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ANLISIS DE ALIMENTOS
PRCTICA # 3
ANLISIS BROMATOLGICO BSICO
ANLISIS DE PROTENAS
DETERMINACIN DE NITRGENO EN PROTENAS
POR EL MTODO DE KJELDAHL

INTRODUCCIN

El problema que representa proporcionar protenas adecuadas a la

poblacin del mundo es un tanto secundario en el problema general de
alimentacin mundial. Adems de su significado nutritivo las protenas juegan
un papel importante en las propiedades organolpticas de los alimentos. Las
protenas ejercen una influencia controladora en la textura de los alimentos
provenientes de fuentes animales. El contenido protico del trigo y su harina
es considerado como uno de los mejores indicadores de la calidad de la
panificacin. El anlisis para la determinacin de protenas, a pesar de no
estar incluido generalmente como factor de clasificacin en los estndares de
granos se acepta como un factor comercial.
Las protenas existen en los alimentos en combinacin fsica o qumica
con carbohidratos o lpidos. Las glucoprotenas y las lipoprotenas afectan las
propiedades reolgicas de las soluciones alimenticias o poseen aplicaciones
tcnicas como emulsificantes comestibles. El "envejecimiento" de la carne est
relacionado con cambios qumicos en las protenas. Las protenas naturales
puras poseen poco sabor. Durante el proceso de calentamiento (ebullicin,
panificacin, asado) las cadenas laterales de aminocidos se degradan o
interactan con otros componentes de los alimentos (ejemplo, la lisina con los
azcares reductores) para conferir sabores tpicos. El calentamiento excesivo
puede, por otro lado, reducir el valor nutritivo.
El analista de alimentos comnmente desea saber el contenido protico
total de los alimentos, aunque dicho contenido est conformado por una mezcla
compleja de protenas. Actualmente todos los mtodos para determinar el
contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica. El
aislamiento y pesado directo de la protena proporcionara un mtodo absoluto,
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sin embargo, dicho mtodo es llevado a cabo slo a veces en investigaciones

bioqumicas pero es completamente imprctico para el anlisis de alimentos.
En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el proceso
bsico del conocido mtodo actual de anlisis de protenas por el mtodo
Kjeldahl, ms propiamente, para analizar nitrgeno orgnico. En esta tcnica
se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos en
una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno
orgnico total es convertido en sulfato de amonio. La mezcla digerida se
neutraliza con una base y se destila posteriormente en una solucin de cido
brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl estandarizado, lo
cual se convierte en el nitrgeno de la muestra. El resultado del anlisis
representa el contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno
tambin proviene de componentes no proticos. Este mtodo ha sufrido varias
modificaciones. As, Kjeldahl us originalmente permanganato de potasio para
llevar a cabo el proceso de oxidacin, sin embargo, los resultados no fueron
satisfactorios, de manera que este reactivo se descart. En 1885 Wilforth
encontr que se poda acelerar la digestin con cido sulfrico aadiendo
algunos catalizadores. Gunning en 1889 sugiri la adicin de sulfato de potasio
para elevar el punto de ebullicin de la mezcla de la digestin para acortar la
reaccin. Por lo tanto, el procedimiento de esta tcnica es ms correctamente
conocido como Mtodo Kjeldahl-Wilforth-Gunning.

FUENTES DE ERROR
Constituyen fuentes de error en este mtodo son: la inclusin de
nitrgeno no protico como parte de la protena; la prdida de nitrgeno
durante la digestin, la digestin incompleta de la muestra.
Las proporciones excesivas de sulfato de sodio o potasio que se
aaden al cido (para elevar el punto de ebullicin) pueden resultar en una
descomposicin por calor y la consecuente prdida de amonaco.
Generalmente se recomiendan temperaturas de digestin de 370-410C.
Tambin puede ocurrir prdida de nitrgeno si se utiliza demasiado
selenio o la temperatura de la digestin no se controla cuidadosamente; las
condiciones son an ms crticas que con el cobre o el mercurio cuando se
usan como catalizadores.
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ESTRATEGIA
En la prctica comercial se tienen que analizar un gran nmero de
muestras diariamente, as que se utilizan estrategias que ahorran tiempo de
anlisis. En el anlisis del harina de trigo se digiere 1 gramo de muestra
usando una cantidad conocida de cido sulfrico 0.1253N, y titulando
(mediante una bureta de lectura invertida) con hidrxido de sodio 0.1253N, as
se hace posible reportar el porcentaje de protena directamente de la lectura de
la bureta.

REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN

catalizadores
(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2
protena calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH 3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H3BO3 (cido brico) NH4 + H2BO3- (in borato)

TITULACIN

El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con

HCl estandarizado:

(4) H2BO3- + H+ H3BO3

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OBJETIVOS

El estudiante conocer el fundamento del anlisis de protenas por el

mtodo de Kjeldahl.
El estudiante se familiarizar con los equipos y el procedimiento del
anlisis de protenas por el mtodo de Kjeldahl y la recuperacin de amonaco.
El estudiante aprender a realizar los clculos pertinentes para la
determinacin de nitrgeno en protenas.

MATERIAL
1 matraz de digestin Kjeldahl con capacidad de 125 ml.
1 matraz de Erlenmeyer de 10 ml.
1 matraz volumtrico de 100 ml.
1 mechero de Bunsen.
2 pinzas (nueces).
1 soporte universal
1 pipeta de 5 ml.
1 pipeta de 10 ml.
1 frasco gotero de 25 ml.
1 frasco lmbar con capacidad de 1 litro.
1 piseta grande con agua destilada.
1 microbureta.
3 cuerpos de ebullicin.
1 par de guantes de asbesto.
1 pinzas largas.
1 embudo de cristal chico o mediano.

EQUIPO
Aparato digestor Kjeldahl (1 para todo el grupo).
1 aparato destilador micro Kjeldahl (1 por equipo).

REACTIVOS

Verde de bromocresol al 0.1% diluido en alcohol al 95%.

Rojo de metilo al 0.1% diluido en alcohol al 95%.
cido brico al 2%.
cido clorhdrico 0.01N (solucin valorada).
Hidrxido de sodio al 30%.
cido sulfrico concentrado.
Mezcla catalizadora para la digestin: 2.5 g de dixido de selenio + 100 g de
sulfato de potasio + 20 g de sulfato de cobre pentahidratado (proporcionada por
la coordinacin de laboratorios).
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MTODO

ELABORACION DE REACTIVOS

1.- Mezcla Indicadora.- Prepare por separado los indicadores verde de

bromocresol al 0.1% y el rojo de metilo al 0.1% diluidos en alcohol al 95%.
Mezcle 10 ml. de verde de bromocresol con 2 ml. de la solucin de rojo de
metilo en un frasco gotero.

2.- cido Brico al 2%.- Disuelva 10 g de cido brico (en cristales) en 500 ml.
de agua destilada hirviendo. Despus de que se enfre transfiera la solucin a
un frasco tapado. Se conserva indefinidamente.

3.- cido Clorhdrico 0.01N.- Prepare un litro y valrela con una solucin de
NaOH de la misma normalidad.

4.- Hidrxido de Sodio al 30%.- Disuelva 150g de perlas de hidrxido de sodio

en 350 ml. de agua destilada. Almacene la solucin en un frasco mbar con
tapn de vidrio.

5.- H2SO4 concentrado.

6.- Catalizadores para la Digestin.- Mezcle 2.5g de dixido de selenio (SeO 2),
100g de sulfato de potasio (K2SO4) y 20 g de sulfato de cobre pentahidratado
(CuSO4 . 5H2O).

PROCEDIMIENTO

DIGESTIN

1.- Pese exactamente 0.15g de harina de trigo en un matraz de micro-Kjeldahl

cuidando que la muestra no se adhiera a las pardes o al cuello del matraz.
2.- Aada 2.5 ml. de H2SO4, dos perlas de ebullicin y aproximadamente 1.0 g
de mezcla catalizadora.
3.- Someta a digestin la muestra en el aparato de microKjeldahl bajo una
campana de extraccin, con el matraz ligeramente inclinado usando baja
temperatura al inicio y aumentando el calor a medida que procede la digestin,
rotando los matraces de vez en cuando para asegurarse de que se digiera toda
la muestra. La digestin terminar cuando el color de la muestra sea azl-
verde claro. El proceso tomar aproximadamente 90 minutos.
4.- Enfre el matraz durante unos 4 minutos para que no se endurezca al
solidificarse la muestra.
5.- Aada 7 ml. de H2O cuidadosamente, poco a poco, a la muestra digerida.
Mezcle y permtale enfriarse.

DESTILACIN
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6.- Encienda la unidad destiladora.

7.- Si es posible ajuste la velocidad de destilacin a aproximadamente 5 ml.
por minuto
8.- Abra la llave del agua para tener H 2O circulando por el refrigerante todo el
tiempo.
9.- Aada la muestra a la cmara de ebullicin por medio de un embudo (para
recuperar las perlas de ebullicin) y enjuague el matraz con aproximadamente
5ml. de H2O destilada.
10.- Coloque 1 frasco Erlenmeyer con 10 ml de cido brico y 2 gotas de
indicador bajo la salida de destilacin.
11.- Aada aproximadamente 10 ml. de la solucin de NaOH a la cmara de
ebullicin LENTAMENTE. La mezcla digerida se tornar oscura (azl-gris o
caf oscuro). Si no cambia de color aada ms NaOH.
12.- Deje un poco de NaOH en la copita superior del destilador.
13.- Colecte aproximadamente 20 ml. del destilado (4-5 minutos). El destilado
estar listo para ser titulado cuando se torna verde en el matraz receptor.
14.- Retire el matraz de Erlenmeyer y limpie la unidad destiladora enjuagando
la cmara de ebullicin varias veces con agua destilada. Cada vez que se
aada agua destilada hasta llenar la copita superior de la unidad destiladora
para el enjuague deje que sta hierva primero. Luego abra la llave de la parte
que permite salir las muestras hacia fuera de la unidad destiladora. Una vez
vaca la parte en donde se procesa la muestra asegrese de que est bien
vaca. Si queda todava un poco de agua en el fondo permita que hierva para
que se vaya toda hacia esa segunda parte de la unidad destiladora. El matraz
estar listo para recibir la segunda cantidad de agua destilada para lavar la
unidad destiladora. Esta operacin se repite al menos unas 4 veces.

NOTA: La llavecita de la segunda parte de la unidad destiladora (que conduce

la muestra procesada hacia el vasito permanece cerrada (en posicin
horizontal) durante el procesamiento de la muestra. Slo se abre cuando se
enjuaga el destilador.

TITULACIN

15.- Titule la muestra con 0.1N de HCl. Un color violeta indica el punto final de
la titulacin. Comprese este color con el del blanco. Cada equivalente
del HCl usado corresponde a un equivalente de NH 3 o a un equivalente de
N en la muestra original. El peso del N en mg est dado por
miliequivalentes del cido X 14 (el peso equivalente del N).

RECUPERACIN DEL AMONACO

Una posible fuente de variacin en este mtodo es la prdida del gas
amonaco o una falla en atrapar el amonaco en el cido brico. Esto puede
ocurrir en diferentes pasos del proceso. Una tcnica para buscar la
recuperacin del amonaco consiste en destilar cantidades conocidas de
amonaco lquido y titularlo con HCl. Se obtendr otra vez el color prpura en
el cido brico.
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Mientras se digieren las muestras, se puede destilar una solucin de

sulfato de amonio. Aada 5, 10 15 ml (mediante una pipeta) de solucin de
sulfato de amonio a la cmara de ebullicin de la unidad destiladora.
Enjuguela despus con agua destilada y, si es posible, desionizada. Coloque
inmediatamente la punta de la unidad destiladora en 10 ml de cido brico +
indicador. Colecte aproximadamente 20 ml. de destilado.

Titule la muestra con el HCl estandarizado, registre los ml. de HCl

empleados y calcule el peso del nitrgeno en el (NH 4)2SO4.

Clculos

Moles de HCl = Moles de NH3 = Moles de N en la muestra

% N = NHCl x Volumen de cido corregido x 14 g N x 100

g de muestra mol

en donde:

NHCl = Normalidad del HCl en moles/1000ml.

Volumen del cido corregido = (ml. del cido estandarizado para la
muestra) - (ml. de cido estandarizado para el blanco).
14 = Peso atmico del nitrgeno.

Se utiliza un factor para convertir el porcentaje de N a porciento de

protena cruda. El porcentaje de N en protena para el harina de trigo es de
18% y su factor de conversin es de 5.70.

BIBLIOGRAFA

A.O.A.C. 1980. Association of Official Agricultural Chemists. Official

Methods of Analysis. Washington, D.C.

Nielsen, S.S. 1994. Introduction to the Chemical Analysis of Foods. Ed.

Jones and Bartlett Publishers. U.S.A. pp 209-212.

Ranganna, S. 1977. Manual of Analysis of Fruit and Vegetable Products.

Ed. McGraw-Hill Publishing Co. Ltd. New Delhi.

Yeshajahu P. y Meloan C.E. 1987. Food Analysis. Theory and Practice.

2. Ed. AVI U.S.A. pp 753-758.
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VALORACION DE PROTENAS POR EL MTODO DE LOWRY

1.- FUNDAMENTO TERICO

El mtodo de Lowry (1951) es un mtodo espectrofotomtrico de

valoracin cuantitativa de protenas. A la disolucin de protenas se le aade un reactivo
que forma un complejo coloreado con ellas, siendo la intensidad de color de la disolucin
resultante proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer
(A= .l.c).

La preparacin de las muestras consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas en los tomos de
nitrgeno de los enlaces peptdicos, formando complejos. Estos complejos Cu2+-protena,
de un color azul plido, provocan el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la
protena, exponiendo hacia la superficie a los residuos fenolitos de tirosina, que van a
participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina en
forma de su complejo con tartrato.

2) En la segunda etapa, el cobre acta como catalizador de la reduccin, tambin

en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por parte de los grupos fenlicos de los
residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas. El principal constituyente del
reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al
ser reducido por los residuos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.
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Reaccin entre la protena y los reactivos de Cu2+ y de Folin

2.- MATERIAL Y REACTIVOS

Materiales
.- Tubos de ensayo y Falcon (50 mL)
.- Pipetas
.- Colormetro
.- Cubetas de colormetro
_ Agitadores de tubos

Reactivos
- Reactivo A: Na2CO3 al 2%, NaOH 0,1 M
- Reactivo B1: CuSO4 5H2O al 1%
- Reactivo B2: tartrato sdico-potsico al 2%
- Reactivo C: Se prepara en el momento de iniciar el ensayo, mezclando A, B1 y B2
en proporciones 50:0,5:0,5 (en volumen)
- Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial diluido a 1/4
- Solucin patrn de albmina de suero bovino (2 mG/mL)
- Muestra problema
3.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Realizacin de la curva de calibrado:
Para poder determinar la concentracin de protenas en la muestra problema hay
que contar con una curva patrn o de calibrado que relacione la concentracin de
albmina presente en cada tubo con la Absorbancia determinada en el colormetro. Para
realizar la curva patrn se toman diferentes volmenes de la solucin patrn de BSA (2
mg/ml) tal y como se detalla en el cuadro, tubos del 0 al 4. El tubo 0, que no contiene
protena y s los reactivos, sirve de blanco para el ajuste del colormetro a cero de
absorbancia.
Es conveniente procesar simultneamente los tubos 5 y 6 con la disolucin problema para
determinar igualmente su absorbancia.
Pasos a seguir:
.- Numerar los tubos de plstico de 10 ml, del 0 al 6,
.- Pipetear las cantidades de agua, solucin patrn de albmina y solucin problema de
protenas.
.- Preparar el reactivo C, a partir de A, B1 y B2
.- Pipetear a todos los tubos el reactivo C. Mezclar el contenido de cada tubo y dejarlo
reposar 15 minutos en oscuridad. El proceso sigue
TUBOS Agua Patrn problema Reactivo Folin diluido Abs.580 nm
(2mg/ml) C
0 1,0 ml -- -- 5 ml 0,5 ml
1 0,9 ml 0,1 ml -- 5 ml 0,5 ml
2 0,8 ml 0,2 ml -- 5 ml 0,5 ml
3 0,7 ml 0,3 ml -- 5 ml 0,5 ml
4 0,6 ml 0,4 ml -- 5 ml 0,5 ml
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5 0,7 ml -- 0,3 ml 5 ml 0,5 ml

6 0,5 ml -- 0,5 ml 5 ml 0,5 ml

.- A continuacin se aade el reactivo de Folin (diluido 1/4) a todos los tubos, mezclando
bien. Dejar reposar 30 minutos en oscuridad para que se desarrolle completamente la
reaccin coloreada.

.- Leer las absorbancias en el colormetro a 580 nm. Previamente en el aparato se ajusta

la absorbancia a cero con el blanco (tubo n 0); de esa forma slo se determina la
absorbancia producida por las protenas modificadas, puesto que se resta la absorbancia
debida a los reactivos.

4.- TRATAMIENTO Y DISCUSIN DE LOS RESULTADOS

4.1.- Curva patrn: Representar, en papel milimetrado, las absorbancias de los tubos 1 a 4
frente a la concentracin de protenas de cada tubo (1,2,3,4), previamente calculadas.

4.2.- Determinar la concentracin de protenas en la muestra problema, expresando el

resultado en mg/ml (tener en cuenta las diluciones realizadas). La concentracin de
las muestras problema se determina por interpolacin de los valores de absorbancia en
la curva patrn

5.- CUESTIONES

5.1.- La concentracin de protenas en la muestra problema, obtenida a partir de los tubos

5 y 6 debera ser igual o diferente?

5.2.- La relacin entre absorbancias y concentracin de protenas se mantiene siempre de

forma lineal? Hacer un comentario al respecto.

5.3.- Observaciones a la prctica.