Ao 2006

SEMINARIO I
ESTEQUIOMETRIA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

La conversin microbiolgica de carbohidratos para obtener biomasa y

productos de inters industrial es tema de constante actualidad debido a la creciente
dependencia de los recursos renovables.
Los rendimientos alcanzados en biomasa y productos son de relevancia
significativa debido a que, generalmente, el valor de los sustitutos empleados en la
formulacin de medios de cultivo tiene una importancia sustancial en el costo de
operacin de las plantas industriales. El grado en que un microorganismo puede
transformar los componentes del medio de cultivo en nueva biomasa y productos
juega un papel fundamental, a punto tal que puede llegar a ser factor determinante
de la viabilidad de un proceso en gran escala. Desde este punto de vista, resulta de
sumo inters poder llegar a determinar, estimar o predecir rendimientos que den
cuenta de las transformaciones que se estn llevando a cabo en un biorreactor. Los
balances de materia y energa resultan a tal fin de suma utilidad y su empleo se ha
extendido ampliamente en ciencias bsicas y aplicadas.
La aparicin en el mercado de sensores que permiten medir importantes
variables de los cultivos microbianos y el uso de ordenadores acoplados a los
biorreactores (biorreactor = recipiente en el cual se cultivan los microorganismos)
han ampliado el horizonte para la aplicacin de balances de materia y energa. la
produccin de biomasa (biomasa = concentracin de microorganismos expresada en
gramos de clulas secas / litro de cultivo), consumo de las fuentes de C y energa,
de nitrgeno y Oxgeno y las produccin de CO 2 y desprendimiento de calor son
algunas de las variables que pueden ser estimadas a partir de medidas
experimentales y utilizadas en el planteo y clculo de balances de materia y energa.
Antes de proceder a considerar el sistema de anlisis propuesto, es
conveniente introducir algunas definiciones y hacer ciertas consideraciones sobre
algunas regularidades observadas experimentalmente en el cultivo de
microorganismos.
En primer lugar se ha encontrado que la composicin elemental de un
importante nmero de microorganismos, cultivados bajo diferentes condiciones, se
mantiene prcticamente constante; as podemos definir un microorganismo
promedio (composicin standard) como aquel cuya composicin es (% p/p): C =
46,5; H = 6,94; 0 = 31,0 y N = 10,85, donde el aproximadamente 5 % restante est
representado por sales. Es importante recalcar que si bien la composicin elemental
promedio de la biomasa se mantiene prcticamente constante, la concentracin
intracelular de protenas, RNA y dems constituyentes celulares puede variar
sensiblemente entre diferentes especies e incluso entre diferentes estados del
cultivo de un mismo microorganismo.
Teniendo en cuenta esta composicin media, podemos escribir lo que sera la
frmula mnima de nuestro m.o. promedio como C H 1,79O0,5N0,2 (en la que est
representada el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prcticos definir 1 C-
mol de biomasa como la cantidad de biomasa que contiene 1 tomo gramo de C.
As pues tenemos que:

12 1,79 16 x 0,5 14 x 0,2

1 C - mol de biomasa = = 25,8 g
0,95

1
 Si llamamos x a la fraccin de C en la biomasa y tenemos en cuenta que
para nuestro m.o. promedio x = 0,465, obtendramos el mismo valor anterior
haciendo el siguiente clculo: 12/0,465 = 25,8. Estrictamente hablando, para conocer
la cantidad de biomasa que corresponde a n C-moles de biomasa debemos conocer
su composicin elemental y en trminos generales el factor de conversin resulta
12
n. g
ser: x de biomasa.
De forma anloga a como lo hicimos con la biomasa, podemos definir 1 C-mol
de sustrato (entindase por sustrato fuente de carbono y energa, FCE), 1 C-mol de
fuente de N, etc. Como ejemplo, para la glucosa: C 6H12O6, 1 C-mol de glucosa estar
representado por CH2O y pesar 30 g, y para el etanol, 1 C-mol de etanol (CH 3O0,5)
pesar 23 g.
Otro concepto que debemos introducir es el de grado de reduccin o grado
de reductancia, el cual ser de gran utilidad en el momento de plantear nuestros
balances de materia y energa.
Tomemos como ejemplo las siguientes reacciones de oxidacin:

C + O2. CO2 =4
CH4 + 2O2 CO2 + 2H2O =8
CO + 0,5 O2 CO2 =2
CH2O + O2 CO2 + H2O =4
CH3O0,5 + 1,5 O2 CO2 + 1,5 H2O ` =6

Podemos observar que los distintos valores de que figuran a la derecha de

cada ecuacin coinciden con el nmero de electrones disponibles que fueron
transferidos desde el compuesto a oxidar al oxgeno. En general se expresa en
trminos de n de e- disponibles / c-mol.
Para calcular el valor de de un determinado compuesto se toman los grados
de reduccin 4 para el C; 1 para el H; -2 para el O y -3 para el N. En el caso del CO 2,
H2O y NH3 no se tienen e- disponibles (estados de referencia), luego CO2 = H2O = NH3
= 0. Se considera adems que el estado de oxidacin predominante del N en la
biomasa es -3. En trminos generales para un compuesto de frmula CH aObNc, su
grado de reduccin vendr dado por:

= 4 + a - 2b - 3c (1)

Si tenemos un compuesto cuya frmula es Ch Hi Oj Nk, debemos llevarlo a la forma

CH i O j N k
h h h

Si tomamos como ejemplo a nuestro m.o. promedio su x (donde el subndice

x indica biomasa) ser:
e - disp.
x = 4,19
C - mol

2
 Este valor, junto a su correspondiente x = 0,4, son dos de las regularidades
a las que nos habamos referido con anterioridad. Estos valores pueden ser
empleados en balances de materia y energa en aquellos casos en que se
desconoce la composicin de la biomasa sin temor de incurrir en errores groseros de
clculo. Otras regularidades observadas en el cultivo de m.o. es que el calor de
reaccin por mol de e- transferidos al O2 es relativamente constante para la
oxidacin de una amplia variedad de molculas orgnicas y corresponde a 27
Kcal/mol e- disponibles transferidos al O2.
Estamos ahora en condiciones de plantear una serie de balances de materia y
energa, para lo cual trataremos al cultivo de un m.o. como si fuera una reaccin
qumica simple.
r = velocidad de
1C mol S + a mol fte de N + b O2
reaccion
y x X y p prod + CO2 + w H2 O + q (calor )

Donde X significa biomasa, cuaquiera sea su naturaleza.

Debemos hacer notar que los coeficientes estequiomtricos estn referidos a
1 C-mol de fuente de C y energa. As pues:

C - mol de X
yx C - mol de fte. de C y E
lo mismo para yp e yCO2.

Generalizando:

CH S 2 OS 2 + a NH3 + bO2 y X CH X 1OX 2 N X 3 + y p CH P1OP 2 N P 3 + yCO2 CO2 + wH 2 O + q

(1
)

El balance de carbono para esta reaccin de formacin de biomasa y producto ser:

y x + y p + y CO2 1
(2)

De igual forma podemos establecer un balance del grado de reduccin:

s + (-4)b = yx . x + yp . p (3)

Reordenando y dividiendo por s obtenemos

4b yx . yp . p
x
1
s s s (4)
o lo que es lo mismo
++=1 (5)

4b
donde = s (fraccin de e- disponibles del sustrato transferidos al O2)

3
 y x . x
= s (fracin de e- disp. del s transferidos a la biomasa)
y p . p

= s (fraccin de e- disp. del s transferidos al producto)

Estos dos balances obedecen directamente al principio de conservacin de la

masa y la energa, en el primero de ellos, no puede haber entre los productos ms
carbono del que un c-mol de sustrato puede aportar y el en el caso del segundo, los
electrones disponibles del sustrato deben ir obligadamente a los distintos productos.
Si asumimos, como ya se mencion, que el calor de reaccin por mol de e -
disponibles transferidos al oxgeno es constante para un importante n de molculas
orgnicas, el primer trmino de la ecuacin (4) nos da la fraccin de energa del
sustrato que evoluciona como calor. Si llamamos q o a esa constante con qo = 27
Kcal/mol e- disponibles transferidos al O 2, el calor generado en la ecuacin l vendr
dado por:

q = 4 qo b kcal/C-mol de sustrato (6)

Si conocemos la velocidad de consumo de O 2 de nuestroo cultivo podemos

calcular la velocidad de produccin de calor y por lo tanto los requerimientos de H 2O
de enfriamiento para mantener constante la temperatura de nuestro biorreactor.
El concepto de e- disponibles nos brinda un mtodo simple de clculo para
chequear los resultados obtenidos experimentalmente en lo que se da en llamar
anlisis de consistencia interna. Empleando las ecuaciones (2) y (4) o (5) con datos
obtenidos en el laboratorio, podemos estimar parmetros no medidos y tener idea de
cun confiables fueron nuestras determinaciones. Medidas realizadas en el
laboratorio deben encontrarse dentro de los intervalos:

0,94 yx + yp + yCO2 1,06

0,93 + + 1,07

Valores inferiores o superiores a estos lmites de aceptabilidad determinados

estadsticamente ponen en evidencia errores en las determinaciones
experimentales.
En el trabajo habitual de laboratorio la cuantificacin de la biomasa producida
se efecta gravimtricamente, es decir, se determina el incremento en biomasa
expresado en g/l (x) correspondiente a la utilizacin de una determinada cantidad
de sustrato (s) (igualmente expresada en g/l) con lo cual definimos nuestro
x
Yx
rendimiento en base a sustrato como s al que tomamos como rendimiento
global en el que slo se tienen en cuenta los valores finales e iniciales de biomasa y
sustrato, ms rigurosamente Yx debiera ser expresado por el lmite x / s con s
dx
Yx
0, esto es: ds (observar que el signo negativo es introducido porque x y s
varan en sentido contrario).
Estamos ahora en condiciones de calcular los valores de yx, yp, y yCO2
conociendo los respectivos rendimientos globales y los valores de x, s, p y CO2 tal

4
 x p CO 2
y x Yx ; y p YP ; y CO 2 YCO 2
cual vemos a continuacin: S S S
(7)
Resulta de gran inters conocer los destinos que toma la fuente de C y
energa durante el crecimiento microbiano y la fraccin de la misma empleada por el
m.o. para obtener la energa necesaria para llevar adelante sus funciones
metablicas.

Por balance de sustrato:

s = sx + sp + sE (8)

donde S = Sustrato total consumido

Sx = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de biomasa
Sp = Fraccin de sustrato utilizado en la formacin de producto
SE = Fraccin de sustrato utilizado para obtener energa

Por otro lado, se debe cumplir que: - Sx . s = X . x (9)

Sp . s = P . p (10)

por consiguiente:

SE = S - Sx - Sp

x P
P.
..
SE = S + X s s

S E x p
1 Yx Yp
fE = S s s fE : fracc. de FCE destinada a la obtencin
de E.

y CO 2
fE = 1 - yx - yp = (11)

Experimentalmente lo que se hace es determinar la produccin global de CO 2

y conociendo la masa de CO 2 y sustrato consumido y calcular SE por
estequiometra. Este mtodo presenta dos inconvenientes: en primer lugar existen
reacciones enzimticas que incorporan O 2 a determinados componentes celulares
(O2 que no es empleado para obtener energa) no obstante este consumo puede ser
despreciado frente al global para oxidar la fte. de C y E; y el ms importante es que
debemos suponer que x s, caso contrario se introduce un grosero error en el
clculo.

Hasta aqu los balances planteados por el mtodo de e - disponibles

consideran el caso particular de formacin de biomasa y producto cuando la fuente
de N es NH3. Ahora bien, qu sucede cuando sta no es NH 3?

5
 Lo que se hace en este caso es modificar los estados de referencia para que
en los balances: CO 2 = H 2O = fte.de N = 0 con lo cual estamos estableciendo un
"grado de reduccin generalizado".

H a 1 O b 1 N c1
Tomemos: Biomasa = C
H a2 O b2 N c2
Sustrato = C
H a 3 O b3 N c3
Producto = C
C d 4 H a4 O b4 N c4
Fuente de N =

Se definen los i generalizados como:

C1
4d 4 a 4 2 b 4
2 b1 C4
x = 4 + a1 - -

C2
4d 4 a 4 2 b 4
C4
s = 4 + a2 -2 b 2 - "

C3
4d 4 a 4 2 b 4
C4
p = 4 + a3 - 2 b 3 - "

a4 b C d4 a4 b
N 4 2 4 4 4 2 4
d4 d 4 C4 d4 d4 d4

Veamos ahora algunos ejemplos aplicados al anlisis de datos

Ejemplo 1:
En un cultivo continuo de Saccharomyces cerevisiae se encontr que por
cada C-mol de biomasa formada se consumieron 4,26 C-moles de glucosa, 0,35
moles de O2 y se formaron 1,92 C-moles de etanol. La fuente de N fue NH 3 y la
glucosa; a fuente de C y energa. La composicin elemental es CH 1,8O0,56N0,17.
Verifique si el consumo de O2 es correcto.

x = 4,17 p = 6 s = 4 (C2H6O)

1 1,92
yx = 4,26 = 0,235 yp = 4,26 = 0,45

CH2O + c NH3 + b O2 yx biomasa + yp CH3O0,5 + (1-yc-yp)CO2 + w H2O

s - 4b = yx . x + yp . p

6
 mol de O 2
b = (s - (yx . x + yp . p) ) = 0,079 C - mol de S

mol de O 2
Valor experimental = 0,35 C - mol de biomasa

mol de O 2 b
0,34
Verificacin: C - mol de biomasa y x

Ejemplo 2:
Un microorganismo crece anaerbicamente en un medio con glucosa como
fuente de C y energa; NH3 como fuente de N y NO3- como aceptor de electrones. El
yx = 0,6 C-mol/C-mol. El NO3- es reducido por el microorganismo a N 2. Cunto NO3-
ser necesario para obtener 3,5 g de biomasa/l?

Al no tener datos sobre la composicin elemental de la biomasa supongamos:

CH1,8 O0,5N0, sales 5 %, en consecuencia 1 mol de biomasa pesar 25,8 g y x = 4,19.
NO3- = -5

CH2O + n NO3- + c NH3 ------- yx biomasa + (1-yx) CO2 + m N2 + w H2O

s y x . x mol de NO 3

s - 5n = yx . x , luego ser n = 5 C - mol de S

mol de NO 3 n
0,49
ser pues C - mol de biomasa y x , por lo tanto se necesitarn:

3,5 g / l
x 0,49 mol de NO 3 / l = 0,066 mol de NO 3 / l
25,8 g / l