Aquino, S. F. et al.

Artigo Tcnico

Metodologias para determinao da Atividade

Metanognica Especfica (AME) em Lodos Anaerbios
Methodologies for determining the Specific Methanogenic Activity
(SMA) in Anaerobic Sludges
Srgio F. Aquino
Professor do Departamento de Qumica, Universidade Federal de Ouro Preto - UFOP

Carlos A. L.Chernicharo
Professor do Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental, Universidade Federal de Minas Gerais - UFMG

Eugnio Foresti
Professor do Departamento de Hidrulica e Saneamento, Universidade de So Paulo USP/So Carlos

Maria de Lourdes Florncio dos Santos

Professora do Departamento de Engenharia Civil, Universidade Federal de Pernambuco - UFPE

Luiz O. Monteggia
Professor do Instituto de Pesquisas Hidrulicas, Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS

Recebido: 21/07/06 Aceito: 26/03/07

Resumo
Esse artigo apresenta uma reviso sobre os diferentes protoco-
los para a determinao da atividade metanognica especfica
(AME) de lodos anaerbios. Os protocolos propostos se
diferem tanto em relao aos procedimentos adotados para a
incubao do lodo, quanto ao mtodo utilizado para quanti-
ficao do metano produzido durante o teste. So discutidos
os princpios dos mtodos manomtricos e volumtricos, e
descritos brevemente os protocolos de incubao do lodo,
de medio do metano e o procedimento para clculo da
AME obtida pelos mtodos mais utilizados pela comunidade
cientfica nacional.
Abstract
This paper presents a review on the different methodologies to
determine the specific methanogenic activity (SMA) of anaerobic
sludges. The protocols available in the literature differ not only
regarding the procedures adopted to incubate the sludge, but
also in relation to the method utilized to quantify the methane
produced during the test. This paper discusses the principles of
manometric and volumetric methods, and briefly describes the
protocols mostly used by the Brazilian research community for
sludge incubation, methane measurement and calculation of
SMA.

Palavras-chave: Lodo anaerbio, dgesto anaerbia, Keywords: Anaerobic sludge, anaerobic digestion, Specific
Atividade Metanognica Especfica, Testes AME. Methanogenic Activity; SMA tests.

INTRODUO da demanda qumica de oxignio determinado reator permite estabelecer,

A atividade metanognica espe-
cfica (AME) pode ser definida como
a capacidade mxima de produo de
metano por um consrcio de micror-
ganismos anaerbios, realizada em
condies controladas de laboratrio,
para viabilizar a atividade bioqumica
mxima de converso de substratos
orgnicos a biogs. A determinao
da capacidade do lodo anaerbio em
produzir metano importante porque
a remoo de eltrons equivalentes, ou
seja compostos reduzidos causadores
(DQO), da gua residuria a ser trata-
da s ocorrer de fato com a formao
do metano, que por ser praticamente
insolvel em gua, escapa facilmente
da fase lquida.
Desta forma, a AME pode ser
utilizada como um parmetro de moni-
toramento da eficincia da populao
metanognica presente em um reator
biolgico e, como tal, constitui-se
ainda em uma importante ferramenta
para o controle operacional de reatores
anaerbios (Foresti et al, 1999). O
conhecimento da AME do lodo de
em ltima anlise, a capacidade mxima
de remoo de DQO da fase lquida, e
por isso permite estimar a carga orgnica
mxima que pode ser aplicada com mi-
nimizao do risco de desbalanceamento
do processo anaerbio. Fazendo uma
anlise inversa, a AME permite determi-
nar a massa mnima de lodo anaerbio
a ser mantida no reator para a remoo
de determinada carga orgnica aplicada.
Consequentemente o conhecimento da
AME possibilitaria a adoo de procedi-
mentos mais racionais para o descarte de
lodo de sistemas anaerbios.

Eng. sanit. ambient. 192 Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201


Os trabalhos de Valcke &
Verstraete (1983), De Zeeuw (1984)
e Dolfing & Bloemen (1985) foram
pioneiros no desenvolvimento e uso
dos testes de AME, como ferramenta
de caracterizao e avaliao de reatores
anaerbios. No Brasil, pesquisas sobre
o teste de AME comearam a ser feitas
cerca de dez anos depois, e a tese de
doutorado de Penna (1994) talvez te-
nha sido o primeiro trabalho brasileiro
devotado ao estudo das condies de
incubao e implantao do teste de
AME. Os artigos de Penna et al (1995)
e Monteggia (1997) foram de fato as
primeiras comunicaes cientficas
nacionais que discutiram a necessidade,
e propuseram uma metodologia, para a
harmonizao do teste de AME. No
obstante as contribuies desses autores,
o fato que h, na literatura nacional
e internacional, diferentes protocolos
para a determinao da atividade me-
tanognica de lodos anaerbios. Os
protocolos diferem entre si tanto nos
procedimentos adotados para a incuba-
o do lodo (concentrao de biomassa,
tipo e concentrao de substrato, rela-
o alimento/microrganismo, tipo e
concentrao de nutrientes, tempo de
incubao, etc), quanto para a quanti-
ficao do metano produzido.
Em relao aos procedimentos de
incubao, observa-se que a comunida-
de cientfica utiliza diferentes concen-
traes iniciais de substrato e biomassa,
sendo que alguns pesquisadores prefe-
rem utilizar glicose como substrato, ao
passo que outros utilizam cido actico
ou uma mistura dos principais cidos
orgnicos intermedirios da digesto
anaerbia (cidos actico, propinico e
butrico). Em relao quantificao de por qualquer mtodo que venha a ser
metano, h mtodos mais sofisticados,
como os que se empregam cromat-
grafos a gs e/ou respirmetros inter-
faciados com micro-computadores,
bem como mtodos simplificados que
se baseiam na purificao do metano
do biogs seguida de sua determinao
volumtrica.
Em virtude da no existncia de
um procedimento padro para a deter-
minao atividade metanognica, um
esforo da International Water Associa-
tion (IWA) resultou na criao de um
grupo de especialistas para harmonizar
diversos protocolos de anlise, dentre
os quais se encontra a AME. Como
no h, at o momento, consenso em
relao melhor condio de incubao durante metabolismo dos microrga-
do lodo anaerbio, bem como para a
Eng. sanit. ambient. 193
Metodologias para determinao da atividade metanognica
medio do metano produzido, no se
pode sugerir nesse artigo, um procedi-
mento nico para a determinao da
AME. Sendo assim, o principal objetivo
dessa reviso apresentar os principais
mtodos utilizados pela comunidade
cientfica nacional e internacional para
a determinao da AME, dedicando-se
especial ateno ao princpio de cada
mtodo, aos principais equipamentos
necessrios para sua implantao, bem
como ao procedimento para clculo
da AME.
Torna-se importante esclarecer
que a falta de uma padronizao in-
ternacionalmente aceita para o teste
de AME dificulta, de certa forma, a
comparao dos resultados absolutos
obtidos a partir de cada metodologia
atualmente disponvel. Nesse sentido,
entende-se que os resultados obtidos
a partir de cada um dos mtodos ora
descritos devam ser utilizados muito
mais como base relativa de comparao
em cada local em que vier a ser aplicado
e levando-se em conta ainda o objetivo
principal de aplicao do resultado.
Em outras palavras, uma vez escolhido
um determinado mtodo para o teste
de AME, os resultados obtidos atravs
do mesmo sero muito mais teis em
termos comparativos, por exemplo,
entre determinadas condies e fases
operacionais de reatores anaerbios.
Portanto, a maior contribuio
deste artigo ser no sentido de fornecer
subsdios para a comunidade cientfica
e para os operadores de reatores ana-
erbios escolherem um determinado
mtodo para medio da AME do lodo,
alm da proposio de algumas padro-
nizaes mnimas a serem empregadas
escolhido.
CONSIDERAES SOBRE
AS CONDIES DO
TESTE DE AME
Tipo e concentrao de
substrato
Para se avaliar, strictu sensu, a
atividade metanognica de determi-
nado lodo deve-se aliment-lo com
substrato que suporte apenas a ativi-
dade metablica dos microrganismos
metanognicos. Como se sabe, a maior
parte do metano produzido, cerca de
70%, advm da clivagem do acetato
nismos metanognicos acetoclsticos.
Artigo Tcnico
Os cerca de 30% restantes de metano
so produzidos por microrganismos
hidrogenotrficos a partir da reduo
do dixido de carbono. Desta forma,
muitos pesquisadores utilizam comu-
mente sais de acetato ou cido actico
como substrato. O clculo da AME
atravs do uso de apenas acetato como
fonte de carbono e energia subestima
em no mnimo 30% a capacidade m-
xima de produo de metano, uma vez
que microrganismos hidrogenotrficos
tm maiores taxas de crescimento que
os acetoclsticos (Harper & Poland,
1986; Pavlostathis & Giraldo-Gomez,
1991) e certamente estaro presentes
em reatores reais devido degradao
de substrato mais complexo (protenas,
carboidratos e lipdeos) que resulta em
produo de hidrognio (H2) e gs
carbnico (CO2).
No sentido de se avaliar a ativida-
de metanognica de ambos os grupos
de microrganismos, acetoclsticos e
hidrogenotrficos, alguns pesquisa-
dores (Field et al, 1987; Florencio
et al, 1993; Alves et al, 2005) utilizam
uma mistura de cidos graxos volteis
(AGVs), comumente constituda de
acetato (C2), propionato (C3) e butirato
(C4), na proporo de 100:100:100 g/L,
respectivamente. A DQO resultante
da mistura de AGVs tem a proporo
de 24,3:34,4:41,3 % para C2, C3 e C4,
respectivamente. Nesse caso, o teste
avaliar no s a atividade dos micror-
ganismos metanognicos, mas tambm
a capacidade sintrfica do sistema, ou
seja, a atividade dos microrganismos
que convertem propionato e butirato
em acetato. importante salientar que
a avaliao da atividade dos microrga-
nismos sintrficos fundamental para a
boa operao dos digestores anaerbios.
Como os microrganismos metanog-
nicos no produzem metano a partir
de propionato ou butirato, a queda de
eficincia de um reator anaerbio pode
estar mais relacionada baixa atividade
dos microrganismos sintrficos pro-
dutores de acetato do que atividade
de microrganismos metanognicos
consumidores de acetato.
Nessa linha de raciocnio alguns
pesquisadores defendem que um teste
de atividade do lodo anaerbio deva
avaliar todo consrcio microbiano,
e para isso o uso de substratos mais
complexos, como glicose, seria o re-
comendado, simulando o que ocorre
em um reator em escala real. De fato
o uso de glicose suportaria a atividade
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201
 Aquino, S. F. et al.
Artigo Tcnico
metablica de microrganismos fer-
mentativos (acidognicos), sintrficos
(acetognicos) e produtores de metano
(metanognicos), permitindo avaliar
a atividade do consrcio anaerbio
como um todo. Se o teste com glicose
evidenciar uma baixa produo de me-
tano, ento novos testes com mistura
de AGVs ou com acetato poderiam ser
feitos para identificar que grupo(s) de
microrganismo(s) est(o) limitando a
degradao anaerbia.
Em relao concentrao do Monteggia (1997) que, investigando o
substrato utilizado, importante res-
saltar que o teste de AME deve ser feito
com excesso de substrato e nutrientes,
de forma que a cintica de degradao se
aproxime de uma reao de pseudo or-
dem zero, passando a depender apenas
da concentrao dos microrganismos
(inculo) presentes. Desta forma, o
importante que a concentrao de
substrato seja maior que o valor de
Ks, que no caso dos microrganismos
metanognicos acetoclsticos situa-se
na faixa de 11 a 421 mg/L de acetato
(Harper & Ohlland, 1986; Pavlostathis
& Giraldo-Gomez, 1991). Sendo assim
uma concentrao de 2 g/L de acetato
seria suficiente para garantir excesso de
substrato e, de fato, essa concentrao
o valor de referncia recomendado
por Monteggia (1997), que concluiu
que o uso de concentraes de cido
actico na faixa de 2 a 4 g/L resultaram
em valores mximos de AME.
Segundo Penna (1994), para
cada quantidade de biomassa, existe
uma faixa adequada de quantidade de
substrato, que varia com a natureza e
atividade do lodo. Ou seja, a relao
alimento/microrganismo que resulte
em maior valor de AME deve ser pes-
quisada caso a caso. Alm disso, Penna
(1994) chega a sugerir a utilizao,
como substrato durante o teste, da
prpria gua residuria que alimenta o
reator que forneceu o lodo para o teste.
Essa proposio decorre do fato de o
autor ter verificado que a AME obtida
com a gua residuria foi similar quela
obtida quando se usou uma mistura de
AGVs como substrato.
Concentrao inicial de
inculo
Assumindo-se que o substrato e os
nutrientes estaro presentes em excesso
durante o teste de AME, de se esperar
que a concentrao inicial de inculo
defina, em ltima instncia, a durao inculo. Por isso indispensvel que
Eng. sanit. ambient. 194
do teste. Ou seja, partindo-se de uma
concentrao maior de biomassa,
haver uma menor relao alimen-
to/microrganimos (A/M), resultando
em degradao mais rpida do substra-
to disponvel, sendo a anlise inversa
verdadeira. Como o resultado final da
AME expresso de forma normalizada,
ou seja, levando-se em conta a massa
de inculo, a concentrao inicial de
lodo no deveria afetar o valor da AME
obtido. Tais fatos foram observados por
efeito da concentrao de microrganis-
mos no teste de AME feito sob agitao,
concluiu que a faixa tima de valores
de AME ocorreu entre 2 e 5 g SSV/L
e que, para valores crescentes de SSV,
houve reduo significativa na durao
do teste, ao passo que, para valores de
SSV abaixo de 2 g/L ou superiores a
5 g/L, houve reduo apenas discreta
nos valores de AME. Rocha et al (2001)
salientam que se o ensaio conduzido
sem agitao, a concentrao de lodo
deve ser em torno de 2,0 gSSV/L para
se reduzir problemas com a difuso do
substrato.
Os resultados de Penna (1995)
so concordantes com os de Monteggia
(1997), ao mostrarem que a quantidade
de biomassa, na faixa de 2,5 a 20 g/L,
no influenciou no resultado da AME.
Entretanto, Penna (1995) mostrou que,
para testes de AME com lodo de esgoto
sanitrio, nas concentraes iniciais de
5,2 e 10 gSSV/L, os melhores valores
de A/M ficaram na faixa de 0,3 a
0,5 gDQO/gSSV. Para testes com lodo
a 20 gSSV/L, a melhor relao ficou na
faixa de 0,1 a 0,25 gDQO/gSSV, ao
passo que para lodo com 2,5 gSSV/L,
a faixa de 0,8 a 1,8 gDQO/gSSV foi
a que forneceu os maiores valores de
AME. Steil et al (2004) corroboram
a proposio de Penna (1995), de
que necessrio pesquisar para cada
lodo a relao A/M que fornece o
maior valor de AME, e mostraram que
0,25 gDQO/gSSV foi o valor de A/M
mais adequado quando a mistura de
AGVs foi escolhida como substrato.
Como o resultado do teste ser
expresso em termos da quantidade de
biomassa presente, a quantidade do
inculo usada, em tese, no precisaria
ser exatamente a mesma para diferentes
ensaios. O importante que se saiba
exatamente a concentrao do lodo pre-
sente em cada frasco para que se possa
calcular com preciso a massa inicial de
termos de Brasil, a soluo nutricional a
se faa anlise dos slidos suspensos
volteis (SSV) no lodo utilizado como
inculo. Outro aspecto importante que
se deve ter em mente o crescimento
da biomassa durante o ensaio, que
interfere diretamente na determinao
do valor de AME, uma vez que a con-
centrao de SSV geralmente medida
no incio e no no final do teste. Para
minimizar este problema, devem ser
utilizadas concentraes relativamente
altas de lodo e baixas concentraes de
substrato (baixa relao A/M). Uma
alternativa seria fazer a anlise de SSV
tanto no incio quanto no final do teste,
e usar o valor mdio para calcular a
AME. Esse procedimento informaria,
ainda, se houve predominantemente
crescimento ou endogenia da biomassa
durante o teste.
Soluo de nutrientes
A soluo de nutrientes ideal,
ou gua de diluio, deve conter
macro (N-NH4+, P-PO43-, Mg, Ca) e
micro-nutrientes (Fe, Ni, Zn, Co...),
bem como alcalinidade (NaHCO3 ou
KH2PO4 + K2HPO4) e agente redutor
(Na2S.7H2O). No h consenso na
literatura em relao soluo nutri-
cional a ser usada no teste de AME,
havendo inclusive a sugesto de alguns
pesquisadores para a no utilizao das
solues minerais e nutricionais, para
alguns tipos de lodo, como o caso
do lodo de esgoto sanitrio (Dolfing
& Bloemen, 1985; Penna, 1995). Tal
sugesto motivada pela decorrente
simplificao do teste, e tem como
premissas a pequena durao do teste e
a presena de nutrientes no lodo de es-
goto sanitrio. Entretanto, a tendncia
na literatura nacional e internacional
a de se adicionar soluo nutricional
ao frasco de reao, conforme mostra a
Tabela 1, originalmente proposta por
Monteggia (1997) e complementada
aqui com outras referncias.
A soluo de nutrientes utilizada
por Souza et al (2005) uma adapta-
o do meio nutricional apresentado
em Chernicharo (1997), por incluir
os macro-nutrientes clcio e magnsio
(CaCl2.2H2O e MgCl2), os micronu-
trientes nquel e boro (NiCl2.6H2O e
H3BO3), e por reduzir a quantidade de
fsforo (K2HPO4 e KH2PO4) devido
substituio desse sistema tampo pelo
sistema bicarbonato (NaHCO3).
No sentido de harmonizar, em
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201

ser usada no teste de AME, recomenda-
se que a soluo de nutrientes proposta
pela referncia X (ver Tabelas 1 e 2)
seja utilizada e complementada com
50 mg/L de extrato de levedura (fonte
de vitaminas). Embora tal procedimen-
to no contribua para a simplificao
do teste, tal padronizao facilitaria a
comparao de resultados de diferen-
tes grupos de pesquisa, uma vez que
eliminaria incertezas relacionadas
deficincia nutricional que poderiam
eventualmente surgir, a depender da
origem do lodo testado.
Tempo de incubao antes
da adio de substrato
Durante a execuo dos testes
de AME comum incubar frascos de
branco, ou seja, contendo gua des-
tilada ao invs da soluo de substrato,
para se avaliar a produo residual de
metano devido ao decaimento endge-
no, sendo a produo endgena descon-
tada da produo observada nos frascos
contendo o substrato. Tal procedimento
pode levar a erros grosseiros no clculo
da AME, uma vez que a endogenia
observada no frasco contendo substrato
deve ser bem menor que aquela obser-
vada no frasco branco. Para eliminar a
incerteza do metano de origem endge-
na FDZ-Polanco et al (2005) sugeriram
a incubao do lodo por 7 dias a 35 oC,
antes que o substrato fosse adicionado,
para que o metano produzido pela
endogenia pudesse ser desconsiderado
no teste. Outros autores (James et al,
1990; Penna, 1994; Monteggia 1997;
Silva et al, 2005) tambm sugeriram a
incubao do lodo, na temperatura de
realizao do ensaio e na presena de
nutrientes e soluo tampo, previa-
mente adio do substrato, todavia
por perodos menores, da ordem de 6
a 15 horas.
Ressalta-se que, dependendo das
condies operacionais do reator (Ex.
carga aplicada) no qual o lodo anae-
rbio foi amostrado, a produo de
metano endgena pode durar horas ou
dias. Uma prtica segura para garantir
que a endogenia no afete os resultados
da AME consiste em incubar o lodo,
na presena de nutrientes e na tempe-
ratura de realizao do teste, at que a
produo de metano se estabilize. S
ento o substrato seria adicionado para
incio do teste.
O teste de AME pode ser fina-
lizado aps o consumo total do subs-
Eng. sanit. ambient. 195
Metodologias para determinao da atividade metanognica
trato, ou seja, quando a quantidade de
metano acumulada for igual terica
(Penna, 1995), o que poderia levar de
horas a semanas. A maioria dos pesqui-
sadores prefere adotar uma soluo mais
prtica, encerrando o teste quando a
produo acumulada de metano sai da
fase exponencial e entra na fase estacio-
nria. Nesse caso preciso verificar se a
produo acumulada de metano ao final
da fase exponencial atingiu o mnimo
de 50% da produo terica.
Agitao e controle de
temperatura
Deve-se garantir, durante o teste
de AME, que haja suficiente contato
da biomassa com o substrato e que no
haja limitao de transferncia de massa
do substrato e nutrientes. Sendo assim
comum incubar os frascos de reao
sob agitao constante, muito embora
no haja na literatura resultados con-
clusivos sobre a influncia da agitao
intermitente, e do tipo de agitador uti-
lizado (agitao orbital versus agitao
magntica) nos testes de AME. Penna
(1994) sugeriu que para lodo de esgoto
sanitrio seria possvel uma simplifi-
cao da metodologia substituindo a
agitao mecanizada contnua pela agi-
tao manual intermitente. Resultados
preliminares de pesquisa em andamento
(Souto, 2006) demonstraram que se a
agitao magntica for muito intensa,
os valores de AME podem ser menores
que os valores obtidos com a agitao
orbital e com a agitao intermitente
(agitao dos frascos uma vez por dia).
Esses resultados parecem demonstrar
que a agitao muito intensa com barras
magnticas pode levar ruptura dos flo-
cos microbianos, afetando consequen-
temente a transferncia de produtos e
substratos entre os microrganismos do
consrcio anaerbio.
Com relao temperatura, h
consenso na literatura de que o teste
de AME deva ser feito na faixa de 30
a 35 oC, para que os microrganismos
metanognicos mesoflicos tenham
as melhores condies de crescimen-
to. Alguns pesquisadores utilizam a
temperatura de 30 oC (Chernicharo,
1997; Souza et al, 2005) enquanto
outros preferem a temperatura de 35 oC
(Alves et al, 2005; Monteggia, 1997;
FDZ-Polanco, 2005). Como o teste de
AME indica a capacidade de formao
de metano, o valor de AME obtido
pode ser usado para se determinar a
Artigo Tcnico
carga orgnica que poderia ser aplicada
no reator anaerbio contendo determi-
nada massa de lodo. Contudo, deve-se
avaliar criticamente o resultado do
teste de AME, uma vez que os reatores
anaerbios em operao nas estaes de
tratamento ficam submetidos variao
sazonal de temperatura, e raramente
trabalham na faixa de temperatura ideal
para a atividade metanognica. Sendo
assim, o resultado de AME determina-
do em laboratrio pode superestimar a
capacidade de converso dos micror-
ganismos metanognicos no reator
exposto a condies ambientais dife-
rentes. Pesquisa em andamento (Souto,
2006) se prope a avaliar a influncia
da temperatura no resultado da AME,
possibilitando a determinao de coefi-
ciente emprico que permita converter
os valores de AME obtidos a 30oC ou
35 oC para outras temperaturas.
MTODOS DE MEDIO
DO BIOGS
H diferentes mtodos para a me-
dio de biogs produzido no teste de
AME, os quais podem ser classificados
em manomtricos ou volumtricos.
Mtodos manomtricos
Os mtodos manomtricos se
baseiam na medio da presso exercida
sobre um sensor (membrana trasdutora
de presso) acoplado ao frasco de rea-
o. Dependendo da configurao do
sistema a presso medida pode ser de-
vido mistura de gases do biogs, que
constitudo principalmente por metano
e dixido de carbono, ou devido somen-
te ao metano. Como possvel, atravs
de calibrao do sistema, estabelecer
uma correlao entre a presso medida e
a quantidade de metano presente dentro
do frasco de reao, o registro dirio
da presso permite determinar a taxa
diria de produo de metano e, por
conseguinte, o valor da AME.
A grande vantagem do mtodo
manomtrico a possibilidade de se
acoplarem os medidores de presso
a microcomputadores, permitindo
assim o monitoramento instantneo
e a automao do processo, enquan-
to que a principal desvantagem est
relacionada ao custo de aquisio e
manuteno dos equipamentos. Um
exemplo de respirmetro apresentado
na Figura 1, e vrios autores j desen-
volveram equipamentos semelhantes
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201
 Aquino, S. F. et al.

Artigo Tcnico

Tabela 1 - Resumo dos nutrientes recomendados para testes de AME

Nutriente Referncia
(mg/l) (I) (II) (III) (IV) (V)a (VI)a (VII)a (VIII) (IX) (X) (XI) (XII)
NH4Cl 1.000 73,6 500 500 40 174 500 73,6 500 500 2.235 280
(NH4)2SO4 - 13,6 - - - - - 13,6 - -
NaHCO3 - - 10.000 10.000 1.000 - - - - 1.000 - 1e
KH2PO4 2.500 13,6 300 300 9 - 1.500 13,6 1.500 650 486
K2HPO4 1.000 - 400 400 - - 1.500 - 1.500 150 - 252
Na2HPO4.2H2O - - - - - 37 - - - - -
MgCl2 100 - - - 5,5 - - 500 - 100 150 100f
CaCl2.2H2O - - - - - - - - - 100 107 10
KCl - - - - 25 - - - - - -
Na2SO4 - - - - 9 7 - - - - -
Na2S.7H2O 100 - - - - - 50 - 50 50 0,25
Extrato levedura 200 - - - 50 - 200 - - - -
Elementos trao No Sim b
No No Sim b
Sim b
No Sim c
Sim c
Sim c
Simc Simc
Resarzurinad - - - - - - - 1 ml/L - 1 ml/L - 0,2
a) gua de torneira contendo aproximadamente 35 mg/l de ons clcio; b) adio de 1 ml de soluo de elementos trao descrito por Zehnder et al (1980);
c) soluo de micronutrientes (Tabela 2); d) indicador de potencial redox (pE) (incolor: baixo pE; rosa, roxo: alto pE); e) 1 g/gDQO; f ) adio na forma
de MgSO4.7H2O.
Referncias: I) Valcke & Verstraete, (1983) apud Monteggia (1997); II) De Zeeuw, (1984); III) Dolfing & Bloemen, (1985) apud Monteggia (1997); IV)
Dolfing, (1985) apud Monteggia (1997); V) Koster et al, (1986); VI) Koster & Cramer, (1987); VII) Monteggia (1997); VIII); Penna (1994); IX) Cherni-
charo (1997); X) Souza et al.. (2005); XI) Alvez et al (2005); XII) Florencio et al, (1993).

Tabela 2 Soluo de micronutrientes

Micronutriente Referncia
Concentrao na soluo final (em mg/L) VIII IX X XI XII
FeCl3.6H2O 2a 2 2 4 2
ZnCl2 0,05 0,05 0,05 0,212b 0,05
CuCl2.2H2O 0,03 0,03 0,03 0,076 c
0,038
MnCl2.4H2O 0,5 0,5 0,5 1 0,5
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,05 0,05 0,05 0,2 0,05
AlCl3.6H2O 0,05 0,05 0,05 - 0,09
CoCl2.6H2O 2 2 2 2,2 2
NiCl2.6H2O - - 0,05 0,1 0,142
H3BO3 - - 0,01 0,1 0,05
Na2SeO3 - - - 0,2 0,164
EDTA - - - 2 1
H3PO4 1 ml/L - - - -
HCl conc.d 1 ml/L 1 ml/L 1 ml/L 1 ml/L 1 ml/L
a) Sal usado foi FeCl2.4H2O; b) Sal usado foi ZnSO4.7H2O; c) Sal usado foi CuSO4.5H2O; d) Proporo a ser adicionada na soluo estoque.

Eng. sanit. ambient. 196 Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201


para a determinao da AME usando
o procedimento manomtrico (James
et al, 1990; Chernicharo & Campos,
1991; Cohen, 1991; Chernicharo
et al, 1997; Monteggia, 1991;
FDZ-Polanco et al, 2005; Louzada
et al, 2005).
O sistema mostrado na Figura 1
consistia de 8 frascos de reao de 1 L
submersos em um banho termostati-
zado, sendo a mistura do seu contedo
feita com agitadores magnticos. O
sistema de medio de gs era cons-
titudo de uma vlvula solenide de
3 vias controlada por um medidor de
presso (manmetro ou transdutor de
presso), de tal forma que duas vias (vias
1 e 2 indicadas na Figura 1) ficavam
normalmente abertas permitindo a
comunicao do frasco de reao com
o reservatrio de gs. No decorrer do
ensaio de AME a presso no frasco de
reao e no reservatrio de gs aumen-
tava e era registrada progressivamente
pelo manmetro at atingir um valor
limite. Quando a presso detectada no
manmetro atingia o limite estipulado,
o controlador emitia um sinal eltrico
para a vlvula solenide para fechar a via
de entrada para o reator (via 1) e abrir
a via de purga (via 3). Isso fazia com
que a presso do sistema fosse aliviada
devido liberao do gs acumulado
no reservatrio. Aps a despressurizao
o controlador enviava um novo sinal
para a vlvula para fechar a via 3 e
abrir novamente as vias 1 e 2, iniciando
assim um novo ciclo (Ince et al, 1995).
Outros respirmetros utilizam sistemas
de medio semelhantes, substituindo o
manmetro por transdutores de presso
(Cohen, 1991; Chernicharo et al, 1997;
FDZ-Polanco et al, 2005).
importante ressaltar que os pro-
cedimentos manomtricos s dispen-
sam o uso de cromatgrafo caso haja
a absoro do dixido de carbono em
etapa prvia medio de presso. Nos
respirmetros utilizados por James
et al (1990), Chernicharo & Campos
(1991), Monteggia (1991), Ince et al
(1995) e Chernicharo et al (1997), a
presso registrada correspondia s presses
parciais do gs carbnico e metano e, por
isso a determinao cromatogrfica dos
gases era necessria para quantificao do
metano produzido. Recentemente, FDZ-
Polanco et al (2005) desenvolveram um
respirmetro acoplado a um sistema de
absoro de gs carbnico (Figura 2), de
forma que a presso medida pelo trasdu-
tor devida apenas ao gs metano.
Eng. sanit. ambient. 197
Metodologias para determinao da atividade metanognica
Um outro sistema respiromtrico
que pode ser utilizado e, que tambm
utiliza a concepo de absoro do
gs carbnico previamente medio
de presso, uma adaptao do kit
comercial Oxitop disponvel no
mercado e usualmente empregado nas
determinaes da demanda bioqumica
de oxignio (DBO).
A determinao da DBO com o
sistema Oxitop (Figura 3) se baseia no
fato de que durante a respirao aerbia
haver consumo de oxignio dissolvido
na fase lquida, com conseqente repo-
sio pelo oxignio molecular presente
na fase gasosa. Desta forma a presso
parcial do oxignio no headspace tende
a diminuir devido reposio do oxi-
gnio consumido pela atividade micro-
biana. Como h, durante a degradao
aerbia, produo de gs carbnico,
preciso que se tenha um dispositivo
para sua absoro antes que a presso
seja medida, de forma que a queda de
presso devido ao consumo de oxignio
seja percebida e quantificada correta-
mente. Nos equipamentos Oxitop,
a absoro de gs carbnico feita por
Figura 1 Respirmetro, originalmente proposto por Monteggia
(1991), para realizao de testes de AME
Figura 2 Respirmetro desenvolvido por FDZ-Polanco et al (2005) para
remoo do CO2 previamente medio da presso
Artigo Tcnico
pastilhas de NaOH colocadas em uma
cestinha suspensa, atravs da qual os
gases so obrigados a passar antes de
atingirem o trasdutor de presso.
Com base no exposto possvel
adaptar o equipamento Oxitop para
sua utilizao nas determinaes de
AME, s que nesse caso o equipamento
registraria acrscimos de presso, devi-
do produo de metano, ao invs da
reduo de presso devido ao consumo
de oxignio.
No processo manomtrico preci-
so calibrar o equipamento e determinar
a constante do frasco (K, em unidade de
volume/unidade de presso), de forma
que o volume do biogs produzido
(V, em unidade de volume) possa ser
relacionado presso medida (P, em
unidade de presso) atravs da Equao
1 (Chernicharo, 1997):
V = K.P (1)
A determinao experimental da
constante K pode ser feita atravs da
calibrao de frascos de reao contendo
um volume de gua correspondente ao
volume lquido utilizado no teste com
o lodo. Para minimizar, durante o teste
1- Frascos de reao (V =1 L)
2- Septa para amostragem
3- Agitadores magnticos
4- Vlvula solenide de 3 vias
5- Reservatrio de gs (V = 80 ml)
6- Manmetro
7- Cabos eltricos
8- Termostato de imerso
9- Banho de gua
10- Motor do agitador magntico
11- Painel de controle da vlvula solenide
12- Computador par a aquisio de dados
1- Frasco de reao (200 ml)
2- Soluo alcalina (15 gNaOH/L)
3- Headspace da cmara de lavagem do biogs
4- Tubo coletor
5- Porta de amostragem
6-
7-
Agulha de seringa
Transdutor de presso
8- Computador para aquisio de dados
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201
 Aquino, S. F. et al.

Artigo Tcnico
de calibrao, a solubilizao de gases na
gua, principalmente do CO2, deve-se
utilizar gua previamente saturada com
NaCl. A simulao da produo de gs
seria feita injetando-se, a cada 30 mi-
nutos ou outra frequncia mais conve-
niente, quantidades conhecidas de uma
mistura padro contendo gs carbnico
e metano em concentraes conhecidas.
O acrscimo de presso registrado pode
ser ento relacionado com a quantidade
de metano adicionada, possibilitando a
determinao de K (Figura 4).
Figura 3 Sistema Oxitop para medio da AME (Borges, 2004)
Mtodos volumtricos
Os mtodos volumtricos se ba-
seiam na determinao do volume de
biogs ou metano produzido em um Presso mxima registrada pelo transdutor
frasco reacional que contm o lodo a (o headspace do frasco deve ser escolhido de
Presso medida (atm)

ser testado. A literatura reporta trs forma que o valor de presso mxima no
metodologias comumente utilizadas seja atingido durante o teste)
que empregam procedimentos volu-
mtricos: i) medio do volume e com-
posio do biogs, ii) medio apenas
da composio do biogs, iii) medio dV/dP = K (ml/atm)
direta do volume de metano.

Medio do volume e composio do

biogs
Nesse procedimento, frascos de
vidro (tipo antibitico por exemplo)
so inoculados com lodo a ser testado,
substrato e soluo de nutrientes, e
incubados 30 oC por um perodo que
varia de 7 a 20 dias. O teste deve ser
finalizado quando a produo acumu-
lada de metano se estabilizar, ou seja,
fundamental que a taxa mxima de
produo de metano (ponto de mxima
inclinao na curva obtido em grfico
tipo volume acumulado de metano
versus tempo de incubao) seja ob-
tida antes que o teste seja encerrado. O
monitoramento da produo de metano
pode ser feito diariamente com o auxlio
de uma seringa esmerilhada (que no
oferea resistncia ao deslocamento),
e a determinao da composio do
biogs amostrado pode ser feita por
cromatografia gasosa.
Nesse procedimento a produo
volumtrica de metano calculada dia-
riamente, multiplicando-se o volume
de biogs pela porcentagem de metano
no biogs. A porcentagem de metano
no biogs pode ser encontrada a partir
de uma curva de calibrao construda
injetando-se volumes fixos de diferentes
gases padro que contenham metano
em diferentes porcentagens, ou inje-
Metano adicionado (ml)
Figura 4 Exemplo da determinao grfica da
constante do frasco (K)
tando-se diferentes volumes de um
mesmo gs padro. A taxa mxima de
produo de metano pode ser obtida
ao se construir um grfico temporal
da produo acumulada de metano. A
AME pode ser ento determinada no
grfico volume acumulado de metano
versus tempo de incubao (Figu-
ra 5), pelo coeficiente angular no trecho
de maior inclinao. Deve-se assegurar
que a taxa mxima seja determinada
no trecho linear que corresponda ao
consumo mnimo de 50% do substrato
adicionado.
Como o resultado de AME geral-
mente expresso como gDQOCH4/gSSV.d,
preciso conhecer tambm a massa de
lodo inoculada (em gramas de SSV),
bem como converter a produo volu-
mtrica de metano (Ex. ml CH4/d) em
DQO (gDQO/d). Isso pode ser feito
sabendo-se o coeficiente estequiomtrico
de oxidao do metano (Equao 2).
CH4 + 2O2 & CO2 + 2H2O
A Equao 2 mostra que 1 mol
de metano equivale a 2 moles de O2 ou
64 g de DQO. Como 1 mol de qual-
quer gs, na CNTP (O oC e 1 atm),
ocupa um volume de 22,7 L, pode-se
dizer que 1 g de DQO destruda equi-
vale, na CNTP, a 0,354 L de metano
formado. Como as condies do teste
de AME no se encontram na CNTP,
preciso usar a Equao 3 para ajustar
a relao terica:
d n = d 2 2n
PV
1 1 PV
T1 CNTP T2 LAB (3)
Supondo que o teste de AME seja
feito em um laboratrio localizado em
uma regio onde a presso atmosfrica
de 1 atm, e sendo a temperatura de
incubao de 30 oC (303 K), tem-se:
=c
1atm # V2 m
c 1atm # 22, 7L m &
273K CNTP 303K LAB
& V2 = 25, 19L (4)
Ou seja, nas condies em que a
produo de metano foi determinada,
1 mol de metano ocupar um volume
de 25,19 L. Desta forma possvel
(2) dizer que a 30 oC e 1 atm, 394 ml de
metano produzido equivalem a 1 g de
DQO destruda. Atravs dessa correla-
o possvel expressar a taxa mxima
de produo de metano determinada

Eng. sanit. ambient. 198 Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201


graficamente em equivalentes de DQO
(gDQOCH4/d).
Medio apenas da composio do
biogs
De forma similar ao procedimen-
to descrito anteriormente, frascos de
vidro (tipo antibitico por exemplo)
so inoculados em triplicata com lodo
anaerbio, substrato e soluo de nu-
trientes, e incubados at que a produo
acumulada de metano se estabilize.
A diferena principal para o mtodo
descrito anteriormente est relacionada
forma de medio do metano produ-
zido. Nesse caso o monitoramento da
produo de metano feito diariamente
amostrando-se um volume fixo de bio-
gs (Ex. 0,5 ml) de dentro do frasco de
reao e deteminando-se a quantidade
de metano (massa ou nmero de moles)
produzida, por cromatografia gasosa
(Steil et al, 2004).
A grande vantagem dessa metodo-
logia que ela dispensa a medio do
volume de biogs e o uso de seringas
de vidro. Por outro lado sua grande
desvantagem reside no fato de que o
frasco de reao trabalha sob presses
muito maiores, aumentando o risco de
perda de biogs, principalmente durante
o procedimento de amostragem do volu-
me fixo. Alm do mais, para evitar erros
na construo da curva de calibrao,
preciso que o volume de biogs amos-
trado seja exato (Ex. 1 ml), uma vez que
esse volume determinar a quantidade de
metano injetada no cromatgrafo.
Por ser um gs pouco solvel, a
quantidade de metano presente na fase
lquida desprezada na metodologia
de AME descrita na seo anterior,
uma vez que a presso no interior do
frasco zerada (igualada atmosf-
rica) periodicamente. Entretanto, no
procedimento em que se mede apenas
a composio do biogs, um pequeno
volume de gs amostrado periodica-
mente, causando a elevao contnua da
presso no interior do frasco de reao.
Nesse caso a solubilizao do metano
no pode ser desprezada, e necessita
ser calculada.
A solubilidade de metano em
gua pode ser facilmente calculada pela
Lei de Henry, conforme a Equao 5
(Manahan, 1994).
Xl = K.Pg (5)
Onde:
Xl = concentrao metano dissolvida
(mol.L-1)
Eng. sanit. ambient. 199
Metodologias para determinao da atividade metanognica
K = Constante da Lei de Henry (Para CH4
a 25oC, K = 1,34.10-3 mol.L-1.atm-1)
Pg = presso parcial do metano (atm),
funo da presso total e da % de meta-
no no headspace (PCH4 = Ptotal %CH4)
Conhecendo-se os volumes da fase l-
quida e gasosa, pode-se encontrar ento
a quantidade de metano produzida a
partir da Equao 6.
n = Xg.Vg + Xl.Vl (6)
Onde:
n = quantidade de metano dentro do
frasco (em moles)
Xg = concentrao de metano determi-
nada na fase gasosa (em mol.L-1)
Vg = volume (em L) da fase gasosa
(headspace)
Xl = concentrao de metano calculada
na fase lquida (em mol.L-1)
Vl = volume da fase lquida
O inconveniente do procedimen-
to descrito acima a necessidade de se
saber a presso dentro do frasco para se
determinar de forma exata a quantidade
de metano dissolvida.
Para se determinar a produo
diria de metano preciso construir
uma curva de calibrao que relacio-
ne nmero de moles de metano no
headspace com a rea sob o pico de
metano separado e detectado por cro-
Volume acumulado
de CH4(ml)
Taxa mxima produo CH4 = dV/dt
Figura 5 Determinao grfica da taxa mxima
de produo de metano
Nmero de moles CH4
Figura 6 Curva de calibrao para
quantificao do metano
Artigo Tcnico
matografia gasosa (Figura 6). Conforme
discutido anteriormente, isso pode ser
feito injetando-se diferentes quantida-
des de um gs contendo porcentagem
fixa de metano, ou volumes fixos de ga-
ses contendo diferentes porcentagens de
metano. Por sua vez, o nmero de moles
de metano que injetada no cromat-
grafo durante a construo da curva de
calibrao obtido conhecendo-se o
volume de metano injetado bem como
a temperatura e presso local.
A curva de calibrao permite
ento que o nmero de moles de me-
tano produzido diariamente no frasco
de reao seja determinado a partir da
injeo de um volume fixo de amostra
(Ex. 1 ml). Uma vez conhecido o n-
mero de moles de metano produzido
diariamente, pode-se obter a produo
diria em termos de ml CH4/d, bem
como a produo acumulada em ter-
mos de gDQOCH4 conforme racioc-
nio desenvolvido anteriormente. De
forma similar, o valor da AME, em
gDQOCH4/gSSV.d, pode ser calcula-
do conhecendo-se a quantidade de
lodo usada como inculo (g SSV) e a
taxa mxima de produo de metano
(gDQO CH4/d) obtida no trecho de
maior inclinao.
Tempo incubao (d)
rea
Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201
 Aquino, S. F. et al.
Artigo Tcnico
Medio direta do volume de metano
A nica diferena entre o mtodo
de medio do volume e composio
descrito anteriormente e o mtodo da
medio direta de metano que, para
se medir o volume de apenas metano,
deve-se lavar o biogs com uma soluo
de soda (Ex. NaOH 15%) para que haja
a absoro do CO2 de acordo com as
seguintes reaes:
H2O + CO2 * H2CO3 (7)
H2CO3 + 2NaOH * Na2CO3 + 2H2O
(8)
CO2 + 2NaOH & Na2CO3 + H2O (9)
Esse procedimento assume que o
CO2 e o CH4 so os principais constitu-
ntes do biogs formado durante o teste
de AME. Essa considerao vlida de incubao ser seguida da expulso
uma vez que em pH neutro a maior
parte da amnia (NH3) e metade do
sulfeto de hidrognio (H2S), se presen-
tes, estaro ionizados e dissolvidos na
fase lquida como NH4+ e HS-.
Diferentes grupos de pesquisa
brasileiros usam esta metodologia
(Rocha et al, 2001; Alves et al, 2005),
e o monitoramento da produo de
metano tambm feito diariamente,
com o auxlio de uma seringa conectada
a um recipiente para absoro do CO2.
A grande vantagem dessa metodologia
que ele dispensa o cromatgrafo
para determinao da composio do para o correto funcionamento dos apa-
biogs. Por isso essa tcnica tem baixo
custo e pode ser implementada em,
literalmente, qualquer laboratrio de
monitoramento, e mesmo em ETEs
pequenas sem grande capacidade de
infra-estrutura. A medio de metano
do biogs pode ser realizada como
ilustrado na Figura 7.
A Figura 7 mostra que o volume
de metano produzido pode ser aferido
medindo-se o volume do biogs lavado
(Aparato I), ou o volume de soluo de
hidrxido deslocado pelo gs lavado
(Aparato II). No Aparato I pode-se,
no momento da leitura, conectar o fras-
co de incubao ao frasco de NaOH por
meio de um sistema agulha-mangueira
latex-agulha, de forma que a introdu-
o da agulha da seringa esmerilhada no
septo do frasco de NaOH cause a au-
tomtica despressurizao do frasco de CONCLUSES
incubao. Como o gs entra no frasco
de NaOH abaixo do nvel da soluo,
garante-se que o gs medido na seringa
esmerilhada seja predominantemente
metano. No caso do Aparato II, o sis-
tema agulha-mangueira latex-agulha
Eng. sanit. ambient. 200
Aparato I
Gs livre de CO2
(medio volume com
seringa esmerilhada)
Frasco Frasco
incubao NaOH 15%
Figura 7 Esquema de dois aparatos experimentais para lavagem do
biogs e medio do volume de metano produzido
tambm seria usado para conectar o
frasco de incubao ao frasco de NaOH,
entretanto a despressurizao do frasco
incubao do lodo (concentrao de bio-
de soluo de soda, que corresponde
ao volume deslocado pelo metano. O
volume de metano produzido pode ser
conhecido atravs da medio do volu-
me ou peso da soda expulsa do frasco.
Caso se opte pela pesagem do liquido
tambm deve ser conhecida a densidade
da soluo alcalina. A grande vantagem
do Aparato I a sua simplicidade e a
dispensa da necessidade de recompo-
sio peridica do volume da soluo
de NaOH, enquanto que a vantagem
do Aparato II a dispensa do uso das
seringas esmerilhadas. Salienta-se que
ratos I e II, as mangueiras utilizadas nas
conexes agulha-mangueira-agulha
devem ser impermeveis a gases (Ex.:
mangueiras tipo cristal ou de ltex,
impermeveis a gases).
Uma vez conhecido o volume
de metano produzido diariamente,
pode-se obter a produo acumulada
em termos de gDQOCH4/d conforme
raciocnio desenvolvido anteriormente.
De forma similar, o valor da AME, em
gDQOCH4/gSSV.d, pode ser calcula-
do conhecendo-se a quantidade de
lodo usada como inculo (g SSV) e a
taxa mxima de produo de metano
(gDQO CH4/d) obtida no trecho de
maior inclinao e que corresponda a
uma utilizao de, pelo menos, 50%
do substrato adicionado.
Esse artigo apresentou uma reviso
sobre os diferentes testes normalmente
utilizados para a determinao da
atividade metanognica especfica
(AME) de lodos anaerbios. Apesar do
Aparato II (Frasco de Mariotte)
Gs livre
de CO 2
Frasco
NaOH 15%
Medio do volume
Vreao deslocado com proveta
esforo de alguns pesquisdores, no h,
na literatura nacional e internacional,
consenso sobre as melhores condies de
massa, tipo e concentrao de substrato,
relao alimento/microrganismo, tipo e
concentrao de nutrientes, tempo de
incubao), bem como procedimentos
de medio de metano (manomtricos,
volumtricos) para a execuo do teste.
A no existncia de um procedi-
mento padro para a determinao da
AME, dificulta a comparao dos resul-
tados obtidos por diferentes estudos, e
limita a aplicabilidade e disseminao
do teste de AME como ferramenta
de controle dos processos anaerbios.
Dessa forma importante que novas
pesquisas investiguem a possiblidade
de harmonizao do teste de AME,
tanto pela adoo de procedimentos
comuns de incubao do lodo, como
pela avaliao da confiabilidade dos
diferentes mtodos de medio do
metano durante o teste.
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Endereo para correspondncia:
Srgio F. Aquino
Departamento de Qumica
Universidade Federal de Ouro
Preto - UFOP
Campus Morro do Cruzeiro
35400-000 Ouro Preto Minas
Gerais - Brasil
E-mail: sergio@iceb.ufop.br
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Vol.12 - N 2 - abr/jun 2007, 192-201