TRABAJO PRCTICO N 1: CONSTITUYENTES BSICOS DE LOS ALIMENTOS

TEMA: Determinacin de constituyentes bsicos

OBJETIVOS: - Relacionar los conceptos tericos desarrollados con su aplicacin prctica

- Identificar las diferentes tcnicas para la determinacin de constituyentes bsicos de los
alimentos segn el tipo de alimento a analizar
- Adquirir destreza en el manejo de las tcnicas y del material de laboratorio y uso eficiente
del tiempo
- Aprender a trabajar en equipo
- Explicar e interpretar los resultados obtenidos
- Disear y organizar el protocolo de anlisis

DETERMINACIN DE HUMEDAD

En los lquidos el agua se expresa como extracto seco y en los slidos y pastosos, como humedad.
Existen dos categoras de mtodos: directos: que valoran el agua separndola del productos y
determinando su proporcin por gravimetra o volumetra; indirectos: en los que se determinan el
porcentaje de agua eliminada pesando finalmente el producto.

Mtodos indirectos:

Mtodo de eliminacin trmica del agua y su determinacin por prdida de peso

Aplicacin:

Es aplicable a todos los productos alimenticios excepto los que pueden contener compuestos
voltiles distintos del agua o los que son susceptibles a la descomposicin a 100C. La
aplicacin de altas temperaturas en estufas para lograr la remocin total del agua, puede
producir los siguientes inconvenientes:

- Volatilizacin de componentes no acuosos, lo que depende de la composicin del alimento.

- Descomposicin trmica de componentes inestables e interaccin de componentes pudiendo
resultar una formacin de humedad adicional o de nuevas sustancias que son voltiles
- Oxidacin de componentes oxidados por el aire

Procedimiento

- Se deseca la cpsula vaca y su tapa, en la estufa durante 15 minutos y se la transfiere a un

desecador para que se enfre.
- Se homogeneiza la muestra y se pesa 5 g en la cpsula
- Se tapa y se pesa rpidamente
- Se quita la tapa y se coloca ambas en estufa a 100-105C durante 2-3 horas
- Se retira la cpsula, se coloca la tapa, se enfra en desecador y se pesa
- Se coloca en estufa nuevamente 1 hora, para comprobar que se alcanz el peso constante

Clculos
 ( P2 P3 )
%H h .100
P2 P1

( P2 P3 )
%H s .100
P3 P1

Siendo
- H h = humedad de la muestra en base hmeda
- H s = humedad de la muestra en base seca
- P2 = peso de la cpsula mas muestra
- P3 = peso de la cpsula, mas muestra desecada
- P1 = peso de la cpsula desecada
- P2 P3 = prdida de peso
- P2 P1 = peso de la muestra
- P3 P1 = peso de la muestra desecada

( P3 P1 )
% Slidos Totales .100
P2 P1

Mtodos directos:

a) Mtodo termovolumtrico de destilacin y arrastre por tolueno (Markusson, )

Este mtodo puede ser aplicado a alimentos que posean muchos componentes voltiles, como
las especies que poseen aceites esenciales.
En este procedimiento se forma una mezcla azeotrpica que hierve a unos 111C, logrando
medir volumetricamente el agua y reduciendo al mnimo la posibilidad de reacciones pirolticas
que conducen a la formacin de agua adicional; se agrega tolueno saturado de agua hasta cubrir
la muestra (aprox. 975 ml) y perlas de vidrios. Se adapta la trampa de Dean-Stark graduada en
dcimas de ml y provistas de refrigerante ascendente. Se calienta de manera que destilen entre
100 200 gotas por minuto hasta que el lquido ya no destile turbio y permanezca invariable el
nivel de la capa inferior acuosa (1 hora aproximadamente), cuyo volumen se lee a 25C. Se
puede agregar a la trampa una gota de solucin tolunica de Sudn para visualizar la separacin
de las capas.

b) Mtodo qumico de Karl Fischer

Determina la humedad con un reactivo especial a base de iodo, anhdrido sulfuroso, piridina y
metanol

Reaccin qumica: 2 H 2 O SO2 I 2 H 2 SO4 2 HI ( ac )

DETERMINACIN DE CENIZAS TOTALES

Mtodo de incineracin en mufla a 550C

 Todos los alimentos contienen elementos minerales, formando compuestos orgnicos e
inorgnicos y resulta muy difcil determinarlos tal como se presentan en los productos
alimenticios.
El mtodo de incineracin al destruir toda la materia orgnica presente, cambia su naturaleza;
las sales metlicas de los cidos orgnicos se convierten en xidos o carbonatos, o reaccionan
durante la incineracin para formar sulfitos, fosfatos o haluros (sales de halgenos).
Algunos elementos como el azufre y los halgenos, pueden no ser completamente retenidos en
las cenizas, perdindose por volatilizacin.

Aplicacin:
El mtodo es aplicable a todos los tipos de productos alimenticios, con excepcin de aquellos
ricos en grasas (ms del 50%).

Principio:
Se realiza un calentamiento en etapas, primero para eliminar el agua, a continuacin para
carbonizar el producto y finalmente para incinerar en mufla a 550 C.

Procedimiento:
- Se seca el crisol a 100C durante 15 minutos, se enfra y se pesa
- Se homogeneiza la muestra y se transvasa al crisol 5 g de la misma
- Si la muestra es lquida se debe pre-desecarla sobre bao de vapor, para evitar salpicaduras
durante la fase de carbonizacin
- Se coloca el crisol sobre el calentador y se va incrementando la temperatura hasta que cese
el desprendimiento de humo y la muestra aparezca totalmente carbonizada
- Se coloca el crisol en la mufla y se incinera durante 30 minutos a 550C
- Si las cenizas presentan aspecto lmpio y color blanco, se enfra y se pesa. Si se observan
trazas de carbn, se agregan unos mililitros de agua destilada, se agita con varilla de vidrio,
se seca sobre bao de vapor y se coloca nuevamente en la mufla durante 30 minutos.

Clculos:

( P3 P1 )
% de cenizas .100
P2 P1

Siendo
- P3 = peso del crisol desecado mas cenizas
- P1 = peso del crisol desecado
- P2 = peso del crisol desecado mas muestra
- P3 P1 = peso de cenizas
- P2 P1 = peso de la muestra

DETERMINACIN DEL CONTENIDO DE LPIDOS TOTALES

Mtodo Soxhlet:
Esta determinacin suele designarse con el nombre de extracto etreo, pues se extraen
adems de los lpidos, otros principios solubles en el solvente.
Este aparato clsico consta de tres partes a saber: el baln, el extractor propiamente dicho y
el refrigerante, los cuales se acoplan perfectamente por medio de uniones esmeriladas.
La parte ms importante es el extractor, en donde se coloca la sustancia seca en un dedal de papel
de celulosa de medidas adecuadas al dimetro del extractor. Al costado del mismo se encuentra un
tubo grueso por donde circulan los vapores del solvente que luego se condensa en el refrigerante
para caer enfriado sobre el dedal que tiene el producto a extraer. En el costado opuesto del extractor
se observa un sifn que descarga el solvente en el baln, acompaado de las sustancias extractivas
(grasa, colorantes entre otros.), repitiendo este ciclo tantas veces como sea necesario para agotar el
contenido de lpidos de la muestra.

Aplicacin
El mtodo es aplicable para la determinacin del contenido de materia grasa libre; es utilizado
para determinar el contenido de aceite en semillas de oleaginosas

Principio
La grasa se extrae con ter de petrleo a partir del residuo desecado, obtenido en la determinacin
de humedad. El solvente se elimina por evaporacin y se pesa en residuo de grasa.

Procedimiento
-Se deseca el dedal de extraccin y el baln durante 15 minutos
- Se transfiere aproximadamente 5 g de muestra seca al dedal de extraccin; se tapa con un copo de
algodn y se pesa.
- Se coloca el dedal en el extractor, se conecta a un baln tarado previamente que contenga un
volumen de ter equivalente a una vez y media el volumen del extractor.
- Se extrae los lpidos de la muestra bajo reflujo durante 2- 3 horas, tomando la precaucin al
finalizar, de apagar la fuente de calor un instante antes de que accione el sifn; se desconecta el
baln y se elimina el resto del solvente del extractor.
- Se evapora a sequedad el extracto de ter de petrleo.
- Se deseca el baln y el dedal de extraccin durante media hora, se enfra y se pesa

Clculos:

( P5 P1 )
% de grasa extrada .100
P3 P2
Siendo
- P5 = peso del baln con grasa
- P1 = peso del baln desecado
- P3 = peso del dedal de extraccin ms algodn ms muestra
- P2 = peso del dedal de extraccin ms algodn
- P5 P1 = peso de grasa extrada
- P3 P2 = peso de la muestra

Esta frmula expresa el porcentaje de grasa extrada en base seca, si se parte de la muestra que
ha sido previamente desecada. En caso contrario, es decir, si se parte de una muestra hmeda, la
frmula expresar el porcentaje extrado en base hmeda. En este caso, para obtener esos
valores en base seca, se aplica la siguiente frmula:

% grasa extrada en base hmeda

% de grasa extrada en base sec a .100
% slidos totales
 DETERMINACION DE PROTEINAS

El contenido en nitrgeno, se expresa como nitrgeno total o protena (N x 6,25). Este

procedimiento se basa en un proceso que comprende dos fases de digestin, empleando cido
sulfrico concentrado y perxido de hidrgeno al 30%. El cido deshidrata y carboniza la muestra,
y el perxido completa la descomposicin de la muestra.
La etapa de carbonizacin previa a la adicin del perxido de hidrgeno, proporciona un
medio reductor, el cual ayuda a convertir nitrgeno orgnico en sulfato de amonio. En presencia de
compuestos de carbono oxidables, el cido sulfrico reacciona para producir dixido de azufre, el
cul es un agente reductor activo.
La reaccin es:
H2SO4 H2O + SO2 + O2
El perxido de hidrgeno reacciona inmediatamente con el cido sulfrico a la temperatura
de digestin, para dar cido peroximonosulfrico:
H2SO4 + H2O2 H2SO5 + H2O
El nitrgeno orgnico se transforma primero, en sulfato de amonio y finalmente en
amonaco el cul se determina colorimtricamente con el Reactivo de Nessler

Objetivo:
Determinar el contenido de protena en una muestra de jalea real, como un parmetro de calidad de
la misma.

Aparato:
Digestor para microKjeldahl

Reactivos:
1- Acido sulfrico concentrado (98%, d = 1,84)
2- Perxido de hidrgeno al 30 % (100 volmenes)
3- Estabilizador mineral: comercial
- Tartrato de sodio y potasio
- Citrato de sodio
- Agua desmineralizada

4- Alcohol polivinlico: comercial

5- Reactivo Nessler: (Tetraiodomercuriato potsico, Hidrxido de potasio), comercial (Merck)

(txico)
Composicin:
- Hidrxido de Potasio
- Ioduro de Sodio
- Ioduro mercrico
- Agua
En presencia de iones amonio, se descompone formando yoduro de dimercuriamonio, que se
determina colorimtricamente a 460 nm

2 Hg I4 + 2NH3 2NH3HgI2 + 4HI-

2 NH3HgI2 NH2Hg2I3 + NH4+ + I-

6- Estndar primario para la curva de calibracin: Cloruro de amonio, anhidro p.a.

7- Estndar primario de control: glicina para-toluensulfonato

Procedimiento:
El procedimiento consta de dos etapas:

A) Digestin
B) Determinacin colorimtrica

A) Digestin:
1- Se transfiere al matraz volumtrico de digestin de 100 ml, una cantidad de muestra exactamente
pesada de 0.3 g en base seca.

2- Se agrega al matraz de digestin, 4 ml de cido sulfrico concentrado.

3- Se coloca el matraz de digestin con la pesa incorporada en el cuello del mismo, sobre la placa
calefactora. Se adosa la columna de fraccionamiento y se produce la succin en la misma mediante
la puesta en funcionamiento del sistema generador de vaco. (Trabajar bajo campana y con el
extractor encendido)

4 - Se ajusta la temperatura de digestin en 440C, y se calienta paulatinamente hasta alcanzar la

misma.
Nota: si la muestra produce espuma que asciende hasta el cuello del matraz, bajar la temperatura
hasta 335C. Continuar el calentamiento a esta temperatura hasta que todo el agua se evapore.
Luego retornar a la temperatura de digestin inicial.

5- Una vez alcanzada la temperatura de 440C, se mantiene el calentamiento durante 5 minutos, sin
permitir el secado de la muestra en el interior del matraz. Si la muestra se seca (si no hay cido
sulfrico), no continuar con el punto 6.

6- Se coloca en el embudo capilar, 10 ml de perxido de hidrgeno al 30%.

7- Una vez finalizada la adicin de perxido de hidrgeno, se calienta 1 minuto ms para permitir
la evaporacin del exceso de perxido. Se deja enfriar y se lava el dispositivo con agua destilada,
dejando que la misma gotee desde el embudo.
Nota: si el digerido no es incoloro, agregar 5 ml de perxido de hidrgeno hasta que el digerido se
aclare

8- Se saca el matraz con los dedos de amianto y se coloca en el ladrillo refractario, para acelerar el
enfriamiento. Se retira la columna de fraccionamiento y se deja enfriar hasta temperatura ambiente.

9- Agregar al matraz agua destilada, lentamente, y finalmente enrasar a volumen final.

Homogeneizar el digerido.

B) Determinacin colorimtrica del digerido:

Los siguientes procedimientos se aplican tanto al digerido de la muestra, como a un blanco
que se obtiene de la misma manera que la descripta en el item A, con la diferencia de que la muestra
se sustituye por idntico peso de agua destilada.

1- Se toma 0.5 ml del digerido y del blanco y se coloca por separado en matraces de 25 ml.
2- Se agrega a ambos matraces 10 ml agua destilada y luego 3 gotas de estabilizador mineral. Se
homogeiniza el preparado, mediante sucesivas inversiones de los matraces. Se adiciona 3 gotas de
alcohol polivinlico a cada matraz y se homogeiniza nuevamente.

3- Se enrasa ambos matraces con agua destilada.

4- Se toma 1ml de reactivo de Nessler y se agrega a cada matraz; se invierte repetidamente y luego
se espera que transcurran 5 minutos para que el preparado desarrolle color.

5- Se lleva a cero de absorbancia con el blanco, a 460 nm

6- Se lee la absorbancia de la muestra.

7- Con el dato de absorbancia obtenido, se determina la concentracin de nitrgeno con la curva de

calibracin.

8- Para obtener el porcentaje de nitrgeno en la muestra ( % N, en base seca), se aplica la siguiente

frmula:

%N = a x 0.5 a: concentracin de N en mg/l

b b: g de muestra en base seca

Clculo del % de protena:

Con el dato del % de N obtenido de la etapa B), se determina el porcentaje de protenas.
Protenas (% N x 6,25)

Curva de calibracin:
1) Se prepara una solucin estndar de cloruro de amonio, anhidro, (sal inorgnica soluble en agua;
no requiere digestin): pesar exactamente 0,381873 g, disolver con un poco de agua destilada y
llevar a volumen final de 100 ml (Solucin A). Tomar exactamente 1ml de solucin A , colocar en
un matraz de 100 ml y llevar a volumen final de 100 ml con agua destilada (Solucin B) (Conc. 10
mg de N/l).

2) Preparar 5 matraces de 25 ml, numerados y agregar a cada uno:

NDE MATRAZ SOLUCION B (ml) AGUA DESTILADA (ml) CONCENTRACIN
(mg de N /L)
1 2,5 10 1
2 5 7,5 2
3 7,5 5 3
4 10 2,5 4
5 12,5 - 5

3) Agregar al matraz N 1, 3 gotas de estabilizador mineral y mezclar, luego tres gotas de alcohol
polivinlico y mezclar. Llevar a volumen final de 25 ml con agua destilada y mezclar. Luego, se
agrega 1 ml del reactivo de Nessler y se mezcla. Dejar en reposo la solucin durante 5 minutos y
luego leer en espectrofotmetro a 460 nm. Proceder de la misma manera, con los matraces N 2, 3,
4 y 5.
4) Con los datos obtenidos, se obtiene una grfica de absorbancia vs. concentracin (mg N/l)
Paralelamente, se procede a digerir 0,15 g de un estndar primario de control: glicina-
paratoluensulfonato, y se realiza un tratamiento igual a la muestra, para obtener el % de N.
* Estndar primario de control: Para-toluensulfonato de amonio: C7H11O3SN, (7,402 % de N) sal
orgnica soluble en agua, puede ser digerida, pero no necesariamente. Glicina-para-toluensulfonato:
C9H13O5SN (5,665 % N) sal de un aminocido, relativamente fcil para digerir. Acido nicotnico-
para-toluensulfonato: C13H13O5SN, (4,743 % de N) de difcil digestin.

DETERMINACIN DE HIDRATOS DE CARBONO

En los productos elaborados contienen azcares reductores y no reductores, naturales o bien

agregados. Los azcares no reductores estn representados principalmente por sacarosa.
La sacarosa original sufre una inversin gradual durante el procesado y almacenamiento, y se
producen azcares invertidos: glucosa y fructosa.
Por el mtodo de Fehling-Causse Bonnans pueden determinarse azcares reductores directos y
azcares totales, y para este ltimo debe hacerse una inversin previa de la muestra. La
determinacin directa de azcares reductores en un producto elaborado, no es un valor constante,
pues variar con la inversin.

La composicin del reactivo de Fehling-Causse Bonnans es la siguiente:

- Tartrato doble de sodio y potasio (Sal de Seignette): 130 g

- Hidrxido de sodio: 110 g
- Sulfato cprico, pentahidratado: 24 g
- Ferrocianuro de potasio: 18,8 g
- Agua destilada, c.s.p. 1000 ml

Principio del mtodo:

Este mtodo se basa, en que a la temperatura de ebullicin, los productos de resinificacin de

azcares reductores, son oxidados en medio alcalino por el cobre, que en el reactivo de Fehling se
encuentra formando un complejo cupro-tartrato sdico- potsico.
La reduccin se efecta en medio alcalino porque se exalta as, el poder reductor. Dado que los
productos que se obtienen no siempre son los mismos, variando de acuerdo al tiempo que dura la
determinacin y a la concentracin de la solucin azucarada, adems que distintas hexosas en igual
concentracin no reducen la misma cantidad de cobre, se impone una rigorosa estandarizacin del
mtodo.
Se deben emplear iguales volmenes de reactivos, la misma temperatura de calentamiento,
concentraciones azucaradas similares y el mismo tiempo de reaccin. Solo as, las determinaciones
se harn comparables.
Respecto al tiempo, es variable segn el azcar, aunque para la mayora y para los que ms nos
interesa (glucosa y fructosa), la determinacin debe efectuarse durante los dos primeros minutos de
ebullicin, en caso contrario se cometen errores.
La concentracin se aconseja aproximarla a valores cercanos a 5g/l. En este mtodo la solucin
cupro-alcalina contiene ferrocianuros de potasio que permite un punto final muy claro, pues retiene
el in cuproso formado, como ferrocianuro cuproso de color amarillo en solucin por unos
instantes, para dar luego el precipitado castao.
Reactivo
- Solucin de acetato de plomo cristalizado al 25%
- Solucin de azcar invertido
- Solucin de azul de metileno al 1%
- Reactivo de Fehling- Causse-Bonnans (F.C.B)

Procedimiento

Preparacin de la muestra
La determinacin de azcares reductores, requiere una operacin previa: ajuste de la
concentracin de azcares y desproteinizado de la muestra, ya que esto ltimo evita que sustancias
no azucaradas reduzcan el cobre del reactivo Fehling. El desproteinizado se realiza con acetato de
plomo.

a) Para azcares reductores directos:

Se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 100 ml de capacidad, una
cantidad de muestra, pesada con precisin de mg que permita obtener una solucin
azucarada de aproximadamente 0,5-1 % de concentracin.
Se agrega la cantidad de acetato de plomo necesaria para desproteinizar la solucin
(generalmente solo son necesarios de 1 a 10 ml).
Se deja decantar el precipitado y se agrega una gota de acetato de plomo al lquido claro
sobrenadante; si se forma mas precipitado, se agrega ms acetato de plomo.
Se lleva a volumen final la solucin con agua destilada, se mezcla y se filtra a travs de
papel de filtro; se desechan los primeros mililitros y se filtran por lo menos 50 ml del
lquido; si el filtrado saliera turbio, refiltrar hasta obtener un lquido aceptablemente
claro.

b) Para azcares totales:

Se transvasa a un matraz de 100 ml, 50 ml de la solucin desproteinizada.
Se aaden 10 ml de la solucin al 20% de HCl o 5 ml de HCl concentrado y 5 ml de
agua destilada.
Se mantiene a 20C durante 24 horas o bien 1 hora a 70C a bao Mara.
Se neutraliza con solucin de NaOH al 30% usando como indicador 3 gotas de solucin
de fenolftalena, hasta coloracin levemente rosada.
Se completa a volumen con agua destilada y se mezcla; se filtra la solucin si fuera
necesario.

Titulacin de la muestra

- Se coloca en un Erlenmeyer de 250 ml de capacidad, 15 ml de reactivo de F.C.B y 50 ml de

agua destilada; se calienta la solucin hasta ebullicin, e inmediatamente se agrega por
medio de una bureta acodada, la muestra preparada a razn de 3 gotas por segundo,
cuidando de mantener una franca ebullicin.
- Prximo al punto final, el que se aprecia por la leve coloracin verdosa que toma el lquido,
se agregan dos gotas de la solucin de azul de metileno, y una vez que este sea distribuido
uniformemente, se continua la adicin de la solucin azucarada a razn de 1 o 2 gotas por
vez y con intervalos de unos segundos, hasta la desaparicin del color azul.
Clculos

15 ml del Reactivo F.C.B, son reducidos por 0,041g de azcar invertido

Para azcares reductores directos:

0.041.100
A.r (%) .100
G.V

Para azcares totales:

0.041.100
A.t (%) .100
G.V .50

Para azcares no reductores:

A (%) = A.t (%) A.r (%)

Siendo:
A.r: Contenido de azcares reductores, en % en peso
A.t: Contenido de azcares totales, en % en peso
A: Contenido de azcares no reductores, en % en peso
V = Volumen en ml del lquido azucarado desproteinizado, y previamente invertido, empleado en la
valoracin
G = peso de la muestra, en gramos.

c) Azcares en dulce de leche, leche condensada, entre otros.

Reactivos
- ter etlico
- Acetato de plomo neutro (30%)
- Na2 SO4 (30%)
- HCl concentrado
- NaOH (40% y 10%)

Procedimiento
- Se pesan 10 g de muestra en vaso de precipitado tarado.
- Se agrega una cucharadita de arena calcinada y se elimina la grasa en 3 porciones de 10 ml
de ter etlico agitando cada vez con ayuda de una varilla (se desechan las fases etreas)
- Luego se evapora el exceso de ter en bao Mara a 40 - 50C.
- Se agregan aproximadamente 60 ml de agua a 37C y se agitan hasta completa
homogeneizacin.
- Se agregan 5 ml de solucin de acetato de plomo, se mezclan bien y se elimina el exceso de
plomo con 6 ml de solucin de sulfato de sodio (se respetan los volmenes de ambas
soluciones)
- Posteriormente se deja decantar 30 minutos y se filtran, preferiblemente en Bchner al
vaco. Los primeros ml del filtrado pueden ser turbios, en tal caso se les vuelca nuevamente
en la solucin y se vuelve a filtrar con el mismo papel.
- Se lava 3 veces con aproximadamente 20 ml de agua cada vez, luego se pasa el filtrado a un
matraz de 200 ml, se enrasa y se homogeneiza bien.
- Los azcares reductores se determinan de la misma forma.

Azcares reductores totales

Procedimiento
- Se colocan 50 ml de la solucin anterior en un Erlenmeyer de 150 ml y se agregan 1,8ml de
HCl concentrado.
- Se deja 15 minutos en bao Mara a 65C.
- Se neutraliza al tornasol con la solucin de NaOH de la siguiente manera: con 1ml de la
solucin al 40% y luego con la del 10%, gota a gota.
- Se pasa a un matraz de 250 ml, se enrasa y se homogeneiza.
- Esta solucin tienen una concentracin aproximadamente de 5g/l en azcares reductores, tal
como lo exige el mtodo a emplear.

Nota: si se dejan soluciones azucaradas de un da para el otro, es necesario agregarles unos

cristales de fenoles o pocas gotas de una solucin de propionato de calcio. Guardar en heladera.

d) Azcares totales (solubles e insolubles) A.O.A.C (1980) Modificada.

Mtodo directo por hidrlisis cida y valoracin de la glucosa liberada

Reactivos

dHCl = 1,125
Soluciones de NaOH al 10% y 40%

Procedimiento

- Se disuelven 3 g de muestra en 200 ml de agua acidificada con 20 ml de HCl y se transfieren

a un baln de 500 ml conectado a un refrigerante a reflujo; se caalienta durante 2 horas.
- Se enfra y se lleva a neutralidad con solucin de NaOH (comenzando con el NaOH 40 % y
siguiendo con el NaOH 10%).
- Luego se transvasa a un matraz aforado y se lleva a 500 ml con agua destilada
- Se agita y se filtra descartando las primeras gotas.
- Se valora la glucosa liberada por el mtodo de Fehling- Causse Bonnans modificado

Azcares insolubles A.O.A.C p.334 y 495 (1965)

Procedimiento

- Se diluyen 3 g de muestra en 30 ml de una solucin alcohol-agua (70% v/v)

- Se filtra y se lava la fraccin insoluble con la misma solucin, hasta llevar el filtrado a un
volumen de 50 ml (con este filtrado se pueden determinar azcares reductores y no
reductores, segn los mtodos mencionados anteriormente)
- Luego se transfiere la fraccin insoluble con 200 ml a un matraz de 500 ml, se agregan 20
ml de HCl, y se contina segn lo indicado en el mtodo b.
- DETERMINACIN DE FIBRA DIETARIA TOTAL
 Incubacin con -amilasa estable al calor a pH 6; 15 minutos, 95C

Incubacin con proteasa a pH 7,5; 30 minutos , 60C

Incubacin con amiloglucosidasa a pH 4,5; 30 minutos, 60C

Precipitacin con etanol (Filtracin)

Lavados con etanol y acetona

Secado

Determinacin de protenas
por Kjeldahl Determinacin de cenizas
2 horas, 525C

Clculo de fibra dietaria total

Aparatos:
Crisoles filtrantes: porosidad N2 (gruesa 40 -50m)
Fuente de vaco. Una bomba de vaco o aspirador equipado con un frasco de vaco de lnea
doble, para ser usado para prevenir la contaminacin en caso de regreso de agua.
Secado en estufa a 105C o en estufa al vaco a 70C
Desecador
Mufla
Bao de agua hirviente
Bao de agua ajustar a temperatura constante a 60C con un agitador de multiestacin o un
agitador magntico de multiestacin para proveer la agitacin de los frascos de digestin
durante la hidrlisis enzimtica
Vaso de precipitacin: 400 o 600 ml
Balanza analtica capaz de pesar hasta 0.1mg
pH-metro: estandarizado a pH 4 y pH 7

Reactivos:
Nota: Emplear agua destilada o desionizada, para hacer las soluciones.
ter de petrleo: grado reactivo
Etanol 95% (v/v): grado tcnico
Etanol 78%
Acetona: grado reactivo
Buffer fosfato 0.08 M pH = 6
-amilasa; estable al calor
proteasa
amiloglucosidasa
NaOH 0.275 N
HCl 0.325 M
Celite, cido lavado (slice de diatomeas)
Preparacin:
Crisoles:
Se limpian los crisoles.
Se calienta una hora a 525C y se enfra
Se empapa y se enjuaga con agua; se seca al aire
Se agregan 0,5 g de Celite a cada crisol y se seca a 130C hasta peso constante (una hora o ms)
Se enfra en desecador y se pesa aproximadamente al 0,1mg
Se registra ste como Celite + peso del crisol
Se almacena en desecador hasta ser utilizado
Muestra:
Si el contenido de grasa de la muestra es mayor que 10 %, extraer la grasa con ter de petrleo
como describe el procedimiento de A.O.A.C. Se registra la prdida de peso debido a la grasa
extrada y se hace la correccin apropiada al % de fibra dietaria
Cuando se procede con muestras desconocidas, se extrae la grasa total.
Se homogeneiza cada muestra, si es necesario, y se seca toda la noche en una estufa a 105C (70C
en estufa de vaco)
Se enfra en desecador y la muestra seca se muele hasta 0,3 0,5 mm de un tamiz. Si el aparato no
sirve para moler, moler en un mortero suele ser suficiente. Si la muestra no puede ser calentada, se
congela se seca antes de moler.
Se almacena la muestra en un desecador hasta que el anlisis se realice.
Determinacin:
Se corren blancos a travs de todo el procedimiento junto con las muestras, para medir cualquier
contribucin que puedan hacer los reactivos hasta el residuo. Muestras y blancos que van ser
testeados para contenido de fibra dietaria, se deben correr al menos por cuadruplicado, de tal
manera que las protenas duplicadas y los valores de cenizas estn disponibles para mejorar la
exactitud
Se separan cuatro muestras de 1 g de cada material para ser probado en un vaso de precipitacin
alto
Las muestras no deben presentar una diferencia de 20 mg. Se registran los pesos hasta 0,1mg
Se agregan 50 ml de buffer fosfato pH 6 (reactivo 5) en cada vaso
Se agregan 0.10 ml de -amilasa en cada vaso y se mezclan bien
Se cubre cada vaso con hoja de aluminio y se coloca en un bao de agua hirviente. Se agitan los
vasos suavemente a intervalos de 5 minutos. Se incuba por 15 minutos despus de que la
temperatura interna del vaso de precipitacin alcance los 95C.
Se dejan las soluciones enfriar a temperatura ambiente.
Se ajusta el pH de las soluciones a 7.50.2 con la adicin de 20 ml de NaOH 0.275N en cada vaso.
Se chequea el pH, se ajusta si es necesario, ya sea con NaOH o HCl (se necesitan aproximadamente
10 ml de la solucin de NaOH si se usa cido fosfrico 0.205M. (23,64g de H3PO4 en agua)
Se hace una solucin de proteasa 50 mg/ml en buffer fosfato, inmediatamente antes de su uso y
luego se pipetea 0,1ml (5 mg) en cada vaso.
Se cubre cada vaso de precipitacin con hoja de aluminio y se coloca en un bao de agua a 60C,
con agitacin continua, se incuba por 30 minutos despus que la temperatura interna de los vasos de
precipitacin alcance los 60C.
Se dejan las soluciones enfriar a temperatura ambiente.
Se ajusta el pH de las soluciones entre pH 4 y 4,6 adicionando 10 ml de HCl 0.325M en cada vaso
de precipitacin. Controlar el pH ajustar si es necesario con NaOH o HCl.
Se agregan 0,3 ml de amiloglucosidasa en cada vaso.
Se cubre cada vaso de precipitado con hoja de aluminio y se coloca en un bao de agua a 60C, con
agitacin continua, se incuba por 30 minutos despus que la temperatura interna de los vasos de
precipitacin alcance los 60C.
Se agregan cuatro volmenes de etanol 95% en cada vaso de precipitacin.
Se deja la solucin sedimentar toda la noche a temperatura ambiente hasta completa precipitacin.
Filtracin:
Se humedece y se distribuye el lecho de Celite en cada crisol usando etanol al 78%
Se aplica succin para extraer Celite macerado como un no metal sin brillo y uniforme
Se mantiene una suave succin y se transfiere cuantitativamente el precipitado y la suspensin a
partir de cada vaso de precipitacin a sus respectivos crisoles
Se lava el residuo con dos porciones de 10 ml de etanol al 78%, dos porciones de 10 ml de etanol al
95% y 2 porciones de 10 ml de acetona
Se puede formar una goma con algunas muestras, entrampando lquido.
Se rompe la superficie del film con una esptula para mejorar la tasa de filtracin. Se debe asegurar
de rescatar todo el material adherido en la esptula hacia el crisol. El tiempo para la filtracin y el
lavado varia de 6 minutos a 6 horas por crisol, promediando 5 minutos por crisol.
Se secan los crisoles conteniendo los residuos toda la noche a 105C, o en estufa de vaco a 70C
Se enfran todos los crisoles en un desecador, se pesa aproximadamente 0,1mg y se registra el peso
como residuo + Celite + peso del crisol

Peso del residuo = (residuo + Celite + peso del crisol) (Celite + peso del crisol)
Se analizan los residuos de dos muestras y dos blancos para protenas, por anlisis de nitrgeno por
Kjeldahl como est especificado en el procedimiento de AOAC. Se usa 6.25 como factor para
convertir el amonio determinado en el anlisis en protena, excepto donde el contenido de nitrgeno
de la muestra de protena sea conocido
Se hace cenizas el residuo de los crisoles de las 2 muestras y los dos blancos, por 2 horas a 525C.
Se enfra en desecador, se pesa aproximadamente 0,1mg y se registra el peso como cenizas +
Celite + peso del crisol

Peso de cenizas = (cenizas + Celite + peso del crisol) (Celite + peso del crisol)

Clculos: % Fibra dietaria total (FDT) es:

Blanco = promedio peso + promedio peso + promedio de peso

blanco de reactivos (mg) blanco de protenas (mg) de cenizas (mg)

FDT= promedio peso residuo (mg)- promedio peso protena (mg)- promedio peso cenizas (mg).100
promedio peso muestra (mg)