemente ubicado en el epicardio (da 14 pi) y moderadamente en el miocardio (da 21
pi). La presencia del infiltrado en el caso de P1 concord con la distribucin de los nidos de
amastigotes, ya que stos se observaron principalmente la zona sub-epicardial. En algunos casos,
se evidenciaron daos en las fibras musculares y necrosis. Se observ la presencia del infiltrado
de forma moderada en las clulas musculares cercanas a paredes de vasos sanguneos, tendencia
que fue mayor en ratones infectados con P1. La mayor diferencia en lo que respecta a la
presencia del infiltrado en tejidos infectados se encontr en que el aislado P2 produjo un mayor
presencia leucocitaria en tejido graso.

Tabla 4.2. Presencia del infiltrado inflamatorio en tejido cardaco

Ubicacin Estructuras especiales

Aislado Da pi Tejido Vasos Nidos

Epicardio Miocardio Endocardio Necrosis Granulomas
adiposo sanguneos

14 ++ + + + + + ++ +
P1
21 ++ +++ ++ + + - ++ +++
14 +++ - - + + - - +
P2
21 + ++ + ++ + + + +

La presencia del infiltrado respecto a su ubicacin en el tejido y la presencia o no de leucocitos en

estructuras especiales fue clasificada como: +: raramente observada; ++: observada con frecuencia; +++:
predominante; -: no observada. Se observaron cortes histolgicos para ambos aislados P1 y P2 (n=6, 100
campos c/u)

Se encontr un nmero variable de pseudoquistes, predominantes en el da 21 pi. Se not

que P1 posee una cintica de reproduccin ms rpida y agresiva en lo que respecta al nmero de
nidos presentes en el tejido durante el tiempo de estudio, este no es el caso para el aislado de P2
cuya cintica es ms lenta. Se procedi a cuantificar el nmero de pseudoquistes (Figura 4.4)
 33

para compararlos entre da pi y entre aislado, tenindose que la mayor cantidad de nidos se
encontr en corazones de ratones infectados con P1, lo que concuerda con la alta carga parasitaria
observada en fluido peritoneal para este aislado. Sucede lo mismo en el caso de P2 donde una
baja carga parasitaria se reflej con un bajo nmero de nidos.

400
350 P1
P2
N nidos/50 campos

300
250
200
50
40
30
20
10
0
14

21
a

a
D

D
Tiempo

Figura 4.4 Nmero de pseudoquistes presentes en tejido cardaco. Se muestra el

nmero total de nidos encontrados en 50 campos aleatorios para cada aislado provenientes de
cortes histolgicos de corazn, observados bajo microscopio a un aumento de 400X. P1 (n=3) y
P2 (n=3).

No solamente se observaron diferencias en el nmero de nidos sino tambin en su tamao

por lo que se procedi a cuantificar el rea de los mismos encontrados en el tejido cardaco en los
das 14 y 21 pi (Figura 4.5), encontrndose una diferencia significativa entre los aislados, el
tamao en rea est directamente relacionado con el nmero de amastigotes encontrados en cada
nido, lo que a su vez se puede relacionar con la patogenicidad del parsito y con la capacidad del
hospedador de eliminar al parsito en la fase aguda.

Resulta interesante notar que no hay una diferencia aparente entre el tamao de los nidos de
P1 entre los das 14 y 21 pi, aunque se observ una gran variabilidad en el rea de los mismos.
 34

Por otro lado, la infeccin con P2 al ser menos agresiva, permite observar la evolucin del
tamao de los nidos a medida que progresa la enfermedad lo que se evidencia en el aumento del
rea observable que se produjo del da 14 al da 21 pi.

P1
400
P2
** ***

300
rea (m2 )

200

100

0
14

21
a

a
D

D
Tiempo

Figura 4.5 Tamao de los nidos en tejido cardaco. El rea fue medida con el programa
de anlisis de imgenes ImageJ . En el da 14 pi los nidos de amastigotes encontrados en los cortes
histolgicos de tejido cardaco presentaron un tamao promedio de 279,2 m2 en los ratones infectados
con el aislado de P1 (n=3) y un tamao promedio de 27,67 m2 en el caso de P2 (n=3); por otro lado en el
da 21 pi el tamao promedio de los nidos fue de 291,0 m2 para P1(n=3) y 122,4 m2 para P2 (n=3). En
ambos casos, en el da 14 y 21 pi hubo diferencia significativa en el tamao de los nidos observados, se
elabor un anlisis estadstico no paramtrico con una prueba T de Student (**) (p-valor: 0,007) y (***)
(p-valor: 0,0005).

Con el objetivo de cuantificar cuntas clulas haba presentes en los campos fotografiados,
se emple la herramienta de anlisis de partculas (ImageJ ) la cual permiti obtener un
estimado del nmero de clulas correspondientes al infiltrado celular presente en el tejido, cada
campo posea un rea total de 400 m2. Se tom en cuenta que el programa no discierne los
ncleos celulares de los miocitos de las clulas de infiltrado dado que son de tamaos similares,
por lo que se tomaron muestras controles con ausencia de clulas inflamatorias y se cuantific el
 35

nmero de ncleos celulares pertenecientes a los miocitos y de esta forma se estim el nmero
promedio de miocitos presentes en un campo, este valor se rest al nmero total de clulas en las
muestras de tejido infectado para obtener el nmero de clulas correspondientes al infiltrado
(Figura 4.6).

Notablemente, en el da 14 pi, los corazones infectados con P2 mostraron la mayor

presencia de infiltrado inflamatorio entre los dos aislados, a pesar no haberse observado un gran
nmero de pseudoquistes, el nmero promedio de clulas inflamatorias se mantuvo sin cambios
significativos hasta el da 21 pi, lo que podra sugerir que este aislado permite una respuesta
inflamatoria rpida y efectiva, capaz de controlar la reproduccin del parsito, dado que en el
caso particular de P2, la localizacin del infiltrado se mantuvo predominantemente focal. Por
otro lado, P1 mostr un aumento en el nmero de clulas inflamatorias del da 14 al da 21 pi,
indicando que posee la capacidad de producir en el husped una respuesta inflamatoria ms
severa y predominantemente difusa, acompaada de un alto parasitismo en el tejido cardaco.

*** **
800

P1
N de clulas/campo

600
P2

400

200

0
14

21
a

a
D

Tiempo

Figura 4.6 Nmero de clulas correspondientes al infiltrado celular. La cuantificacin se

llev a cabo mediante la herramienta de anlisis de partculas de ImageJ y los anlisis estadsticos se
elaboraron con una prueba T de Student. Se observa que el nmero de clulas incrementa
significativamente (***) (p-valor: 0,0003) en el caso de los ratones infectados con el aislado de P1 (n=3)
pero en el caso de P2 (n=3) ste valor se mantiene aproximadamente igual a lo largo del tiempo, adems
 36

de esto se encontr una diferencia significativa entre ambos aislados en lo que se refiere a nmero de
clulas el da 21 pi (**) (p-valor; 0,0019). Un anlisis de varianza (ANOVA) demostr que no hay
diferencia entre ambos aislados pero s entre el tiempo de estudio (p-valor < 0,0001). rea de un campo:
400 m2

Finalmente, se decidi evaluar el tamao de las clulas que componan el infiltrado

inflamatorio, se emple una clasificacin por tamao (Pratt, 2012): linfocitos 7-10 m2,
granulocitos 12-15 m2, monocitos 15-25 m2, como se puede observar en la Figura 4.7 el
tamao promedio de las clulas correspondientes al infiltrado fue de ~8-10 m, indicado la
posible predominancia de linfocitos en tejido cardaco independientemente del aislado inoculado,
aunque hizo falta la aplicacin de un marcador especfico de linfocitos (CD3) para comprobarlo.

15

P1
** P2
10
rea (m2 )

0
14

21
a

a
D

Tiempo

Figura 4.7 Tamao promedio celular del infiltrado inflamatorio. Se muestra el rea
aproximada de las clulas correspondientes al infiltrado. Se muestran las medias SEM obtenidas
por cada campo. Los anlisis estadsticos se elaboraron mediante un anlisis de varianza
(ANOVA) que mostr una diferencia significativa entre ambos aislados (**) nicamente en el da
14 pi. (p-valor:<0,01). rea de un campo: 400 m2
 37

4.3 Evaluacin de la actividad de macrfagos y expresin de TNF-

Con el fin de determinar si en el modelo empleado ocurri un incremento de la apoptosis en

las poblaciones celulares presentes en la zona de infeccin, se elabor una prueba mediante la
tincin con Naranja de Acridina y Bromuro de Etidio (AO/EB) para as comparar el % de clulas
apoptticas y necrticas en la zona de infeccin (cavidad ip) entre ratones control y los infectados
con P1 y P2 (Figura 4.8). Como se mencion previamente, sta prueba se realiz el da 14 pi
dado que en ese tiempo se encontr la mayor carga parasitaria en el caso de los ratones infectados
con P2. Por otro lado, los ratones infectados con P1 no sobrevivan a la dosis de anestsico
requerida para realizar el ensayo el da 21 pi.

A medida que se realizaba el experimento, se tuvo especial cuidado de no contaminar la

muestra con sangre y as evitar acumulacin de grupos celulares por efectos de depsitos de
plaquetas y eritrocitos, las muestras que presentaron cmulos de clulas fueron descartadas para
asegurar la cuantificacin real y clasificar correctamente las clulas segn los estadios a estudiar.
 38

Figura 4.8 Tincin (AO/EB) en la zona de infeccin. Se muestran las clulas en proceso
apopttico (A) caracterizadas por una porcin color naranja en un borde de la clula correspondiente al
Bromuro de Etidio intercalado con el ADN de la clula. Las clulas necrticas (N) se observan totalmente
naranjas y las clulas vivas (V) slo se tien de verde. (a): Extracto de fluido peritoneal de los ratones
control no infectados, (b): clulas provenientes de los ratones infectados con P1, (c): clulas provenientes
de ratones infectados con P2. Fotos tomadas con un microscopio de epifluorescencia a un aumento de
200X (a, c) y 400X (b).

Seguidamente se procedi a cuantificar el porcentaje de clulas apoptticas contabilizando

en base al total de clulas encontradas en un campo fotografiado y luego elaborando un promedio
para cada grupo para un total de 5 campos por ratn, se obtuvieron diferencias significativas entre
los grupos de estudio (Figura 4.9), hay que resaltar que no se obtuvieron diferencias
significativas entre los ratones infectados con P2 y los ratones Control, lo que podra estar
 39

relacionado directamente con la baja carga parasitaria obtenida para dicho aislado, sucede lo
contrario con los altos valores de apoptosis encontrados en los ratones infectados con P1 ya que
de stos se obtuvo la mayor carga parasitaria. Se evidencia entonces una correlacin entre la
carga parasitaria presente en los ratones y la muerte celular programada que ocurre en la zona de
infeccin.

100 ** **

80 Necrosis
Apoptosis
% de Clulas

60 Vivas

40

20

0
ol P1 P2
ntr
Co
Tipo de aislado

Figura 4.9 Prueba de apoptosis en la zona de infeccin el da 14 pi Se muestra el

porcentaje de clulas necrticas, apoptticas y vivas en los extractos de lquido asctico ip obtenidas por
tincin AO/EB para ratones controles (n=2) y ratones infectados con P1 (n=2) y P2 (n=4). Mediante
pruebas estadsticas T de Student se obtuvo una diferencia significativa (**) entre el porcentaje de
apoptosis de P1 vs el control (p-valor: 0,0032); no se encontr diferencia significativa entre los ratones
infectados con P2 vs control pero s entre P1 vs P2 (*), (p-valor: 0,0156).

Adems, se procedi a evaluar la presencia de monocitos macrfagos activados y de clulas

que estuviesen expresando la citoquina proinflamatoria TNF-, para esto cada extracto de fluido
peritoneal fue sometido a un ensayo de inmunofluorescencia como se describe en la metodologa.
Esta tincin se logr efectuar de manera exitosa mostrndose claramente los diferentes grupos
celulares que fueron reconocidos por los anticuerpos, se encontr que en cada extracto hubo una
presencia variable de clulas marcadas como macrfagos CD68+, as como de clulas que
expresaban TNF-+, adems se observ una colocalizacin de ambos fluorocromos indicando la
presencia de macrfagos CD68+ activados expresando TNF-+ (Figura 4.10).
 40

Figura 4.10 Ensayo de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos anti CD68 y

anti TNF-. Se puede observar la expresin de macrfagos CD68+ de color verde, TNF-+ de color rojo,
una colocalizacin de ambos fluorocromos CD68+/TNF-+ correspondientes a macrfagos activados
expresando la citoquina, los ncleos celulares se tien de azul con DAPI.(a) Tincin de
inmunofluorescencia indirecta doble en una muestra representativa de ratones infectados con P2 el da 14
pi. (b) Se observa el control negativo, sin los anticuerpos secundarios para comprobar que no hubiese
autofluorescencia. Fotografas tomadas con un microscopio de epifluorescencia a un aumento de 400x.

El siguiente paso a seguir fue la cuantificacin de los porcentajes de clulas CD68 + que
estaban expresando TNF-+. Por lo que se cont cada tipo celular y se elabor un porcentaje en
base al total de clulas encontradas en cada campo (Figura 4.11). Se pudo observar que en los
ratones control, la gran mayora de las clulas fueron CD68-/TNF-- a pesar de esto se observ un
pequeo grupo de clulas que expresaban de manera natural TNF-. Por otro lado, en los
extractos obtenidos de ratones infectados con P1 se observ un incremento considerable en la
presencia de clulas CD68+/TNF-+ correspondiente a la respuesta inmune y al proceso
inflamatorio ocurriendo en el lugar debido a la infeccin. De igual manera pero aunque en menor
medida, se observ un incremento de clulas CD68+ y TNF-+ en los extractos de ratones
infectados con P2, pero la presencia de clulas CD68+/TNF-+ no fue tan marcada.
 41

***
Control
100 ***
P1
P2
80
% de Clulas

60

***
40

20

+
-

-
68

68

68
68
D

D
D

D
/C

/C
C

-/
-/
+

+
F
F

F
TN
TN

TN

TN
Figura 4.11 Clulas que expresaron CD68+ y TNF-+ mediante inmunofluorescencia.
Se puede observar el porcentaje de cada uno de los grupos celulares identificados segn la tincin
empleada, se muestran las medias SEM de cada campo correspondiente a una muestra de 3
experimentos independientes. Ratones control (n=2). Ratones infectados con P1 (n=2) y Ratones
infectados con P2 (n=4). Se elaboraron anlisis de varianza (ANOVA) que arrojaron diferencias
significativas entre los tipos celulares respecto a su control (***), (p-valor<0,0001).

Una vez ms se puede correlacionar la carga parasitaria encontrada para cada aislado con la
capacidad de la misma de producir una respuesta inmune acorde con el nmero de parsitos
contabilizados, por lo que se nota que P1 es un aislado de moderada virulencia capaz de inducir
una reaccin mayor en el organismo, en comparacin con P2. Adems, hay que notar que existe
una correlacin positiva entre la presencia de macrfagos TNF-+/CD68+ con el porcentaje de
apoptosis encontrado en fluido peritoneal (Figura 4.12), dado que en P1 el % de apoptosis fue
mayor, es de esperarse que en la zona se encuentre un mayor nmero de clulas ejerciendo una
actividad fagoctica para controlar las clulas muertas.

Aunque en el caso de P2 el nmero de macrfagos TNF-+/CD68+ no fue tan alto, en

definitiva se aprecia la presencia de macrfagos activados CD68 + pero los cuales no estn
 42

ejerciendo una expresin in situ de la citoquina proinflamatoria, este papel, lo estn tomando
otros tipos celulares que no pudieron ser identificados dado que no formaban parte de los
objetivos de este estudio.

60 25
P1 P2
20
%TNF +/CD68+

%TNF +/CD68+
40
15

10
20
r 2 = 0,71 5 r 2 = 0,03
p = 0,01 p = 0,53
0 0
0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100

% Apoptosis % Apoptosis

Figura 4.12. Anlisis de correlacin entre la presencia de clulas TNF-+/CD68+ y el

% de apoptosis. Se observa una correlacin positiva en el caso de la infeccin con P1, se muestra el
valor estadstico de significancia (p) junto con su r2.

4.4. Evaluacin del efecto de la infeccin en bazo.

El da 21 pi se procedi a extraer los bazos de los ratones infectados como se describe en la

metodologa y de este modo poder evaluar los efectos de la infeccin con los diferentes aislados
en el tamao, nmero de clulas y capacidad de proliferacin de dicho rgano. Se eligi el ltimo
da de infeccin dado que se aseguraba la presencia de parsitos en los ratones infectados y se
encontr ser tiempo suficiente para observar alteraciones en la fase aguda de infeccin. Adems
de que en el da 21 se estabilizaban los pesos de todos los grupos de ratones (datos no mostrados)
llegando a un peso neto de 27,5 0,3 g en toda la poblacin estudiada (n=37) por lo que se
esperaba que el bazo posea un peso promedio similar en cada uno de los grupos de estudio.

Al realizar la extraccin del bazo se pudo observar una inflamacin visceral generalizada
en los ratones infectados con P1 de acuerdo con lo previamente reportado por Rodrguez-Angulo
et al. (2013), ste fenmeno no se observ en los ratones infectados con P2. Una vez extrado, el
bazo, se procedi a elaborar una proporcin entre el peso del bazo hmedo y el peso del ratn. Se
logr observar una esplenomegalia en ratones infectados con P1 correspondiente a un
 43

alargamiento del bazo por encima del tamao normal (ratones control), sin embargo ste no fue el
caso para los ratones infectados con P2 aunque los pesos fueran ligeramente mayores a los
controles (Figura 4.13).

1.5
*** **
Peso bazo/Peso ratn

Control
1.0 P1
P2

0.5

0.0
ol

P1

P2
tr
on
C

Tipo de aislado

Figura 4.13 Proporcin del peso hmedo de los bazos en comparacin al peso neto del
ratn. El da 21 pi se pesaron los ratones y luego de la extraccin del bazo como se explica en la
metodologa se tom el peso hmedo del mismo, se observa la proporcin entre el peso del bazo y del
animal. Se muestran las medias SEM de muestras de ratones correspondientes a 3 experimentos
independientes. Un anlisis de varianza (ANOVA) mostr una diferencia significativa entre los tres
grupos (p-valor: 0,0008). As mismo un test Bonferoni de comparaciones mltiples arroj diferencias
entre ratones infectados con P1(n=10) vs controles (n=8) (**) (p-valor:<0,001) y entre ratones infectados
con P1 vs P2 (n=10) (***) (p-valor: <0,0001)

Posteriormente se decidi evaluar el nmero de esplenocitos presentes en los bazos luego

del ensayo de disgregacin mencionado previamente en la metodologa, y de este modo poder
relacionar la esplenomegalia observada en P1 con un aumento anormal de esplenocitos. Se
encontr que los bazos provenientes de ratones infectados con los aislados posean un nmero
menor de clulas en comparacin a los ratones control (Figura 4.14), de igual forma resulta
resaltante notar que aunque no se observ una diferencia significativa entre el peso de los bazos
de ratones infectados con P2, stos presentaron un nmero de clulas considerablemente menor a
 44

los ratones controles por lo que se puede decir que est ocurriendo un proceso que permite la
acumulacin de otros tipos celulares en el bazo

*
1.5
10 8 *
Control
P1
N de clulas/10 mL

P2
1.0 10 8

5.0 10 7

0
P1

P2
ol
tr
on
C

Tipo de aislado

Figura 4.14 Nmero de esplenocitos presentes en el bazo. Se cuantificaron bajo

microscopio en cmara de Newbauer el nmero de clulas correspondientes a esplenocitos purificados
segn se describe en la metodologa. Se muestra la media SEM de los extractos purificados de cada
ratn correspondientes a 3 experimentos independientes. Un anlisis estadstico T de Student mostr una
diferencia significativa (*) (p-valor<0,01) entre el nmero de clulas de extractos de bazo infectados con
P1 (n=10) vs Control (n=8) as como entre el nmero de clulas de extractos de P2 (n=10) y el control.

Para intentar explicar el aumento del peso de los bazos infectados, se midieron los hematocritos
(Figura 4.15) de los grupos de estudio y aunque se observa una ligera disminucin del % de
eritrocitos, estadsticamente no se encontr una diferencia significativa entre los ratones
infectados con P2 y controles.
 45

50
*
40
Paquete Globular
% Volmen del

30

20

10

P1

P2
ol
tr
on
C

Tipo de aislado

Figura 4.15 Hematocritos. Se tomaron muestras de sangre por puncin cardaca el da 21 p.i. y
cuantificaron con una tabla comercial Criptocap como se describe en materiales y mtodos. Se muestran
las medias +/- SEM obtenidas por ratn de tres experimentos independientes. Se emple un anlisis
estadstico T de Student y slo se encontr diferencia significativa (*) entre P1 vs Control (p-valor<0,01) a
pesar de esto se observa que los ratones control (n=8) contenan un % mayor que el de los aislados P1
(n=7) y P2 (n=11).

Debido a que el proceso infeccioso con T. cruzi produce efectos de supresin de

proliferacin celular en los rganos ms afectados (entre ellos el bazo), se procedi a cuantificar
la proliferacin de las clulas purificadas de bazo empleando Con A, el cual es un mitgeno para
clulas T. Para esto se decidi normalizar los datos, la absorbancia promedio arrojada por los
ratones control se tom como representativa de una proliferacin normal, correspondiente al
100%. Seguidamente se compararon las absorbancias para las clulas de ratones infectados con
ambos aislados y se encontr una ligera disminucin de proliferacin en P1, pero la infeccin con
P2 no produjo alteraciones en la tasa de proliferacin (Figura 4.16).

En resumen, se observ que los bazos infectados con P1 presentaban esplenomegalia, con
pesos mayores a los controles pero un menor nmero de clulas y una proliferacin disminuida
en comparacin a los controles y de manera contrastante los bazos infectados con P2 presentaban
 46

tamaos ligeramente mayor a los normales, una disminucin de la celularidad al igual que P1,
pero en este caso la proliferacin no se vio afectada.

ns
150
% de Proliferacin

100

50

0
P1

P2
Tipo de aislado

Figura 4.16 Proliferacin de esplenocitos. Se observa el % de proliferacin de los

esplenocitos infectados con P1 (n=3) y P2 (n=3) en base a datos normalizados de los ratones
controles (n=8) se estimularon con concanavalina A durante un periodo de 12 h como se describe
en metodologa, se considera 100% como una proliferacin normal correspondiente a los ratones
control. Se muestra la media SEM de cada muestra de esplenocitos purificados provenientes de
tres experimentos independientes, un anlisis estadstico T de Student muestra una diferencia
significativa entre los % de proliferacin (***) (p-valor<0,0001).
 5. DISCUSIN

En este trabajo, el comportamiento biolgico de los dos aislados de T. cruzi estudiados

revelaron infecciones de contrastada intensidad en los ratones, lo que era de esperarse debido a
que pertenecen a DTUs distintos, numerosos estudios han demostrado previamente una fuerte
asociacin entre la distancia gentica y las propiedades biolgicas y mdicas de T. cruzi in vivo e
in vitro (Toledo et al., 2002, Pea et al., 2011, Monteiro et al., 2013, Meza et al., 2014,
Rodrguez et al., 2014, Rivera et al., 2015). Por lo que identificar el genotipo de T. cruzi resulta
de suma importancia para la caracterizacin de las diferencias biolgicas entre aislados, tales
como virulencia, patogenicidad, tropismo de los tejidos, ubicacin geogrfica y capacidad
hospedador/reservorio (Roellig & Yabsley, 2010).

Los reportes clnicos ms frecuentemente observados en pacientes infectados con T. cruzi

perteneciente al DTU TcI, son fiebre, dolor abdominal, seguido de dolor de cabeza y edemas
faciales, linfoadenopata, hepatomegalia, esplenomegalia, cardiomegalia, efusiones pericrdicas y
en un menor grado, efusiones pleurales (Alvarado-Tapias et al., 2012), este grupo de
investigadores pudo inducir desordenes cardacos similares a los encontrados en pacientes
humanos en modelos experimentales como los empleados en este estudio. Por lo que la
caracterizacin biolgica de los aislados P1 y P2 en modelos murinos resulta ser una herramienta
til y confiable.

Parasitismo y virulencia de los aislados.

En primera instancia, se obtuvo que P1 posea altos niveles de carga parasitaria en

comparacin con P2, por lo que se puede decir que posee una virulencia considerablemente
mayor. Se han encontrado niveles significativos de parsitos sanguneos circulando en pacientes
venezolanos infectados con T. cruzi perteneciente al DTU TcI (Aez et al., 2004) de los cuales
52, 9% presentaban sntomas severos de infeccin aguda, incluyendo falla cardaca, ocurrida en
 48

un infante de 6 meses de edad, cuya transmisin fue congnita. Indicando que este linaje puede
ser fatal para los nios en la fase aguda. Otros investigadores han trabajado con varios aislados de
TcI obteniendo valores de parasitemia (tripomastigotes en sangre) altamente variables (Toledo, et
al., 2004)

Referente a la carga parasitaria encontrada en los ratones infectados con P2: Meza et al., en
el 2014 obtuvieron un pico mximo de parasitemia promedio de 79,97 (73,34) parsitos/10 L
de sangre el da 6,9 (1,2) pi para un total de 8 aislados correspondiente al DTU TcIV, seguido
de un periodo donde no se encontraron tripomastigotes en sangre desde el da 15 pi, lo que
concuerda con el da de mxima carga parasitaria obtenido en este estudio, (el da 7 pi con 0,90
(1,60) parsitos/50~100 L de fluido peritoneal), y a la disminucin en la carga parasitaria el
da 21 pi. Hay que acotar que la baja cantidad de parsitos encontrados en comparacin con el
estudio de Meza et al., tiene que ver en parte al nmero de parsitos inoculados dado que estos
autores emplearon inculos de 104 tripomastigotes/animal. Por otro lado, en un estudio previo,
Monteiro et al., en el 2013 obtuvieron un pico mximo de parasitemia 12 veces mayor usando 2
aislados de TcIV que luego fueron utilizados en el estudio de Meza et al., indicando una alta
variabilidad para este parmetro inclusive en un mismo aislado.

Previamente se haba reportado que el resultado de la infeccin depende tanto del trasfondo
gentico del ratn como del tamao del inculo, mientras ms alto sea el inculo de parsitos
menor va a ser la tasa de supervivencia, independientemente de la parasitemia, por lo que la
mortalidad parece estar relacionada especficamente a la carga parasitaria en el corazn, al menos
en la fase aguda de infeccin (Sanoja, et al., 2013).

No es de extraarse que ocurra la ausencia de tripomastigotes sanguneos, ya que Roellig &

Yabsley (2010) no encontraron parasitemia en los ratones inoculados con aislados de TcIV, y en
pocos casos una PCR y hemocultivos resultaron positivos para confirmar la infeccin. Esto
sugiere la necesidad de emplear inculos con un mayor nmero de parsitos para asegurar la
infeccin de los ratones y la necesidad de emplear otros mtodos aparte de parasitemia y carga
parasitaria en fluido peritoneal para cuantificar la presencia de parsitos en los ratones infectados.
Por lo que hay que tener en consideracin que la virulencia no es una caracterstica constante de
los parsitos, de hecho, es el resultado de peculiaridades en un hospedador especfico y su
interaccin con el parsito, consecuentemente la virulencia en modelos murinos no refleja la
virulencia en cualquier otra especie, incluyendo humanos. Por otra parte, el comportamiento
 49

biolgico est influenciado por factores ambientales, tales como infecciones concomitantes,
estrs y estado nutricional, entre otros. Consecuentemente, el resultado de la interaccin parsito-
hospedador-ambiente debe ser considerado como nico para una micro-regin dada (Lisboa et
al., 2007).

Como se mencion anteriormente, es posible encontrar comportamientos biolgicos

distintos inclusive entre aislados de un mismo DTU. Para ejemplificar este punto Monteiro et al.
(2013), elaboraron un estudio comparativo entre varios aislados de T. cruzi pertenecientes a los
DTU TcI y TcIV originarios de la Amazonia Brasilera y obtuvieron resultados distintos a los
presentados en este trabajo, el aislado de TcIV tuvo una mayor capacidad de infeccin y
promovi una mortalidad ms alta en la fase aguda; TcI mostr altos valores de mortalidad
acumulada nicamente en la fase crnica de la enfermedad y slo un 2,4% de mortalidad en la
fase aguda. En contraste, Roellig & Yabsley (2010) haban reportado un bajo parasitismo en
varios aislados norteamericanos correspondientes a los DTU TcI y TcIV y una tasa de mortalidad
de 0% en la fase aguda para cada uno de los aislados. Es por esto que, tomando en cuenta el
parmetro de mortalidad, se sugiere que ambos aislados empleados en este estudio, en general,
poseen baja virulencia, dado que un reporte previo demostr que aislados de T. cruzi (DTU TcI)
produjeron porcentajes de mortalidad en los ratones de 100% en la fase aguda (Oliveira et al.,
1997).

Para explicar la diferencia entre distintos genotipos encontrados en un mismo DTU, existe
una hiptesis la cual plantea que por seleccin natural, se ha promovido la adaptacin de clones
particulares al hombre y a los ciclos domsticos mientras que otros se adaptaron a ciclos
silvestres. Por eso es que, segn esta hiptesis, dos cepas isoenzimticamente similares o
idnticas, podran manifestar dos comportamientos biolgicos distintos, digamos un mismo DTU
encontrado en el ciclo domstico y en el silvestre (Rivera, 2000).

Estudio histopatolgico de corazones.

En la Enfermedad de Chagas, los macrfagos y los cardiomiocitos son los principales

objetivos de la infeccin (Cuervo, et al., 2008). Particularmente en los seres humanos, el corazn
es uno de los rganos mayormente afectados por infeccin de T. cruzi (Girones, et al., 2005). Hay
que tener en consideracin que las interacciones entre el hospedador y el parsito causan
diferentes cuadros clnicos y la calidad de la respuesta inmune es uno de los factores
 50

determinantes en la ocurrencia y gravedad de las lesiones cardacas (Oliveira et al., 2008). El

entendimiento de la patognesis de la miocarditis inducida por T. cruzi es crucial en el desarrollo
de estrategias teraputicas que buscan aminorar la inflamacin que produce disfunciones
cardacas. A pesar de esto, existe poca informacin sobre las causas involucradas en los
diferentes patrones de miocarditis y su evolucin en casos agudos.

En el miocardio de ratones infectados durante la fase aguda, existe una reaccin

inflamatoria caracterizada por un infiltrado linfoide y mieloide, as como la expresin de
mediadores inflamatorios que se creen son responsables por la patognesis (Cuervo, et al., 2011),
este proceso es progresivo por lo que resulta necesario estudiarlo en varios puntos durante la
duracin de la fase aguda de infeccin. Oliveira et al., (2008) elaboraron estudios en
histopatolgicos en corazones de ratones infectados con T. cruzi el da 8 pi encontrando pocas
alteraciones y parasitismo, e indicaron que no era necesario realizar estos estudios antes del da
10 pi que es donde encontraron lesiones en el tejido y la presencia un gran nmero de leucocitos
y una intensa respuesta inflamatoria del tipo agudo. Por lo que en este estudio no se esperaban
encontrar efectos significativos antes del da 14 pi.

En base a lo anterior, desde el da 14 pi se encontr que P1 produjo un mayor parasitismo e

infiltrado inflamatorio en el tejido cardaco, reflejando un cardiotropismo ms significativo, en
comparacin con P2, hecho que se respalda por resultados obtenidos por Monteiro et al., (2013) y
Espinoza et al., (2010). De acuerdo con lo obtenido en este estudio, Perez et al., (2015) tambin
encontraron una correlacin positiva entre la carga parasitaria, el infiltrado inflamatorio y la
formacin de nidos de amastigotes. Adems de que estudios con pacientes que expresaban una
miocarditis aguda presentaban altos niveles de citoquinas inflamatorias tales como INF- y TNF-
(Sousa et al., 2014) (este ltimo punto se discutir ms adelante).

En general, se observ una baja patogenicidad en los cortes histolgicos de ratones

infectados con P2. La presencia de parasitismo y un infiltrado inflamatorio severo o moderado en
la fase aguda ya haban sido encontrados en ratones inoculados con TcI en un estudio
comparativo entre TcIV (Monteiro et al., 2013). Pero Meza et al., (2014) fueron los primeros en
mostrar presencia de amastigotes del DTU TcIV in vivo, ubicando nidos de amastigotes en todos
los tejidos de slo uno de los ocho aislados de TcIV con los que trabajaron, e indicaron que dicho
aislado posea un tropismo preferencial por el sistema nervioso central, y un moderado
parasitismo en el corazn, con una predominancia focal en el proceso inflamatorio, aunque
 51

tambin encontraron un infiltrado del tipo difuso lo que concuerda con los hallazgos observados
en este estudio. De nuevo, de los 8 DTUs solamente 1 reflej un parasitismo moderado y bajo en
el corazn, indicando como se mencion anteriormente, la variabilidad de efectos
histopatolgicos que se pueden obtener inclusive en un mismo DTU. Hasta ahora, no ha habido
reportes sobre los efectos de la infeccin con T. cruzi en modelos experimentales con aislados de
TcIV venezolanos, que sepamos, este es el primer trabajo en el que se pueda apreciar
cardiomiopata y parasitismo en un aislado de TcIV en Venezuela.

En el caso de infecciones con P1 se observ una localizacin del infiltrado

predominantemente difusa y una mayor extensin del mismo en los tejidos del corazn, estas
caractersticas ya haban sido reportadas previamente (Espinoza et al., 2010), adems, se
observaron grandes focos de clulas leucocitarias alrededor de los nidos de amastigotes, los
cuales tenan una ubicacin predominante en la periferia del miocardio en el da 14 pi y
extendindose hacia el endocardio en el da 21 pi. En concordancia con lo reportado en este
estudio Perez, et al., (2015) determinaron que el infiltrado inflamatorio incrementa
progresivamente desde el da 7 pi y lo hace de manera dependiente a la carga parasitaria. Por lo
que se puede decir que el infiltrado fue avanzando en consecuencia a la habilidad de P1 de
parasitar el tejido. Adems, los corazones infectados con P1 mostraron altos niveles de carga
parasitaria en comparacin a P2 as como una cintica de crecimiento ms acelerada (nmero de
nidos el da 14 y 21 pi) estableciendo un patrn de infeccin severo.

Referente al tamao de los nidos y a la cintica de crecimiento observada en los nidos de

amastigotes, se sabe que diferentes aislados de T. cruzi poseen diversas cinticas de
internalizacin y niveles de infeccin as como diferentes tiempos requeridos para la
diferenciacin intracelular del parsito a las formas multiplicativas (amastigotes) y luego, de
nuevo, una diferenciacin a las formas infectivas (tripomastigotes), las cuales son las que se
liberan luego de la muerte de la clula hospedadora (de Souza et al., 2003). Por lo que las
diferencias observadas en el tamao de los nidos se deben a la capacidad de cada aislado de
invadir y proliferar las clulas hospedadoras, en este sentido se demostr que P1 posee una
cintica mayor a P2.

Es probable que las diferencias cuantitativas en el nmero de nidos encontrados en el

corazn no sean las nicas responsables por las altas variaciones en los patrones de
cardiomiopata, Rodrguez et al., (2014) sugieren que existen otras propiedades intrnsecas en los
 52

aislados, tales como la habilidad para causar parasitemia, y la disponibilidad del parsito para
infectar clulas diana.

Previamente se ha reportado presencia de parasitismo en tejidos durante la fase aguda por

parte de aislados de TcI, con un proceso inflamatorio de moderado a severo (Toledo et al., 2004).
Hallazgos histopatolgicos en un modelo murino encontrados por Alvarado-Tapias et al., (2012)
fueron similares a los observados en un estudio post-mortem de una paciente femenina adulta,
donde se observ que la microvasculatura se encontraba comprometida de manera importante, las
arteriolas mostraban edemas en las paredes, junto con hipertrofia endotelial y permeabilizacin
de las paredes del corazn, as como un infiltrado inflamatorio de clulas linfomononucleares
(Suarez et al,. 2010). Lo que reafirma la viabilidad de este modelo experimental para reproducir
los efectos cardiopatolgicos que puedan presentarse ante la infeccin con T. cruzi en pacientes
humanos.

En conjunto a lo anterior, se ha reportado que los aislados de TcI obtenidos en Caracas en

el estudio de Morocoima et al., (2006) poseen un particular tropismo por el sistema nervioso
central, tejido ocular, rganos genitales, hueso, cartlago, riones, pulmones, hgado y el
pncreas. Por lo que hara falta estudiar el parasitismo de este aislado en otros rganos para poder
establecer de manera ms exacta su histiotropismo preferencial. Indudablemente T. cruzi puede
invadir una gran variedad de clulas in vivo e in vitro (de Souza et al., 2010) y la capacidad del
parsito de infectar un tejido resulta dependiente del linaje (Tibayrenc & Telleria, 2010, Andrade
et al., 1999). Por lo que la severidad de infeccin que present P1 en este estudio permite
plantear la hiptesis de que este aislado puede escapar a la respuesta inmune del hospedador de
mejor manera que P2, permaneciendo inadvertido por las clulas mononucleares perifricas y de
esta manera parasitar rganos diana (en este caso, cardiomiocitos) con mayor rapidez.

A pesar de esto, hay que tener en cuenta que la incriminacin de TcI con formas severas de
miocarditis en muestras cardacas de pacientes humanos ha sido altamente variable (del Puerto et
al., 2010, Burgos et al., 2010). Se descubri que existe una variabilidad gentica entre TcI,
mostrando la presencia de 5 genotipos (Ia, Ib, Ic, Id y Ie) adems, reservorios selvticos podran
estar seleccionando naturalmente clones especficos de T. cruzi (Ramirez et al., 2010). Estudios
recientes han demostrado la presencia de genotipos TcIa y TcId en pacientes crnicos argentinos,
de manera interesante, el genotipo ms prevalente en el sistema circulatorio sanguneo fue TcIa y
el ms prevalente en tejido cardaco fue TcId sugiriendo que TcI puede tener un histiotropismo
 53

dependiente del genotipo (Burgos et al., 2010). Por lo que las diferencias en los patrones de
infeccin observadas en aislados de TcI puede estar determinada por las peculiaridades de las
condiciones ambientales, diversidad de la fauna del mamfero y del vector al cual estn
infectando, entre otras (Lisboa et al., 2007). Todos estos factores confirman la complejidad del
ciclo de transmisin de T. cruzi en un ambiente silvestre y refuerza la importancia de obtener
muestras representativas en estudios epidemiolgicos.

Rivera et al., (2015) estudiaron aislados de TcI obtenidos de vectores y hospedadores

mamferos en varios estados de Venezuela, y obtuvieron que los que provenan de Caracas
constituyeron un grupo intrnsecamente homogneo, con los niveles de virulencia ms altos en
comparacin con los aislados rurales de los estados Anzotegui, Cojedes y Gurico lo que sugiere
una posible segregacin y seleccin de subpoblaciones en funcin al rea geogrfica, no
solamente esto, sino que tambin se ha reportado una variabilidad gentica en aislados del linaje
TcI en casos humanos infectados de forma oral y no oral (Segovia et al., 2013).

Ahora bien, adems de la presencia de parsitos, se pudo observar la destruccin de fibras

cardiacas y necrosis en corazones en el da 21 pi, especialmente en zonas donde el infiltrado era
muy extenso. La destruccin de las fibras cardacas se produce cuando los nidos de parsitos se
rompen y liberan los antgenos que se unen a la superficie celular y se convierten en blancos de la
respuesta inmune humoral y celular contra T. cruzi (Oliveira et al., 2008). Mientras que una
respuesta inflamatoria apropiada puede ser beneficial en estadios tempranos de la infeccin, la
falta de control en esta respuesta ms tarde en el desarrollo de la enfermedad, permite el
establecimiento del dao en el tejido.

Al estudiar cualitativamente la composicin del infiltrado inflamatorio en el tejido cardaco,

se determin que posean una naturaleza predominantemente linfomorfonuclear, aunque tambin
lograron observarse macrfagos, especialmente en el tejido infectado con P2, donde la mayora
de los nidos de amastigotes se encontraron en macrfagos infectados. En concordancia con lo
presentado en este estudio se han reportado la presencia de infiltrados de naturaleza
linfomorfonuclear en varios aislados de TcI (Espinoza et al., 2010, Aez et al., 2011). Por otro
lado, no se han reportado las caractersticas del infiltrado inflamatorio producido por aislados
pertenecientes a TcIV, lo que reafirma la necesidad de seguir estudiando este DTU,
especficamente en aislados venezolanos dada su relevancia como segundo agente causal de la
Enfermedad de Chagas en Venezuela.
 54

Respecto a la naturaleza linfomorfonuclear del infiltrado, se sabe que para ejecutar la

proteccin contra T. cruzi, se necesita la presencia de clulas efectoras como los linfocitos T
CD4+ y T CD8+, las cuales son capaces de migrar desde los ndulos linfticos y los tejidos y
ejercer una fuerte respuesta inmune. Ambos tipos celulares son capaces de secretar INF-, el cual
activa a los macrfagos para que ejerza su actividad tripanomicida mediante NO. Clulas APC
como los macrfacos, DCs y linfocitos B juegan un papel importante en la generacin de
linfocitos T, los cuales producen diferentes citoquinas involucradas en la polarizacin Th1 o Th2
en la respuesta inmune (Cardillo et al., 2007)

Previamente se han analizado las poblaciones de linfocitos CD4 + y CD8+ en biopsias de

pacientes venezolanos infectados con T. cruzi en la fase aguda de infeccin y se observ que la
proporcin CD4/CD8 era de 0.70, pero no se encontraron diferencias estadsticamente
significativas entre el nmero de ambos tipos celulares (Fuenmayor, et al., 2005). Por lo que,
aunque las clulas T CD8+ son cruciales para el control de la infeccin por T. cruzi, no son las
nicas que juegan un papel importante en la respuesta inmune, esto se ejemplifica con un estudio
de Sanoja et al., (2013) donde analizaron cules de los grupos celulares de linfocitos T CD4+: Treg
o Th17 infiltraban el tejido cardaco tanto en ratones resistentes como sensibles a la infeccin por
la cepa Y (TcII) de T. cruzi y encontraron que en ratones Balb/c, las Th17 eran las que
predominaban en el infiltrado de dicho rgano. Este estudio sugiere que aunque la inflamacin
puede controlar la replicacin del parsito en el tejido cardaco, debe ser de alguna forma
controlada para evitar daos excesivos.

Por otra parte, en lo referente a la presencia de macrfagos observada en los corazones

infectados, se ha reportado la existencia de una poblacin de infiltrados inflamatorios
correspondientes a clulas mieloides que expresaban arginasa I en los corazones de ratones
durante la fase aguda de la infeccin (Cuervo et al., 2008). Los macrfagos, pertenecen un grupo
de clulas mieloides que residen en el corazn sano, y si bien no son tan frecuentes como los
miocitos, clulas endoteliales y fibroblastos, su nmero es substancial e incrementa durante la
enfermedad (Nahrendorf & Swirski, 2013). Cuervo et al., (2011) caracterizaron los infiltrados
mieloides durante la fase aguda y se encontr que dicho grupo contena subpoblaciones
granulocticas (Ly6G+) y monocticas (Ly6G-) adems, estas clulas posean una expresin
aumentada de arginasa I, as como un incremento considerable en la expresin de TNF-.
 55

En base a lo presentado se puede afirmar la necesidad de estudiar los tipos celulares que
infiltran el tejido cardaco ya que varan en intensidad y proporcin, en este estudio P1 y P2
mostraron patrones de infeccin distintos en lo que respecta a localizacin del infiltrado y la
presencia del mismo a lo largo de la fase aguda, as como una cintica de infeccin altamente
contrastante, mientras que por otro lado los tipos celulares observados fueron consistentes. En
este sentido se confirma que la patogenicidad es dependiente del aislado.

Efectos de la infeccin en macrfagos peritoneales.

Durante la infeccin con T. cruzi los macrfagos son unos de los tipos celulares ms
importantes capaces de luchar contra el parsito. Estmulos pro-inflamatorios, metablicos e
inmunes promueven el reclutamiento de monocitos a sitios perifricos, donde la diferenciacin
en macrfagos y DCs ocurre, contribuyendo a la defensa del husped y al remodelaje y
reparacin de tejidos. (Gordon & Taylor, 2005). Diferentes molculas de la familia de receptores
tipo Toll (TLR) reconocen diversos patrones moleculares asociados con bacterias, virus, hongos
y protozoarios. Como resultado, se disparan mecanismos de respuesta inmune innata y se
desarrolla la subsecuente respuesta adaptativa (Iwasaki, 2004).

Uno de estos mecanismos es la muerte celular programada o apoptosis, la cual ocurre en

altas proporciones en tejido infectado, inflamado o en remodelacin, a pesar de esto las clulas
apoptticas libres raramente se encuentran en tejido, incluso durante un proceso inflamatorio ya
que son rpidamente removidas, ya sea por fagocitos locales o especializados, como los
macrfagos. Su correcta disposicin tiene efectos regulatorios importantes en las respuestas
inflamatorias e inmunes. No solamente esto, sino que clulas apoptticas tienen la capacidad de
activar macrfagos para producir la secrecin rpida y aumentada de mediadores
proinflamatorios (Lucas et al., 2003).

Se observ que en los ratones infectados con P1 el porcentaje de clulas apoptticas (CAs)
fue considerablemente mayor que en P2 y result ser tres veces mayor en comparacin a las CAs
encontradas en los ratones control, mientras que en el caso de la infeccin con P2, no hubo un
aumento significativo. En la actualidad, no hay investigaciones que reporten la capacidad de
TcIV de inducir apoptosis en macrfagos peritoneales in vivo por lo que en este estudio se reporta
por primera vez la baja capacidad de este aislado en producir apoptosis en la zona de infeccin, lo
 56

que podra estar relacionado con la baja carga parasitaria encontrada y/o a la incapacidad del
parsito de evadir el sistema inmune y modular los eventos apoptticos.

Modelos experimentales como los empleados en este estudio demostraron que aislados de
TcI son capaces de inducir la apoptosis en macrfagos, as como en otros tipos celulares (de
Souza et al., 2008, Luna-Gomes et al., 2014), mientras que ensayos in vitro se ha observado que
ocurre un aumento del crecimiento de T. cruzi en macrfagos que fagocitan CAs, por lo que su
accin fagoctica los predispone a la infeccin con el parsito (Freire-de-Lima et al., 2000), estos
mismos autores indicaron que los factores que conllevan a la replicacin de T. cruzi podran ser
los mismos mediadores involucrados en el crecimiento del parsito y la consecuente apoptosis
celular. Otros modelos in vitro han demostrado que TcI tiene una alta capacidad de inducir
apoptosis en macrfagos peritoneales (hasta un 75%, de los cuales la mayora estaban
infectados), hay que considerar que la capacidad de T. cruzi de inducir la apoptosis depende del
DTU, y en el caso de TcI se puede relacionar esta capacidad con los hallazgos histopatolgicos
encontrados en el corazn (de Souza et al., 2003).

Mientras las clulas se vuelven apoptticas, generalmente son removidas in situ por
macrfagos en un proceso que no induce una reaccin local de los tejidos. De hecho, el
reconocimiento y remocin de CAs suele ser anti-inflamatorio y anti-inmunognico (Patel et al.,
2012, Zhang et al., 2010). Adems, este proceso induce la secrecin de factores regulatorios tales
como TNF- y TGF- (Huynh, 2002).

Por otro lado, un ambiente inflamatorio conduce a la exposicin de los macrfagos a

mltiples estmulos, con consecuencias fenotpicas complejas (Gordon & Taylor, 2005). Los
macrfagos infectados con T. cruzi soportan un incremento en la replicacin del parsito cuando
son expuestos a linfocitos apoptticos (Nunes et al., 1998), lo que sugiere que la apoptosis de los
linfocitos seguida de su eliminacin por fagocitosis ayuda al establecimiento de la infeccin
(DosReis et al., 2009). Adems, las respuestas de los macrfagos a estos procesos estn
estrechamente reguladas y se ha demostrado que la internalizacin de CA es capaz de disminuir
la respuesta de macrfagos, monocitos y DCs (Lucas et al., 2003). En un modelo in vivo Luna-
Gomes et al., (2014) demostraron que en un ambiente inflamatorio inducido por infecciones con
el aislado Dm28c (TcI) un bloqueo de la expresin de TNF- disminuy la parasitemia en un
modelo murino como el empleado en este estudio, es decir, existe una relacin entre los niveles
de TNF- y la patogenicidad del aislado.
 57

Por lo que se puede decir que una respuesta inmune exitosa por parte del hospedador debe
establecer un balance adecuado entre eventos apoptticos y antiapoptticos, asociados con
niveles apropiados de mediadores inmunes y sus clulas efectoras, produciendo un control
favorable del parsito y la reparacin del tejido. Claramente no solamente el efecto directo que
produce el parsito sino que factores derivados del hospedador, tales como mediadores
inflamatorios (TNF-) y la produccin de NO modulan la apoptosis en las clulas hospedadoras,
interfiriendo con la susceptibilidad del individuo a la infeccin con T. cruzi (Roggero et al.,
2002)

Es por esto que se decidi estudiar la activacin de los macrfagos en la zona de infeccin
empleando el anticuerpo CD68. Se observ que ambos aislados lograron activar a los
macrfagos, aunque P1 lo hizo en mayor medida que P2. Resulta indudable la importancia de la
activacin de macrfagos en infecciones experimentales con T. cruzi. En la fase aguda, luego de
la interaccin con los parsitos, los macrfagos producen citoquinas tales como IL-12 y TNF-,
los cuales activan la produccin de IFN- por clulas NK. El IFN- producido junto con TNF-
activa a los macrfagos para producir derivados de oxgeno y eliminar el parsito (Abrahamsohn
& Coffman, 1996; Cardillo et al., 2007; Holscher et al., 1998; Silva, et al., 1992). Magalhaes et
al. (2015) estudiaron la capacidad de activacin de monocitos y determinaron que el aislado Col
cl.17 (TcI) aument la expresin de ligandos de molculas co-estimulatorias, sugiriendo que
posee una mayor capacidad de activar monocitos en comparacin con la cepa de referencia Y
(TcII).
En lo referente a la citoquina proinflamatoria TNF-, se observ un aumento de su
expresin en ambos aislados en comparacin con los ratones control. Este aumento se produjo en
clulas TNF-+/CD68+ en el caso de las infecciones con P1 y en clulas TNF-+/CD68- en el caso
de P2. Por lo que puede afirmarse que la mayor expresin de clulas TNF-+/CD68+ refleja una
respuesta del sistema inmune ante los altos niveles de carga parasitaria encontrados en P1,
adems se encontr que el TNF- se correlaciona de manera positiva a la presencia del parsito
en el sitio de infeccin y a su vez a la extensin del infiltrado inflamatorio en el corazn (datos no
mostrados). Mientras que en el caso de los ratones infectados con P2 no se encontr una
correlacin entre estos parmetros, lo que probablemente se debi a la alta variabilidad de
expresin de TNF- por grupos celulares CD68+ y CD68- y a la baja carga parasitaria.
 58

Rodrguez-Angulo et al., (2013), Pea et al., (2011) y de Souza et al., (2003) mostraron la
presencia de la forma intracelular de T. cruzi en clulas provenientes de fluidos peritoneales y en
cultivos de macrfagos in vitro, demostrando la capacidad del parsito de replicarse dentro de las
mismas. Ahora bien, Magalhaes et al., (2015) encontraron un aumento en el porcentaje de
monocitos TNF-+ luego de infecciones con la cepa Col cl1.7 (TcI), este aumento se observ slo
en monocitos infectados, a su vez, la intensidad de la expresin de TNF- fue mayor en
monocitos infectados en comparacin a clulas espectadoras, lo que sugiere que un contacto
directo con el parsito es requerido para una mejor activacin. Adems de esto, encontraron que
los monocitos infectados con dicho aislado posean una mayor expresin de IL-10, la cual es una
citoquina anti-inflamatoria lo que sugera que es capaz de inducir una respuesta inmune ms
balanceada en comparacin con aislados ms virulentos (como el aislado Y del linaje TcII). De
esta manera se puede relacionar la expresin de TNF- por parte de macrfagos CD68+ con la
patogenicidad y virulencia de P1, ya que este aislado posee una alta capacidad de invadir y
reproducirse en las clulas del hospedador, como se demostr en los estudios histopatolgicos del
corazn. Adems de que los macrfagos doblemente activados, expuestos a CAs y
lipopolisacridos (LPS) liberan una cantidad significativamente mayor de TNF- (Lucas et al.,
2003).

En contraste con el estudio anterior, Carvalho et al., en el 2008 observaron que las DCs
infectadas con Leishmania braziliensis eran el principal tipo celular responsable por la expresin
de TNF-, mientras que DCs espectadoras tenan una expresin de HLA-DR incrementada (la
cual es una molcula presentadora de antgenos importante cuya expresin cambia luego de la
activacin de la clula), aumentando de esta manera la habilidad de las DCs de activar a las
clulas T, adems, result que la activacin de DCs espectadoras era dependiente de TNF-. Esto
podra explicar en cierto modo la mayor proporcin de clulas TNF-+/CD68- encontradas en los
ratones infectados con P2, dado que los macrfagos no son los nicos que producen TNF- ante
la infeccin, como se ha mencionado previamente. A pesar de esto, no se pudo relacionar de
manera significativa la activacin de macrfagos CD68+ y la produccin de TNF- con los
porcentajes de apoptosis, lo que podra deberse, como se mencion anteriormente, a la baja
capacidad del parsito de invadir y evadir a las clulas del sistema inmune.

Otra explicacin podra darse en base a la activacin de monocitos y su importancia en la

activacin de clulas T. Magalhaes et al., (2015) analizaron la expresin de citoquinas para
 59

determinar si la activacin de linfocitos estaba relacionada con la produccin de stas y

encontraron que las clulas T CD8+ eran los que tenan la mayor produccin de TNF- por lo que
podra decirse que en el caso de la infeccin con P2, la expresin de clulas TNF-+/CD68-
podran corresponder, de manera alternativa, a linfocitos CD4 + y CD8+ activados, especialmente
de clulas T CD8+, que podran ser inducidos por las clulas TNF-+/CD68+ presentes en el
fluido peritoneal. Sin embargo, hacen falta anlisis ms especficos para estudiar las poblaciones
celulares que estn participando en este proceso infeccioso especfico.

Como es de esperarse en el caso de respuestas inmunes en contra de la infeccin, la

produccin de citoquinas vara considerablemente entre individuos y la regulacin diferencial de
la sntesis de las mismas puede jugar un papel importante en el desarrollo de la CCC (Poveda, et
al., 2014). Se ha reportado previamente que la infeccin por T. cruzi induce un incremento
sistmico de los niveles de TNF- en una respuesta en contra de la infeccin (Sanoja et al., 2013,
Sousa et al., 2014, Perez et al., 2015) El grupo de Sanoja et al., tambin cuantificaron las
cantidades de TNF- y otras citoquinas en tejido cardaco de ratones Balb/c infectados con la
cepa Y y encontraron que en la fase aguda, el pico de expresin de TNF- sucede el da 17 pi
empezando a disminuir los das posteriores por lo que dicha disminucin de expresin de las
citoquinas inflamatorias se asocia con el control de la infeccin.

En modelos de miocarditis viral se ha encontrado que la falta de expresin de TNF-

resulta ser un factor importante en la resistencia de ratones hembras a la enfermedad, dado que
una administracin exgena de esta citoquina restaura la susceptibilidad a la miocarditis (Huber,
2010). De acuerdo con esto, se sabe que la presencia de tmTNF- biolgicamente activo en el
corazn promueve una hipertrofia cardaca (Dibbs et al., 2003). Por lo que la miocarditis
observada en los ratones infectados con P1 puede estar relacionada con que se encontr una
mayor expresin de TNF- en monocitos en el sitio de infeccin. Se puede apreciar que la
presencia de clulas TNF-+/CD68+ est relacionada con los niveles de apoptosis en el caso de P1
ya que se obtuvo una correlacin positiva entre estos parmetros. As mismo, la carga parasitaria
tiene un efecto en la produccin de TNF-. El TNF- podra estar desempeando un papel
predominantemente pro-inflamatorio y pro-apopttico especficamente con este aislado, por lo
que se reafirma la relacin entre la produccin de TNF- y la virulencia de P1, as como la
relacin de las clulas TNF-+/CD68+ con la capacidad de P1 de inducir apoptosis, lo cual ha sido
demostrado previamente (Martins et al., 1998).
 60

Efectos de la infeccin en clulas esplenocticas.

Es sabido que el peso del bazo es un factor importante a evaluar cuando se presentan
enfermedades inflamatorias, pero este a su vez puede variar dependiendo de la especie y la edad
del animal, por otro lado, se sabe que la proporcin del peso del bazo respecto al peso total del
cuerpo se mantiene relativamente constante sin importar la edad (Cesta, 2006), se ha reportado
que la proporcin relativa entre el peso hmedo del bazo/peso del animal en ratones Balb/c est
entre 0,4 y 0,5 % (Pereira, et al., 2015) lo que concuerda con lo obtenido en este estudio.

En nuestro modelo de infeccin, se encontr que tanto en P1 como P2 haba un aumento

del peso hmedo del bazo, as como su relacin con el peso total del animal, lo que concuerda
con modelos murinos infectados con varios aislados de TcI (Espinoza et al.. 2010). Al cuantificar
el nmero de clulas esplenocticas se not una disminucin de las mismas respecto a los
controles, ste fue el caso para ambos aislados, donde P1 tuvo una disminucin de celularidad de
~46% y P2 una reduccin de ~38%. Lo que resulta interesante ya que P1 denotaba una
esplenomegalia marcada. Esto concuerda con estudios previos de aislados mexicanos de TcI,
donde se encontr que el % de linfocitos CD4+ era significativamente menor en ratones
infectados, aunque el nmero de linfocitos CD8+ no sufra cambios (Espinoza et al., 2010). Al
contrario de lo observado en este estudio Goi et al., en el 2002 encontraron un aumento de la
celularidad de ratones infectados en un ~50-80%. Y a su vez descartaron que una reduccin en el
nmero de clulas T fuese responsable de diminucin de la respuesta proliferativa. Dos hiptesis
podran explicar la reduccin de la celularidad (i) un incremento en el porcentaje de muerte
celular (apoptosis) o (ii) una reduccin en las nuevas clulas generadas (proliferacin).

Ahora bien, dada la intrnseca relacin entre los componentes celulares de la circulacin
con las funciones del bazo, se decidi estudiar el porcentaje de hematocritos, el cual mide el
volumen total de la sangre compuesta por glbulos rojos (VPG). El % de hematocritos obtenidos
el da 0 de infeccin fue de 55,1 3,44 el cual entra dentro de los valores normales para ratones
machos Balb/c (Nemzek et al., 2001), Los mismos autores reportaron un valor de 41.16 1.11 %
para sangre obtenida por puncin cardaca, lo que se acerca al valor obtenido para los ratones
controles este estudio: 40,12 3,72 %. Si bien hubo una ligera disminucin de este parmetro
para los ratones infectados con P1 (VPG: ~35%) y P2 (VPG: ~ 37%), solamente en el caso de P1
se encontr una diferencia significativa, que entra dentro de los parmetros de disminucin
normales en ratones Balb/c sometidos a una infeccin por T. cruzi (Truyens et al., 1995) aunque
 61

en otros modelos experimentales puede suceder lo contrario (aumento del VPG) (Cassin et al.,
2014, Berra et al., 2005) lo que podra deberse a la deshidratacin de los objetos de estudio
producto de la enfermedad.

Se ha reportado una disminucin de los progenitores oligopotentes del linaje mieloide y

eritroide en otros modelos de ratn, donde stos disminuyeron de forma significativa a lo largo de
la infeccin, tanto en porcentaje como en nmero total de clulas (Carbajosa, 2014) lo que podra
ocurrir debido a que un precursor comn a ambos linajes estuviese siendo afectado, dndose un
bloqueo parcial en la hematopoyesis a partir de ese punto, o que cada poblacin estuviera
sufriendo supresiones independientes. El estrs hematopoytico inducido por infecciones es un
factor que contribuye a citopenias (MacNamara et al., 2009), se ha propuesto que la prdida de
las clulas progenitoras de la hematopoyesis es una consecuencia de la muerte celular inducida
por inflamacin o por apoptosis, una reducida proliferacin de clulas progenitoras y un
incremento en la movilizacin celular de la mdula sea a la periferia. Por lo que en el caso de
P1, se le puede atribuir la prdida de los progenitores hematopoyticos a la capacidad de este
aislado de inducir apoptosis.

Ahora bien, Carbajosa (2014) plantea que uno de los factores que pudiese estar afectando el
peso de los bazos es la acumulacin de eritrocitos, en su estudio se determin que las poblaciones
que contribuyeron en mayor medida al incremento de la celularidad de bazo fueron los
precursores de eritrocitos y los eritrocitos maduros. Esto sugiere que la esplenomegalia que se
observa durante la fase aguda de la infeccin por T. cruzi se debe, en gran medida, a este
incremento en la eritropoyesis, sumada a una incapacidad del tejido de liberar las clulas a la
circulacin, lo que est respaldado por varios modelos que han determinado que la
esplenomegalia resultado de la infeccin con T. cruzi se debe, en gran medida, a un incremento
en la eritropoyesis extramedular (Jackson et al., 2010; MacNamara et al., 2009).

Por otro lado, se maneja la hiptesis de que una estimulacin continua de linfocitos los
lleva a una disfuncin inmune: una prdida de la habilidad para responder a un antgeno y/o a un
incremento en los niveles de apoptosis. Se sabe que la infeccin con T. cruzi provoca la apoptosis
en linfocitos T y B (de Meis et al., 2006) y en el caso de las clulas B esplenocticas estas se
someten espontneamente a la apoptosis en ratones infectados, sin la contribucin de otros tipos
celulares (Zuiga et al., 2005). Por lo que para determinar la tasa proliferativa de las clulas
esplenocticas se emple Con A la cual se considera fundamentalmente un mitgeno que
 62

promueve la proliferacin de clulas T, sin embargo, es una lectina que se une a diversas
estructuras de carbohidratos y podra tambin estimular la proliferacin de otros tipos celulares
de forma inespecfica (Petryniak et al., 1986).

En este trabajo solo se logr observar una disminucin en la tasa de proliferacin de

esplenocitos correspondientes a ratones infectados con P1, ya que en los bazos infectados con P2
la proliferacin se mantuvo en niveles normales, por lo que se puede decir que este aislado
produce niveles de inmunosupresin considerablemente ms bajos que P1 y que la actividad
inmunosupresora depende del aislado. Se sabe que las clulas T de individuos infectados con T.
cruzi son altamente insensibles a antgenos y mitgenos, lo que resulta en una sntesis reducida
de IL-2 y un aumento en la produccin de xido ntrico. De manera ms especfica, se considera
que la gran cantidad de molculas O-glicosiladas Thr/ser/Pro ricas en mucina (Tc mucina) en la
superficie de T. cruzi son las principales aceptoras de cido silico y las responsables de la gran
mayora de los efectos inmunes durante la infeccin (Alcaide & Fresno, 2004; Kierszenbaum et
al., 2002). Se ha demostrado que esta mucina tiene la capacidad de inhibir proliferacin de las
clulas T (especialmente de clulas T CD4+), as como la produccin y transcripcin de IL-2 en
respuesta a mitgenos (Nunes et al., 2013). Lo que quiere decir que grandes cantidades de T.
cruzi y su presencia en las clulas del hospedador podran estar afectando la capacidad
proliferativa de las clulas del sistema inmune.

La molcula transialidasa (TS) es capaz de modular la supervivencia de clulas neuronales,

previniendo su apoptosis, pero dispara la muerte celular en el timo, el bazo y los ndulos
linfticos durante la infeccin aguda (Mucci et al., 2002). Como los niveles de carga parasitaria
en P2 se mantuvieron considerablemente bajos durante el transcurso de la fase aguda de
infeccin, se puede asumir que este aislado no mostr un parasitismo considerable que lograra
inhibir la proliferacin de los linfocitos T en el bazo. Mientras que la alta carga parasitaria
observada en P1 podra explicar la capacidad que posee este aislado en inhibir la proliferacin de
las clulas T.

Contrario a lo observado en este estudio, Espinoza et al., (2010) no observaron un

incremento de la actividad de clulas T CD4+ sino ms bien una disminucin, mientras que el
nmero de clulas T CD8+ permaneci sin cambios, al estimular estas clulas con Con A, no
encontraron diferencias en la capacidad proliferativa en aislados de TcI. En contraste, Cuervo et
al., (2011) encontraron que los bazos de animales infectados con T. cruzi contenan una
 63

poblacin de clulas mieloides capaces de inhibir la proliferacin de clulas T va NO y durante

la fase aguda de la infeccin, la supresin de la proliferacin de linfocitos T era parcialmente
causada por esa molcula (Goi et al., 2002).

Hay que tener en cuenta que durante la infeccin se liberan numerosos factores solubles
capaces de regular la expansin y diferenciacin de los diferentes linajes hematopoyticos, entre
los cuales se encuentra el TNF- (Rezzoug et al., 2008), estos factores que resultan cruciales para
mantener la proliferacin y diferenciacin de las clulas madres hematopoyticas tanto en
condiciones fisiolgicas como en respuesta a estrs. Sin embargo, una desregulacin de la
produccin de estas citoquinas puede llevar al efecto contrario y causar supresin de la
hematopoyesis en diferentes niveles (Jacobsen, et al., 1994, Sedger et al., 2002, citado por
Carbajosa, 2014)

P1 mostr una mayor expresin de TNF- en comparacin a P2 y se sabe que el tmTNF-

es capaz de activar clulas supresoras del sistema mieloide (MDSCs) como se ha demostrado en
modelos tumorales en ratones (Hu et al., 2014), este conjunto de clulas liberan mediadores
inhibitorios como NO, ROS, IL-10 y TGF-. Adems, las MDSCs son capaces de suprimir la
activacin y proliferacin de clulas T (Gabrilovich & Nagaraj, 2009, Cuervo, et al., 2011), el
mecanismo mediante el cual sucede dicha supresin, tiene que ver con que el tmTNF- es capaz
de incrementar la liberacin en las MDSCs de IL-10 y TGF- las cuales son citoquinas
inhibitorias de la proliferacin de clulas T, por lo que de esta manera, junto con alteraciones en
la linfopoyesis, podra explicarse en cierta medida la disminucin de proliferacin de
esplenocitos observada en los ensayos realizados con P1 y se reafirma la estrecha relacin que
posee P1 con la respuesta que puede inducir en el hospedador en lo referente a la produccin de
TNF-
 64

CONCLUSIONES

El aislado venezolano P2 (TcIV) posee una menor virulencia y patogenicidad en ratones

Balb/c infectados, en contraste con la moderada virulencia y patogenicidad producto de la
infeccin con P1 (TcI).

Los patrones de miocarditis observados en la infeccin experimental con T. cruzi dependen

del aislado empleado y estos, a su vez, pueden causar diferencias en la progresin de la
Enfermedad de Chagas durante la fase aguda.

El infiltrado inflamatorio en el corazn se relaciona con la capacidad del aislado de

parasitar el tejido durante la fase aguda, la infeccin con P1 produce una mayor carga parasitaria
que P2 y por lo tanto una mayor presencia del infiltrado.

P1 posee una mayor capacidad para infectar a los miocitos cardacos, as como una cintica
de multiplicacin ms acelerada en comparacin a P2

Existe una correlacin positiva entre el porcentaje de apoptosis y la presencia de

macrfagos TNF-+/CD68+ en el caso de la infeccin con P1.

La respuesta inmune a T. cruzi es compleja, y pueden ocurrir diferentes patrones en

diversos aspectos del sistema inmune, incluyendo proliferacin celular, produccin de TNF- y
muerte celular, las cuales dependen del aislado, en este caso, P1 es capaz de inducir alteraciones
en estos parmetros de manera ms contrastada que P2.
 65

RECOMENDACIONES

Para continuar esta lnea de estudio, nuevos aislados de T. cruzi venezolanos deberan ser
analizados. El hallazgo de amastigotes por HE en el tejido cardaco de ratones inoculados con
TcIV es un justificativo para el uso de tcnicas ms sensibles para la deteccin del parsito en
tejido. Por ejemplo, estudios de amplificacin de ADN podran proveer un mejor entendimiento
de la patogenicidad del aislado empleado. Se sugiere adems alargar el tiempo de estudio ms
all de la fase aguda de la enfermedad y estudiar el comportamiento crnico de los ratones
infectados especialmente con el DTU TcIV dado que es el linaje menos caracterizado en
Venezuela en comparacin con TcI. Respecto al infiltrado cardaco, se propone emplear tcnicas
inmunohistoqumicas para caracterizar cules poblaciones celulares especficas componen el
infiltrado, y adems, estudiar la expresin de TNF- en el tejido y de forma sistmica, para
entender mejor el papel del TNF- y la virulencia de los aislados estudiados. As mismo, se
propone caracterizar de manera ms especfica los tipos celulares provenientes de fluido
peritoneal para elucidar qu tipos celulares se ven afectados por P2 y cmo evoluciona la
respuesta inmune celular ante este aislado. Finalmente, se sugiere evaluar efectos especficos de
los aislados en el bazo, como parasitismo en el tejido, % apoptosis e histologa o citometra de
flujo para determinar cules tipos celulares estn siendo afectados.
 66

BIBLIOGRAFA

Abrahamsohn I. A., Coffman R. L. (1996) Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN-gamma, and IL-12
regulate innate and acquired immunity to infection Exp Parasitol 84: 231244

Alarcn de Noya B., Diaz-Bello Z., Colmenares C., Ruiz-Guevara R., Mauriello L., Zavala Jaspe R.,
Suarez J.A., Abate T., Naranjo L., Paiva M., Rivas L., Castro J., Marques J., Mendoza I., Acquatella H.,
Torres J., Noya O. (2010). Large urban outbreak of orally acquired acute Chagas disease at a school in
Caracas, Venezuela. J. Infect. Dis. 201: 13081315.

Alarcn de Noya B., Daz-Bello Z., Colmenares C., Ruiz-Guevara R., Mauriello L., Muoz-Caldern A.,
Noya O. (2015) "Update on oral Chagas disease outbreaks in Venezuela: epidemiological, clinical and
diagnostic approaches". Mem Inst Oswaldo Cruz 110(3): 377-386.

Alcaide P., Fresno M. (2004) The Trypanosoma cruzi membrane mucin AgC10 inhibits T cell activation
and IL-2 transcription through L-selectin. Int Immunol 16: 136575.

Alvarado-Tapias A., Miranda-Pacheco R., Rodrguez-Bonfante C., Velsquez G., Loyo J., Gil-Oviedo M.,
Mogolln N., Prez-Aguilar M. C., Recchimuzzi G., Espinosa R., Carrasco H. C., Concepcin J. L.,
Bonfante-Cabarcas R. A. (2012) Electrocardiography repolarization abnormalities are characteristic signs
of acute chagasic cardiomyopathy Invest Clin 53(4): 378 394.

Ameisen J. C., Idziorek T., Billaut-Mulot O., Loyens M., Tissier J. P., Potentier A., Ouaissi A. (1995).
Apoptosis in a unicellular eukaryote (Trypanosoma cruzi): implications for the evolutionary origin and
role of programmed cell death in the control of cell proliferation, differentiation and survival. Cell Death
Differ 2: 285-300.

Andrade, L. O., Machado C. R., Chiari E., Pena S. D., Macedo A. M., (1999). Differential tissue
distribution of diverse clones of Trypanosoma cruzi in infected mice. Mol.Biochem. Parasitol. 100, 163
172.

Andrade L. O., Machado C. R., Chiari E., Pena S. D. and Macedo A. M. (2002) Trypanosoma cruzi: role
of host genetic background in the differential tissue distribution of parasite clonal populations. Exp
Parasitol 100, 269-75.

Aez N., Crisante G., Maia da Silva F., Rojas A., Carrasco H., Umezawa E. S., Stolf A. M. S., Ramirez J.
L. & Teixeira M. M. G. (2004). Predominance of lineage I among Trypanosoma cruzi isolates from
 67

Venezuelan patients with different clinical profiles of acute Chagas disease. Trop. Med. Int. Health. 9:
1319-1326

Aez N., Crisante G., Aez-Rojas N., Rojas A., Moreno G., da Silva Flavia M. et al. (2009) "Genetic
typing of Trypanosoma cruzi isolates from different hosts and geographical areas of western Venezuela."
Bol Mal Salud Amb 49(2): 251-258.

Aez N., Martens M. L., Romero M. & Crisante G. (2011) Primoinfeccin por Trypanosoma cruzi
previene re-infecciones severas en ratones Bol Mal Salud Amb 51(2) 1690-4648.

Barretto M. (1979). Trypanosoma cruzi e doena de Chagas. Eds. Brener Z., Andrade, Z. & Barral-
Netto M. 2 Ed. Publicaciones Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, Brasil. 89-115.

Balogh P., Horvath G., & Szakal A. K. (2004). Immunoarchitecture of distinct reticular fibroblastic
domains in the white pulp of mouse spleen. J Histochem Cytochem 52, 128798.

Basso B. (2013) Modulation of immune response in experimental Chagas disease. World J Exp Med.
3(1): 1-10

Berra H. H., Piaggio E., Revelli S. S., Luquita A. (2005). Blood viscosity changes in experimentally
Trypanosoma cruzi-infected rats. Clin Hemorheol Microcirc 32: 175-182.

Bogitsh B., Carter C., Oeltmann T. (2005). Human Parasitology. Amsterdam: Elsevier. 20-38

Bouzahzah B., Nagajyothi F., Desruisseaux M. S., Krishnamachary M., Factor S. M., Cohen A.W., et al.
(2006) Cell cycle regulatory proteins in the liver in murine Trypanosoma cruzi infection. Cell cycle.
5:23962400.

Brener Z., Gazzinelli R. T. (1997) Immunological control of Trypanosoma cruzi infection and
pathogenesis of Chagas disease. Int Arch Allergy Immunol. 114: 103-110.

Brisse S., Barnabe C., Tibayrenc M. (2000) Identification of six Trypanosoma cruzi phylogenetic
lineages by random amplified polymorphic DNA and multilocus enzyme electrophoresis. Int J Parasitol
30: 3544.

Burgos J. M., Diez M., Vigliano C., Bisio M., Risso M., et al. (2010) Molecular identification of
Trypanosoma cruzi Discrete Typing Units in end-stage chronic Chagas heart disease and reactivation after
heart transplantation. Clin Infect Dis 51: 485495.
 68

Carbajosa S. (2014) Alteraciones en la hematopoyesis y el metabolismo de la L-arginina durante la

infeccin aguda experimental por Trypanosoma cruzi. Tesis Doctoral de la Universidad Autnoma de
Madrid. Departamento de Biologa Celular. Facultad de Ciencias. Madrid. Espaa. 39-139.

Cardillo F., Postol E., Nihei J., Aroeira L.S., Nomizo A., Mengel J.(2007) B cells modulate T cells so as
to favour T helper type 1 and CD8+ T-cell responses in the acute phase of Trypanosoma cruzi infection.
Immunology. 122: 584-595.

Cardoso, J.E., Brener, Z., (1980). Hematological change in mice experimentally infected with
Trypanosoma cruzi. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 75, 97-104.

Cassin A. L., de Abreu P., Mendes B., Oliveira Aguiar-Soares R. D., de Oliveira J. M., Carvalho F.,
Soares L. V., Luiz W., Veloso V. M., Barbosa A., Martins C. (2014) The TcI and TcII Trypanosoma
cruzi experimental infections induce distinct immune responses and cardiac fibrosis in dogs Mem Inst
Oswaldo Cruz. 109(8): 1005-1013.

Chagas C. (1909). "Nova tripanozomiase humana". Mem. Inst. O. Cruz. 1:159-218.

Chen C.K., Leung S.S.F, Guilbert C., Jacobson M.P., Mckerrow J.H. & Podust L.M. (2010) Structural
characterization of CYP51 from Trypanosoma cruzi and Trypanosom brucei bound to the antifungal drugs
posaconazole and fluconazole. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4(4): e651.

Camargo M.M., Andrade A.C., Almeida I.C., Travassos L.R., Gazzinelli R.T. (1997) Glycoconjugates
isolated from Trypanosoma cruzi but not from Leishmania species membranes trigger nitric oxide
synthesis as well as microbicidal activity in IFNgamma- primed macrophages. J Immunol. 159: 6131-
6139.

Carrasco, H. Segovia M., Londoo J. C., Ortegoza J., Rodrguez M., Martnez C. E. (2014)
"Panstrongylus geniculatus and four other species of triatomine bug involved in the Trypanosoma cruzi
enzootic cycle: high risk factors for Chagas disease transmission in the Metropolitan District of Caracas,
Venezuela" Parasites & Vectors 7:602.

Carrasco H., Segovia M., Llewellyn M.S., Morocoima A., Urdaneta-Morales S., Martnez C., Martnez
C.E., Garcia C., Rodrguez M., Espinosa R., Alarcn de Noya B., Daz-Bello Z., Herrera L., Fitzpatrick F.,
Yeo M., Miles M.A., Feliciangeli M.D. (2012). Geographical distribution of Trypanosoma cruzi
genotypes in Venezuela. PLoS Negl Trop Dis 6: e1707.

Cesta M. (2006) "Normal Structure, Function, and Histology of the Spleen" Toxicologic Pathology.
34:455465.
 69

Corraliza I.M., Soler G., Eichmann K., Modolell M. (1995) Arginase induction by suppressors of nitric
oxide synthesis (IL-4, IL-10 and PGE2) in murine bone-marrow-derived macrophages. Biochem Biophys
Res Commun. 206:66773.

Cuervo H., Pineda M.A., Aoki M.P., Gea S., Fresno M., Girons N. (2008) "Inducible nitric oxide
synthase and arginase expression in heart tissue during acute Trypanosoma cruzi infection in mice:
arginase I is expressed in infiltrating CD68+ macrophages." J Infect Dis. 197(12): 1772-82.

Cuervo H., Nstor A., Guerrero, Carbajosa S., Beschin A., De Baetselier P., Girones N. & Fresno M.
(2011) Myeloid-Derived Suppressor Cells Infiltrate the Heart in Acute Trypanosoma cruzi Infection J
Immunol. 187:2656-2665.

da Matta P.M., Gutierrez F.R., Maia F.L., Milanezi C.M., Silva G.K., Pavanelli W.R., Silva J.S. (2010)
IL-17 produced during Trypanosoma cruzi infection plays a central role in regulating parasite-induced
myocarditis. PLoS Negl Trop Dis. 4:e604.

del Puerto F., Nishizawa J. E., Kikuchi M., Roca Y., Avilas C., Gianella A., Lora J., Velarde F. U., Miura
S., Komiya N., Maemura K. and Hirayama K. (2012) Protective human leucocyte antigen haplotype,
HLA-DRB1*01-B*14, against chronic Chagas disease in Bolivia. PLoS Negl Trop Dis. 6, e1587.

del Puerto R, Nishizawa J.E., Kikuchia M.K., Iioshi N., Roca Y., et al. (2010) Lineage analysis of
circulating Trypanosoma cruzi parasites and their association with clinical forms of Chagas disease in
Bolivia. PLoS Negl Trop Dis 4: e687.

Dias J. C. (2000). "Epidemiologia". En: Trypanosoma cruzi e doena de Chagas. Eds Brener Z., Andrade
Z. & Barral-Netto M. Guanabara-Koogan, Rio de Janeiro, Brasil. 48-74.

Dibbs, Z., Diwan A., Nemoto S., DeFreitas G., Abdellatif M, Carabello B. A., Spinale F. G., Feuerstein
G., Sivasubramanian N., Mann D.L. (2003) Targeted Overexpression of Transmembrane Tumor Necrosis
Factor Provokes a Concentric Cardiac Hypertrophic Phenotype Circulation. 108:1002-1008

De Meis, J., Morrot, A., Farias-de-Oliveira, D. A., Villa-Verde, D. M. S., & Savino, W. (2009).
Differential Regional Immune Response in Chagas Disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 3(7),
e417.

de Souza E. M., Araffljo-Jorge T. C., Bailly C., Lansiaux A., Batista M. M., Oliveira G. M., Soeiro M. N.
C. (2003) Host and parasite apoptosis following Trypanosoma cruzi infection in in vitro and in vivo
models. Cell Tissue Res. 314:223235.
 70

de Souza E. M. , Meuser-Batista M., Batista D.G., Duarte B.B., Araujo-Jorge T.C., Soeiro M.N.C. (2008)
Trypanosoma cruzi: Alpha-2-macroglobulin regulates host cell apoptosis induced by the parasite
infection in vitro Experimental Parasitology. 118: 331337.

de Souza W., de Carvalho T.M., Barrias E.S., (2010). Review on Trypanosoma cruzi: host cell
interaction. Int. J. Cell Biol.

Dutra W.O., Menezes C.A.S., Villani F.N.A., Costa G.C., Silveira A.B., et al. (2009) Cellular and
genetic mechanisms involved in the generation of protective and pathogenic immune responses in human
Chagas disease. Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 104: 208218.

DosReis G.A., Ribeiro-Gomes F.L., Guillermo L.V., Lopes M.F. (2007). Cross-talk between apoptosis
and cytokines in the regulation of parasitic infection. Cytokine Growth Factor Rev 18: 97-105.

DosReis G.A., Lopes M.F. (2009). The importance of apoptosis for immune regulation in Chagas
disease. Mem Inst Oswaldo Cruz. 104(Suppl. I): 259-262.

Espinoza B., Rico T., Sosa S., Oaxaca E., Vizcaino-Castillo A., Caballero M. L., & Martinez I. (2010)
Mexican Trypanosoma cruzi TcI Strains with Different Degrees of Virulence Induce Diverse Humoral
and Cellular Immune Responses in a Murine Experimental Infection Model Journal of Biomedicine and
Biotechnology. ID: 890672, 10 pp

Feliciangeli M.D, (2009) Control de la enfeermedad de Chagas en Venezuela. Logros Pasados y

Presentes Interciencia. 34:393399.

Feldman A.M., & McNamara D. (2000) Myocarditis. N Engl J Med. 343:13881398.

Freire-de-Lima C., Nascimento D. O., Soares M.B.P., Bozza P.T., Castro-Faria-Neto H.C., de Mello F.G.,
DosReis G.A. & Lopes M.F. Uptake of apoptotic cells drives the growth of a pathogenic trypanosome in
macrophages Nature. 403: 199-203

Fuenmayor C., Higuchi M.L., Carrasco H., Parada H., Gutierrez P., Aiello V., Palomino S. (2005) Acute
Chagas' disease: immunohistochemical characteristics of T cell infiltrate and its relationship with T. cruzi
parasitic antigens. Acta Cardiol. 60(1):33-7

Gabrilovich D. I. & Nagaraj S. (2009) Myeloid-derived-suppressor cells as regulators of the immune

system Nat Rev Immunol. 9(3): 162174.
 71

Gascn J., Bern C., Pinazo M.J. (2010). Chagas disease in Spain, the United Sates and other non-
endemic countries. Acta Trop 115: 22-27.

Gaunt M. & Miles M. (2000). The ecotopes and evolution of triatomine bugs (Triatominae) and their
associated trypanosomes. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 95: 557-565.

Girones N., Cuervo H., Fresno M. (2005) Trypanosoma cruzi-induced molecular mimicry and Chagas
disease. Curr Top Microbiol Immunol 296: 89123.

Goni O., Alcaide P., Fresno M. (2002) Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection:
involvement of Ly6G (Gr1+)CD11b+ immature myeloid suppressor cells. Int Immunol. 14:11251134.

Gordon S., Fraser I., Nath D., Hughes D., Clarke S. (1992) Macrophages in tissues and in vitro. Curr
Opin Biol. 4:25.

Gordon S. & Taylor M. (2005) "Monocyte and macrophage heterogeneity" Inmunology. 5:953-964.

Herrera L. (2010) "Una revisin sobre reservorios de Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi (Chagas,
1909), agente etiolgico de la Enfermedad de Chagas". Bol Mal Salud Amb. 50 (1): 3-15.

Higuchi M.D., Reis M.M., Aiello V.D., Benvenuti L.A., Gutierrez P.S., Bellotti G., Pileggi F. (1997)
Association of an increase in CD8+ T cells with the presence of Trypanosoma cruzi antigens in chronic,
human, chagasic myocarditis. Am J Trop Med Hyg. 56:485489.

Holscher C., Kohler G., Muller U., Mossmann H., Schaub G.A., et al. (1998) Defective nitric oxide
effector functions lead to extreme susceptibility of Trypanosoma cruzi-infected mice deficient in gamma
interferon receptor or inducible nitric oxide synthase. Infect Immun. 66: 12081215.

Hu X., Baihua L., Xiaoyan L., Xianxian Z., Lin W,. Guohong L., Min Y., Jing W., Xiaodan J., Wei F.,
Zhihai Q., Bingjiao Y., & Zhuoya L. (2014) Transmembrane TNF-a Promotes Suppressive Activities of
Myeloid-Derived Suppressor Cells via TNFR2 J Immunol . 192:1320-1331.

Huber, S. (2010). Tumor Necrosis Factor- Promotes Myocarditis in Female Mice Infected with
Coxsackievirus B3 Through Upregulation of CD1d on Hematopoietic Cells. Viral Immunology. 23(1),
7986.

Huynh M.L.N., Fadok V.A., Henson P.M. (2002) Phosphatidylserine-dependent ingestion of apoptotic
cells promotes TGF-beta1 secretion and the resolution of inflammation. J Clin Invest. 109: 4150.
 72

Iwasaki A., Medzhitov R. (2004) Toll-like receptor control of the adaptive immune responses. Nat
Immunol. 5: 987-995.

Jackson A., Nanton M. R., O'Donnell H., Akue A. D. & McSorley S. J. (2010) Innate immune activation
during Salmonella infection initiates extramedullary erythropoiesis and splenomegaly. J Immunol. 185:
6198-204.

Jacobsen F. W., Rothe M., Rusten L., Goeddel D. V., Smeland E. B., Veiby O. P., Slordal L. & Jacobsen
S. E. (1994) Role of the 75-kDa tumor necrosis factor receptor: inhibition of early hematopoiesis. Proc
Natl Acad Sci. 91, 10695-9.

Knapp W., Dorken B., Gilks W.R., Rieber E.P., Schmidt R.E., Stein H., von dem Borne A.E.G.Kr (eds)
(1991) Leukocyte Typing IV. White Cell Differentiation Antigens. Oxford, UK, Oxford.

Kierszenbaum F., Fresno M., Sztein M.B. (2002) The Trypanosoma cruzi membrane glycoprotein
AGC10 inhibits human lymphocyte activation by a mechanism preceding translation of both, interleukin-2
and its high-affinity receptor subunits. Mol Biochem Parasitol. 125: 91101.

Kirchhoff L.V. (1996) American trypanosomiasis. Gastro Clinics of North Amer. 25:517533.

Kollias G., Sfikakis P.P. (2010) TNF pathophysiology: molecular and cellular mechanisms. Basel
(Switzerland). Karger. pp. 1-26.

Kumar S. & Tarleton R. L. (1998) The relative contribution of antibody production and CD8+ T cell
function to immune control of Trypanosoma cruzi. Parasite Immunol. 20, 207-16.

Lisboa C., Mangia R., Rubio E., Lima N., Xavier S., Picinatti A., Ferreira L., Fernandes O. & Jansen A.
M. (2004). Trypanosoma cruzi transmission in a captive primate unit, Rio de Janeiro, Brazil. Acta Trop.
90: 97106.

Lisboa C. V., Pinho A.P., Monteiro R.V., Jansen A.M. (2007) Trypanosoma cruzi (kinetoplastida
Trypanosomatidae): Biological heterogeneity in the isolates derived from wild hosts. Experimental
Parasitology. 116 (2007) 150155

Lorenzo M., Guarneri A., Pires H., Diotaiuti L. & Lazzari C. (2000). "Aspectos microclimticos del
hbitat de Triatoma brasiliensis". Cad. Sade Pblica. 16: 69-74.

Lucas M., Stuart L.M., Savill J. & Lacy-Hulbert A. (2003) Apoptotic Cells and Innate Immune Stimuli
Combine to Regulate Macrophage Cytokine Secretion J Immunol. 171:2610-2615.
 73

Luna-Gomes T., Filardy A.A., Rocha J.D.B., Decote-Ricardo D., LaRocque-de-Freitas I.F., et al. (2014)
Neutrophils Increase or Reduce Parasite Burden in Trypanosoma cruzi-Infected Macrophages,
Depending on Host Strain: Role of Neutrophil Elastase. PLos ONE. 9(3): e90582.

Marin-Neto J. A., Cunha-Neto E., Maciel B. C., & Simoes M. V. (2007). Pathogenesis of chronic Chagas
heart disease. Circulation. 115: 11091123.

Martin D. & Tarleton R. (2004) Generation, specificity, and function of CD8+ T cells in Trypanosoma
cruzi infection. Immunol Rev. 201, 304-17.

Martins G.A., Cardoso M.A., Aliberti J.C., Silva J.S. (1998). Nitric oxide-induced apoptotic cell death in
the acute phase of Trypanosoma cruzi infection in mice. Immunol Lett. 63: 113-120.

Machado F.S., Souto J.T., Rossi M.A., et al. (2008) "Nitric oxide synthase-2 modulates chemokine
production by Trypanosoma cruzi-infected cardiac myocytes". Microbes Infect 10:15581566.

Machado F. S., Dutra W. O., Esper L., Gollob K. J., Teixeira M. M., Factor S. M., Weiss L. M.,
Nagajyothi F., Tanowitz H. B. and Garg N. J. (2012) Current understanding of immunity to
Trypanosoma cruzi infection and pathogenesis of Chagas disease. Semin Immunopathol. 34, 753-70.

Maclennan I.C., Toellner K.M., Cunningham A.F. et al. (2003) Extrafollicular antibody responses.
Immunol Rev. 194:818.

MacNamara K. C., Racine R., Chatterjee M., Borjesson D. and Winslow G. M. (2009) Diminished
hematopoietic activity associated with alterations in innate and adaptive immunity in a mouse model of
human monocytic ehrlichiosis. Infect Immun. 77, 4061-9.

Magalhes L.M.D., Viana A., Chiari E., Galvo L.M.C., Gollob K.J., Dutra W.O. (2015) Differential
Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi. PLoS Negl
Trop Dis. 9(7): e0003816.

Malvezi A. D., Cecchini R., de Souza F., Tadokoro C. E., Rizzo L. V. and Pinge-Filho P. (2004)
Involvement of nitric oxide (NO) and TNF-alpha in the oxidative stress associated with anemia in
experimental Trypanosoma cruzi infection. FEMS Immunol Med Microbiol. 41, 69-77.

Marcondes M. C., Borelli P., Yoshida N. and Russo M. (2000) Acute Trypanosoma cruzi infection is
associated with anemia, thrombocytopenia, leukopenia, and bone marrow hypoplasia: reversal by
nifurtimox treatment. Microbes Infect. 2, 347-52.
 74

McMichael A.J., Beverley P.C.L., Cobbold S., Crumpton M.J., Gilks W., Gotch F.M., Hogg N., Horton
M., Ling N., MacLennan I.C.M., Mason D.Y., Milstein C., Spiegelhalter D., Waldmann H. (eds): (1987)
Leukocyte Typing . White Cell Differentiation Antigens. Oxford, UK, Oxford.

Meza S.K.L., Nobuyoshi E., de Oliveira S., Gabriel M., Marques S., Gomes M. L., Monteiro W. M.,
Barbosa M. G. V., de Ornelas M. J. (2014) "Comparative pathogenicity in Swiss mice of Trypanosoma
cruzi IV from northern Brazil and Trypanosoma cruzi II from southern Brazil" Experimental Parasitology
146: 3442.

Miles, M.A., Llewellyn, M.S., Lewis, M.D., Yeo, M., Baleela, R., Fitzpatrick, S., et al., (2009). The
molecular epidemiology and phylogeography of Trypanosoma cruzi and parallel research on Leishmania:
looking back and to the future. Parasitol. 136, 1509_1528.

Minoprio P.M., Eisen H., Forni L. et al.(1986) Polyclonal lymphocyte responses to murine Trypanosoma
cruzi infection. I. Quantitation of both T- and B-cell responses. Scand J Immunol. 24:6618.

Monteiro W.M., Margioto Teston A.P., Gruendling A.P., dos Reis D., Gomes M.L., et al. (2013)
Trypanosoma cruzi I and IV Stocks from Brazilian Amazon Are Divergent in Terms of Biological and
Medical Properties in Mice. PLoS Negl Trop Dis 7(2): e2069.

Morocoima A., Rodrguez M., Herrera L., Urdaneta S. (2006) Trypanosoma cruzi: Experimental
parasitism of bone and cartilage. Parasitol Res. 99: 6638.

Mucci J., Hidalgo A., Mocetti E., Argibay P.F., Leguizamon M.S., Campetella O. (2002) Thymocyte
depletion in Trypanosoma cruzi infection is mediated by trans-sialidase-induced apoptosis on nurse cells
complex. Proc Natl Acad Sci. 99:3896 3901.

Muller U., Sobek V., Balkow S., Holscher C., Mullbacher A., Museteanu C., Mossmann H. and Simon M.
M. (2003) Concerted action of perforin and granzymes is critical for the elimination of Trypanosoma
cruzi from mouse tissues, but prevention of early host death is in addition dependent on the FasL/Fas
pathway. Eur J Immunol 33, 70-8.

Muoz-Caldern A., Daz-Bello Z., Valladares B., Noya O., Lpez M.C., Alarcn de Noya B., Thomas
M.C. (2013). Oral transmission of Chagas disease: typing of Trypanosoma cruzi from five outbreaks
occurred in Venezuela shows multiclonal and common infections in patients, vectors and reservoirs.
Infect Genet Evol. 17: 113-122.

Murray P.J., Wynn T.A. (2011a). Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev
Immunol. 11(11):723-37.
 75

Murray P.J., Wynn T.A. (2011b). Obstacles and opportunities for understanding macrophage
polarization. J Leukoc Biol. 89(4):557-63.

Muoz-Fernndez M.A., Fernndez M.A., y Fresno M. (1992). Activation of human macrophages for the
killing of intracellular Trypanosoma cruzi by TNF-alpha and IFN-gamma through a nitric oxide-
dependent mechanism. Immunol. Lett. 33:35-40

Nahrendorf M. & Swirski F. K. (2013) "Monocyte and macrophage heterogeneity in the heart Circ Res.
112(12): 16241633

Nemzek J. A., Bolgos G. L., Williams B. A. & Remick D. G. (2001) Differences in normal values for
murine white blood cell counts and other hematological parameters based on sampling site Inflamm. res.
50: 523527.

Nunes, M. P., Andrade, R. M., Lopes, M. F. & DosReis, G. A. (1998). Activation-induced T cell death
exacerbates Trypanosoma cruzi replication in macrophages cocultured with CD4+ T lymphocytes from
infected hosts. J. Immunol. 160, 1313-1319

Nunes M. P., Fortes B., Silva-Filho J.L., Terra-Granado E., Santos L., et al. (2013) Inhibitory Effects of
Trypanosoma cruzi Sialoglycoproteins on CD4+ T Cells Are Associated with Increased Susceptibility to
Infection. PLoS ONE 8(10): e77568.

Oliveira E. C., Stefani M. M. A., Campos D. E., Andrade A. L. S. S., Silva S. A., Rami A. & Luquetti A.
(1997) Trypanosoma cruzi stocks isolated from acute Chagas disease patients lead to lethal murine
infection Transactions of the royal society of tropical medicine and hygiene 91: 25-27

Oliveira A. M.; Borges P.; Pons A.H., Babinski M.A. & Brasil, F. (2008) Anlise histopatolgica e
estereolgica do corao de camundongos na fase aguda da infeco experimental por trypanosoma
cruzi. Acta Scientiae Medica_On line. 1(1): 10-18

Parada H., Carrasco H.A., Aez N., et al. (1997) Cardiac involvement is a constant finding in acute
Chagas disease: a clinical, parasitological and histopathological study. Int J Cardiol; 60:4954.

Patel V.A., Feng L., Lee D.J., Massenburg D., Pattabiraman G., et al. (2012) Recognition-dependent
signaling events in response to apoptotic targets inhibit epithelial cell viability by multiple mechanisms:
implications for non-immune tissue homeostasis. J Biol Chem 287: 1376113777.
 76

Pena D. A., Eger I., Nogueira L., Heck N., Menin I., Bafica A., y Steindel M. (2011) "Selection of TcII
Trypanosoma cruzi Population Following Macrophage Infection The Journal of Infectious Diseases;
204:47886

Pereira P. R. , Silva J.T., Vercimo M.A., Paschoalin V.M.F., Teixeira A.P.B. (2015) Crude extract from
taro (Colocasia esculenta) as a natural source of bioactive proteins able to stimulate haematopoietic cells
in two murine models Journal of Functional Foods 18: 333343

Perez B., Vazquez T.P., Miguel C.B., Rodrigues W.F., Mendes M.T., de Oliveira C.J. & Lazo Chica J.L.,
Vazquez et al. (2015) Inflammatory responses and intestinal injury development during acute
Trypanosoma cruzi infection are associated with the parasite load Parasites & Vectors. 8:206

Petryniak J., Huard T. K., Nordblom G. D. and Goldstein I. J. (1986) Lectin binding studies on murine
peritoneal cells: physicochemical characterization of the binding of lectins from Datura stramonium,
Evonymus europaea, and Griffonia simplicifolia to murine peritoneal cells. Arch Biochem Biophys 244,
57-66.

Piacenza L., Peluffo G., Radi R. (2001). L-arginine-dependent suppression of apoptosis in Trypanosoma
cruzi: contribution of the nitric oxide and polyamine pathways. Proc Natl Acad Sci USA 98: 7301-7306.

Poveda C., Fresno M., Girons N., Martins-Filho O.A., Ramrez J.D., Santi-Rocca J, et al. (2014)
Cytokine Profiling in Chagas Disease: Towards Understanding the Association with Infecting
Trypanosoma cruzi Discrete Typing Units (A BENEFIT TRIAL Sub-Study). PLoS ONE 9(3): e91154.

Pratt, E. D. (2012) How to sort circulating tumor cells Part I : Size. Disponible on-line en:
https://kirbylabblog.wordpress.com/2012/11/09/how-to-sort-circulating-tumor-cells-part-i-size/

Rassi A., Jr., Rassi A., Little W.C., et al. (2006) Development and validation of a risk score for
predicting death in Chagas heart disease. NEJM J Med. 355:799808.

Rassi A., Jr., Rassi A. & Marin-Neto J. A. (2010) Chagas disease Lancet 375, 1388-402.

Rassi A., Jr., Rassi A. & Marcondes de Rezende J. (2012) American trypanosomiasis (Chagas
disease) . Infect Dis Clin North Am 26, 275-91.

Ramrez J.D., Guhl F., Rendn L.M., Rosas F., Marin-Neto J.A., et al. (2010) Chagas Cardiomyopathy
Manifestations and Trypanosoma cruzi Genotypes Circulating in Chronic Chagasic Patients. PLoS Negl
Trop Dis 4(11): e899.
 77

Regueiro A, Garca-lvarez A, Sitges M, Ortiz-Prez JT, De Caralt MT, Pinazo MJ, Posada E, Heras M,
Gascn J, Sanz G. (2008) "Myocardial involvement in Chagas disease: Insights from cardiac magnetic
resonance." Int J Cardiol.

Rezzoug F., Huang Y., Tanner M. K., Wysoczynski M., Schanie C. L., Chilton P. M., Ratajczak M. Z.,
Fugier-Vivier I. J. & Ildstad S. T. (2008) TNF-alpha is critical to facilitate hemopoietic stem cell
engraftment and function. J Immunol 180, 49-57.

Rivera I.M., Moreno E.A., Gonzles N., Lugo A., (2000) Caracterizacin de aislados de Trypanosoma
cruzi del occidente de Venezuela .Rev. Ecol. Lat. Am. 7(3):1-10.

Rivera M., Herrera L., Morocoima A., Aguilar C.M., Grate T., Lpez M., Lares M., Viettri M. & Ferrer
E., (2015) Genetic variability of Trypanosoma cruzi TcI isolates from rural and urban areas of
Venezuela. J Vector Borne Dis 52: 2329.

Rodrguez-Angulo H. Thomas L.E., Castillo E., Crdenas E., Mogolln F., Mijares A. (2013). Role of
TNF in sickness behavior and allodynia during the acute phase of Chagas disease. Experimental
Parasitology. 134: 422429.

Rodriguez H.O., Guerrero N.A., Fortes A., Santi-Rocca J., Girones N., Fresno M. (2014) Trypanosoma
cruzi strains cause different myocarditis patterns in infected mice. Acta Trop. 139:57-66.

Roellig D.M., Yabsley M.J. (2010) Infectivity, pathogenicity, and virulence of Trypanosoma cruzi
isolates from sylvatic animals and vectors, and domestic dogs from the United States in ICR Strain Mice
and SD Strain Rats. Am J Trop Med Hyg 83: 519522

Roggero E., Perez A., Tamae-Kakazu M., Piazzon I., Nepomnaschy I., Wietzerbin J., Serra E., Revelli S.,
Bottasso O. (2002) Differential susceptibility to acute Trypanosoma cruzi infection in BALB/c and
C57BL/6 mice is not associated with a distinct parasite load but cytokine abnormalities. Clin Exp
Immunol 128:421428.

Rudin C.M., Thompson C.B. (1997). Apoptosis and disease: regulation and clinical relevance of
programmed cell death. Annu Rev Med 48: 267-281.

Saito N., Pulford K.A.F., Breton-Gonus J., Mason D.Y., Cramer E.M. (1991) Ultrastructural localization
of the CD68 macrophage-associated antigen in human blood neutrophils and monocytes. Am J Path 01
139:1053.
 78

Sanoja C., Carbajosa S., Fresno M., Girones N. (2013) Analysis of the Dynamics of Infiltrating CD4+ T
Cell Subsets in the Heart during Experimental Trypanosoma cruzi Infection. PLoS ONE 8(6): e65820.

Schmunis G. A. (2007) "Epidemiology of Chagas disease in non-endemic countries: the role of

international migration". Mem Inst Oswaldo Cruz 102 Suppl 1, 75-85.

Schneider C. A., Rasband W. S. & Eliceiri K. W. (2012) "NIH Image to ImageJ: 25 years of image
analysis". Nature methods 9(7): 671-675.

Sedger L. M., Hou S., Osvath S. R., Glaccum M. B., Peschon J. J., van Rooijen N. and Hyland L. (2002)
Bone marrow B cell apoptosis during in vivo influenza virus infection requires TNF-alpha and
lymphotoxin-alpha. J Immunol 169, 6193-201.

Segovia M., Carrasco H.J., Martnez C.E., Messenger L.A., Nessi A., Londoo J.C., et al. (2013)
Molecular epidemiologic source tracking of orally transmitted Chagas disease, Venezuela. Emerg Infect
Dis. 19: 1098101.

Silva J.S., Morrissey P.J., Grabstein K.H., Mohler K.M., Anderson D., et al. (1992) Interleukin 10 and
interferon gamma regulation of experimental Trypanosoma cruzi infection. J Exp Med 175: 169174.

Smith M.E.F., Costa M.J., Weiss S.W. (1991) Evaluation of CD68 and other histiocytic antigens in
angiomatoid malignant fibrous histiocytoma. Am J Surg Pathol 15:757.

Sousa G.R., Gomes J.A.S., Fares R.C.G., Damasio M.P., Chaves A.T., et al. (2014) Plasma Cytokine
Expression Is Associated with Cardiac Morbidity in Chagas Disease. PLoS ONE 9(3): e87082.

Stijlemans B., Vankrunkelsven A., Brys L., Raes G., Magez S. and De Baetselier P. (2010) Scrutinizing
the mechanisms underlying the induction of anemia of inflammation through GPI-mediated modulation of
macrophage activation in a model of African trypanosomiasis. Microbes Infect 12, 389-99.

Suarez J., de Suarez C., Alarcn de Noya B., Espinosa R., Chiurillo M.A., Villaroel A., De Martin F.,
Paiva M., Daz-Bello Z., Valderrama E., Estrada D., Vivas E. (2010) Enfermedad de Chagas sistmico en
fase aguda por transmisin oral: diagnstico integral de un caso autopsiado. Gac Med 118: 212-222.

Tanowitz H. B., Machado F. S., Jelicks L. A., Shirani J., Campos de Carvalho A., Spray D., Factor S. M.,
Kirchhoff L. V., y Weiss L. (2009) "Perspectives on Trypanosoma cruzi-induced heart disease". Prog
Cardiovasc Dis. 51(6): 524539.
 79

Tarleton R.L. (2007) Immune system recognition of Trypanosoma cruzi. Current Opinion in
Immunology 19: 430434.

Teixeira A. R., Hecht M. M., Guimaro M. C., Sousa A. O. & Nitz N. (2011) Pathogenesis of chagas'
disease: parasite persistence and autoimmunity. Clin Microbiol Rev 24, 592-630.

Telleria J. & Tibayrenc M. (2010) "American Trypanosomiasis Chagas Disease: One Hundred Years of
Research" Elsevier. ISBN: 978-0-12-384876-5.

Toledo M. J. O., Lana M., Carneiro C.M., Bahia M.T., Machado-Coelho G.L.L., Veloso V.M., et al.,
(2002). Impact of Trypanosoma cruzi clonal evolution on its biological properties in mice. Exp.
Parasitol. 100, 161172.

Toledo M. J. O., Bahia M. T., Veloso V. M., Carneiro C. M., Machado-Coelho G. L. L., Alves C. F.,
Martins H. R., Cruz R. E., Tafuri W. L., & Lana M. (2004) Effects of specific treatment on
parasitological and histopathological parameters in mice infected with different Trypanosoma cruzi clonal
genotypes Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 53, 10451053.

Truyens C., Torrico F., Angelo-Barrios A., Lucas R., Heremans H., De Baetselier P., Carlier Y. (1995)
The cachexia associated with Trypanosoma cruzi acute infection in mice is attenuated by anti-TNF-
alpha, but not by anti-IL-6 or anti-IFN-gamma antibodies. Parasite Immunol. 17(11): 561-8.

Van Rees, E. P., Sminia, T., and Dijkstra, C. D. (1996). Structure and Development of the Lymphoid
Organs. In: Pathobiology of the Aging Mouse. ILSI Press. 1: 173187

Vitelli-Avelar D.M., Sathler-Avelar R., Massara R.L., Borges J.D., Lage P.S., et al. (2006) Are increased
frequency of macrophage-like and natural killer (NK) cells, together with high levels of NKT and
CD4+CD25high T cells balancing activated CD8+ T cells, the key to control Chagas disease morbidity?
Clinical & Experimental Immunology. 145: 8192.

Yeo M., Acosta N., Llewellyn M., Sanchez H., Adamson S., Miles G., Lopez E., et al. (2005). Origins of
Chagas disease: Didelphis species are natural hosts of Trypanosoma cruzi I and armadillos hosts of
Trypanosoma cruzi II, including hybrids. Int. J. Parasitol. 35: 225-33

Zhang Y., Kim H.J., Yamamoto S., Kang X., Ma X. (2010) Regulation of interleukin-10 gene expression
in macrophages engulfing apoptotic cells. J Interferon Cytokin Res. 30:11322.
 80

Zingales B., Andrade S. G., Briones M. R., Campbell D. A., Chiari E., Fernandes O., Guhl F., et al.
(2009). A new consensus for Trypanosoma cruzi intraspecific nomenclature: second revision meeting
recommends TcI to TcVI. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 104: 1051-1054.

Zingales B., Miles M. A., Campbell D. A., Tibayrenc M., Macedo A. M., Teixeira M. M., Schijman A. G.,
Llewellyn M. S., Lages-Silva E., Machado C. R., Andrade S. G. and Sturm N. R. (2012) The revised
Trypanosoma cruzi subspecific nomenclature: rationale, epidemiological relevance and research
applications. Infect Genet Evol 12: 240-53.

Zuniga E., Acosta-Rodriguez E., Merino M. C., Montes C. and Gruppi A. (2005) Depletion of immature
B cells during Trypanosoma cruzi infection: involvement of myeloid cells and the cyclooxygenase
pathway. Eur J Immunol 35: 1849-58.
 81

Anexos

Anexo 1. Tratamiento de imgenes para determinacin de nmero de clulas con

Image J. (a) Fotografa en blanco y negro del corte histolgico, (b) Ajuste del umbral de
contraste, (c) Analizador de partculas, bordea y enumera cada clula contabilizada.