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2003
RESUMEN ABSTRACT
se utiliza microestacas como explante, as co- in vitro regeneration, since the multiplication rate,
mo el tiempo para que ocurrieran los eventos when using microcuttings as explants, as well as
morfogenticos, fueron diferentes para los ma- the timing for the morphogenetic events to occur,
teriales de las 3 procedencias, lo que indica que were different for each of the 3 sources of material,
las plantas de cada localidad son genticamen- suggesting that plants from each location have a
te diferentes. different genetic background.
nudos, sin sntomas ni lesiones causadas por plagas agitacin constante por 2 horas, despus los te-
y enfermedades en 4 localidades de Costa Rica: jidos se colocaron por 1 minuto en etanol al
Puriscal de San Jos, en adelante Puriscal-2, La 70%, y luego en hipoclorito de sodio (NaOCl)
Cruz de Guanacaste, en adelante Guanacaste, Sara- al 2,5% por 25 minutos. Finalmente, los ex-
piqu de Heredia, en adelante Sarapiqu y Golfito plantes fueron lavados 3 veces con agua desio-
de Puntarenas, en adelante Golfito (Figura 1). Las nizada estril.
muestras fueron envueltas en toallas de papel h- Cuando la contaminacin por hongos fue
medo y transportadas al Laboratorio de Biotecno- muy fuerte, particularmente con el uso de hojas co-
loga de Plantas del Centro de Investigaciones mo fuente de explante, se adicion al medio de cul-
Agronmicas de la Universidad de Costa Rica, tivo el fungicida Imazalil en dosis de 0,5 mg l-1.
donde se realiz ste trabajo. Tambin se incluy
plantas procedentes de Puriscal, que se han mante- Medio de Cultivo. El medio de cultivo utiliza-
nido in vitro por 4 aos, en adelante Puriscal-1. do fue el de Murashige y Skoog, (MS, 1962),
NICARAGUA
MAR
2 CARIBE
OCANO
PACFICO
4 PANAM
Fig. 1. Ubicacin geogrfica de los sitios de colecta P. acuminata en Costa Rica. 1-La Cruz, Guanacaste; 2-Sarapiqu,
Heredia; 3-Puriscal, San Jos; y 4-Golfito, Puntarenas.
A B
Fig. 2. Entrenudos de P. acuminata en la etapa de establecimiento. Recin inoculados (A) y con una semana de cultivo (B).
A B C
Fig. 3. Entrenudo de P. acuminata con 8 semanas de cultivo (A), entrenudo con 16 semanas (B). C = callo.
12 AGRONOMA COSTARRICENSE
localidad de Guanacaste tambin se observ, ade- contaban con un tamao uniforme, color verde
ms de los callos en los extremos, la formacin de y un crecimiento activo, tambin ya se poda
pequeos callos a lo largo del entrenudo; sin em- apreciar el inicio de la formacin de brotes. Es-
bargo, stos ltimos no regeneraron plntulas. tas caractersticas se mantuvieron hasta las 4
semanas, donde adems de un aumento en el ta-
Multiplicacin mao de los brotes se observ una mayor pro-
duccin (Figura 5).
Las microestacas generaron gran cantidad A las 6 semanas, las microestacas ya
de brotes a partir de las yemas axilares y de la re- mostraban diferencias entre las procedencias,
gin del tallo en contacto con el medio de culti- respecto al nmero y desarrollo de los brotes.
vo (datos no mostrados). Por su parte, las hojas Las microestacas de Puriscal-1, fueron las que
respondieron con un arrollamiento, cambio de mostraron el mayor nmero de brotes por mi-
color y la formacin de brotes sobre las venas croestaca (Figura 6). En estos explantes fue di-
media y secundarias (Figura 4). Los brotes for- fcil determinar el origen de los brotes entre la
mados sobre las venas media y secundarias de las seccin del tallo en contacto con el medio de
hojas se originaron mediante organognesis y cultivo y el nudo, ya que el potencial de brota-
embriognesis (Lara et al. 2003). cin del nudo es sumamente alto, lo que hace
que la epidermis del mismo se abra para dar pa-
so a la emergencia de una gran cantidad de bro-
tes (Figura 5). Por su parte los brotes produci-
dos por Puriscal-2, son pocos en comparacin
con Puriscal-1 y en varios casos las microesta-
cas no brotaron. Los brotes producidos por los
explantes provenientes de Golfito presentaron
poco desarrollo, hojas delgadas y con una ten-
dencia al enrrollamiento. Las microestacas de
Guanacaste, produjeron brotes principalmente
en las yemas axilares. A partir de la semana 8 y
hasta la semana 12 aument la produccin de
brotes para todas las localidades (Figura 6).
El anlisis de variancia del nmero pro-
medio de brotes por microestaca segn su proce-
Fig. 4. Hoja de P. acuminata, proveniente de Puriscal, a dencia mostr diferencias significativas
las 12 semanas de cultivo con arrollamiento y (P0,001). Puriscal-1 fue el material ms prolfi-
brotacin en la vena media.
co, seguido por Puriscal-2, Golfito y Guanacaste
Debido a la contaminacin con una bac- (Figura 6). El nmero de brotes por microestaca
teria endgena, los explantes provenientes de aument conforme transcurri el tiempo de culti-
Sarapiqu, que sobrevivieron en la fase de esta- vo para los explantes de todas las procedencias
blecimiento, murieron gradualmente durante la (Figura 6).
etapa de multiplicacin, por lo que las evalua- El cuadro 1 muestra los resultados de mul-
ciones subsiguientes se realizaron nicamente tiplicacin a partir de microestacas a las 12 sema-
con los materiales procedentes de Guanacaste, nas de cultivo. El anlisis estadstico indic dife-
Golfito y Puriscal. rencias (P0,01, F= 42,80) en el promedio de
brotes por explante segn la procedencia. Al rea-
Multiplicacin a partir de microestacas. El lizar la comparacin entre las medias, se observ
proceso de multiplicacin se evalu cada 2 se- que entre Puriscal-2 y Golfito no hay diferencia
manas por un perodo de 12 semanas de cultivo. para esta variable. Cuando se analiz el nmero
La primera evaluacin se realiz a las 2 semanas de explantes brotados no se encontr diferencias
de cultivo. En este momento, las microestacas (P>0,05) entre las procedencias.
LARA et al.: Micropropagacin de Psychotria acuminata 13
Fig. 5. Proceso de multiplicacin de Psychotria acuminata (Puriscal-1) desde la semana 2 hasta la 12. En cada semana, la
fotografa de la izquierda presenta la multiplicacin a partir de hojas y la de la derecha la multiplicacin a partir de
microestacas.
18
16
Puriscal-1
14
Puriscal-2
12
Nmero de brotes
por microestaca
Golfito
10 Guanacaste
8
0
2 4 6 8 10 12
Semanas
Fig. 6. Nmero de brotes promedio ( error estndar) por microestaca segn su procedencia en P. acuminata.
14 AGRONOMA COSTARRICENSE
Cuadro 1. Porcentaje de brotacin y promedio de brotes por ni entre las hojas de cada procedencia, por lo que
microestaca de Psychotria acuminata, a las 12 se- en algunas hojas el proceso morfogentico hacia
manas de cultivo segn la localidad.
la formacin de brotes fue ms rpido y evidente
Procedencia # Expl. % Br./ que en otras.
Explant. Brot.1 Brotac. Expl.2 A las 12 semanas, todas las hojas de Puris-
cal-1 y un 89% de las de Puriscal-2 haban inicia-
Puriscal-1 148 138 93 17 0,18a
do un proceso de brotacin. Ms an, algunos de
Puriscal-2 139 129 93 14 0,16b
los brotes ya haban completado su desarrollo has-
Golfito 88 88 100 12 0,15b
ta la formacin de plntulas. En Golfito y Guana-
Guanacaste 113 95 84 6 0,10c
caste el nmero de hojas que inici el proceso de
Total 488 450 92 12,25
brotacin, aument a un 56% y un 67%, respecti-
1 Expl. Brot. = explantes que brotaron. vamente. La figura 7 muestra el nmero de brotes
2 Los valores representan los promedios E.E. del nmero de por explante a las 10 y 12 semanas de cultivo. Los
brotes por microestaca para cada procedencia. Letras dife- explantes de Puriscal-1 mostraron una mayor bro-
rentes en cada columna indican diferencias significativas a
P 0,001, segn la prueba de Tukey.
tacin que los de las otras localidades.
El cuadro 2 muestra los resultados de la
Multiplicacin a partir de hojas. A las 2 semanas brotacin de las hojas, segn la procedencia a las
de cultivo las hojas presentaron una coloracin 12 semanas de cultivo. El anlisis estadstico de
verde-amarillenta con algunas pequeas regiones los datos mostr diferencias a P0,01 (F= 64,99)
color caf (Figura 5). Dos semanas ms tarde, en
las hojas de Puriscal-1, se observ algunas protu- Cuadro 2. Porcentaje de brotacin y promedio de brotes por
berancias en las venas media y secundarias. En la hoja de Psychotria acuminata, a las 12 semanas
semana 6, Puriscal-2 tambin mostr el crecimien- de cultivo segn su procedencia.
to de protuberancias sobre las venas media y se-
cundarias. En las hojas de las otras procedencias, Procedencia # Expl. % Br./
Explant. Brot.1 Brotac. Expl.2
las protuberancias muestran un crecimiento dife-
rencial. En la semana 8 hubo un mayor crecimien- Puriscal-1 23 23 100 40 1,67a
to de las protuberancias tanto en Puriscal-1 como Puriscal-2 9 8 89 12 0,60b
en Puriscal-2; las protuberancias en las hojas de Golfito 23 13 56 4 2,90b
Golfito fueron menores en nmero y en tamao. Guanacaste 24 16 67 10 4,54b
En la semana 10 se observ que un 91,3% de Total 58 60 78 16,5
las hojas de Puriscal-1 (Figura 5), un 78% de las de
Puriscal-2, un 43,5% de las de Golfito y un 62,5%
1
Expl. Brot. = explantes que brotaron.
2
Los valores representan los promedios E.E. del nmero de
de las de Guanacaste se encontraban en el proce- brotes por hoja para cada procedencia. Letras diferentes en
so de brotacin. Cabe aclarar que la brotacin no cada columna indican diferencias significativas a
fue sincronizada entre las diferentes procedencias P 0,001, segn la prueba de Tukey.
50
40
Puriscal-1
Nmero de brotes
por explante
30 Puriscal-2
Golfito
20
Guanacaste
10
0
10 12
Semanas
Fig. 7. Promedio de brotes a partir de hojas segn su procedencia en P. acuminata. Las barras indican el error estndar.
LARA et al.: Micropropagacin de Psychotria acuminata 15
en el nmero promedio de brotes por hoja; sin em- en un 100%. El crecimiento de las races se em-
bargo, la prueba de separacin de medias incluy pez a observar luego de una semana en el medio
a Puriscal-2, Golfito y Guanacaste en un solo gru- de enraizamiento. A las 8 semanas las races fue-
po y a Puriscal-1 en otro. No se detect diferencias ron abundantes, de aspecto largo y fibroso (Figu-
(P>0,05) en el nmero de hojas brotadas. ra 8 A y B)
Despus de las 12 semanas no se observ
ningn incremento en el nmero de hojas brota- Aclimatizacin
das, bsicamente todas las hojas con brotes, sin
importar la procedencia, siguieron el mismo pa- Ocho semanas despus del transplante
trn morfogentico (datos no mostrados). al invernadero, se observ que el tratamiento
A las 12 semanas de cultivo, en ambos ti- con Agriroot 1 DP indujo un nuevo sistema
pos de explante (Cuadros 1 y 2), los explantes que radical fibroso y abundante, con races cuya
proceden de Puriscal mostraron la mayor produc- longitud promedio fue de 1,5 cm. Con la utili-
cin de brotes, especialmente los de Puriscal-1. El zacin de Rootone-F el crecimiento de races
promedio de brotacin de las 3 procedencias fue nuevas fue pobre; el AIA indujo la formacin
de 92% para microestacas con un promedio de de algunas races, las cuales fueron poco
12,25 brotes por microestaca. Para las hojas el abundantes. Cuando las plntulas fueron trata-
promedio de brotacin fue de 78% con 16,5 bro- das con Rootone-F o Agriroot 1 DP y sem-
tes por hoja. A pesar de esto, en la figura 5 se bradas en un suelo fertilizado con fsforo, el
puede observar que la diferencia de tamao entre tratamiento con Rootone-F propici algn
los brotes provenientes de las hojas y los de las enraizamiento, mientras que con Agriroot 1
microestacas es muy marcada en la semana 12. DP no hubo diferencia entre las plntulas con
Mientras que los brotes de las microestacas pue- y sin fertilizacin fosforada. Una vez que se
den ser subcultivados separadamente a las 12 se- elimin el plstico que cubra las bandejas y la
manas, los brotes de las hojas estn an en una humedad relativa fue menor, se observ que en
etapa incipiente de crecimiento. el tratamiento con Agriroot 1 DP las plntu-
las sobrevivieron en un 80% y con el AIA un
Enraizamiento 30%, comparado con 0% obtenido en los otros
tratamientos. La figura 9 muestra el aspecto
Las plntulas de P. acuminata en el medio del sistema radical de las plntulas en cada tra-
MS/2 suplementado con 6 mg l-1 de AIA enraizaron tamiento a las 8 semanas.
A B
Fig. 8. Enraizamiento de plntulas de P. acuminata con 4 semanas (A) y 12 semanas (B) de cultivo en un medio MS/2 con
6 mg l-1 de AIA.
16 AGRONOMA COSTARRICENSE
condiciones in vitro, el medio nutritivo resulta Desde luego que tambin podra indicar que Pu-
ideal para su proliferacin. An as, los tejidos riscal, en general, es otro genotipo, el cual ade-
que sobrevivieron fueron suficientes para ini- ms tiene la caracterstica de contar con una ma-
ciar la multiplicacin de esta especie, en algu- yor capacidad de multiplicacin. La introduccin
nas especies la respuesta de un nico explante de Puriscal-1 permiti evaluar cmo perodos
ha dado paso a la obtencin de cientos de plan- prolongados in vitro podran afectar el potencial
tas (comunicacin personal con investigadores de multiplicacin de algunos explantes o espe-
en palma aceitera). cies, al comparar su respuesta con el material de
Con el medio de cultivo utilizado, los en- la misma localidad (Puriscal-2), suponiendo que
trenudos produjeron callos en los extremos, posi- son genticamente idnticos. Las diferencias en
blemente inducidos a partir del cambium vascu- el promedio de brotes por microestaca segn la
lar. Como se indic, los brotes que se formaron procedencia (Cuadro 1) tambin fueron refleja-
provenan de la seccin entre el callo y el corte das en el inicio de la brotacin, el cual fue ms
en el entrenudo, por lo que pareciera que el ori- temprano en Puriscal-1 (material que ha perma-
gen de los mismos es directo. De hecho, no se necido por ms tiempo en cultivo in vitro) y tar-
observ diferencias morfolgicas que indicaran do en los otros materiales de reciente introduc-
la presencia de algn tipo de variacin somaclo- cin, particularmente Guanacaste.
nal (George y Sherrington 1984). Durante la micropropagacin de esta es-
pecie con el uso de microestacas, se observ
Multiplicacin que algunos de los brotes producidos por las
microestacas tambin entraron en un proceso de
En la fase de multiplicacin, los resulta- multiplicacin. Cabe aclarar que para efectos de
dos muestran que tanto las microestacas como las esta investigacin, los brotes producidos de esta
hojas son un material del cual es posible micro- forma no se contabilizaron como parte de los
propagar clonal y masivamente P. acuminata. brotes producidos por microestaca, dado que es-
ta caracterstica solo se present en algunas mi-
Multiplicacin a partir de microestacas. Con croestacas y solo en Puriscal-1, lo cual podra ser
el crecimiento y desarrollo de los brotes obteni- efecto de su larga permanencia en cultivo in
dos a partir de los entrenudos, se inici la fase de vitro. Tambin, las microestacas presentaron dis-
multiplicacin, utilizando las microestacas como tinto potencial morfogentico dependiendo de su
material de propagacin. Las microestacas culti- ubicacin a lo largo del tallo, desde su parte api-
vadas en el mismo medio de cultivo que se utili- cal hasta la seccin basal. Estudios paralelos (da-
z para el establecimiento, iniciaron un proceso tos no mostrados) con el uso de microestacas de
de produccin de brotes en 2 puntos principal- Puriscal-1, mostraron que las microestacas de la
mente, los nudos y la seccin del tallo en contac- parte apical y media poseen un mayor potencial
to con el medio de cultivo. El potencial de pro- morfogentico que las de la parte basal; resulta-
duccin de brotes vari con la procedencia de los do concordante con otros estudios en diferentes
materiales, esto podra indicar que genticamen- plantas (Litz y Jarret 1991), aunque en la mayo-
te son materiales diferentes. En trminos genera- ra de estos otros casos se refiere a la toma de los
les, Puriscal-1 fue el material ms prolfico, se- explantes cuando se va a introducir el material de
guido de Puriscal-2, Guanacaste y Golfito. Con campo a condiciones in vitro (De Fossard 1986,
respecto a Puriscal-1 es interesante notar que su George 1993) y no cuando se toma de plantas ya
potencial de multiplicacin fue mayor que el de establecidas in vitro.
los dems materiales, esto podra ser un indicati-
vo de que la permanencia in vitro ha mejorado su Multiplicacin a partir de hojas. Durante la eta-
capacidad de reproduccin, al inducir en los teji- pa de establecimiento, la posibilidad de utilizar
dos un estado de juvenilidad, tal y como se ha ob- hojas como explante para la micropropagacin de
servado en uva (R. Litz, comunicacin personal). esta especie, fue prcticamente descartada, luego
18 AGRONOMA COSTARRICENSE
de los problemas observados durante la desinfec- somticos, aunque la cantidad de los mismos
cin de las mismas; sin embargo, tal y como ya tiende a disminuir (datos no mostrados). Esta
se mencion, otras rubiaceas, como el caf, han caracterstica de mantener un tejido producien-
sido micropropagadas exitosamente a partir de do embrioides en forma casi constante represen-
hojas (Sondahl y Loh 1988). Con Puriscal-1, se ta una ventaja, particularmente en una especie
observ que cuando hojas de las vitroplantas de cuya poblacin, en general, es muy baja pero
P. acuminata entraron en contacto con el medio sus posibilidades de uso, una vez domesticada,
de cultivo, se inici un proceso morfogentico, son muy altas.
principalmente sobre las venas media y secunda- Sumarizando el proceso de multiplicacin
rias y en menor grado en la lmina; inclusive mu- de Psychotria acuminata, la figura 5 muestra las
chas hojas todava unidas al tallo producen bro- vas morfogenticas por las cuales se puede au-
tes cuando entran en contacto con el medio de mentar la poblacin de esta especie. A partir de
cultivo. Esta observacin fue lo que motiv el es- plntulas creciendo in vitro, fue posible regenerar
tudio del uso de hojas de plntulas creciendo in brotes adventicios y embriones somticos en
vitro para la micropropagacin de P. acuminata. gran cantidad, los cuales aparecen en forma no
El proceso de brotacin en las hojas fue sincronizada y cuya produccin a partir del teji-
ms evidente a partir de las 10 semanas, momen- do madre se puede mantener por perodos supe-
to en que se inici el conteo de los brotes. La fi- riores a 1 ao. En este trabajo se evidenci el
gura 7 muestra la capacidad de las plantas de dis- efecto positivo que tiene la permanencia de teji-
tintas localidades para reproducirse a partir de dos de sta especie en cultivo in vitro, as como
hojas. Este resultado confirma que hojas de plan- un posible efecto del genotipo en la capacidad de
tas que han estado in vitro, por perodos prolon- regeneracin de los explantes.
gados, presentan un mayor potencial morfogen-
tico (Puriscal-1). Sin embargo, la brotacin a par- Enraizamiento
tir de hojas no est influenciada por la proceden-
cia ya que entre Puriscal-2, Guanacaste y Golfito Con respecto al enraizamiento, se encon-
no hubo diferencias significativas; contrario a lo tr que en P. acuminata, dependiendo de la va de
que se observ en el caso de la micropropagacin multiplicacin, es necesaria una fase de enraiza-
por microestacas (Cuadro 1), donde si hay un miento. En el medio de cultivo seleccionado los
efecto de la procedencia sobre la brotacin. brotes enraizaron en un 100% y a las 8 semanas
La regeneracin de brotes a partir de ho- el sistema radical pareca adecuado para llevar
jas ocurri por 2 vas, organognesis y embrio- las plntulas a la fase de aclimatizacin. Durante
gnesis somtica, el proceso dominante fue la el enraizamiento no se observ ningn efecto del
embriognesis somtica (Lara et al. 2003). Co- genotipo, los brotes de todas las localidades en-
mo el proceso de regeneracin ocurri en forma raizaron a la misma velocidad y la apariencia de
directa, se espera que tanto las plntulas produ- las races fue la misma.
cidas por organognesis como las producidas
por embriognesis somtica, sean genticamen- Aclimatizacin
te estables (Wawrosh y Koop 1999, Wilhelm
1999, Neumann 1999, von Arnold et al. 2002). La aclimatizacin de esta especie no fue
Estos resultados crean nuevas expectativas no fcil. En condiciones de penumbra y alta hume-
solo acerca de la multiplicacin de sta especie, dad relativa (simulacin del sotobosque), las
sino tambin sobre otros posibles usos de sta plntulas se mantienen vivas; sin embargo, cuan-
caracterstica. do la humedad relativa disminuye (remocin del
Luego de la ltima evaluacin de las ho- plstico), el 100% de las plntulas inicia un pro-
jas a las 12 semanas, stas se mantuvieron en ob- ceso de muerte descendente. El sistema radical de
servacin, se encontr que an despus de 1 ao las plntulas producido in vitro, no es funcional y
las hojas se encuentran produciendo embriones muere prcticamente desde el momento en que se
LARA et al.: Micropropagacin de Psychotria acuminata 19
inicia la aclimatizacin. Esto hizo necesario el GAO S.L, ZHU D.N, CAI Z.H, JIANG Y., XU D.R. 1999.
uso de enraizadores en la etapa de aclimatizacin. Organ culture of a precious Chinese medicinal plant
Fritillaria unibracteata. Plant Cell, Tissue and Or-
En general las plntulas que tenan una apariencia gan Culture 59(3): 197-201.
ms saludable, tambin tenan un mejor sistema
radical. Esta caracterstica fue evidente en el tra- GEORGE E.F. 1993. Plant propagation by tissue culture. The
tamiento con Agriroot 1 DP. Una vez que se ini- technology. Exegetics Ltd, 2nd Ed., England. 574 p.
ci la disminucin de la humedad relativa, tam-
GEORGE E.F., SHERINGTON P.D. 1984. Plant propagation
bin se observ que la mayor sobrevivencia de las by tissue culture. Eastern Press; Great Britain. 709 p.
plntulas (80%) fue en ese mismo tratamiento.
Porcentajes de sobrevivencia similares a los del GLINSKI J.A., DAVID E., WARREN T.C., HANSEN G.,
presente trabajo han sido reportados por Hidalgo LEONARD S.F., PITNER P., PAV S., ARVIGO R.,
et al. (1999). En el tratamiento con AIA el porcen- BALICK M.J., PANTI E., GROB P.M. 1995. Inacti-
vation of cell surface receptors by pheophorbide a,
taje de sobrevivencia fue de 30% y en el resto de a green pigment isolated from Psychotria acuminata.
los tratamientos las plntulas no sobrevivieron. Photochemistry and Photobiology 62 (4): 144 -150.
Los resultados obtenidos acerca de la no
funcionalidad de las races producidas in vitro y HIDALGO N., GMEZ L., SABORIO F. 1999. Regeneracin
la necesidad de enraizar los brotes de Psychotria de brotes a partir de hojas de Psychotria acuminata.
In: XI Congreso Nacional Agronmico y de Recursos
acuminata durante la fase de aclimatizacin, lle- Naturales. Vol II (ed) Floria Bertsch, Jaime Garcia,
va a concluir que en trminos prcticos, la fase de German Rivera, Fernando Mojica y Walter Badilla.
enraizamiento in vitro no es necesaria. EUNED y Colegio de Ingenieros Agrnomos. San Jo-
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