Quinto Parcial

Biotecnologa

La ingeniera gentica puede definirse como un conjunto de

tcnicas, nacidas de la biologa molecular que permiten manipular el
genoma de un ser vivo.

ADN recombinante

ADN recombinante es una molcula que proviene de la unin artificial

de dos fragmentos de ADN. La tecnologa de ADN recombinante es el
conjunto de tcnicas que permiten aislar un gen de un organismo,
para su posterior manipulacin e insercin en otro diferente. De esta
manera podemos hacer que un organismo (animal, vegetal, bacteria,
hongo) o un virus produzca una protena que le sea totalmente
extraa.

Este proceso se realiza a travs de las enzimas de restriccin las

cuales son capaces de cortar el ADN en puntos concretos. Las
enzimas de restriccin y los vectores moleculares, se coordinan para
aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e insertarla en el
ADN de otro.

Enzimas de restriccin

Las enzimas de restriccin son

producidas por bacterias como
mtodo de defensa contra virus y
degradan el ADN extrao. Cada
enzima de restriccin reconoce
una secuencia especfica de
nucletidos y corta en ese punto
cada una de las cadenas de ADN
(secuencias palindrmicas).

Las secuencias reconocidas son

repeticiones invertidas, las
regiones donde cortan el ADN se
llaman palindrmicas. Los
extremos libres que quedan se
llaman extremos pegajosos,
porque pueden unirse a otros
fragmentos de ADN que hayan sido cortados por la misma enzima de
restriccin.

Las 2 molculas de ADN se difieren con la misma endonucleasa de

restriccin, la enzima corta y produce extremos complementarios que
se aparean. La ligasa une las hebras de ADN y se forma el ADN.

Electroforesis

Consiste en la separacin de los

fragmentos obtenidos con endonucleasas
de restriccin. Para su visualizacin estos
fragmentos se tien con bromuro de
etidio y se fotografan.

Vectores

Son pequeas molculas de ADN, que tienen capacidad para

autorreplicarse dentro de las clulas hospederas. Se utilizan con
frecuencia tres tipos de vectores de clonacin:
Plsmidos
Bacteriofagos
Cosmidos

Caractersticas de los vectores de transferencia

Poseen sitios de corte o de restriccin para insertar el gen.

Poseen un marcador para distinguir la clula transformada.
Poseen replicacin independiente para transmitir o multiplicar
el gen.
Se recuperan fcilmente de la clula husped utilizando la
misma enzima de restriccin usada en la insercin.

Transferencia del Gen

Primero se inserta un fragmento de ADN humano en un vector

(en este caso un fago)
El ADN recombinante resultante se introduce en una clula
husped (en este caso la E. Coli)
El fago se replica dentro de la bacteria y produce nuevos fagos
con el ADN recombinante (ADN del fago y ADN humano)
Plsmidos

Los plsmidos son pequeas

molculas ADN bacteriano
circular que se replican
independientemente dentro
de la bacteria algunos son
capaces de pasar de una
clula a otra. Estos llevan
consigo genes que confieren

particularidades fenotpicas a las bacterias que los

contienen, como la resistencia a los antibiticos.
Poseen tres zonas de inters:

Origen de replicacin.
Gen de resistencia a antibiticos
(ampicilina)
Donde se inserta el ADN a clonar.

Los plsmidos son ms fcil de manipular que los fagos, los plsmidos
y el ADN son tratados con endonucleasa de restriccin, se unen con
una ligasa, se coloca el plsmido recombinado en una clula husped
y se reproduce la bacteria y el plsmido.

Bacterifagos

Los bacterifagos son

unos virus que infectan a
las bacterias. Algunos de
ellos (Lambda y M13) se
han adaptado a las
exigencias de los bilogos
moleculares que han
modificado
oportunamente sus
genomas. Los
bacterifagos pueden
tener efectos lticos o
lisognicos en las
bacterias. Los
bacterifagos transbordan
segmentos hasta de 15kb,
tienen un sitio de
restriccin para insercin
del ADN, infectan cultivos
de E.coli. Cada fago forma
una calva nica y se aisla
cada ADN recombinante.
Cosmidos

Los csmicos son unos vectores hbridos entre un plsmido, que

proporciona la resistencia a los antibiticos, y una regin del ADN de
un bacterifago llamada cos que le otorga sus particulares
caractersticas. Transporta ADN de unas 45 kb.
Cromosomas artificiales de levaduras

Son llamados YAC (yeast artificial chromosome) y poseen:

Origen de replicacin
Gen de resistencia a ampicilina
Origen de replicacin en levaduras
Centrmero
Marcador
Telmeros
Clonacin de ADN recombinado

Un clon es un grupo de clulas u organismos genticamente

idnticas. Para tener gran cantidad y fcil disponibilidad del ADN de
inters, el vector se inserta dentro de bacterias (E. coli), las cuales
crecen fcil y rpidamente. O sea, la bacteria se utiliza como
multiplicadora del vector, y por ende del inserto de inters.

Hibridacin Molecular

Es una tcnica que permite la formacin de una cadena

complementaria de ADN-ARN, esto se logra con cambios de
temperatura, ya que al elevar la temperatura se desnaturaliza el ADN
(separan las cadena) y al bajar la temperatura se vuelve a aparear
con una cadena complementaria. Algunas se aparean con ARN
(hibridacin).

ADNc (copiado/complementario)

El ADNc es copiado a partir de ARNm y

es obtenido con una transcriptasa
inversa (enzima de retrovirus). Este
ADN es complementario al ARN, este
ADN se clona y es til para entender la
estructura y funcin de los genes. El
ADN c es extrado por medio de
retrotranscripcin del ARNm, su
producto es ADN sin intrones y se
pueden hacer copias o bibliotecas.

Ejemplo de aplicacin de estas

tcnicas

Produccin de insulina humana

 Produccin de hormona de crecimiento humana (antes se
obtena de cadveres)
Vacunas (hepatitis B)
Organismos genticamente modificados (GMO)
Transgnicos o cisgnicos

PCR

El PCR es el mtodo ms rpido para aislar y clonar cidos nucleicos,

se basa en una reaccin en cadena de la polimerasa y adems de ello
es un termociclador. Sus reactivos son:

Taq polimerasa (polimerasa termorresistente)

dNTPs (desoxirribonucletidos tri-fosfatados)
Primers (cebadores) para iniciar sntesis de DNA.

Secuenciacin de ADN

El objetivo de la secuenciacin de ADN es determinar el orden lineal

de las bases en el ADN. En el Mtodo de Sanger se utilizan
dideoxinucletidos y se separan fragmetos por electroforesis.

Genomas

Se han secuenciado varios genomas (el humano se secuencio en el

2003), esto nos permite saber el nmero de genes, en que momento
y en que tejidos se expresan, etc. Del 1-2% del genoma humano
codifica protenas normalmente y la secuencia de bases entre un
individuo y otro solamente difiere en un 0.3% aproximadamente,
estas variaciones son SNPs o polimorfismos de un nico nucletido.
La secuenciacin del genoma nos es de gran utilidad para
enfermedades como el cncer de colon y mama, la diabetes y el
alzheimer.

Microarreglos o chip de ADN

Este permite monitorear simultneamente la expresin de miles de

genes (25000), utiliza sondas de ADN (gen individual), se hibrida con
ADNc y presenta patrones de expresin de genes.
ADN Recombinante
 Inmunologa

Parasito: organismo que vive sobre el cuerpo de otros o dentro

de l causando dao a su husped.
Patgeno: organismo capaz de causar enfermedad.

Sistema Inmune

El sistema inmune es una repuesta global y coordinada ante una

molcula extraa. El sistema inmune es capaz de distinguir entre
molculas propias y molculas extraas.

Antgeno: molcula capaz de desencadenar una repuesta

inmune.
Anticuerpo: molcula dirigida contra un antgeno.

Todos los organismos poseen mecanismos de defensa frente a la

invasin de agentes patgenos, estos mecanismos pueden ser de dos
clases:

Inespecficos: impiden la entrada de patgenos o los destruyen

con rapidez.
Especficos: provocan lo
que se denomina una
respuesta inmunitaria.

Mecanismos de Defensa
Inespecficos

Barreras naturales
(barreras primarias): son
las constituidas por la
piel, las secreciones de
las superficies mucosas,
el pH cido, secreciones
lisozimicas (moco,
lgrimas, semen, etc)

Microflora normal del

organismo (barreras
primarias): son las que
actan por competencia
o liberando inhibidores al
medio.
 Respuesta celular inespecfica (barrera secundaria): esta
barrera se activa por alguna lesin liberando interferones,
histamina, serotonina, etc. Los cuales desencadenan una
reaccin de inflamacin.

Sistema del Complemento

Consta aproximadamente de 20 protenas solubles la mayora

sintetizadas en el hgado circulando por la sangre y fluido EC. Existen
dos vas de activacin del complemento: la va clsica y la va
alternativa, la finalidad del sistema complemento es producir la lisis
celular.Este sistema ayuda
a los anticuerpos en la lucha
contra la infeccin, pueden
actuar sobre diferentes
agentes patgenos
(inespecficos). El sistema
de complemento acta de
dos formas distintas:

Unindose a los
agentes patgenos y
provocando su
ingestin por
macrfagos.

Destruyendo
directamente a las
clulas infecciosas al
perforar poros en su
membrana plasmtica
y causar su lisis. Su finalidad es producir lisis celular.
rganos de la Inmunidad

Tejido Linfoide Primario

Timo
Mdula Osea

Tejido Linfoide Secundario

Amgdalas
Ganglios Linfticos
Bazo
Placas de Peyer

Componentes del Sistema Inmune

Existen dos tipos de repuestas inmunitarias o de inmunidad

especfica:
 Repuesta humoral: (inmunidad mediada por anticuerpos) En
este caso, los linfocitos (B) producen sustancias especficas
(anticuerpos) que provocan la destruccin del agente invasor.
Repuesta celular: (inmunidad mediada por clulas) En este
caso, los linfocitos (T) atacan directamente al agente patgeno.

Antgenos

Son de naturaleza qumica muy variada (Protenas, polisacridos,

lipoprotenas, etc) y de gran peso molecular. Son exgenos, esto
quiere decir que son extraos al organismo y son inmunolgicos lo
que significa que son capaces de inducir la formacin de anticuerpos
en el hospedador.

Mecanismos de la Inmunidad Celular

Despus de ser fagocitado, el antgeno es cortado en pequeos

fragmentos. Estos pptidos son unidos al MHC (complejo mayor de
histocompatibilidad) que los transporta a la superficie celular.

La combinacin de antgeno-protena atrae a clulas T y promueve su

actividad y diferenciacinl.

Linfocitos CD8: (citotxicos o asesinos) liberan sustancias txicas,

matando a la clula infectada.

Linfocitos CD4: (colaboradores) liberan linfocinas y activan

macrfagos, a los CD8, linfocitos B y aumentan la inflamacin.
Linfocitos de memoria: quedan para actuar en futuras infecciones.
Inmunidad Humoral

Acta en funcin de:

Anticuerpos
Inmunoglobulinas (IG A, IG G, IG E, IG D, IG M)
Sistema del Complemento

Respuesta Mediada por Anticuerpos

La inmunidad humoral presenta una respuesta mediada por

anticuerpos la cual implica la produccin de inmunoglobulinas
(anticuerpos), las cuales se unen al antgeno y evitan que entre a las
clulas, o lo marcan para ser destruida (ingerida por fagotitos o por el
sistema complemento). Las Ig son sintetizadas por Linfocitos B, y
estn compuestas por regiones constantes y regiones variables (FAB).

La recombinacin de genes permite sintetizar diferentes anticuerpos.

Los anticuerpos poseen una regin constante y una variable.
Fases de la respuesta inmunolgica

1. Reconocimiento: se reconoce el antgeno por linfocitos

especficos.
2. Activacin: con proliferacin y diferenciacin hacia clulas
efectoras.
3. Fase efectora: en esta se consigue la eliminacin del
antgeno.
4. Fase de declinacin: la ausencia del antgeno y la muerte
(por apotosis) de las clulas que fueron activadas hace que
desaparezcan los vestigios de la actividad especfica previa.
5. Fase de memoria
Repuesta Inmunitaria

Es una respuesta especfica frente a un antgeno, esta se debe a una

cadena de procesos regulados o controlados por mecanismos
moleculares y genticos.La inmunidad es el estado de resistencia de
un individuo frente a la infeccin, se dice que un organismo es
inmune a determinado antgeno cuando es capaz de destruirlo o
desactivarlo sin sufrir ninguna patologa.

Inmunidad natural
Es la que se adquiere sin ser
provocada, y puede ser:
Activa: es la que se
obtiene al contraer y
superar una enfermedad,
puede conservarse
muchos aos e incluso
toda la vida.
Pasiva: se adquiere de
forma natural durante el
desarrollo embrionario.

Inmunidad artificial
Es la obtenida de forma intencional y puede ser:

Activa: se consigue mediante vacunacin.

Pasiva: se adquiere por la administracin de sueroterapia.
Envejecimiento
Existen mltiples teoras que tratan de explicar los fenmenos que se
observan en el envejecimiento celular o senescencia. Las ms
importantes son:

Teora gentica
Teora de los radicales libres
Teora del acortamiento de los telmeros
Teora del error catastrfico

Teora Gentica

Cada especia est determinada genticamente para cierta cantidad

de tiempo, en el humano se estima como mximo 120 aos de edad,
aunque muy pocas perosnas alcanza ensta edad.

Teora de los Radicales Libres

Los radicales libres son tomos o molculas altamente reactivas, que

tienen tendencia a producir oxidaciones por contener un electrn no
apareado. El oxigeno molecular, ocasiona mltiples oxidaciones, que
paulatinamente van deteriorando las funciones celulares,
especialmente mitocondriales y provocando mutaciones en el ADN.

Teora del acortamiento de telmeros

Los telomeros son estructuras que protegen los extremos de los

cromosomas. En cada replicacin del ADN, una pequea porcin del
telmero se queda sin replicar, por lo que en cada divisin celular se
pierde un fragmento, hasta casi desaparecer, ocasionando que se
pierda la capacidad de dividirse y otras funciones celulares se
deterioren.

Teora del error catastrfico

Ya sea debido a los radicales libres, a mutaciones o a otros agentes,

en la clula se van produciendo lesiones que indiquen a trastornar su
funcionamiento. No existe mucha evidencia que respalde esta teora.

Muerte Celular Programada Apoptosis

Es el mecanismo fisiolgico normal de muerte celular, desempea un

papel importante en la maduracin y recambio de tejidos.

Durante el proceso de desarrollo del feto, se eliminan clulas

producidas en exceso y estructuras transitorias (formacin de dedos,
eliminacin de cola). En tejidos adultos la apoptosis es til para el
recambio celular y la eliminacin de clulas potencialmente
peligrosas (ya sea por lesiones en el ADN, o porque estn infectadas).

Es importante hacer la diferenciacin entre apoptosis y necrosis,

siendo sus conceptos:
Apoptosis: es una serie de procesos que conducen al
desmantelamiento del contenido celular, esta termina en fagocitosis.

Necrosis: ocurre despus del dao celular, la clula daada se hincha

y se rompe liberando su contenido al espacio extracelular.

Procesos de la Apoptosis

1. Condensacin del ADN

2. Disminucin del volumen citoplasmtico
3. Fragmentacin del ncleo y organelos
4. Fragmentacin del ADN por ADNasas.
5. Desmantelamiento de la clula en cuerpos apoptticos.
6. Fagocitosis por macrfagos.

Cncer
Carcinogenesis

El cncer est considerado como una afeccin donde existen

alteraciones en el banco de informacin gentica de la clula, el ADN.
La falla en el control de la expresin genmica lleva a un trastorno en
los procesos normales de multiplicacin, crecimiento y diferenciacin
celular, ello hace que una sola clula alterada pueda ser fundadora de
un clon tumoral.

Los genes y el Cncer

Las sustancias qumicas, la radiacin, los virus y la herencia

contribuyen al desarrollo del cncer activando cambios en los genes
de una clula. Las sustancias qumicas y la radiacin actan daando
los genes, los virus introducen sus propios genes dentro de las clulas
y la herencia transmite alteraciones en los genes que hacen que la
persona sea ms susceptible al cncer.Con modificaciones mnimas
en la secuencia de bases del ADN se puede desorganizar el ciclo
biolgico normal de la clula, como para que se inicie un clon
tumoral.

El cncer es una enfermedad gentica compleja que incluye

alteraciones en los genes involucrados en la proliferacin, apoptosis,
reparacin del ADN y envejecimiento celular. Por medio del cncer se
aaden nuevas mutaciones que alteran otras funciones celulares y
otorgan nuevos atributos biolgicos como:

Invasin
Angiognesis
Motilidad celular
Prdida de la adhesividad celular
Prdida de la proteccin inmunolgica
Metstasis

Las mutaciones son cambios permanentes en el ADN y pueden ser

congnitas o adquiridas. Las congnitas pueden ser hereditarias o
inducidas por factores mutagnicos durante el desarrollo embrionario,
las adquiridas son producidas por diversos factores ambientales,
destacando los agentes qumicos, fsicos y biolgicos.
Un ejemplo de mutacin es el cncer de vejiga se origina por el
reemplazo de guanina por timina. Otro ejemplo sucede en la
Leucemia Mieloide Crnica, donde se da el intercambio entre los
cromosomas 9 y 22 que produce el cromosoma Phyladfelfia.

Proliferacin celular incontrolada

Los tumores se
producen por una
proliferacin
celular
incontrolada en
donde el
equilibrio entre
divisin celular y
diferenciacin
celular se rompe.

Las clulas
cancerosas se
han inmortales
por mecanismos
que mantienen la
longitud de los
telmeros. Producen Telomerasa, permitiendo divisiones celulares
incotroladas. La proliferacipon celular en el cncer es independiente
de anclaje e insensible a la densidad
de poblacin, no se autolimita,
puede crecer en diferentes zonas del
cuerpo y posee incapacidad de sufrir
muerte celular programada. El
crecimiento de los vasos sanguneos
est controlado por el equilibrio
entre activadores e inhibidores de la
angiognesis (formacin de vasos
sanguneos). La diseminacin del
cncer por invasin y metstasis es
un proceso multietapas coplejo. Los
cambios en la adhesin celular, en la
movilidad y en la produccin de
proteasas permiten que las clulas
cancerosas invadan los tejidos y los
vasos circundantes.

El cncer surge a travs de un proceso multietapa que implica la

iniciacin, promocin y progresin de un tumor. Los tumores pueden
ser benignos: cuando crecen en un rea delimitada y locazada, estos
rara vez son peligrosos, o malignos: cuando es capaz de invadir los
tejidos circundantes, entrar en el torrente circulatorio y diseminarse
hacia partes distantes del cuerpo.

Tipos de Tumores
 Carcinomas: origen epitelial.
Adenomas: se originan de glndulas.
Sarcomas: originados del tejido conectivo o msculo. (origen
mesenquimatico)
Leucemia y linfomas: clulas hematopoyticas y sistema
inmune.

Carcinognesis (etapas de desarrollo de un tumor)

Iniciacin: alteracin gentica

que provoca la proliferacin
anormal de una nica clula.
Progresin: mutaciones
adicionales que confieren
ventajas selectivas.
Metstasis: invasin de la lmina
basal y propagacin a travs de
los tejidos.

El sistema inmune puede inhibir el

desarrollo de matstasis

La capacidad del sistema inmune para

reconocer clulas como extraas o
anormales depende de la presencia de
protenas de la superficie celular
denominadas molculas del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC).

Oncogenes

Los oncogenes son genes

implicados en el desarrollo del
cncer. Estos son genes cuya
presencia o sobreactividad, o
ambas, pueden estimular el
desarrollo del cncer. Cuando
aparecen oncogenes en las
clulas normales, ellos pueden
contribuir al desarrollo del
cncer dando instrucciones a
las clulas que produzcan
proteinas que estimulen la
divisin y el crecimiento
excesivos de las clulas.Los
genes que con su activacin
parecen comandar la carcionognesis se denominan oncogenes, los
oncogenes codifican protenas que estimulan la proliferacin celular
excesiva y/o promueven la supervivencia celular.

Proto-oncogenes

Los ongenes estn relacionados con los genes normales llamados

proto-oncogenes, los cuales codifican los componentes del
mecanismo de control de crecimiento normal de la clula.

Clasificacin de los Proto-oncogenes

Los proto-oncogenes pueden ser:

Factores de Crecimiento
Receptores para factores de crecimiento
Pptidos de sealizacin intracelular
Protenas nucleares

Mecanismos para convertir protoncogenes en oncogenes

1. Mutaciones puntuales: el mecanismos ms sencillo para

convertir un protoncogen en un oncogn es una mutacin
puntual, es decir, la sustitucin de un nico nucletido en el
ADN que causa la sustitucin de un nico aminocido en la
protena codificada por el protoncogen normal.
2. Amplificacin gnica: el segundo mecanismo para crear
oncogenes utiliza la amplificacin de los genes para aumentar
el nmero de copias de un protoncogen.
3. Traslocacin cromosmica: durante la traslocacin
cromosmica, una porcin de un cromosoma se quita
fsicamente y se liga a otro cromosoma. Un ejemplo clsico es
el que sucede en el linfoma de Burkitt, un tipo de cncer
asociado con el virus de Epstein Barr.
4. Reordenaciones locales del ADN: otro mecanismo para crear
oncogenes implica reordenaciones locales en donde las
secuencias de bases de los protoncongenes se alteran por
 deleciones, inserciones, inversiones(eliminacin de una
secuencia seguida de una reinsercin en la direccin opuesta).

PROTO-ONCOGENES Y EL CRECIMIENTO NORMAL DE LAS CLULAS

Los proto-oncogenes
forman parte de la carga
gentica de las clulas
normales y codifican
protenas, muchas de las
cuales se comportan
como factores de
crecimiento, es decir que
activan la va de
transmisin de seales
intercelulares que
determinan un estado
mitognico. Los protoncogenes codifican protenas cuya actividad en
la clula normal favorece los procesos de duplicacin del ADN.

Genes supresores de
tumores

Los genes que producen

la sntesis de productos
que frenan el crecimiento
y la multiplicacin celular
son denominados
supresores de tumores.
Estos detienen el ciclo
celular en un estadio
determinado, ejercen un
neto efecto
antiproliferativo y
favorecen la
diferenciacin de la clula.

P53

Un gen supresor de
tumor codifica
particularmente una
protena conocida como
P53 la cual puede
provocar el suicidio de
las clulas (apoptosis).
En clulas que han
 sufrido dao en su ADN, la
protena p53 acta como
un freno que detiene el
crecimiento y la divisin
de las clulas. Si no se
puede reparar el dao, la
protena p53, con el
tiempo, iniciar el proceso
de suicidio celular,
previniendo as el
crecimiento descontrolado
de las clulas
genticamente daadas.

Las clulas normales pueden expresar el gen p53, que desempea un

papel en la regulacin del crecimiento y desarrollo celular, aunque la
mutacin, la sobreexpresin o la delecin de este gen determina la
disfuncin del gen normal al impedir su asociacin para formar un
complejo regulatorio del ADN.

Ciertos casos de canceres familiares pueden ser vinculados con

mutaciones hereditarias en el gen p 53. La incidencia de mutaciones
del gen p53 en distintos tipos tumorales es variable, desde 0 en
cncer de tiroides, 20 a 40% en cncer de mama a mayor de 70% en
cncer de pulmn de pequeas clulas.

Aunque en un primer
momento el p53 fue
considerado un encogen,
recientes observaciones
indican que el gen que
codifica la fosfoprotena
nuclear p20 en su forma
nativa, es un gen su
supresor de tumores.
Cuando presenta algn
tipo de aberracin puede
comportarse como un
verdadero oncogn, de hecho la prdida de un alelo o la mutacin
puntual del ge p53, son la alteracin gentica que se encuentra con
mayor frecuencia en el cncer de pulmn, mama, colon y ovario entre
otros.
Para que la clula desarrolle un fenotipo tumoral, debe producirse
algunas de las siguientes situaciones:
Exceso de concentracin intracelular de una protena
oncognica causado por una superproduccin como
consecuencia de una desregulacin de los sistemas de control.
Exceso de actividad de la oncoprotena, debido a mutaciones
que impiden la inactivacin de la molcula por sus inhibidotes
naturales.

Gentica y Cncer

Se estima que en el 15% de

todos los cnceres existe un
factor de riesgo mediado por
la herencia. Este riesgo es
variable segn el tipo de
cncer, por ejemplo:

5% del cncer de
ovario.
5-10% en el cncer de
mama.
25% para el carcinoma
medular del tiroides
40y50% para el retinoblastoma.