Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Protenas
Prof Eleonora Slide de aula
Protenas
Estruturas conformacionais
So resultantes das foras de ligao entre os diferentes segmentos da cadeia
polipeptdica e freqentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais.
Estrutura secundria
As rotaes em torno das ligaes adjacentes ligao peptdica originam essencialmente
dois tipos de estrutura: as hlices e as folhas pregueadas.
Prolina, glicina e asparagina causam reverses na cadeia, atravs das qual a cadeia
polipeptdica dobra 180.
Estrutura terciria
Este nvel de estrutura corresponde conformao tridimensional das cadeias
polipeptdicas e fundamental para a atividade biolgica.
Estrutura quaternria
Corresponde a associaes, quase sempre reversveis, mantidas por ligaes fracas
(no covalente) entre vrias cadeias polipeptdicas idnticas ou diferentes.
A estrutura quaternria designa o arranjo de subunidades polipeptdicas (monmeros).
A protena , portanto oligomrica sendo, por exemplo, um dmero se for constituda
por duas subunidades ou um tetrmero se for constituda por quatro subunidades.
Observao: O nmero de cadeias polipeptdicas de uma protena oligomrica pode ser avaliado
pela determinao do nmero de resduos N-terminal existente na molcula de protena.
Prof Eleonora Slide de aula
Desnaturao
As protenas sofrem desnaturao em decorrncia de alteraes na sua estrutura
conformacional.
Classe Exemplo
Classificao das
protenas de Enzimas Ribonucleases
Tripsina
acordo com a
funo biolgica Protenas transportadoras Hemoglobina
Lipoprotenas
Protenas globulares
Com cadeia(s) polipeptdica(s) fortemente
enrolada em forma globular ou esfrica.
Usualmente solvel em sistemas aquosos e
se difundem facilmente.
Protenas fibrosas
Com cadeia(s) polipeptdica(s) estendida ao
longo de um eixo. So insolveis em gua,
compridas e filamentosas. A maioria tem
funo estrutural.
Protenas Conjugadas
Peso N. de N. de
Molecular Resduos Cadeias
Insulina (bovina) 5.733 51 2*
Ribonuclease (pncreas bovino) 12.640 124 1
Lisozima (clara de ovo) 13.930 129 1
Mioglobina (corao eqino) 16.890 153 1
Quimotripsina (pncreas bovino) 22.600 241 3*
Hemoglobina (humana) 64.500 574 4*
Albumina do soro (humana) 68.500 550 1
Hexoquinase (levedura) 96.000 800 4*
- globulina (cavalo) 149.900 1.250 4*
Desidrogenase glutmica (fgado bovino) 1.000.000 8.300 40*
Observao:
Peso molecular (protenas simples) 110 = Nmero de resduos de aminocidos
Prof Eleonora Slide de aula
Para estudar uma protena necessrio em primeiro lugar separar esta protena das demais.
Uma preparao pura essencial para que as propriedades e possveis atividades possam ser
determinadas.
Os mtodos clssicos para separao de protenas utilizam propriedades que variam de uma
protena para outra, como tamanho, carga e propriedades ligantes. Alguns mtodos modernos
incluem clonagem de DNA e seqenciamento genmico.
Prof Eleonora Slide de aula
Homogeneizao e
Centrifugao Diferencial 600 rpm
Homogenato peneirado
para remover o tecido
conjuntivo e os vasos
O homogeneizador um tubo de O tubo se sanguneos
move
ensaio de parede espessa atravs do lentamente
para cima e
qual passa um mbolo bem ajustado. para baixo pilo de
enquanto o teflon
A centrifugao diferencial utilizada pilo gira
descartado e o sobrenadante
centrifugado a uma velocidade maior. Sobrenadante 3: frao solvel
do citoplasma (citosol)
Salting out
As protenas, contidas nas fraes sub-celulares ou organelas, so freqentemente submetidas
a uma purificao bruta com base na solubilidade. A solubilidade de protenas geralmente
diminuda em altas concentraes de sal, um efeito denominado salting out (adio de sal). A
adio de certos sais em altas quantidades pode precipitar seletivamente algumas protenas,
enquanto outras permanecem em soluo.
As protenas apresentam solubilidades diferentes em compostos polares e inicos, e
permanecem solveis por causa da sua interao com a gua.
Quando o sulfato de amnio, (NH4)2 SO4, (reagente mais utilizado nesta etapa) adicionado a
uma soluo de protenas, uma parte da gua removida da protena para formar ligaes on-
dipolo com os sais. Com menos gua disponvel para hidratar as protenas, elas comeam a
interagir entre si por meio de ligaes hidrofbicas. A uma quantidade definida de sulfato de
amnio, um precipitado que contem protenas formado. Essas protenas so centrifugadas e,
se forem protenas contaminantes, so descartadas.
A seguir, mais sal adicionado e um conjunto diferente de protenas, que pode conter a
protena em questo, precipitar. Este precipitado coletado por centrifugao e guardado.
A quantidade de sulfato de amnio normalmente medida em comparao com uma soluo
saturada a 100%. Um procedimento comum consiste em levar a soluo a cerca de 40% de
saturao e centrifugar o precipitado que se forma. Depois mais sal adicionado ao
sobrenadante, normalmente a um nvel de 60% a 70% de saturao, e o novo precipitado
formado separado por centrifugao.
Prof Eleonora Slide de aula
Dilise
Uma membrana (tubo de dilise ou papel celofane) contendo a soluo de protena e
outros solutos permite que a gua e solutos pequenos, como sais (NaCl; (NH4)2SO4;
etc.) e acares (glicose; etc.), passem livremente atravs dela. No permite, porm,
a passagem de solutos grandes como as protenas.
stios aninicos
+ NH3-CHR1-COOH
SO3 Na+
+ NH3-CHR2-COOH troca de ctions
+ NH3-CHR3-COOH
+ NH3-CHR4-COOH
SO3 Na+
Aminocidos com maior carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais
facilidade, o Na+ da resina e so ligados mais fortemente.
Aminocidos com menor quantidade de carga positiva (cidos glutmico e asprtico) se ligam
com a menor intensidade.
Todos os demais aminocidos tm quantidade intermediria de carga positiva.
Prof Eleonora Slide de aula
Cromatografia de Afinidade
Separa as protenas por suas propriedades especficas de ligao.
Eletroforese
A eletroforese se baseia na movimentao de partculas em um campo eltrico, em
direo a um eletrodo de carga oposta.
Protenas pI Protenas pI
Diferentes amostras so
aplicadas em depresses (poos)
no topo do gel. As protenas se
movem no gel quando um
campo eltrico ligado.
As protenas podem ser
visualizadas, aps a eletroforese,
por tratamento do gel com um
corante (ex: Coomassie blue).
Cada banda no gel representa
uma protena diferente,
protenas menores se movem
mais rapidamente que as
protenas maiores e so
localizadas prximo a base do (a) (b)
gel.
A primeira raia mostra uma srie de padres de protenas de massa conhecida, que servem de
marcadores de peso molecular. As duas raias seguintes mostram a protena antes e aps a sua
sntese ser induzida. A quarta raia mostra a protena no extrato celular bruto. As raias
subseqentes mostram a protena aps sucessivas etapas de purificao. A protena purificada
uma cadeia polipeptdica (Mr 38.000).