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Sitio Argentino de Produccin Animal

sns N. 7, enero-marzo de 2015


ISSN 2314-2901 / revistasns@senasa.gov.ar

BIOSENSORES ELECTROQUMICOS NANOESTRUCTURADOS PARA LA


DETERMINACIN DE ULTRA TRAZAS DE DROGAS ANABLICAS EN MUESTRAS
DE ORIGEN BOVINO

ELECTROCHEMICAL NANOSTRUCTURED BIOSENSORS FOR DETERMINATION


OF ULTRA-TRACE ANABOLIC DRUGS IN BOVINE SAMPLES

Matas Regiart (Instituto de Qumica San Luis [INQUISAL, CONICET], Departamento de Qumica, Facultad
de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis [UNSL]), Sirley V. Pereira (Instituto
de Qumica San Luis [INQUISAL, CONICET], Departamento de Qumica, Facultad de Qumica, Bioqumica
y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis [UNSL]), Germn Alejandro Messina (Instituto de Qumica
San Luis [INQUISAL, CONICET], Departamento de Qumica, Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia,
Universidad Nacional de San Luis [UNSL]), Martin Fernndez Baldo (Instituto de Qumica San Luis [INQUISAL,
CONICET], Departamento de Qumica, Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional
de San Luis [UNSL]), Viviana G. Spotorno (Instituto de Recursos Biolgicos [IRB, CIRN], Instituto Nacional de
Tecnologa Agropecuaria [INTA], Franco A. Bertolino (Instituto de Qumica San Luis [INQUISAL, CONICET],
Departamento de Qumica, Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis
[UNSL]) y Julio Raba (Instituto de Qumica San Luis [INQUISAL, CONICET], Departamento de Qumica,
Facultad de Qumica, Bioqumica y Farmacia, Universidad Nacional de San Luis [UNSL]) - Argentina.

Resumen Abstract
Los anablicos son drogas capaces de incrementar la Anabolic, drugs able to increase nitrogen retention
retencin de nitrgeno aumentando la acumulacin by increasing the accumulation of proteins in animals
de protenas en los animales, son utilizados en have been used in livestock production and involve a
produccin agropecuaria y entraan un serio serious problem for public health (FAO/OMS, Rome
problema para la salud pblica (FAO/OMS, Roma, 1975). Within these compounds include -agonists,
1975). Entre estos compuestos se encuentran los which have therapeutic uses, but to express its
-agonistas, los cuales empleados en dosis bajas anabolic function require high doses, which generate
presentan usos teraputicos, mientras que utilizados en waste whose accumulation represents a danger for
altas dosis muestran su funcin anabolizante, generan consumers. Since the report of serious food poisoning
residuos cuya acumulacin representa un peligro their use as growth promoter was banned.
para los consumidores. Debido al reporte de serias
intoxicaciones, fue prohibida su utilizacin como The analysis of such residues in animal samples should
promotores del crecimiento. be performed with high sensitivity and selectivity.
The most widely used methods are techniques of
El anlisis de dichos residuos en muestras de origen liquid chromatography and gas chromatography with
animal requiere elevada sensibilidad y selectividad. mass spectroscopy detection, but can also be used
Las metodologas usadas para su determinacin son immunological techniques such as ELISA and RIA.
la cromatografa lquida y gaseosa con deteccin por Alternatively, and because the -agonists containing
espectroscopia de masas y tcnicas inmunolgicas electroactive groups, electrochemical detection should
como ELISA y RIA. Alternativamente, y debido be considered. This detection combined with the use
a que los -agonistas y otros anablicos como el of screen printed carbon electrodes provides many
zeranol contienen grupos electroactivos, la deteccin advantages such as simplicity, versatility, low price,
electroqumica representa una estrategia para ser minimum sample volume required and portability
considerada. Esta deteccin combinada con el uso de system, which allows in situ determinations.
electrodos de lminas impresas ofrece ventajas como
sencillez, versatilidad, bajo precio, mnimo volumen de Another strategy to improve sensitivity over traditional
muestra requerido y portatibilidad del sistema, lo que methods is the incorporation of nanomaterials (metal
permite realizar ensayos in situ. nanoparticles, carbon nanotubes, etc.). These materials
represent a tool for sensors construction because they
La incorporacin de nanomateriales (nanopartculas provide an increased surface area, high conductivity,
metlicas, nanotubos de carbono, etc.) en la superficie electrocatalytic properties, as well as an excellent
de dichos electrodos posibilita mejorar la sensibilidad biocompatibility; therefore can be used as supports

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en comparacin con los mtodos tradicionales. Dichos


for biomolecule immobilization on immunological
materiales se emplean en la construccin de sensores,
and/or enzymatic reactions.
pues ofrecen un aumento en el rea superficial,
conductividad y propiedades electrocatalticas, as Keywords: biosensors, electrochemical, nanomaterials,
como tambin una excelente biocompatibilidad anabolic drugs, bovine samples.
por lo que pueden utilizarse como soportes para
la inmovilizacin de biomolculas en reacciones
inmunolgicas y/o enzimticas.

Palabras clave: biosensores, electroqumica,


nanomateriales, drogas anablicas, muestra bovina.

Introduccin Esto supone un problema importante para la salud


pblica, ya que se originan residuos en los alimentos
La seguridad de los alimentos se ha convertido en una procedentes de los animales tratados. Dentro del
prioridad fundamental para los consumidores, los amplio grupo de residuos derivados del uso de
productores y los organismos pblicos debido a ciertos tratamientos veterinarios se incluyen los compuestos
acontecimientos relevantes como la enfermedad de la antibacterianos, antimicticos y antiparasitarios
vaca loca, la contaminacin de carne con dioxinas, que se emplean en la profilaxis, en el tratamiento de
la utilizacin inadecuada de hormonas, antibiticos, diferentes enfermedades animales y como promotores
derivados transgnicos, etctera. Todos estos sucesos del crecimiento (tranquilizantes, compuestos de accin
demandaron un mayor control por parte de los entes tireosttica y de accin hormonal) (Mersmannetal.).
reguladores, como tambin mejores sistemas de
produccin y tecnologas aplicadas en los alimentos. El uso inadecuado de sustancias tales como los
Esto gener reformas en la legislacin alimentaria -agonistas y otras drogas anablicas ha demostrado
con una poltica dirigida hacia la vigilancia como efectos cancergenos. Algunas de estas sustancias
mecanismo de prevencin. Como consecuencia de pasaron de ser usadas de forma teraputica o
esto la normativa ha sido reformada, para otorgar profilctica, a ser utilizados en dosis que potencian el
un mayor nivel de proteccin a los consumidores crecimiento de los animales (Smithetal.).
(Brambillaetal.).
El empleo de drogas veterinarias representa una
La contaminacin alimentaria se puede definir como herramienta importante en la produccin de alimentos
la introduccin o la presencia de contaminantes en en nuestro pas, por lo que existe un creciente
los alimentos o en la cadena alimentaria que suponen inters en medidas de control ms eficaces, dado
un riesgo para la salud humana (Codex alimentarius, que cualquier episodio puede conllevar la prdida de
1999). La Organizacin Mundial de la Salud (OMS) confianza por parte de los mercados internacionales.
define como residuo a cualquier sustancia qumica Entre las sustancias consideradas peligrosas que
que persiste en un medio tras haber sido introducida en deben controlarse, se encuentra la familia de los
l voluntariamente o no y cuya presencia es cuantitativa -agonistas, que incluye compuestos como el
o cualitativamente anormal. Su origen puede estar clembuterol (CL), zinterol (ZIN), entre otros, junto
en el ambiente, en la aplicacin de promotores del con anablicos de accin hormonal directa como el
crecimiento o de medicamentos de uso veterinario, zeranol (ZEN) (Izquierdo-Lorenzoetal.). Estas drogas
en los aditivos incorporados en los alimentos o fueron originalmente utilizadas para el tratamiento
bien en sustancias procedentes de transformaciones de patologas respiratorias en el ganado debido a
tecnolgicas o tratamientos culinarios (Kuiperetal.). su potente accin broncodilatadora. Sin embargo
su uso fue extendido para incrementar la retencin
En ganadera, los procedimientos zootcnicos, de nitrgeno, aumentando as la acumulacin de
profilcticos y teraputicos son causa frecuente del protenas en los animales (FAO/OMS, Roma, 1975)
ingreso de contaminantes qumicos en la cadena con el fin de lograr una mayor produccin en menor
alimentaria, son capaces de producir intoxicaciones.

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tiempo. El uso de estos compuestos ha sido prohibido, Relevancia y justificacin


pues la acumulacin, larga vida media y estabilidad
de sus residuos afectan la salud humana y deben ser Existe un creciente inters en el campo de la seguridad
cuidadosamente monitoreados (Mitchelletal.). alimentaria respecto del control de sustancias utilizadas
en animales destinados al consumo humano. Entre
Por las razones antes mencionadas, dichos compuestos los elementos considerados peligrosos, se encuentra
son controlados como residuos de medicamentos la familia de los -agonistas, que incluye compuestos
veterinarios en el mbito de la seguridad alimentaria tales como el CL, ZIN y anablicos de accin hormonal
mediante varios mtodos analticos en diversas muestras directa como ZEN.
biolgicas, que incluyen Ultra cromatografa lquida de
alto rendimiento - Espectrometra de masas (UHPLC- Se han reportado varios casos de intoxicacin alimentaria
MS) (Nicolietal.), Cromatografa de gas - Espectrometra humana con sntomas como taquicardia, temblores,
de masas (GC-MS) (Yangetal.), Cromatografa lquida nuseas, diarrea, fiebre, mialgias, astenia e hipertensin.
- Espectrometra de masa (LC-MS) (Crescenzietal.), Su uso en la produccin agropecuaria est prohibido en
Raman scattering (SERS) (Zhu etal.), Electroforesis la Argentina como en la mayora de los pases, incluida
capilar (CE) (Wangetal.), Enzimoinmunoensayo la Unin Europea. La presencia de estos residuos afecta
(ELISA) (Pleadinetal.) e Inmunosensores (Gaoetal.). negativamente la exportacin de productos comestibles
Aunque la determinacin de drogas anablicas por estos de origen animal, pudiendo causar importantes prdidas
mtodos ha sido ampliamente utilizada en diferentes econmicas para nuestro pas.
muestras debido a su alta selectividad y sensibilidad,
Por las razones ya mencionadas, los residuos de
presenta algunas desventajas como un elevado costo,
tales compuestos deben ser controlados en el mbito
complejos pretratamientos de la muestra y prolongados
de la seguridad alimentaria mediante muestras
tiempos de anlisis. El desarrollo de un biosensor
biolgicas. Los mtodos empleados actualmente
electroqumico facilitara dichas determinaciones y
para la determinacin de residuos presentan ciertas
permitira un control ms exhaustivo y econmico sin
desventajas (elevado costo, pretratamientos complejos
perder sensibilidad, y con alta selectividad analtica
de muestra y prolongados tiempos de anlisis, etc.),
(Regiartetal.).
por tanto el impulso de metodologas modernas de
Durante los ltimos aos, se han desarrollado diversas anlisis que ofrezcan soluciones innovadoras frente a
tcnicas de inmunoanlisis para la determinacin de la problemtica planteada reviste gran importancia.
analitos, y los investigadores han enfocado su mirada
Este proyecto plantea el desarrollo de biosensores
en el desarrollo de inmunosensores con deteccin
acoplados a sistemas de deteccin electroqumica, que
electroqumica (Heetal.). Esto se debe principalmente
incorporarn materiales nanoestructurados aplicados
a su elevada sensibilidad y buena compatibilidad
a la deteccin de residuos de drogas anablicas
con las nuevas tecnologas, permitiendo adems la
presentes en muestras de inters provenientes de la
miniaturizacin y la incorporacin de diferentes
actividad agropecuaria. Es llevado a cabo por el grupo
nanomateriales como plataforma de reactivos
de Bioanaltica, Electroqumica y Nanotecnologa
inmunolgicos especficos a travs de un proceso de
dirigido por el Dr. Julio Raba en el Instituto de
inmovilizacin adecuada. Asimismo, posibilitan el diseo
Qumica de San Luis (INQUISAL), Consejo Nacional
de capas de reconocimiento con excelentes propiedades:
de Investigaciones Cientficas y Tcnicas (CONICET),
biocompatibilidad, buena reversibilidad, estabilidad,
Universidad Nacional de San Luis (UNSL), en conjunto
transferencia electrnica y una elevada superficie de
con la Dra. Viviana Spotorno del Instituto Nacional
reaccin que permite el incremento en la sensibilidad de
de Tecnologa Agropecuaria (INTA), en el marco
las determinaciones, debido a una mayor eficacia en las
de los Premios Senasa 2014-2015 a la Investigacin
interacciones entre muestras y reactivos (Guoetal.).
y Transferencia de equipos consolidados, en su
modalidad Calidad e Inocuidad Agroalimentarias.

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Figura 1. Novillo tratado con -agonistas (Unin Ciclista Internacional


[UCI], 2014).

Figura 2: Representacin esquemtica de un inmunosensor. SPCE:

Objetivos electrodo de lminas impresas de grafito. Todas las medidas fueron


realizadas en milmetros (Messina, 2010).

Objetivo general

Desarrollo de biosensores electroqumicos que Metodologia


incorporan materiales nanoestructurados aplicados a la
Actividades principales
determinacin de ultra trazas de drogas anablicas en
muestras bovinas. 1. Se realizar una bsqueda bibliogrfica extensiva de los
temas relacionados con el plan de trabajo propuesto.
Objetivos especficos
2. Se profundizar el aprendizaje y entrenamiento en
Utilizacin de nanomateriales en sistemas de preconcen- el manejo del instrumental electroqumico y las dife-
rentes tcnicas electroanalticas aplicadas.
tracin y modificacin de electrodos empleados para la
deteccin y cuantificacin de los analitos de inters. 3. Desde el punto de vista electroqumico, se estudiarn
las propiedades electroactivas de diferentes compues-
Estudio de las propiedades electroanalticas de elec- tos, como catecol, ter-butilcatecol, hidroquinona y
trodos modificados con nanopartculas metlicas, na- p-aminofenol, para ser utilizados como mediadores
notubos de carbono, entre otros, con el fin de mejorar detectados sobre electrodos desnudos y modificados
con diferentes nanomateriales.
la sensibilidad y especificidad en las determinaciones.
4. Se estudiarn las ventajas de la amplificacin enzi-
Evaluacin y optimizacin de parmetros experi- mtica y comportamiento electroqumico de los elec-
mentales que afectan las estrategias de deteccin trodos modificados.
electroqumica.
5. Se utilizarn distintas tcnicas de modificacin qu-
mica de diferentes matrices, lo que permitir la in-
Estudio de las propiedades electroactivas de los dife-
movilizacin de antgenos o anticuerpos, como ele-
rentes -agonistas, tales como CL, ZEN y ZIN me- mentos biolgicamente activos incorporados en los
diante tcnicas voltamperomtricas. sensores desarrollados.

Utilizacin de biomolculas (antgenos, anticuerpos, 6. Los sistemas desarrollados sern aplicados a la deter-
protenas) inmovilizadas por diferentes tcnicas y en minacin de CL, ZEN y ZIN, entre otros, en mues-
tras bovinas.
distintos soportes, con el fin de obtener nuevas plata-
formas de inmovilizacin. 7. La evaluacin del sistema analtico desarrollado se
realizar por medio de cifras de mrito tales como:
Desarrollo de sensores enzimticos y/o inmunolgicos, lmites de deteccin y cuantificacin, precisin, exac-
con sistemas de deteccin electroqumica, a travs de la titud, frecuencia de anlisis, entre otras.
utilizacin de diferentes tipos de electrodos que permi-
tan la cuantificacin de analitos en muestras biolgicas
tales como pelo, orina y suero bovino, entre otras.

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Ventajas de los biosensores miniaturizados

Reducidos volmenes de muestra.

Menor consumo de reactivos.

Mnimos tiempos de anlisis.

Mltiples procesos integrados en el mismo dispositivo (porttiles).

Automatizacin (confiabilidad y sensibilidad).

Tabla 1. Ventajas de los biosensores miniaturizados (Fernndez-Baldo, 2011).

Tratamiento de los animales

En el experimento, se utilizaron tres novillos holando-argentino de entre 2,5a3aos de edad y aproximadamente


450kg. De acuerdo con el fenotipo, estos animales tienen pelaje blanco con amplias regiones de pelaje negro.
Dos de ellos fueron tratados con una inyeccin intravenosa yugular de 10mL de un formulado veterinario que
contiene 0,03mgmL-1 (0,3mg por animal) de -agonista, segn las instrucciones del protocolo. Treinta y ocho
das posteriores a la primera inyeccin, a estos dos animales se les aplic una dosis mayor, de 65mL (1,95mg por
animal) en dos veces, por la maana y por la tarde. Los tres animales fueron alimentados a pasto con libre acceso
al agua de bebida. Cada semana posterior a las aplicaciones se tomaron muestras de pelo de la misma regin
del animal (de manera que siempre fuera el pelo recin crecido) y de orina que se conservaron a 4C hasta su
anlisis. Los das siguientes a las inyecciones se tomaron muestras de sangre, que se centrifugaron en el da para
la separacin del suero y se guardaron a -20C hasta su anlisis.

Figura 3: Promedio de concentracin de CL en pelo en dos animales tratados (, ) y en un tercer animal utilizado como control () cuantificado por ELISA.
Las flechas indican el tiempo de inyeccin al da 1 y da 39, respectivamente (Spotorno, 2008).

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Desarrollo 1. Caracterizacin del sistema de trabajo

El desarrollo de los biosensores propuestos se basa El comportamiento electroqumico de los diferentes


en el empleo de electrodos de lminas impresas con compuestos y sus derivados se estudiar empleando
electrodos de trabajo de diferentes materiales (oro, voltamperometra cclica (VC) y tcnicas de pulso
grafito, con y sin modificaciones) como sistema de modernas, como voltamperometra de pulso diferencial
deteccin electroqumica. Sobre los electrodos de (VPD) y voltamperometra de onda cuadrada (VOCO)
trabajo se incorporarn nanomateriales para llevar a y utilizando concentraciones de sustrato del orden de
cabo la inmovilizacin o deteccin segn corresponda. 10-4 M o menores. Tambin se emplearn mtodos
Entre los posibles nanomateriales para incorporar auxiliares, como Microscopa Electrnica de Barrido
cabe mencionar: nanopartculas mtalicas (Pt, Au, (MEB) y Microscopa Electrnica de Transmisin
Cu) y/o paramagnticas, nanotubos de carbono y (MET) para la caracterizacin de materiales
grafeno. Los electrodos modificados con materiales heterogneos, pelculas delgadas y sistemas multicapas,
nanoestructurados servirn como plataformas para y Espectrometra Dispersiva en Energa (EDE) o en
la incorporacin de elementos de reconocimiento Longitudes de Onda (EDLO), segn corresponda,
biolgico (inmunorreactivos) que permitan la para cuantificar elementos metlicos y no metlicos
deteccin de manera selectiva de las drogas anablicas que se apliquen en la modificacin de la superficie
antes mencionadas. Se estudiarn las condiciones de electrodos, haciendo uso del microanlisis como
operativas ptimas de estas metodologas para la tcnica no destructiva.
determinacin de niveles extremadamente bajos de
2. Eleccin de las condiciones de trabajo
analitos en las muestras de inters. Las aplicaciones
se centrarn en forma preferencial en analitos con Se estudiarn las condiciones adecuadas de
propiedades teraputicas pero ilegalmente utilizados concentracin, preconcentracin, el medio de trabajo
como anablicos en animales. Algunos de los analitos ya sea acuoso (cido, neutro o bsico) o no acuoso,
propuestos para su correspondiente estudio son: CL, posibles interferentes, etctera. Para soluciones no
ZEN y ZIN, entre otros. Para este fin se usarn tcnicas acuosas los estudios se orientarn a la bsqueda de un
electroqumicas asociadas a metodologas de separacin/ solvente y electrolito soporte adecuado.
preconcentracin. La optimizacin se realizar
mediante herramientas quimiomtricas, siguiendo los 3. Estudio fisicoqumico de las variables que
lineamientos clsicos de la estadstica. La validacin afectan al sistema
de los resultados se har comparndolos con patrones
Se estudiar el efecto de la variacin delpH,
certificados o utilizando metodologas estndares.
particularmente para los sistemas biolgicos, el tiempo
de contacto entre los reactivos inmovilizados y la
muestra, la cintica de las reacciones involucradas, la
fuerza inica, la velocidad de barrido y concentracin
inicial de reactivos. Se evaluar el potencial de pico
(Ep) y la intensidad de la corriente de pico (Ip), al igual
que las modificaciones del Ep y del Ip por la adicin de
el/los analitos de inters.

4. Estudio de los mecanismos enzimticos e


inmunolgicos

Se estudiarn los sistemas enzimticos y/o


inmunolgicos en forma prctica mediante ensayos
Figura 4: Plataforma BAS C-3 conteniendo la celda para las experiencias colorimtricos con deteccin espectrofotomtrica con
voltamperomtricas. Electrodo de trabajo: carbono vtreo (negro), electrodo
de referencia: Ag|AgCl|3M NaCl (blanco) y como contraelectrodo: platino el fin de comprobar su aplicabilidad a los sistemas
(rojo) (Bertolino, 2011). desarrollados. Asimismo, se evaluarn distintos

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mediadores para ser utilizados con el propsito de 7. Anlisis de resultados


seleccionar aquellos que resulten acordes a los fines de Se realizar mediante los lineamientos clsicos de
obtener una seal ptima para el sistema de deteccin la estadstica (Currieetal.) y la constatacin de los
electroqumica. resultados en muestras de patrones certificados (CRM)
o a travs de estudios de recuperacin. Para llevar a
5. Estudio de las distintas tcnicas de inmovilizacin cabo la cuantificacin, se utilizarn los datos obtenidos
de VOCO, VPD o amperometra. La precisin de
Se ensayarn tcnicas de inmovilizacin sobre
las tcnicas desarrolladas se evaluar a travs de
diferentes soportes adaptables a los sistemas en estudio
determinaciones en muestras biolgicas y/o sintticas,
como vidrio de porosidad controlada modificado
adems de su constatacin con mtodos estndares.
con grupos 3-amino propilo, nanotubos de carbono
activados, superficies de carbono, oro y nanopartculas 8. Aplicacin de las metodologas desarrolladas
magnticas modificadas con grupos amino o carboxilo.
Los biosensores electroqumicos nanoestructurados
6. Construccin de biosensores con sistema de sern aplicados en la deteccin de anablicos en
deteccin electroqumico incorporado muestras de inters biolgico (suero, orina, pelo)
mediante la evaluacin de los parmetros estadsticos
Se disearn biosensores con deteccin electroqumica
de estas.
que usarn electrodos de lminas impresas de grafito,
platino u oro (con y sin modificaciones) como
plataformas para la incorporacin de inmunorreactivos
y/o enzimas.

Figura 5: Caracterizacin de nanopartculas de cobre y oxido de cobre. A) La morfologa de las nanopartculas de cobre fue estudiada por microscopia
electrnica de transmisin y barrido; B) Histograma de distribucin de tamao de las nanopartculas de cobre; C) Composicin elemental de las nanopartculas
de cobre; D) La morfologa de las nanopartculas de xido de cobre fue estudiada por microscopia electrnica de transmisin; E) Histograma de distribucin
de tamao de las nanopartculas de xido de cobre; F) Composicin elemental de las nanopartculas de xido de cobre (Regiart, 2015).

Conclusin

La presencia de residuos provenientes de drogas anablicas en productos comestibles de origen animal puede afectar
negativamente la salud de los consumidores, disminuir la exportacin de dichos productos y causar importantes
prdidas econmicas. Por esto, la relevancia de desarrollar biosensores electroqumicos de alta sensibilidad y

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confiabilidad para la determinacin de ultra trazas de Gaichore, R.R. y A.K. Srivastava (2012),
drogas anablicas de abuso en muestras biolgicas. Se Multiwalled carbon nanotube-4-tert-butyl
generara, de este modo, un gran aporte de la Qumica calix(6)arene composite electrochemical sensor
Analtica para la seguridad agroalimentaria. for clenbuterol hydrochloride determination
by means of differential pulse adsorptive
El grupo de investigacin posee una extensa
stripping voltammetry, Journal of Applied
trayectoria en el impulso de metodologas basadas
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en electroanaltica, tratamiento de biosensores
inmunolgicos y enzimticos, sistemas microfludos Gao, L.J., Gan N., Hu F.T., Cao Y.T. y L. Zheng
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