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Curso: QUIMICA ORGANICA III

Profesora: Luz Marina Jaramillo G.

AMINOACIDOS y PROTEINAS- Parte B

7. Pptidos y Protenas
Si la amina y los grupos de cido carboxlico funcionales en los aminocidos se
enlazan para formar enlaces amido, resulta una cadena de unidades de amino-
cidos que se denomina pptido. Por convencin, el amino cido con un gru-
po amino libre se dibuja en el extremo izquierdo (el extremo N-terminal) de la
cadena peptdica, y el aminocido con un cido carboxlico libre se dibuja a la
derecha (el extremo C-terminal).

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Crecimiento de un pptido
!
7.1 Anlisis Conformacional y Resonancia
La flexibilidad conformacional de las cadenas de los pptidos se limita principal-
mente a las rotaciones alrededor de los enlaces del carbono alfa y otros tomos.
Esta restriccin se debe a la naturaleza rgida del enlace amido ( peptdico). Co-
mo se muestra en el diagrama abajo, el par de electrones sobre el N se deslocali-
za sobre el grupo carbonilo otorgando cierto carcter de doble enlace entre el car-
bonilo y el nitrgeno. Esta situacin mantiene la unin peptdica relativamente pla-
nar y resistente a cualquier cambio conformacional.

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Los rectngulos sombreados con color en la estructura inferior definen estas regio-
nes, e identifican las rotaciones relativamente fciles que pueden tener lugar en las
esquinas donde se encuentran (es decir, en el carbono alfa). Este aspecto de la es-
tructura del pptido es un factor importante que influye en las conformaciones adop-
tadas por las protenas y pptidos grandes.

7.2 Estructura Primaria de los Pptidos. Nomenclatura


Debido a que el N-terminal de una cadena peptdica es distinto del extremo C-termi-
nal, un pequeo pptido compuesto de aminocidos diferentes puede presentar va-
rios ismeros constitucionales. Por ejemplo, un dipptido a partir de dos amino-ci-
dos diferentes puede tener dos estructuras diferentes. As, el cido asprtico (Asp)
y fenilalanina (Phe) se pueden combinar para hacer Asp-Phe o Phe-Asp.

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El ster metlico del 1er. dipptido (estructura de la derecha) es el edulcorante
artificial aspartame, que es casi 200 veces ms dulce que la Sacarosa. Ninguno
de los aminocidos componentes es dulce (Phe es realmente amargo), y deriva-
dos del otro dipptido (Phe-Asp) no son dulces.

Los pptidos naturales de diversa complejidad son abundantes. El simple y amplia-


mente distribuido tripptido denominado glutationa (primera entrada en la Tabla 4 ),
es interesante, porque la funcin carboxilo de la cadena lateral del cido glutmico
N-terminal se utiliza para el enlace peptdico.

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Un cido glutmico N-terminal tambin puede cerrarse en un anillo de lactama, co-
mo en el caso de TRH (entrada 2, Tabla 4). La abreviatura para esta unidad trans-
formada es pGlu (o PE), donde p significa "pyro" (tales cierres de anillo a menudo
se producen en calentamiento).

Los pptidos ms grandes en la Tabla 4 tambin demuestran la importancia de las


abreviaturas de los aminocidos, ya que una frmula estructural completa para un
nonapptido (o ms grande) resultara muy compleja y difcil de manejar. Las fr-
mulas que utilizan las abreviaturas de una sola letra son de color rojo.

Los diez pptidos alistados en esa tabla hacen uso de los 20 amino cidos comu-
nes.Observe que la unidad C-terminal tiene la forma de una amida en algunos ca-
sos (e.g. TRH, angiotensina y oxitocina ). Cuando dos o mas cistenas estn pre-
sentes en una cadena peptdica ellas est unidas por enlaces disulfuro (e. g. oxi-
tocina Fig. 8 y endotelina); y en el caso de la insulina como ya se dijo.

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Tabla 4. Algunos pptidos naturales comunes

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Tabla 4. Continuacin.

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7.2.1 Nomenclatura
Los nombres de los pptidos reflejan los nombres de los residuos amino cidos
involucrados en los enlaces amido, empezando en el N-terminal. Todos, excepto
el ultimo llevan el sufijo il (ilo) de los grupos acilo. Por ejemplo, el dipptido si-
guiente es nombrado como alanilserina. El residuo alanina tiene el sufijo il debi-
do a que el tiene acilado el N de la serina.

La bradiquinina hormona humana (vasodilatador hipotensivo, Fig. 8 ) se nombra


como sigue: arginil prolil prolil glicil fenilalanil seril prolil fenilalanil arginina este
nombre resulta incmodo y largo de manera que es mejor usar los cdigos
de las tres letras: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg o simplemente las le-
tras: RPPGFSPFR cuyo uso empieza a generalizarse.

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Figura 8. Bradiquinina un nonapptido con un -+NH3 libre en su N-terminal y un
-COO- libre en su C-terminal.

En la Fig. 9 se muestra la estructura de la oxitocina humana, una hormona


peptdica que ocasiona contraccin del msculo suave uterino e induce labor de
parto. Es tambin un nonapptido con dos residuos de cistena (en posiciones 1 y
6) conectando parte de la molcula en un gran anillo. A su vez, en la Fig. 10 se
muestra la estructura de la protena insulina bovina con sus cadena A y B co-
nectadas por puentes disulfuro.

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Figura 9. Estructura 1ria. de la Oxi-
tocina humana

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Figura 10. Estructura de la Insulina Bovina. Dos cadena peptdicas estn unidas
por puentes disulfuro y un tercer enlace disulfuro sostiene la cadena
A en un anillo.

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Los diferentes aminocidos que componen un pptido o protena, y el orden en el
que se unen entre s por enlaces peptdicos se conoce como la estructura prima-
ria. A partir de los ejemplos mostrados anteriormente, debe ser evidente que no es
una tarea trivial determinar la estructura primaria de tales compuestos, incluso los
de tamao modesto. La hidrlisis completa de una protena o pptido, seguido por
anlisis de los amino cidos componentes, establece a groso modo su composi-
cin, pero no proporciona informacin alguna de la secuencia de unin.

La hidrlisis parcial producir una mezcla de pptidos mas cortos y algunos a.a.
Si la estructuras primarias de estos fragmento se conocen, es algunas veces
posible deducir parte o todos estos fragmentos de la estructura original tomando
ventaja de las piezas que se superponen. Por ejemplo si un heptapptido estaba
compuesto de tres glicinas, dos alaninas, una leucina y una valina, podran escri-
birse muchas combinaciones de la estructura 1ria.
Es necesario entonces, realizar un protocolo mas tecnificado que nos permita
descifrar la estructura primaria. En realidad hoy existen instrumentos comerciales
automatizados que permiten deducir la secuencia de los amino cidos en los pp-
tidos y protenas (ver Sec. 8, parte B)

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7.2.2 Anlisis del grupo N-Terminal: Degradacin de Edman
El anlisis del extremo N-terminal se realiza mediante la degradacin de Edman.
Una funcin amino libre, generalmente en equilibrio con especies del ion dipolar, es
necesario para la unin inicial con el reactivo isotiocianato de fenilo. El producto
de la degradacin de Edman es un heterocclico tiohidantona incorporando el
aminocido N-terminal junto con una cadena recortada del pptido.

Las funciones amino sobre una cadena lateral, como en lisina, puede reaccionar
con el reactivo isotiocianato, pero no dan productos tiohidantona.

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Mecanismo:

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El grupo amino terminal adiciona al isotiocianato para dar una tiourea sustituida.
La porcin es mvil conformacionalmente, y el tomo de S puede aproximarse
al grupo carbonilo del amino cido N-terminal.

7.2.3 Determinacin del N- terminal por el Mtodo de Sanger


El mtodo de Sanger para la determinacin del N-terminal es una alternativa me-
nos comn a la degradacin de Edman. En este mtodo el pptido se trata con
el reactivo de Sanger 2,4-dinitrofluorobeneeno y luego se hidroliza por reac-
cin HCl (6M). El amino cido N-terminal se recobra como su derivado 2,4-dini-
trofenilo y se identifica. Ver las etapas en la prxima diapositiva.
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7.2.4 Anlisis del Grupo C-terminal
El anlisis complementario del C-terminal de la cadena peptdica puede hacerse
qumica o enzimticamente.

7.2.4.1 Anlisis qumico

El anlisis qumico es ligeramente mas complejo que el procedimiento de Edman.


Primero, los grupos carboxilo e hidroxilo de la cadena lateral deben ser protegidos
como amidos o steres. A continuacin, el grupo carboxilo C-terminal se activa co-
mo un anhdrido y se hace reaccionar con tiocianato. El acil tiocianto resultante ci-
cla inmediatamente a un anillo de hidantoina y este puede romperse de la cadena
peptdica en varias formas, que no se describirn aqu.

Dependiendo de la naturaleza del rompimiento final, puede modificarse el procedi-


miento para dar un a una hidantoina, incorporando la penltima unidad C-terminal.
Un anlisis repetitivo de esta clase, puede conducirse en forma parecida al procedi-
miento de Edman.

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7.2.4.2 Anlisis enzimtico
El rompimiento enzimtico de los extremos C-terminales se logra con las enzimas
carboxipeptidasas y es un mtodo rpido y conveniente de anlisis.

Debido a que la cadena recortada est tambin sujeta a rompimiento enzimtico,


debe tomarse cuidado en controlar las condiciones de la reaccin para poder mo-
nitorear apropiadamente los productos de los rompimientos sucesivos.

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Por ejemplo un pptido que contenga una secuencia C-terminal Gly-Ser-Leu se
trata con carboxipeptidasa y los a. a. libres se rompen.
La Leu se rompe primero, la Ser de segunda y la Gly es la tercera, como lo de-
muestra el anlisis de la secuencia. Por supuesto, que las unidades 4. y 5.
tambin sern desprendidas a medida que el tiempo pasa, pero no se muestran .

Figura 11. Anlisis enzimtico de a..a. de un pptido


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7. 3 Relaciones Propiedades-Estructuras
Las protenas exhiben un rango amplio de de propiedades fsicas y biolgicas.
comunmente se reconocen dos categoras generales de protenas simples.

Proteinas Fibrosas. Como el nombre lo indica, estas sustancias exhiben es-


tructuras semejantes a las fibras, y sirven como el material estructural principal
en varios tejidos. Correspondiente con tal funcin estructural, ellas son relativa-
mente insolubles en agua y no se ven afectadas por cambios moderados en la
temperatura y el pH. En esta categora se incluyen los susbgrupos:
Colgenos y Elastinas que son las protenas de los tejidos conectivos, tendones
y ligamentos.
Queratinas, son las protenas componentes (en su mayor parte) de la piel, ca-
bello, plumas y tejidos de la crnea.
Fibrina, una protena formada en los cogulos sanguneos.

Proteinas Globulares. Los miembros de esta clase ejercen papeles como regu-
ladores, de mantenimiento y catlisis en organismos vivientes. Ellas incluyen hor-
monas anticuerpos y enzimas. Se disuelven o forman suspensiones coloidales en
agua, tales protenas son generalmente mas sensibles a la temperatura y cam-
bios de pH que sus contrapartes fibrosas.

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7.4 La Estructura Secundaria de Pptidos grandes y Protenas
Las diversas propiedades de los pptidos y proteinas dependen no solamente de
sus amino cidos componentes y la secuencia de union, sino tambien de la
forma como las cadenas peptidcas se estiran, enrollan y se doblan en el espacio.
Debido a su tamao, las opciones de orientacin abiertas a estas molculas
deberan aparecer como infinitas.

Afortunadamente, varios factores actan para estrechar las opciones estructurales.


Es posible identificar estructuras secundarias que aparecen repetidamente en
molculas diferentes. Estos segmentos conformacionales se describen algunas ve-
ces por los ngulos dihedrales y , definidos en el diagrama de la Fig. 12.

Figura 12. Conformacin de los pptidos definida por los ngulos dihedrales

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Los cinco factores que influencian el equilibrio conformacional de las cadenas
peptdicas son:
La planaridad de los enlaces peptdicos. Las conformaciones son definidas por
ngulos dihedrales & .
El enlace de H de grupos carbonilo amidos a donores N-H.
El aglomeramiento estrico de los grupos vecinos..
La repulsion y atraccin de grupos cargados.
El caracter hidroflico e hidrofbico de los grupos sustituyentes.

A. Enrollamiento Helicoidal
El undecapptido mostrado en el diagrama de la Fig. 13a puede adoptar una
conformacin lineal en zig -zag como est dibujado.
Puede representarse tambin con un modelo bolas y varilla (Fig. 13b).
Sin embargo esta molcula prefiere asumir una conformacin helicoidal
(Fig. 13c ).

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Figura 13a. Representacin extendida con palitos de un Undecapptido

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En esta figura se observa el esqueleto de la cadena como una lnea negra en
trazo grueso y los enlaces de H como lneas lneas interrumpidas.

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Por ltimo, la representacin que define la -hlice como una cinta verde a lo
largo de la cadena del pptido (Fig. 13e). Los siete enlaces de H juntos, propor-
cionan una estabilidad aproximada de 30 kcal/mol que ayuda a mantener la confor-
macin.

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En particular, los tomos de oxgeno del grupo carbonilo forman enlaces de H
con los hidrgenos de la amida [(CO)N-H]. Esta tendencia conduce a los patro-
nes ordenados del enlace de H : la -hlice y la hoja plegada. Estos ordena-
mientos , si estn presentes constituyen la estructura secundaria de las pro-
teinas.

Muchas protenas se enrollan sobre una hlice que luce como una hebra sobre
un tornillo derecho con las cadenas posicionadas fuera de la hlice. Por ejem-
plo, la protena fibrosa -queratina ordenada de forma helicoidal y la mayor parte
de las protenas globulares contienes estos segmentos -hlice (Fig. 14).

Figura 14. El ordenamiento -helicoidal. La cadena peptdica se enrolla de tal


forma que cada grupo C=O es enlazado a u n H del N-H sobre la prxima vuelta
de la hlice.
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Los segmentos de los pptidos pueden formar tambin arreglos ordenados de
enlaces de H que se alinean de lado a lado. En este ordenamiento cada grupo
C=O sobre una cadena forma un enlace de H con el hidrogeno del N-H sobre la
cadena adyacente. Este ordenamiento puede de involucrar muchas molculas
peptdicas alineadas lado a lado resultando en una hoja bidimensional
Los ngulos de enlace son tales que la hoja es plegada con las cadenas laterales de
amino cidos arregladas sobre lados alternantes de la hoja. La fibrona de la seda
(protena fibrosa) principal en las sedas de insectos y arcnidos, tiene una estructu-
ra 2ria. de hoja plegada (Ver Fig. 15).

Figura 15. El arreglo plegado.


Cada grupo carbonilo del pp-
tido es enlazdo a un H del N-H
sobre una cadena peptdica ad-
yacente

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7.5 Estructura Terciaria de las Protenas
La mayor parte de las protenas y pptidos grandes no adoptan conformaciones
completamente uniformes y las descripciones completas de sus arreglos tridimen-
sionales preferidos se definen como las estructuras terciarias. As, piense en
la estructura secundaria como un patrn espacial en una regin local de la mo-
lcula. Partes de esa molcula pueden tener la estructura helicoidal, mientras
que las otras partes tienen la estructura plegada, y aun otras partes pueden en-
rollarse al azar. La estructura terciaria incluye toda la estructura secundaria y
todos las vueltas y dobleces entre. La estructura terciaria de una proteina globu-
lar es representada en la Figura 16.

El enrollamiento de una enzima puede dar formas tridimensionales que producen


efectos catalticos importantes. Las cadenas polares hidroflicas (amante del agua)
se orientan hacia afuera del glbulo. Los grupos no-polares hidrofbicos (rechazo
por el agua) se ordenan hacia el interior. El enrollamiento en la conformacin apro-
piada crea un sitio activo de la enzima, la regin que enlaza al sustrato y cataliza
la reaccin. Una reaccin que toma lugar en el sitio activo (interior de la enzima)
puede ocurrir bajo condiciones esencialmente anhidras (no polares) mientras el
sistema est disuelto en agua !

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Figura 16. La estructura terciaria de una protena globular tpica incluye
segmentos de -hlice con segmentos de enrollamiento al azar
en los puntos donde la hlice es doblada.

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7.6 Estructura Cuaternaria. Se refiere a la asociacin de dos o mas cadenas
peptdicas en la protena completa. No todas las protenas tienen estructura cua-
ternaria, las que la tienen son aquellas que se asocian en su forma activa. Por
ejemplo: la hemoglobina (transportadora del oxgeno en la sangre de los mamfe-
ros), consiste de cuatro cadenas de pptidos ajustadas para formar una pro-
tena globular.

Resumiendo: la estructura primaria es la estructura enlazada covalentemen-


te, incluyendo la secuencia de los aminocidos componentes y cualquier puente
disulfuro. La estructura secundaria se refiere a las reas de una -hlice,
una hoja plegada o enrollamiento al azar. La estructura terciaria se refiere a
a conformacin global de la molcula. La estructura cuaternaria se refiere a
la asociacin de dos o mas cadenas peptdicas en la protena activa (Fig. 17).

En la Fig. 18 se muestra la apariencia de la Tropomiosina una protena fibro-


sa envuelta en la regulacin de la relajacin del msculo. Est presente en to-
das las formas de msculos estriados y suaves.

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Figura 17. Comparacin esquemtica de los niveles de la estructura de una protena.

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Figura 18. Modelo de bolas y varillas de la
estructura de Tropomiosina (con animacin).
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En esta direccin electrnica encontrar la estructura de dos o tres protenas
en varias presentaciones.

http://www2.chemistry.msu.edu/faculty/reusch/VirtTxtJml/protstr1.htm#11pep

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7.7 Sntesis de Pptidos y Protenas
La sntesis de pptidos requiere la formacin de enlaces amido entre los propios
amino cidos. Evidentemente este enlace no se formar por la mezcla simple
de acidos carboxilicos con aminas 1rias. y 2rias porque lo primero que se forma-
ra es una sal. Por lo cual se requiere convertir el acido a un derivado activado
(tal como un haluro de acido o anhidrido) y luego aadir la amina.

enlace amidico

La formacin del enlace amido no es fcil con los amino cidos sin embargo.
Cada a.a. tiene un grupo amino y otro carboxilo. Si se activa el carboxilo,
reaccionar con su propio amino. Si mezclamos amino cidos y se adicionan
reactivos para acoplarlos, ellos formarn cada secuencia concebible. Tambin los
a. a. tienen cadenas laterales que pueden interferir con la formacin de los en-
laces peptdicos deseados. Por lo tanto, la sntesis siempre involucra tanto reactivos
activantes para formar los enlaces peptdicos correctos y grupos protectores para
bloquear la formacin de enlaces incorrectos.
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Se han desarrollado muchos procedimientos para sinterizar pptidos, cayendo en
dos grupos principales. El mtodo clsico en solucin involucra la adicin de
reactivos a soluciones de cadenas peptdicas en crecimiento y purificacin de los
productos cuando sea requerido.

El mtodo en fase slida involucra la adicin de reactivos para cadenas peptidi-


cas en crecimiento enlazadas a partculas de un polmero solido. Este mtodo tiene
la ventaja de que los reactivos remanentes e impurezas son fcilmente lavados de
las partculas polimricas sosteniendo el pptido.

7.7.1 Sntesis de Pptidos en Fase de Solucin

Considrese la estructura de Ala-Val-Phe, un tripptido simple:

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Se empieza con el N-terminal y finaliza en C-terminal, o de izquierda a derecha
como se dibuj el pptido. Lo primero es acoplar el grupo carboxilo de la ala-
nina al grupo amino de la valina.

Por lo tanto debe protegerse el grupo amino de la alanina y hacerlo no-nucleofilico.


Se usa para ello cloroformiato de bencilo (o cloruro de benciloxicarbonilo). Se for-
ma un uretano, o ster de carbamato, el cual es fcilmente removido al final de la
sntesis.
Etapa preliminar: proteccin del grupo amino

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Etapa 1: Activacin del grupo carboxilo con cloroformiato de etilo.

Etapa 2: Formacin del enlace amido (peptdico) para acoplar el nuevo a.a. :

Algunos procedimientos usan


un ster del nuevo amino cido
para evitar reacciones de com
petencia con el grupo carboxilico.

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En este punto , se tiene el dipeptido Z-Ala-Val N-protegido. La fenilalanina puede
adicionarse al para completar el tripptido Ala-Val-Phe. La activacin del grupo
carboxilo de Val, seguido por adicin de fenilalanina (Phe), da el tri-pptido prote-
gido.

Etapa 1 Otra vez se activa el grupo carboxilo con clororformiato de etilo:

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Etapa 2 Se forma un enlace amido para acoplar al a. a. siguiente (fenilalanina):

tripptido

Para hacer un pptido mas grande, repita estas dos etapas para la adicin de
cada residuo de a. a. :

1. Activacin del C-terminal del pptido en crecimiento por la reaccin con


cloroformiato de etilo.
2. Acople al amino cido siguiente

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La etapa final en la sntesis en fase lquida es la desproteccin del N-terminal
del pptido completo. El enlace amido N-terminal debe romperse sin afectar
cualquiera de los otros enlaces peptdicos en el producto. Afortunadamente, el
grupo protector benciloxicarbonilo es parcialmente una amida y parcialmente un
ester benclico, y la hidrogenlisis de esteres benclicos toma lugar bajo condicio-
nes suaves que no rompen los enlaces peptdicos. Esta es la razn para el uso
del grupo benciloxicarbonilo (lo opuesto a otro grupo acilo) para proteger el
N-terminal.

Etapa final : remocin del grupo protector

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El mtodo en fase liquida trabaja bien para pptidos pequeos , y muchos se han
preparado con este proceso. No obstante, se requiere un gran numero de reac-
ciones qumicas y etapas de purificacin. Aunque los rendimientos individuales son
excelentes, con un pptido grande, el rendimiento global se reduce hasta ser
intil y se requerira varios meses y hasta aos para completar todas las etapas.
Por lo tanto, los pptidos grandes y las protenas se obtienen a travs de la sn-
tesis en fase slida.

7.7.2 Sntesis de Pptidos en Fase Slida

En 1962, Robert Bruce Merrifield de Rockefeller University desarroll un mtodo


para sintetizar pptidos sin tener que purificar los intermediarios. El hizo esto per-
mitiendo que las cadenas de pptidos en crecimiento estuviesen unidas a cuentas
de poliestireno. Despus de que cada amino cido se adiciona, el exceso de reacti-
vos se lava enjuagando las cuentas con disolvente. Este ingenioso mtodo dio ori-
gen a la automatizacin, y Merrifield construy una mquina que puede adicionar
unidades de a. a. sin que alguien est pendiente.

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Usando esta mquina Merrifield sintetiz la ribonucleasa (124 amino cidos ) en
seis semanas con un rendimiento global de 17%. El trabajo de Merrifield con la
sntesis en fase slida le vali el Premio Nobel en 1984.

Las reacciones individuales: Debe considerarse tres reacciones importantes


antes de usar la sntesis de pptidos en fase slida de Merrifield (SPFSM):

a) Cmo se une un a. a. al soporte slido.


b) Cmo y por qu el grupo amino se protege.
c) Cmo se forman los enlaces del pptido.

La Union del Pptido al Soporte Slido. La mayor diferencia entre la SPFSM


y el mtodo en solucin, es que la primera se hace en la direccin opuesta: es de-
cir que se empieza con el C-terminal yendo hacia el N-terminal, de derecha
a izquierda como suele escribirse el pptido. Entonces la primera etapa es enlazar
el ultimo a.a. (por el C-terminal) al soporte slido.

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El soporte slido es un poliestireno especial en el cual los anillos aromticos
tienen grupos clorometilos. A este polmero se le ha denominado la resina
de Merrifield, se hace por copolimerizacin de estireno con un porcentaje de
p-(clorometil)estireno.

Unin del amino cido C-terminal

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Observe que el polmero representa como la parte alcohlica de un grupo protector
ster para el extremo carboxilo del amino cido C-terminal. La cadena peptdica se
construye sobre este amino acido enlazado al polmero.

El grupo protector del N en el procedimiento de Merrifield es el grupo t-butiloxicar-


bonilo, abreviado BOC o t-BOC. EL BOC es semejante al grupo Z (que se us en el-
mtodo en solucin), pero tiene un grupo terc-butilo en lugar del bencilo. El protec-
tor BOC se remueve fcilmente bajo condiciones acidas.

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La remocin de este grupo protector es bastante fcil por accin del acido tri-
fluoroactico (TFA) como se observa a continuacin:

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En general se consiguen amino cidos comerciales ya protegidos con el BOC.

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7.7.3. N,Ndiciclohexilcarbodiimida (DCC) como un agente acoplador de
Pptidos
La reaccin final requerida para el procedimiento de Merrifield es la condensacin
que forma el enlace peptdico (o amido). As, cuando una mezcla de una amina
y un cido carboxilico se trata con el reactivo N,Ndiciclohexilcarbodiimida (DCC),
la amina y el cido (en sus formas carboxilato e ion amonio) se acoplan para
formar una amida como se muestra enseguida:

La prdida de una molcula de agua en esta condensacin, convierte la DCC a


N,N-diciclohexil urea (DCU). La DCC acta entonces como un deshidratante.

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Mecanismo General: Activacin del grupo
carboxilo con DCC

condensacin

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Ejemplo de Sntesis en Fase Solida: Ala-Val-Phe

El primer a. a. de la secuencia (Phe) protegido con BOC y conectado a la matriz


polmrica (pasos no mostrados) se desprotege con TFA quedando el a. a. final lis-
to para seguir la secuencia del tripptido.

El segundo amino acido (valina) se adiciona en su forma protegida N-BOC as que


no puede acoplarse consigo mismo. La adicin de DCC acopla el grupo carbo-
xilo de la valina con el grupo amino (-NH2) libre de la fenilalalina (Phe).

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Para acoplar el amino cido final (Ala), la cadena (Boc-Val-Phe- P) se desprotege
por tratamiento con el cido trifluoro actico (TFA). Entonces, se adicionan el l-
timo amino cido Ala N-BOC protegido y la DCC.

Etapa 1: Desproteccin

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Etapa 2: Acoplamiento

Una vez que el pptido se ha completado, el grupo protector BOC se remueve


y el pptido se separa del Polmero, el HF rompe la unin ester que enlaza el
pptido al polmero (P) basado en el copolmero de poliestireno y tambin remue-
ve el BOC.

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8. Determinacin de Estructura de los Pptidos
La insulina es una protena relativamente simple, pero es una estructura org-
nica complicada. Cmo ha de ser posible determinar la estructura de una pro-
tena con cientos de residuos de a. a. y un PM de muchos miles? Los qumi-
cos han desarrollado los caminos inteligentes para det)erminar la secuencia
exacta de los a.a.s en una protena. Se considerarn algunos de los mtodos
mas comunes.

8.1 Rompimiento de Enlaces Disulfuro (-S-S-)

El primer paso en la determinacin de la estructura de protenas es romper,


todos los enlaces disulfuro y separar las cadenas peptdicas individuales. Es-
tas cadenas son entonces, purificadas y analizadas por separado.

As, los puentes de la cistina se rompen fcilmente reducindolos a grupos tioles


(-SH de cistena). Estos residuos de cistena tienen una tendencia a reoxidarse
y re-formar el enlace -S-S-, sin embargo. Un rompimiento mas permanente in-
volucra la oxidacin de las uniones disulfuro a grupos de cidos sulfnicos (-SO3H).
Las unidades de cistena oxidadas se denomina residuos del acido cisteico.

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Figura 19. Oxidacin de las uniones disulfuro de una protena con cido peroxifr-
mico rompiendo todas las uniones disulfuro y convirtiendo los residuos de cistina
cido cisteico.
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8.2 Determinacin de la composicin de los amino cidos en la protena
Una vez que los puentes disulfuro se han roto y las cadenas individuales de pp-
tidos se han separado y purificado, la estructura de cada cadena puede determi-
narse. La primera etapa es determinar cules amino cidos estn presentes y en
que proporciones. Para ello, la cadena peptdica se hidroliza completamente
hirvindola durante 24 h en HCl (6M). La mezcla resultante de los a. a.s (el
hidrolizado) se coloca sobre la columna de un Analizador de Amino cidos
(AAA Fig. 18).

Los amino cidos presentes en la muestra se identifican comparando los tiempos


de retencin (rt) con los valores conocidos. El rea bajo cada pico es aproxima-
damente proporcional a la cantidad de a. a. que produce el pico, as que puede
determinarse las cantidades relativas de los a. a. presentes.

La Fig. 19 muestra una traza estndar de una mezcla equimolar de amino cidos,
seguida por las trazas producidas del hidrolizado de una muestra de bradiquinina
humana (Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg).

Luz Marina Jaramillo Gmez


Figura 20. Analizador de amino cidos (AAA): el hidrolizado pasa a travs
de una columna de intercambio inico. La solucin que emerge de la columna se
trata con ninhidrina y su absorbancia se registra como funcin del tiempo. Cada
a. a. es identificado por el tiempo de retencin (tr) a travs de la columna .

Luz Marina Jaramillo Gmez


Figura 21. Determinacin de la bradiquinina humana con el AAA (los picos
para Pro, Arg y Phe son mas grandes que aquellos de la mezcla estndar equi-
molar debido a que la bradiquinina tiene tres residuos de Pro, dos de Arg y
dos de Phe en su composicin.
Luz Marina Jaramillo Gmez
8.3 Secuenciacin de los Pptidos: Anlisis de los residuos terminales

El AAA determina los a. a.s presentes en un pptido, pero no revela su secuen-


cia: es decir el orden en el cual ellos estn enlazados o conectados. La secuen-
cia se pierde al hidrolizar la protena o el pptido.

Para saber la secuencia de los a. a. se deber retirar (o romper) un a. a. de la ca-


dena y dejar el resto de la cadena intacta. El a. a. separado ser identificado y
otra vez se repite el procedimiento en la cadena restante. El a. a. que se va a
separar puede romperse por el N-terminal o el C-terminal. A este proceso
se le denomina anlisis de los residuos terminales. (ver: Secs. 7.2.2 y 7.2.3
Parte A)

Se recuerda: La degradacin de Edman que es el mtodo de secuenciacin de


aminocidos en un pptido, donde el residuo amino terminal se etiqueta (marca) y
se separa del pptido sin afectar a los enlaces peptdicos entre los otros residuos.

Luz Marina Jaramillo Gmez

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