UdeSantiago

ALBERTO AEDO CRISTIAN CABELLO

LEONARDOMUOZ LIFKO VILLAGRA
PROFERSOR: BRAULIO PAILLAVIL

Extraccin y
purificacin de
protenas de un tejido
vegetal
Bioqumica
Resumen: En este informe se encontrar una pequea resea de la extraccin y purificacin de
protenas, adems se dilucidara el procedimiento experimental de las funciones realizadas. Luego
se entregaran los resultados obtenidos , mediante tablas y grficos .Siguiendo la lnea , se
explicaran los resultados obtenidos mediante una discusin .Finalmente se ver la conclusin, en
donde se entregaran los aprendizajes adquiridos, adems de las referencias utilizadas para la
realizacin de este informe.

Introduccin
Objetivos
Extraer una protena de un tejido vegetal
Determinar la concentracin de una protena por mtodo de Bradford
Evaluar la integridad de protenas y calidad de extraccin utilizando SDS-PAGE

La mayor parte de las investigaciones bioqumicas requieren la purificacin, al menos

parcial, de las sustancias en estudio. Esto requiere generalmente un gran esfuerzo ya que
una clula contiene miles de sustancias diferentes, por otra parte, la molcula que buscamos
puede ser extremamente inestable o encontrarse a concentraciones muy bajas. Para llegar a
la protena de inters debemos seguir un protocolo detallado:
Extraccin y rotura celular: El primer paso en el aislamiento de una protena es la rotura
celular, para posteriormente poder extraer la protena con un tampn adecuado. El mtodo
de rotura a elegir depende de las caractersticas mecnicas del tejido o clulas de donde se
va a aislar la protena, as como de su localizacin. Entre los distintos mtodos estn
- Lisis celular
- Destruccin mecnica
- Congelacin y descongelacin
Para los tejidos vegetales, la lisis no basta para romper las clulas (vegetales) por
completo, es por eso, que se usa la destruccin mecnica y la congelacin-descongelacin
con nitrgeno lquido ms la ayuda de un mortero para destruir. Luego debe emplearse un
buffer de extraccin para evitar la desnaturalizacin.
Luego de obtener un lisado u homogenado que contiene una mezcla de enzimas,
membranas y clulas rotas, la preparacin se somete a centrifugacin (10.000 15.000
rpm) para eliminar los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas
solubles, del precipitado.
Mtodos de Separacin y purificacin de protenas: Una preparacin pura de una
protena es esencial para poder determinar sus propiedades y su actividad .Los mtodos
clsicos de separacin de protenas aprovechan propiedades que varan de una protena a
otra, entre las que incluye el tamao, carga y las propiedades de unin.
Mtodos Cromatgraficos: Las separaciones cromatogrficas se basan en las diferencias de
carga, tamao o afinidad de las diferentes protenas. Uno de los mtodos ms habitualmente
utilizados para la separacin de protenas es la cromatografa en columna, aunque tambin
existe la cromatografa en papel y en placa.
Mtodos electroforticos: Para comprobar si la protena de inters se ha separado del resto,
es decir si la protena est pura, se requieren las tcnicas electroforticas. La electroforesis
de protenas se lleva a cabo generalmente en geles de poliacrilamida. Se trata de geles
porosos, cuya porosidad se puede regular en funcin de la concentracin de acrilamida.
Segn su condicin se pueden separar en:
- Condicin nativa : las protenas se separan en funcin de su carga/masa
- Condicin desnaturalizada: la electroforesis se realiza en presencia de un detergente,
el SDS (dodecil sulfato sdico).
El SDS es un detergente aninico, que se une a todas las protenas en la misma proporcin
formando una especie de micela cargada negativamente. La gran carga negativa del SDS
enmascara la carga intrnseca de las protenas, con lo que stas se separan solo en funcin
de su masa e independientemente de su carga. El nico inconveniente de esta tcnica es que
el SDS desnaturaliza las protenas y las protenas multimricas se separan en sus
subunidades. Las electroforesis en SDS adems de permitir calcular el peso molecular de
las cadenas polipeptdicas, nos indican las distintas subunidades que posee la protena.
 Procedimiento
Realizacin de una curva de calibracin utilizando mtodo de Bradford
Se mezcl en tubos Eppendorf un volumen de 980L de reactivo de
Bradford, con 20L de las soluciones de suero albumina, las cuales iban de 1
a 0,1 mg/mL. Luego de 2 minutos, se midi la absorbancia a 595 y se
construy una curva de calibracin.
Extraccin de protenas de tejido vegetal
Se masaron 150 mg de un tejido vegetal (hoja de rbol), esta se llev a un
mortero, en donde se homogenizo utilizando nitrgeno lquido. Una vez
obtenido un polvo fino, se le agrega 1 mL de buffer de extraccin. Esta
muestra se vierte en un tubo Eppendorf y se lleva a una centrifuga a 13000
rpm por 15 minutos a 4C. Se descarta el pellet y se retiene el sobrenadante.
Las muestras se guardan a 4C.
Determinacin de la concentracin de protenas por el mtodo de Bradford
En 2 tubos Eppendorf se mezclaron 980L de reactivo de Bradford y 20 L
de la muestra vegetal, al cabo de 2 minutos se mide la absorbancia a 595 nm
Evaluacin de la integridad de protenas y calidad de extraccin utilizando SDS-
PAGE
Se cargan 20L de protena vegetal en un gel de poliacrilamida al 12%
Preparacin gel SDS-PAGE
Gel concentrador 3 mL
Agua 2,1
Acrilimida 30% 0,5
Tris 1,5 M pH 6,8 0,38
10% SDS 0,03
10% PSA* 0,07*
Temed* 0,007*
El Temed se agrega al final, debido a que es el que le da la consistencia gel

Gel separador 5 mL
12 %
Agua 1,6
Acrilimida 30% 2
Tris 1,5 M pH 1,3
8,8
 10% SDS 0,05
10% PSA* 0,09*
Temed* 0,009*

Resultados
Actividad 1: Elaboracin de una curva de calibracin de BSA 1 mg/L
- Se adjunta la tabla nmero 1 , con los datos recopilados
Las concentraciones se calcularon de la siguiente manera .Se dar solo un ejemplo, ya que
las otras concentraciones siguen el mismo procedimiento.
CBSA V BSA=CFinal VdeEnrase (BSA + PBS)

( 1mg
mL )
0,004 mL=(c) 0.040 mL c =0.1 mg/L

Concentr
Absorb
acin
ancia
(M)
0 0,3269
0,1 0,3438
0,2 0,8012
0,3 0,8804
0,4 0,9173
0,5 1,0233
Tabla N1

Con los datos obtenidos de la tabla nmero 1 se procede a graficar

 Tabla 1
1.2

1 f(x) = 1.51x + 0.34

R = 0.87
0.8

0.6
Absorbancia
0.4

0.2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

BSA (mg/mL)

Grfico N1: La pendiente nos indica la absortividad en 1 cm de celda

- Contramuestra: Se adjunta tabla N2, con los datos recopilados

Concentr
Absorb
acin
ancia
(M)
0 0,3253
0,1 0,3276
0,2 0,4541
0,3 0,8191
0,4 0,8707
0,5 1,0333
Tabla N2

Con los datos obtenidos de la tabla nmero 2, se procede a graficar

 Tabla 2
1.2

1
f(x) = 1.58x + 0.24
0.8 R = 0.93

0.6
Absorbancia
0.4

0.2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

BSA (mg/mL)

Grfico N 2: La pendiente nos indica la absortividad en 1 cm de celda

Actividad N2: Determinacin de protena

- Con las absorbancias obtenidas a una longitud de onda de 595

nm en la muestra y contra muestra ( tabla N3 ) , se procede a
calcular las concentraciones de estas ultimas

Absorbancias
Muestra 0,3829
Contra muestra 0,3986
Tabla N 3
Antes de empezar a calcular las concentraciones debemos discriminar
entre la primera y segunda grfica, obtenidas en la primera actividad,
ya que de ah obtendremos la ecuacin de la recta que nos ayudara a
determinar la concentracin.
 - Guindonos en el R2 procedemos a utilizar la ecuacin de la recta
de la grfica 2
La ecuacin de la recta es: y = 1,5812x + 0,243
- Se procede a reemplazar y ,con las absorbancias obtenidas en
la tabla N3

Muestra: y = 0,3829
0,3829=1,5812 x+ 0,243 x=0,088 mg/mL

Contra muestra: y=0,3986

0,3986=1,5812 x +0,243 x=0,098mg /mL

Como las muestra fueron diluidas, se procede a calcular la nueva

concentracin:

Referencias

1. Mercedes Sobern Lozano Qumica de las protenas Purificacin de

protenas
2. Gua de laboratorio entregada por profesor.
3. NELSON, D.L.; COX, M.M. Principios de Bioqumica, 4edicin, p.190, Editorial Ediciones

Omega S.A, Barcelona, Espaa, (2005).

- Paginas. 84-90

4. DICKERSON, R.E., Principios de Qumica, 3 edicin, p. 855, Editorial Revert S.A.,

Espaa, (1992).